Résumé non technique d'un projet d'expérimentation animale publié sur ALURES le 14/04/2023
("EC NTS/RA identifier" : NTS-FR-047067)
280 souris vont être utilisées, toutes tuées à l’issue, dans des procédures classées sans réveil. Elles reçoivent pendant douze jours un traitement au DSS, un antibiotique et des gavages quotidiens, avec des isolements pour collecter des fèces, afin d’induire une colite et d’étudier l’implantation de bactéries associées à la maladie de Crohn. Le porteur décrit une diarrhée et une perte de poids inférieure à 10 %, les souris étant tuées pour les prélèvements. Il indique avoir mené des études in vitro préalables mais juge l’expérimentation « indispensable » pour reproduire la complexité de l’interaction hôte-bactérie.
Objectifs et bénéfices escomptés du projet
Décrire les objectifs du projet.
Le microbiote intestinal est un écosystème complexe de micro-organismes dont l’équilibre peut être rompu lors de pathologies comme la maladie de Crohn (MC). Les patients atteints de MC ont un microbiote enrichi en entérobactéries dont les Escherichia coli adhérentes et invasives (AIEC). De plus, chez ces patients, l’altération de la barrière intestinale engendre une augmentation de sa perméabilité, facilitant ainsi le passage d’éléments microbiens vers la lamina propria. Cet afflux d’éléments exogènes provoque une réponse immunitaire locale exacerbée. Ainsi, ces patients souffrent d’un état inflammatoire chronique au niveau de l’intestin jumelé à une accumulation locale de molécules pro-inflammatoires stimulant le système immunitaire dont les macrophages intestinaux. Ainsi, les macrophages sont considérés comme des acteurs clés de l’inflammation intestinale dans la MC. Néanmoins, chez les patients atteints de la maladie de Crohn, les macrophages sont jugés défectueux car incapables d’éliminer les bactéries ce qui est pourtant leur fonction dans l’organisme. Une protéine de ces macrophages, nommée CHI3L1, est en partie responsable du dysfonctionnement des macrophages dans l’élimination des AIEC. Il est décrit que la CHI3L1 est fortement exprimée par les cellules épithéliales intestinales des patients atteints de MC et qu’elle joue un rôle clé dans l’interaction des cellules de la barrière avec les bactéries AIEC notamment en interagissant avec une protéine bactérienne : ChiA. Des études ont démontré que les AIEC avaient une meilleure capacité d’entrée au sein de macrophages lorsqu’elles exprimaient la protéine ChiA, par comparaison avec des bactéries délétées pour ChiA. Elles ont également révélé que les AIEC survivaient deux fois moins au sein de macrophages traités avec des anticorps anti-CHI3L1 que dans une condition standard. Ces résultats appuient notre hypothèse et cette interaction constituerait donc une nouvelle cible pour des thérapies visant à décoloniser la muqueuse des individus colonisés. Les objectifs expérimentaux de cette étude sont : 1. Valider in vivo le rôle de l’interaction ChiA-CHI3L1 dans l’infection des macrophages de la muqueuse intestinale par les AIEC ; 2. Si ce rôle est validé, tester trois stratégies de blocage de l’interaction ChiA-CHI3L1 afin de déterminer si cela permet de réduire la colonisation de la muqueuse par les AIEC.
Quels sont les bénéfices susceptibles de découler de ce projet?
Ce projet exploratoire permettra de mettre en évidence l’importance de l’interaction ChiA-CHI3L1 dans l’invasion des macrophages intestinaux par les bactéries AIEC et de tester l’efficacité de différentes stratégies visant à limiter cette interaction : anticorps anti-CHI3L1, CHI3L1 recombinante, régime alimentaire enrichi en chitine. Si l’une de ces stratégies permet de réduire l’implantation des bactéries AIEC chez les souris, cela constituera une solide preuve de concept en vue d’une étude clinique interventionnelle chez les patients atteints de MC et colonisés par les AIEC.PBS
Nuisances prévues
À quelles procédures les animaux seront-ils soumis en règle générale?
Tous les animaux seront soumis à un traitement au DSS (Dextran Sulfate Sodium) pendant 8 jours, à un traitement antibiotique à la streptomycine pendant 3 jours et à une pesée quotidienne pendant douze jours. Tous les animaux subiront un gavage intra-gastrique quotidien pendant 5 jours. Tous les animaux seront isolés dans une enceinte fermée pendant une courte durée (inférieure à 30 min) en vue de collecter des fèces fraîches. Certains animaux recevront un régime alimentaire enrichi en chitine. Certains animaux subiront un traitement administré par injection intra-péritonéale ou par gavage intragastrique pendant 8 jours.
