Résumé non technique d'un projet d'expérimentation animale publié sur ALURES le 2024-04-04 00:00:00
("EC NTS/RA identifier" : NTS-FR-994838)
Lavages vaginaux quotidiens pendant huit à vingt jours, que le porteur reconnaît « désagréables pour les femelles », inoculations intravaginales sous anesthésie, six prélèvements de sang à la queue, pose d’une puce sous la peau et tests de comportement sexuel répétés jusqu’à huit fois : 6 227 souris vont être utilisées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour 3 427 d’entre elles et modéré pour 2 800. 5 227 sont tuées, notamment les femelles dont il faut examiner les ovaires, les embryons et les organes génitaux, et 1 000 mâles sont gardés vivants pour être réutilisés d’un fragment d’anticorps à l’autre. Le projet teste des fragments d’anticorps de camélidés censés contrôler la reproduction sans toucher au comportement sexuel. Le porteur le présente comme mené « à des fins strictement scientifiques », tout en visant des alternatives à la contraception hormonale et des méthodes de synchronisation et de superovulation pour les animaux d’élevage.
Objectifs et bénéfices escomptés du projet
Décrire les objectifs du projet.
Note de l'OXA. Cette question est celle du formulaire européen de résumé non technique. Elle est posée au laboratoire qui demande l'autorisation, et sa réponse est écrite avant que la première procédure commence (arrêté du 1er février 2013, art. 5). Ces objectifs servent à justifier l'utilisation des animaux devant le comité d'éthique. Aucun document public ne dira ensuite s'ils ont été atteints : la directive permet aux États de faire mettre à jour le résumé avec les résultats de l'appréciation rétrospective (directive 2010/63/UE, art. 43), la base européenne prévoit de les recevoir, et aucune entrée française n'en porte (base ALURES).
Les méthodes actuelles de contrôle de la reproduction (traitements hormonaux, stéroïdes) sont associées à de nombreux effets secondaires, et les molécules utilisées s’accumulent dans l’environnement où elles agissent comme des perturbateurs endocriniens. Par ailleurs, aucune solution thérapeutique n’existe pour la prise en charge des troubles du comportement social, et les contraceptifs peuvent être associés à une diminution de la libido. La prise en charge des patients souffrant de troubles de la reproduction et du comportement, ainsi que la maîtrise de la reproduction des animaux d’élevage, bénéficieraient donc du développement de nouveaux traitements pharmacologiques. Les anticorps monoclonaux représentent une des meilleures promesses thérapeutiques dans le domaine de la reproduction. Les fragments d’anticorps de camélidés (VHH) présentent des caractéristiques uniques : ils ont une durée de vie courte dans le sang, sont dégradables et capables de moduler l’activité des récepteurs, et sont donc une alternative majeure aux composés chimiques et hormones stéroïdiennes. Nous caractérisons in vitro des VHH capables d’activer ou inhiber l’activité de cibles impliquées dans le contrôle de la reproduction et/ou du comportement sexuel localisées dans les gonades : récepteur de l’hormone folliculo-stimulante (FSHR), récepteur de l’hormone lutéinisante (LHR), récepteur des oestrogènes couplé aux protéines G 1 (GPER). Les VHH les plus prometteurs doivent désormais être développés pour un usage in vivo, afin de déterminer leur potentiel thérapeutique. Le projet proposé a pour objet i) de déterminer la pharmacocinétique et pharmacodynamique in vivo de ces fragments d’anticorps, ii) le cas échéant de procéder à une ingénierie de leurs séquences pour leur utilisation in vivo, iii) de déterminer les effets fonctionnels sur la reproduction et le comportement chez la souris de ces nouvelles stratégies thérapeutiques innovantes, le tout à des fins strictement scientifiques. Le projet a ainsi pour objectif de démontrer la faisabilité de l’utilisation in vivo de VHH pour contrôler et moduler la fonction de reproduction sans affecter le comportement sexuel dans le cadre i) du développement d’alternatives aux méthodes actuelles de contraception, ii) du traitement de troubles de la reproduction, ou iii) du développement d’alternatives aux méthodes de contrôle de la reproduction (synchronisation, induction de l’ovulation, …) utilisées en élevage.
