Résumé non technique d'un projet d'expérimentation animale publié sur ALURES le 09/10/2023
("EC NTS/RA identifier" : NTS-FR-300744)
8 480 souris vont être utilisées, toutes tuées à l’issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré pour 1 420 d’entre elles et sévère pour 7 060. Le porteur les intoxique avec deux toxines végétales qu’il décrit comme « faciles à produire » puis teste des molécules thérapeutiques et des tests de diagnostic, avec des injections et jusqu’à quinze prélèvements sanguins. Il indique que l’intoxication provoque perte de poids, mobilité réduite et difficultés respiratoires et peut entraîner la mort des animaux. Il inscrit le projet dans un objectif de biodéfense, visant à « doter l’Europe » de tests rapides, et affirme le modèle murin « nécessaire », les effets sur un « organisme entier » n’étant selon lui pas prévisibles in vitro.
Objectifs et bénéfices escomptés du projet
Décrire les objectifs du projet.
Certaines toxines de plantes présentent une toxicité telle qu’il est nécessaire de développer des tests de diagnostic et des solutions thérapeutiques performantes pour contrer une intoxication accidentelle ou volontaire. A ce jour, aucune molécule thérapeutique ni traitement n’est commercialisé pour deux de ces toxines, faciles à produire. Des molécules (chimiques ou biologiques) ont cependant été développées et ne sont que partiellement caractérisées. Afin de déterminer spécifiquement leur efficacité, il est nécessaire de les évaluer dans un même modèle animal. Le modèle d’intoxication chez la souris nous permet de faire une première évaluation de l’efficacité des différentes molécules. Le projet présente deux objectifs majeurs : 1) Evaluer différentes molécules thérapeutiques contre deux toxines de plante. Ces molécules seront administrées seules ou combinées afin de déterminer la meilleure stratégie thérapeutique. 2) Améliorer les méthodes de diagnostic clinique d’une intoxication à ces toxines dans des fluides et/ou tissus biologiques (par exemple sang). Un test de diagnostic d’une intoxication à une des toxines est en cours de commercialisation. Il s’agit de préparer la prochaine génération, plus sensible et permettant une détection encore plus précoce. Il n’existe pas à l’heure actuelle de test de diagnostic pour la deuxième toxine d’étude. L’objectif est de doter l’Europe de tests de diagnostic rapides et performants afin de détecter ces toxines le plus rapidement possible pour la prise en charge des patients et administrer les contremesures médicales nécessaires.
Quels sont les bénéfices susceptibles de découler de ce projet?
A terme, l’objectif est d’améliorer la prise en charge des personnes intoxiquées en évaluant l’efficacité de différentes molécules thérapeutiques en fonction des différentes voies d’administration. La fenêtre de temps pour administrer les traitements et leur efficacité restent restreintes pour le moment. L’objectif est donc de disposer de molécules au meilleur de l’état de l’art pour élargir cette fenêtre de temps, en particulier après l’intoxication. Il est également nécessaire de disposer de tests de diagnostics rapides et performants (sensibles et spécifiques) dans différentes matrices biologiques pour mettre en évidence une action malveillante de dispersion de toxines et une contamination humaine éventuelle, afin de mettre en place une thérapie adaptée le plus rapidement possible.
Nuisances prévues
À quelles procédures les animaux seront-ils soumis en règle générale?
Toutes les manipulations pouvant entrainer des nuisances (prélèvements de sang, injections) seront réalisées sur des souris anesthésiées. Le prélèvement se fait en 30 à 60 secondes. Majoritairement, il y a 3 prélèvements et ils pourront aller jusqu’à 15 prélèvements selon les procédures.. Le volume prélevé sera adapté en conséquence, excepté pour les prélèvements terminaux effectués en fin de protocole, qui seront donc plus importants, mais toujours réalisés sur animaux anesthésiés. Dans le cas des injections, nous en avons 1 pour l’administration des toxines et 1 pour l’injection des anticorps, qui se font toutes les deux sur animal anesthésié en 30 à 60 secondes. Pour les protocoles courts (21 jours au maximum), ces gestes ne sont réalisés qu’une seule fois. Nous avons également, et ce pour un seul projet, des injections par voie sous cutanée 2 fois par jours dans les 10 jours de l’expérience. Pour les protocoles longs, les animaux étant réexposés, ils subissent une deuxième fois l’administration de la toxine en intra-nasale.
Quels sont les effets/effets indésirables prévus sur les animaux et la durée de ces effets?
Les effets indésirables dans ce modèle d’intoxication sont la perte de poids, la mobilité réduite, des difficultés respiratoires ainsi que des douleurs lors des injections et/ou prélèvements et du stress lors des pesées. A l’extrême, cela peut entrainer la mort des animaux.
Justifier le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure.
