Résumé non technique d'un projet d'expérimentation animale publié sur ALURES le 2024-09-02 00:00:00
("EC NTS/RA identifier" : NTS-FR-616705)
Pour suivre l’origine des cellules souches du sang depuis l’embryon jusqu’à l’âge adulte, 440 souris génétiquement modifiées vont être utilisées, toutes tuées à l’issue, dont 60 dans des procédures menées sous anesthésie sans réveil et 380 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Les femelles gestantes reçoivent deux injections intrapéritonéales à 24 heures d’intervalle, vigiles et contenues, avant d’être tuées aux stades voulus pour prélever les embryons. D’autres subissent un prélèvement sanguin sous anesthésie de vingt minutes, puis sont tuées pour récupérer fémur, rate et thymus. Le produit injecté peut rendre la mise bas difficile, et le porteur indique alors que la mère sera tuée et les embryons collectés.
Objectifs et bénéfices escomptés du projet
Décrire les objectifs du projet.
Note de l'OXA. Cette question est celle du formulaire européen de résumé non technique. Elle est posée au laboratoire qui demande l'autorisation, et sa réponse est écrite avant que la première procédure commence (arrêté du 1er février 2013, art. 5). Ces objectifs servent à justifier l'utilisation des animaux devant le comité d'éthique. Aucun document public ne dira ensuite s'ils ont été atteints : la directive permet aux États de faire mettre à jour le résumé avec les résultats de l'appréciation rétrospective (directive 2010/63/UE, art. 43), la base européenne prévoit de les recevoir, et aucune entrée française n'en porte (base ALURES).
Le projet consiste à étudier l’origine et la mise en place du système sanguin (vaisseaux et sang), et en particulier des cellules souches hématopoïétiques (CSH), au cours du développement embryonnaire, foetal, ainsi que son déploiement dans la moelle osseuse après la naissance. Cette approche nécessite l’utilisation de 2 types de souris transgéniques capables de marquer (par une protéine fluorescente) de façon indélébile certaines cellules embryonnaires cibles qui sont à l’origine des cellules des vaisseaux sanguins de l’embryon et suivre leur devenir. L’ensemble des connaissances acquises au cours de cette étude visent à mieux comprendre l’origine et la génération des CSH à partir des cellules des vaisseaux sanguins dérivés de cellules embryonnaires. Cette étude permettra de dégager des mécanismes de production des CSH et de les transposer à des systèmes de culture in vitro à des fins thérapeutiques.
Quels sont les bénéfices susceptibles de découler de ce projet?
Note de l'OXA. Le formulaire européen demande les bénéfices « susceptibles de découler » du projet. Il appelle donc une projection, et il l'obtient : ce que le laboratoire écrit ici est ce qu'il espère, avant d'avoir commencé. Deux chercheuses ont repris six corpus d'études précliniques déjà menées et pesé les dommages réellement infligés aux animaux contre les bénéfices cliniques réellement obtenus : moins de 7 % de ces études ressortaient défendables (Pound et Nicol, 2018).
Il est critique de bien comprendre comment les cellules souches hématopoïétiques se forment au cours du développement normal. En effet, ces cellules sont d’une très grande importance en clinique car elles sont utilisées pour transplanter des patients atteints de maladie du sang. Bien connaitre leur mode de formation nous permettra de manipuler ces cellules à façon, par exemple de les générer en culture a des fins de transplantations. Dans cette étude nous voulons démontrer que certaines cellules endothéliales issues de cellules mésodermiques sont capables de générer des cellules souches hématopoïétiques sous certaines conditions (selon leur origine, leur localisation [foie foetal, moelle osseuse…]). Déterminer quels sont ces facteurs (origine cellulaire, contact avec d’autres cellules au cours du développement et en condition homéostatique) et caractériser (au niveau moléculaire) les étapes de formations des cellules souches hématopoïétiques nous permettra de manipuler cesdernières à des fins cliniques.
Nuisances prévues
À quelles procédures les animaux seront-ils soumis en règle générale?
Note de l'OXA. La formule « en règle générale » autorise une réponse générale, et c'est l'un des points sur lesquels les examens de qualité trouvent ces documents défaillants. Cruelty Free International a établi en 2018 que les résumés allemands et britanniques, les seuls examinés à ce jour, décrivaient mal ce qui est fait aux animaux et ce que ceux-ci pourraient éprouver (Taylor et al., 2018). L'adoption d'un modèle commun européen a nettement amélioré le premier point, à peine le second (Taylor et al., 2024).
Une partie des souris subiront une injection par voie intra-péritonéale 2 fois à 24h d’intervalle, les animaux seront vigiles au moment de l’injection, la contention et l’injection durent moins d’une minute. Ils seront ensuite euthanasiés aux différents stades requis pour le projet. Une autre partie sera anesthésiée pour effectuer un prélèvement de sang avant d’être euthanasiée. L’endormissement dure environ 20 minutes, le prélèvement sanguin 30 secondes.
Quels sont les effets/effets indésirables prévus sur les animaux et la durée de ces effets?
Note de l'OXA. C'est l'endroit du document où les animaux devraient apparaître, et c'est celui qui résiste. Cruelty Free Europe a mesuré en 2024 que cinq des six éléments attendus sur les dommages prévus progressaient depuis l'adoption d'un modèle commun européen. Les effets indésirables sont le sixième : 41 % des résumés allemands et 48 % des britanniques les décrivent complètement. Les auteurs relèvent aussi des effets présentés comme minimes sur des projets classés modérés ou sévères (Taylor et al., 2024). Ces deux pays sont les seuls dont les résumés ont été examinés. Les résumés français relèvent du même modèle européen, et leur qualité n'a jamais été mesurée.