Quels sont les bénéfices susceptibles de découler de ce projet?
Note de l'OXA. Le formulaire européen demande les bénéfices « susceptibles de découler » du projet. Il appelle donc une projection, et il l'obtient : ce que le laboratoire écrit ici est ce qu'il espère, avant d'avoir commencé. Deux chercheuses ont repris six corpus d'études précliniques déjà menées et pesé les dommages réellement infligés aux animaux contre les bénéfices cliniques réellement obtenus : moins de 7 % de ces études ressortaient défendables (Pound et Nicol, 2018).
En cas de succès de la preuve de concept chez la souris, la voie sera ouverte pour i) le développement de nouveaux traitements innovants des troubles de la reproduction, présentant une meilleure efficacité et moins d’effets indésirables, ii) le développement de méthodes de contraception non hormonales qui présenteraient moins d’effets secondaires et seraient mieux tolérées que les traitements actuels, tout en préservant l’environnement de l’accumulation de perturbateurs endocriniens à très longues demi-vies, iii) le développement de nouvelles méthodes non hormonales pour la synchronisation et l’induction de superovulation chez les animaux de rente.
Nuisances prévues
À quelles procédures les animaux seront-ils soumis en règle générale?
Note de l'OXA. La formule « en règle générale » autorise une réponse générale, et c'est l'un des points sur lesquels les examens de qualité trouvent ces documents défaillants. Cruelty Free International a établi en 2018 que les résumés allemands et britanniques, les seuls examinés à ce jour, décrivaient mal ce qui est fait aux animaux et ce que ceux-ci pourraient éprouver (Taylor et al., 2018). L'adoption d'un modèle commun européen a nettement amélioré le premier point, à peine le second (Taylor et al., 2024).
– Test d’interaction sociale réciproque : le test d’une durée de 10 minutes sera réalisé à faible intensité lumineuse avec des animaux vigiles. Chaque animal sera soumis 1 fois au test. – Test des trois chambres : le test sera réalisé à faible intensité lumineuse avec des animaux vigiles. Chaque animal sera soumis à 1 session de 10 minutes à J-2, 1 session de 10 minutes à J-1, et 2 sessions de 10 minutes à J0. – Test de comportement sexuel : le test sera réalisé avec des animaux vigiles et aura une durée maximale d’une heure. Selon les animaux, ceux-ci pourront être soumis : i) 3 fois au test à 4 jours d’intervalle, ii) 2 fois au test à 2 semaines d’intervalle, iii) 8 fois au test, ou iv) 1 fois au test. – Pesée : la procédure sera réalisée avec des animaux vigiles et dure moins de 5 minutes par animal. Chaque animal sera soumis à la procédure 1 fois par jour pendant environ 25 jours. – Puçage : la procédure sera réalisée sous anesthésie générale gazeuse, et une injection sous-cutanée d’anesthésique sera réalisée pour réduire la douleur liée à l’incision. Chaque animal sera soumis une seule fois à la procédure. – Lavages vaginaux : la procédure sera réalisée sur animaux vigiles et dure moins de 5 minutes. Chaque animal sera soumis à la procédure 1 fois par jour. Selon les animaux, ceux-ci pourront être soumis à la procédure pendant 16-20 jours ou pendant 8-10 jours. – Injection intrapéritonéale : la procédure sera réalisée sur animaux vigiles et dure moins de 5 minutes. Chaque animal sera soumis 1 fois à la procédure. – Prélèvements sanguins par la queue : la procédure dure moins de 5 minutes et sera réalisée sur animal vigile avec une anesthésie locale. Chaque animal sera soumis 6 fois à la procédure, à 1h, 12h, 2 jours, 5 jours et 7 jours d’intervalle du premier prélèvement. – Inoculation intravaginale : la procédure dure moins de 5 minutes et sera réalisée sous anesthésie générale pour une durée d’environ 30 minutes. Chaque animal sera soumis 1 fois à la procédure.