Quels sont les effets/effets indésirables prévus sur les animaux et la durée de ces effets?
Les manipulateurs sont formés aux gestes techniques (contention, gavage, injection en intrapériotonéal) de sorte que ces gestes ne causent qu’un stress léger. L’expérience du laboratoire sur le modèle d’infection sous DSS (Dextran Sulfate Sodium) montre que les souris souffriront d’une colite modérée se traduisant par une diarrhée et une perte de poids (inférieure à 10% du poids corporel).
Justifier le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure.
La mise à mort de ces animaux est nécessaire pour les prélèvements post-mortem envisagés.
Application de la règle des "3R"
1. Remplacement
Dans l’objectif de limiter les expérimentations sur animaux, des études préliminaires sur plusieurs modèles in vitro ont été menées au laboratoire. Nos principales hypothèses ont notamment été démontrées sur une lignée immortalisée de macrophages et sur des cellules primaires. Cependant, il n’existe pas de méthode alternative permettant de rendre compte de la complexité de l’interaction entre les cellules immunitaires de l’hôte et les bactéries AIEC. La virulence des bactéries dans le contexte du tractus gastrointestinal et la réponse des macrophages sont influencées par les multiples interactions au sein de la muqueuse intestinale. Les expériences faisant l’objet de cette demande d’autorisation sont donc indispensables pour déterminer si les bactéries AIEC utilisent l’interaction chiA-CHI3L1 in vivo pour infecter les macrophages intestinaux et pour tester l’efficacité des stratégies envisagées pour limiter cette interaction.
2. Réduction
Le nombre d’animaux utilisé pour cette manipulation a été réduit au minimum, dans la mesure où cela ne compromet pas les objectifs du projet. Le maximum d’organes sera prélevé sur le même animal lorsque c’est techniquement possible sans compromettre la réussite de l’expérience. Il est à noter que l’extraction des macrophages de la lamina propria pour la cytométrie en flux requiert l’utilisation d’un colon complet pour garantir l’extraction d’un nombre suffisant de macrophages. L’expérience du laboratoire montre une hétérogénéité interindividuelle dans l’implantation des bactéries et dans la réponse de l’hôte à cette implantation. C’est pourquoi nous prévoyons trois répétitions de l’expérience comprenant chacune 5 animaux pour quantifier l’implantation bactérienne et localiser les bactéries en imagerie, et 3 animaux pour caractériser le profil phénotypique des macrophages infectés en cytométrie. Ce nombre d’animaux (3 x 5 = 15 animaux par condition expérimentale pour dénombrement et imagerie ; 3 x 3 = 9 animaux par condition pour la cytométrie) nous semble nécessaire pour obtenir des résultats fiables et statistiquement significatifs.
3. Raffinement
Les animaux seront hébergés en cages ventilées dans le respect de la réglementation et auront libre accès à l’eau et la nourriture. Une période d’acclimatation de 7 jours sera réalisée avant le début de l’expérimentation. Les conditions d’hébergement sont les suivantes : température 20-22°C, hygrométrie 40-60%, cycle 12h/12h, éclairage 350-450 lux. Un enrichissement est proposé aux souris : tube/cachette en polycarbonate teinté rouge préalablement lavé et stérilisé. Le bien-être de chaque animal sera évalué quotidiennement par des personnels formés à partir d’une grille d’évaluation dans le but de mettre en évidence tout signe de souffrance. En fonction de ce score individuel de bien-être et de son évolution, la surveillance sera adaptée ou le traitement de l’animal par des antalgiques sera envisagé. Si un animal dépasse le score limite, il sera alors sorti de l’étude et euthanasié.
Expliquer le choix des espèces et les stades de développement y afférents.
Le choix du modèle souris C57BL6 est lié à trois paramètres essentiels : -Utilisation du fond génétique C57BL6 préférable pour l’étude des réponses anti-infectieuses contre des pathogènes intracellulaires -Disponibilité des outils moléculaires (anticorps, cytokines recombinantes…) et expertise technique du laboratoire pour cette espèce -Importance des données bibliographiques déjà publiées sur la réponse immunitaire mucosale sur ce modèle C57BL6 Les expériences d’infection seront débutées sur des souris âgées de 6 semaines dans la mesure où la maladie de Crohn chez les Hommes se déclare majoritairement chez des sujets jeunes (pic entre 15 et 25 ans). L’expérience prendra fin à l’euthanasie des animaux après 12 jours d’expérimentation.