Résumé non technique d'un projet d'expérimentation animale publié sur ALURES le 23/03/2023
("EC NTS/RA identifier" : NTS-FR-272268)
56 souris vont être utilisées, toutes tuées à l’issue, dans des procédures classées sévères. Elles sont cousues deux à deux par chirurgie de parabiose sous anesthésie générale, pour partager leur système sanguin, puis subissent prélèvements et injections avant d’être tuées environ cinq semaines après l’opération. Le porteur reconnaît que la parabiose est classée sévère en raison de l’inconfort post-opératoire, prévoit une analgésie de 48 heures et fixe comme point limite une perte de poids supérieure à 20 % ou une détresse non soulagée au-delà de 24 heures. Il affirme que ce partage chirurgical du sang est la seule alternative pour identifier la source d’une cytokine dans le modèle murin de la sclérose en plaques.
Objectifs et bénéfices escomptés du projet
Décrire les objectifs du projet.
La sclérose en plaques est une maladie auto-immune qui se caractérise par l’infiltration du système nerveux central (CNS) par des cellules immunitaires conduisant à la destruction de la gaine de myéline qui est à l’origine des désordres moteurs chez les patients. Afin de développer des traitements plus ciblés, il est essentiel de mieux comprendre la physiopathologie de la maladie. Nous avons identifié une nouvelle fonction pour une cytokine pro-inflammatoire, le GM-CSF, en mettant en évidence son rôle crucial dès les premières étapes de la maladie. Nous souhaitons dans ce projet identifier la source cellulaire de cette cytokine.
Quels sont les bénéfices susceptibles de découler de ce projet?
L’utilisation d’anticorps antagonistes bloquant le GM-CSF est une piste thérapeutique prometteuse et les premiers résultats testant l’inocuité du traitement chez les patients sont prometteurs. Notre projet permettra d’apporter un nouveau mécanisme d’action du GM-CSF en montrant que l’utilisation d’un anticorps monoclonal bloquant la cytokine agit non seulement au niveau du système nerveux central, mais aussi en périphérie au niveau des organes lymphoïdes secondaires dès les étapes les plus précoces de la maladie, renforçant ainsi la pertinence de son utilisation dans le traitement de la SEP.
Nuisances prévues
À quelles procédures les animaux seront-ils soumis en règle générale?
Les animaux seront soumis à une chirurgie de parabiose sous anesthésie générale. Deux semaines après la chirurgie, un prélèvement sanguin sera effectué dans la veine mandibulaire sous anesthésie gazeuse. Quatre semaines après la chirurgie, les animaux recevront, sous anesthésie gazeuse, une injection sous-cutanée au niveau de la base de la queue ainsi qu’une injection intra-veineuse au niveau de la veine caudale. Les animaux seront euthanasiés aux alentours de 5 semaines après la parabiose.
Quels sont les effets/effets indésirables prévus sur les animaux et la durée de ces effets?
Les expériences de parabiose sont des expériences classées sévères du fait de l’inconfort qu’elle crée en post-opératoire. Cependant, nous avons déjà réalisé ce type de chirurgie pour un autre projet, et dès 2-3 jours après la parabiose, les parabiontes se déplacent dans la cage et se suspendent à la grille.
Justifier le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure.
A l’issue de la procédure, les animaux seront tous euthanasiés.
Application de la règle des "3R"
1. Remplacement
L’objectif de notre projet est d’identifier la source de GM-CSF et de distinguer si le GM-CSF est sécrété par une population cellulaire circulante ou une population résidente dans les tissus lors des premières étapes de la mise en place de la réponse inflammatoire mise en place lors d’une encéphalite auto-immune expérimentale, le modèle murin de la sclérose en plaques. C’est un processus complexe et intégré qui nécessite l’implication de plusieurs types cellulaires dans des organes distincts avec une cinétique précise. Ces étapes ne peuvent pas être mimées in vitro. De plus, les expériences de parabiose, à savoir le partage du système sanguin, sont les seules alternatives expérimentales afin de répondre à notre question.
2. Réduction
Nous avons calculé que le nombre minimum pour obtenir des résultats reproductibles et statistiquement interprétables est de 7 souris/groupe et que les expériences seront reproduites 2 fois. Nous effectuerons le maximum d’analyse sur le même animal : analyse des tissus inflammés par histologie, analyse multiparamétrique en cytométrie en flux …
3. Raffinement
Avant la procédure de parabiose, les futurs parabiontes seront isolées dans une cage enrichie (igloo/papier kraft pour nidification) pendant deux semaines afin qu’elles s’habituent l’une à l’autre. Lors de la procédure de parabiose, les souris seront anesthésiées avec un mélande de Kétamine 100 mg/kg/Xylazine 10mg/kg injecté en i.p (aiguille de 26G). A cette dose, l’anesthésie dure environ 60 min. Si les souris devaient se réveiller, une nouvelle injection en i.p. serait réalisée de kétamine seule (25 mg/kg) (aiguille de 26G). Nous nous assurerons de la perte de conscience des animaux avant la chirurgie par une absence de reflexe palpébral et du reflexe du retrait. Durant l’opération, un gel oculaire sera appliqué afin d’éviter tout dessèchement de la cornée. Après la chirurgie et jusqu’à leur réveil, les animaux seront placés sur un tapis chauffant afin de limiter l’hypothermie. En post-opératoire, les animaux seront analgésiés pendant 48h, 2 fois/24h, par des injections souscutanées (aiguille de 26G) de Buprenorphine à 0.1 mg/kg. Durant 10 jours, les animaux recevront des antibiotiques sous forme d’un traitement dans l’eau de boisson. Nous nous assurerons aussi que les animaux aient une prise hydrique et alimentaire correcte en rajoutant dans la cage du gel d’hydratation ainsi que des croquettes sous forme de gel. Une attention particulière sera portée aux sutures cutanées pendant la première semaine. Les animaux seront surveillés et pesés quotidiennement pour détecter des signes de douleur et de détresse (tremblement, léthargie, dos arqué, manque de toilettage…). Une perte de poids sévère (>20% du poids initial) ou des signes de douleur et de détresse >24h et non soulagé par le traitement analgésique constituent des points limites et la mise à mort des animaux. Pour réaliser l’immunisation, les animaux seront anesthésiés sous anesthésie gazeuse (Isoflurane 4%). La procédure n’entraîne pas de douleurs, ni de dommages aux animaux.
Expliquer le choix des espèces et les stades de développement y afférents.
Du point de vue immunitaire, les souris présentent des caractéristiques proches de l’espèce humaine. Elles nous permettent d’étudier la physiopathologie des maladies auto-immunes telles que la sclérose en plaques, avec son modèle murin l’EAE (encéphalite auto-immune expérimentale). Nous disposons aussi des modèles murins génétiquement modifiés qui nous permettront d’évaluer l’origine du GM-CSF dans la réponse mise de place da réponse immune encéphalitogène. Des souris adultes seront utilisées dans ce projet