Quels sont les effets/effets indésirables prévus sur les animaux et la durée de ces effets?
Note de l'OXA. C'est l'endroit du document où les animaux devraient apparaître, et c'est celui qui résiste. Cruelty Free Europe a mesuré en 2024 que cinq des six éléments attendus sur les dommages prévus progressaient depuis l'adoption d'un modèle commun européen. Les effets indésirables sont le sixième : 41 % des résumés allemands et 48 % des britanniques les décrivent complètement. Les auteurs relèvent aussi des effets présentés comme minimes sur des projets classés modérés ou sévères (Taylor et al., 2024). Ces deux pays sont les seuls dont les résumés ont été examinés. Les résumés français relèvent du même modèle européen, et leur qualité n'a jamais été mesurée.
Les injections en intrapéritonéale, en intraveineuse et en sous-cutané ainsi que les prises de sang à la veine caudale peuvent engendrer une légère douleur au niveau du site. La pose d’une puce RFID sous anesthésie générale peut engendrer une légère douleur au niveau du site de l’incision lors du réveil de l’animal. La contention des animaux génère du stress. Les tests d’interaction sociale peuvent entrainer une certaine agressivité entre les animaux et ces tests comportementaux peuvent être anxiogènes lié à l’environnement nouveau. Les lavages vaginaux sont des actes désagréables pour les femelles.
Justifier le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure.
Note de l'OXA. Le formulaire demande de justifier ce sort, non de le décrire. L'analyse dommage-avantage que la directive impose au comité d'éthique porte sur « la souffrance, la douleur et l'angoisse » infligées aux animaux (directive 2010/63/UE, art. 38). Quand ce sort est la mise à mort, celle-ci ne figure donc pas parmi les dommages que le comité met en balance avec les bénéfices annoncés. L'OXA écrit « mise à mort » plutôt que « sacrifice », qui emprunte au registre du don consenti, ou « euthanasie », qui désigne une mort décidée dans l'intérêt de celui qui meurt.
Pour le génotypage et phénotypage des animaux transgéniques, les femelles doivent être euthanasiées pour pouvoir étudier les paramètres embryonnaires ainsi que les gonades et organes accessoires. Les mâles seront également euthanasiés car aucuns animaux de ces génotypes ne seront utilisés par la suite, et nous ne pouvons pas envisager de les replacer étant donné que nous ne connaissons pas à l’avance leur phénotype. Pour la mise au point de l’analyse automatisée des tests de comportement sexuel, les femelles ovariectomisées seront euthanasiées à l’issue de la procédure car elles ne seront pas réutilisées par la suite. Tous les autres animaux seront gardés en vie pour être réutilisés. Pour l’effet des fragments d’anticorps (VHH) sur la cyclicité et le comportement sexuel des femelles, les femelles devront être euthanasiées à l’issue de la procédure afin de déterminer si l’oestrus est ovulatoire ou anovulatoire, et pour pouvoir étudier les ovaires (marquage VHH, nombre et taille des follicules, …). Les mâles seront gardés en vie pour être réutilisés. Pour l’effet des fragments d’anticorps (VHH) sur la fertilité des femelles, les femelles devront être euthanasiées à l’issue de la procédure afin d’étudier les paramètres embryonnaires, et pour pouvoir peser et étudier les organes accessoires et les ovaires (marquage VHH, nombre et taille des follicules, …). Les mâles seront gardés en vie pour être réutilisés. Pour l’effet des fragments d’anticorps sur la mobilité spermatique, les femelles devront être euthanasiées à l’issue de la procédure pour pouvoir étudier les paramètres embryonnaires. Toutefois, si aucune gestation n’est constatée, les femelles seront gardées en vie pour être réutilisées.