Dans l’ensemble des procédures, les animaux seront euthanasiés à la fin du protocole, le but étant de prélever le sang pour effectuer des mesures plasmatiques des antigène et/ou des anticorps ainsi que différents tissus pour nous permettre de procéder à des analyses d’histopathologie au niveau des poumons, mais également caractériser l’inflammation suite à l’intoxication.
Application de la règle des "3R"
1. Remplacement
Des tests préliminaires in vitro sont mis en place dans le laboratoire (avec différentes lignées cellulaires : lymphocytes T humains, cellules épithéliales de reins de singe, cellules pulmonaires humaines) afin de déterminer et de sélectionner les molécules ou les combinaisons de molécules qui semblent être les plus efficaces avant de réaliser les tests in vivo. Ces tests cellulaires permettent de réaliser un grand nombre de combinaisons, et ainsi d’éviter une utilisation massive d’animaux. Cependant, nous savons d’ores et déjà que même si ces modèles sont pertinents pour une présélection/pré-évaluation, il existe encore des disparités entre les résultats obtenus in vitro et ceux obtenus in vivo (nous avons ainsi pu observer qu’un anticorps apportant une très bonne neutralisation à l’échelle d’une lignée cellulaire dans le modèle in vitro avait une efficacité très modérée in vivo. Ainsi, les mécanismes d’action des anticorps peuvent être multiples et un effet à l’échelle cellulaire ne reflète pas toujours un effet sur un organisme entier. Il est donc nécessaire de passer par des modèles d’études plus complexes, prenant en compte la distribution de la toxine comme celle de la molécule thérapeutique, la réponse inflammatoire et immunitaire, comme c’est le cas avec des modèles murins. A ce jour, aucun modèle in vitro ou in silico n’est capable de prédire à 100% la capacité protectrice des molécules thérapeutiques. Un modèle animal est donc nécessaire. Pour les tests de diagnostic, des échantillons prélevés sur des souris naïves, c’est-à-dire n’ayant reçues aucun traitement, mais auquel de la toxine aura été ajouté ont déjà été utilisés pour les mises au point des protocoles avant de faire les essais sur des échantillons d’animaux intoxiqués. Cela permet d’optimiser les échantillons utilisés et de réduire la quantité d’animaux en expérimentation.
2. Réduction
Dans le but de réduire le nombre d’animaux utilisés pour ce projet, nous avons décidé de réduire le nombre de molécules qui seront testées. Pour cela, les essais in vitro réalisés sur différents modèles cellulaires nous ont permis de sélectionner les molécules montrant le meilleur potentiel thérapeutique. De plus, nous avons décidé de limiter les voies d’injection de ces molécules pour réduire le nombre d’animaux nécessaires. Aux regards de tests statistiques, le nombre d’animaux par lot a été déterminé pour nous permettre d’avoir suffisamment de données pour évaluer la sensibilité du test diagnostic ainsi que la performance des molécules thérapeutiques. Certains animaux seront prélevés deux fois (intervalle de 15 jours) afin de réduire le nombre de groupe nécessaire pour les cinétiques plus longues. Par ailleurs, pour les projets où différents temps d’administration sont envisagés, un seul sera testé pour commencer : seulement si celui-ci fonctionne, les autres pourront être testés.
3. Raffinement
Les animaux seront en cage collective afin de favoriser les relations sociales. Une maison en carton ainsi qu’une feuille de cellulose seront également ajoutées et changée chaque jour pour maximiser le bien-être des animaux et leur permettre de faire leur nid. Les animaux seront également observés une fois par jour durant toute la durée des essais, lorsque leur état de santé est bon puis une surveillance matin et soir sera mise en place en cas de dégradation de l’état de santé d’un ou de plusieurs animaux. L’ensemble des procédures sera réalisé par du personnel qualifié. Avec le vétérinaire de l’installation, nous avons déterminé des points limites à ne pas dépasser pour ces essais (notamment les signes cliniques suivis quotidiennement ou biquotidiennement afin d’assurer au mieux le bien-être des animaux, et d’éviter une souffrance trop importante. Lors des essais avec les toxines de l’aliment hydraté sera ajouté dans les cages pour éviter la déshydratation et la dénutrition à hauteur des animaux pour permettre même aux animaux les plus faibles d’accéder à l’aliment. L’ensemble des procédures sera également réalisé sur animaux anesthésiés.
Expliquer le choix des espèces et les stades de développement y afférents.
De nombreuses études dans la littérature sur ce sujet ont déjà utilisé le modèle murin, assez sensible aux intoxications avec des toxines végétales. Leur système immunitaire très caractérisé et assez proche de celui de l’être humain ainsi que la facilité d’élevage et manipulation font des souris un modèle approprié pour faire ces essais. Les expériences seront réalisées sur souris à l’âge adulte, pourvues d’un système immunitaire mature.