Application de la règle des "3R"
1. Remplacement
Note de l'OXA. La directive demande au résumé « une démonstration de la conformité » aux exigences de remplacement, de réduction et de raffinement (directive 2010/63/UE, art. 43). C'est donc le demandeur qui démontre sa propre conformité, dans le document même qui sollicite l'autorisation. Cette démonstration peut prendre la forme d'une affirmation qu'aucune méthode de substitution n'existe, que le document n'a pas à sourcer. Ces trois exigences sont par ailleurs subordonnées à l'objectif du projet : elles cherchent à remplacer les animaux dans un projet donné, elles n'interrogent pas ce projet.
Tous les VHH utilisés ont été entièrement développés et caractérisés in vitro, mais aucune étude de reproduction ou de comportement ne peut se réaliser par des approches in vitro, ex vivo ou de modélisation. Ce projet étudie les régulations entre plusieurs fonctions physiologiques et/ou comportementales, qui sont impossibles à reproduire par des méthodes alternatives. La gestation ne peut être mimée in vitro, et l’activité neuronale à l’origine des comportements socio-sexuels est dépendante de l’interconnectivité des neurones, ces phénomènes ne peuvent donc être étudiés que sur des animaux entiers. De plus, la pharmacocinétique (demi-vie dans la circulation sanguine ou temps de résidence dans les organes cibles), la pharmacodynamique (effets des substances injectées sur leur cible), les effets secondaires éventuels et les effets fonctionnels des VHH sur la reproduction ou les comportements ne peuvent être évalués que chez l’animal. Compte tenu de l’ensemble de ces paramètres et de l’absence de méthodes de remplacement in vitro, il est indispensable de recourir à une expérimentation in vivo.
2. Réduction
Note de l'OXA. La réduction dont il est question ici porte sur le nombre d'animaux par groupe expérimental, calculé pour que l'analyse statistique tienne. Le total annoncé dans la fiche est une estimation portant sur une autorisation de cinq ans au maximum (code rural, art. R214-123) : il ne dit pas combien d'animaux seront effectivement utilisés, et il ne se rapporte pas à une année.
Le nombre d’animaux utilisés a été rationalisé afin de ne pas utiliser plus d’animaux que nécessaire pour pouvoir mettre en évidence un effet après analyse statistique. Un effectif de 16 animaux par groupe est ainsi nécessaire. Toutefois, il est indispensable de prendre en compte un certain nombre de facteurs de variabilité pouvant conduire à l’élimination de certains animaux de l’expérience. Ainsi, afin d’assurer un effectif exploitable de 16 animaux par groupe en fin d’expérience, nous avons besoin d’un nombre total de 20 animaux expérimentaux par groupe. De plus, nous avons fait le choix de regrouper certains tests dans une même expérimentation, afin de réduire le nombre d’animaux utilisés pour étudier ces paramètres. Enfin, les effectifs décrits correspondent aux effectifs maximaux qui pourraient être utilisés. En effet, dès que cela sera possible, plusieurs aménagements nous permettront de réduire le nombre d’animaux utilisés pour les expériences : i) pour les tests de comportement sexuel, les mâles pucés pourront être réutilisés pour les expériences avec différents VHH, ii) pour les femelles ayant reçu une administration intravaginale de VHH, si aucune gestation n’est constatée au bout de 20 jours après mise en présence du mâle, celles-ci seront gardées en vie et réutilisées pour tester d’autres VHH, iii) dès que cela sera possible, plusieurs fragments d’anticorps candidats seront testés en parallèle avec un seul groupe contrôle commun, ce qui permettra de réduire les effectifs totaux des animaux contrôles utilisés. Enfin, concernant les animaux exprimant le transgène FSHR humain, si ceux-ci ne présentaient pas de restauration de la fertilité, aucune expérience ultérieure avec ces animaux ne serait réalisée.
3. Raffinement
Note de l'OXA. Le raffinement nomme une amélioration technique de la procédure, sans dire ce qu'elle change pour l'animal qui la subit. La réglementation impose d'atténuer la douleur, dans une limite qu'elle inscrit elle-même : « pour autant que cela soit compatible avec la finalité de la procédure expérimentale » (code rural, art. R214-109). Ce qui reste de souffrance après cette limite est autorisé. Le raffinement ne porte par ailleurs que sur la procédure : les souffrances de la captivité elle-même, confinement, bruit, lumière, manipulations d'entretien, ne relèvent d'aucun des trois R.
Les expériences sont menées dans les plus courts délais possibles afin de minimiser l’inconfort et le stress des animaux et de les remettre dans leurs cages en présence de leurs congénères. Les animaux sont observés quotidiennement et leur état de bien-être déterminé sur la base de 3 critères : apparence, poids, comportement (critères décisionnels en annexe). Un enrichissement est mis en place dans l’arène utilisée pour les tests de comportement : cabane en plastique rouge, copeaux, biberon, gamelle de croquettes. Des phases d’habituation sont réalisées avant les tests de comportement, qui sont effectués à faible intensité lumineuse pour limiter l’anxiété des animaux. Ces derniers sont transférés dans une salle contigue à la salle de tests comportementaux 1h avant le début des procédures. Avant d’euthanasier des animaux, ceux-ci sont transférés un à un dans la salle dédiée, afin d’éviter une communication d’anxiété entre congénères. Les puces RFID sont insérées sous la peau au moins 1 semaine avant le début des expériences sous anesthésie gazeuse et une anesthésie locale est réalisée pour réduire la douleur liée à l’incision. Pour les tests de cyclicité, nous réalisons de simples lavages au liquide physiologique plutôt que des frottis vaginaux à proprement parler (qui nécessitent l’introduction de petits coton-tiges à l’intérieur du vagin), cette méthode étant suffisante à la réalisation des objectifs scientifiques tout en limitant l’inconfort des animaux. Une anesthésie locale est réalisée pour les prélèvements de sang ainsi qu’en cas d’injections répétées des fragments d’anticorps. Les administrations intravaginales d’anticorps seront réalisées sous anesthésie générale de courte durée et les animaux sont placés sur un tapis chauffant au cours de la procédure. Les animaux sont soigneusement examinés jusqu’à leur réveil total et contrôlés 2 fois par jour après l’opération pendant 15 jours, pour détecter tout signe de douleur ou d’infection. En cas de signes, le responsable du bien-être animal serait immédiatement informé et les animaux traités. Si le traitement ne fonctionnait pas dans les 24 heures, les animaux seraient euthanasiés pour éviter toute souffrance. L’hébergement des femelles gestantes sera enrichi avec des cotons de ouate. Lors de l’introduction des mâles avec les femelles, nous surveillons l’absence de comportements agressifs pendant 1 heure puis quotidiennement. En cas d’agressivité du mâle envers les femelles, celui-ci serait remplacé.
Expliquer le choix des espèces et les stades de développement y afférents.
Note de l'OXA. Le dossier d'autorisation demande de justifier l'origine des animaux, leur espèce, leur nombre estimé et leur stade de développement (arrêté du 1er février 2013, art. 5). La justification attendue est technique : elle porte sur l'adéquation de l'espèce à l'objectif poursuivi. Ce que l'appartenance à une espèce autorise à faire subir à un individu est une question morale, et le formulaire ne la pose pas. L'appartenance à une espèce, prise seule, ne fonde pourtant pas de différence de statut moral entre des individus également capables de souffrir.
La souris est une espèce sociale qui se reproduit bien et vite, dont la physiologie de la reproduction est bien caractérisée, et qui présente de façon innée des comportements socio-sexuels bien décrits. Cette espèce permet la génération d’animaux modèles transgéniques (souris « humanisées » pour une cible dans le cas présent), approches qui ne sont pas ou que peu possibles sur d’autres espèces. Par ailleurs, à l’heure actuelle seules des petites quantités de VHH sont produites au laboratoire, compatibles uniquement avec une utilisation in vivo chez la souris. Les études seront réalisées chez l’animal adulte (à partir de 7 semaines), les animaux devant avoir passé la puberté pour pouvoir étudier leurs paramètres reproducteurs et comportements sexuels.