Pour induire la recombinaison, les souris gestantes recevront à un stade précis une injection intrapéritonéale entrainant un stress lors de la contention et une douleur légère de courte durée au moment de l’introduction de l’aiguille. Le produit peut entrainer une difficulté de mise bas, ce qui peut entrainer une douleur à la femelle. Dans certains cas, nous serons amenés à faire des prélèvements sanguins (uniquement chez le jeune adulte/adulte) sous anesthésie générale avant euthanasie. Cette anesthésie peut induire un léger stress et dans de rare cas peut provoquer un arrêt cardio-respiratoire
Justifier le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure.
Note de l'OXA. Le formulaire demande de justifier ce sort, non de le décrire. L'analyse dommage-avantage que la directive impose au comité d'éthique porte sur « la souffrance, la douleur et l'angoisse » infligées aux animaux (directive 2010/63/UE, art. 38). Quand ce sort est la mise à mort, celle-ci ne figure donc pas parmi les dommages que le comité met en balance avec les bénéfices annoncés. L'OXA écrit « mise à mort » plutôt que « sacrifice », qui emprunte au registre du don consenti, ou « euthanasie », qui désigne une mort décidée dans l'intérêt de celui qui meurt.
Les femelles gestantes seront euthanasiées aux stades définis par le protocole expérimental afin d’analyser les embryons par des expériences immunohistologiques et de cytométrie en flux. Les souris ayant subi un prélèvement sanguin, seront euthanasiées afin de récupérer les organes hématopoïétiques (fémur, rate et thymus) pour analyse.
Application de la règle des "3R"
1. Remplacement
Note de l'OXA. La directive demande au résumé « une démonstration de la conformité » aux exigences de remplacement, de réduction et de raffinement (directive 2010/63/UE, art. 43). C'est donc le demandeur qui démontre sa propre conformité, dans le document même qui sollicite l'autorisation. Cette démonstration peut prendre la forme d'une affirmation qu'aucune méthode de substitution n'existe, que le document n'a pas à sourcer. Ces trois exigences sont par ailleurs subordonnées à l'objectif du projet : elles cherchent à remplacer les animaux dans un projet donné, elles n'interrogent pas ce projet.
A l’heure actuelle, il n’existe aucun système de remplacement (autre que le modèle murin) permettant de suivre comment certaines cellules de l’embryon s’organisent pour former un organe ou un système biologique chez l’adulte. Pour notre étude, il nous est nécessaire d’utiliser des souris modifiées génétiquement afin de suivre le devenir de cellules spécifiques depuis le développement de l’embryon jusqu’au stade adulte pour comprendre en détail comment les vaisseaux sanguins et le sang se mettent en place
2. Réduction
Note de l'OXA. La réduction dont il est question ici porte sur le nombre d'animaux par groupe expérimental, calculé pour que l'analyse statistique tienne. Le total annoncé dans la fiche est une estimation portant sur une autorisation de cinq ans au maximum (code rural, art. R214-123) : il ne dit pas combien d'animaux seront effectivement utilisés, et il ne se rapporte pas à une année.
Pour cette étude nous utiliserons 440 animaux. Nous utilisons des animaux transgéniques homozygotes ce qui nous permet de nous assurer que tous les embryons de la portée ont le même génotype et peuvent donc tous être analysés, ce qui réduit le nombre de femelles gestantes à induire. Le nombre de souris utilisées a été calculé au mieux pour limiter au maximum le nombre d’animaux tout en permettant d’avoir des analyses statistiquement correctes. Pour cela nous utiliserons des tests quantitatifs de comparaison de 2 échantillons indépendants.
3. Raffinement
Note de l'OXA. Le raffinement nomme une amélioration technique de la procédure, sans dire ce qu'elle change pour l'animal qui la subit. La réglementation impose d'atténuer la douleur, dans une limite qu'elle inscrit elle-même : « pour autant que cela soit compatible avec la finalité de la procédure expérimentale » (code rural, art. R214-109). Ce qui reste de souffrance après cette limite est autorisé. Le raffinement ne porte par ailleurs que sur la procédure : les souffrances de la captivité elle-même, confinement, bruit, lumière, manipulations d'entretien, ne relèvent d'aucun des trois R.
Les souris sont placées dans des cages adaptées à leur nombre, ces cages seront enrichies par du matériel de nidification (sizzle-dri kraft). La nourriture et l’eau de boisson sont fournis ad libidum. Les cages des mâles isolés servant aux accouplements contrôlés seront enrichies en buchettes en bois. Les femelles gestantes qui auront été injectées seront observées quotidiennement selon l’évaluation des expressions faciales. Les souris pour lesquelles nous souhaitons une mise bas seront surveillées 2 fois par jour à l’approche du terme, si elle s’avère trop difficile la mère sera euthanasiée et les embryons collectés. Les prélèvements sanguins seront effectués sous anesthésie générale (comportant une valence analgésique) avant euthanasie. Le projet comportera la mise en place de points limites définis.
Expliquer le choix des espèces et les stades de développement y afférents.
Note de l'OXA. Le dossier d'autorisation demande de justifier l'origine des animaux, leur espèce, leur nombre estimé et leur stade de développement (arrêté du 1er février 2013, art. 5). La justification attendue est technique : elle porte sur l'adéquation de l'espèce à l'objectif poursuivi. Ce que l'appartenance à une espèce autorise à faire subir à un individu est une question morale, et le formulaire ne la pose pas. L'appartenance à une espèce, prise seule, ne fonde pourtant pas de différence de statut moral entre des individus également capables de souffrir.
A l’heure actuelle, il n’existe aucun système de remplacement (autre que le modèle murin) permettant de suivre comment certaines cellules de l’embryon s’organisent pour former un organe ou un système biologique chez l’adulte. Pour notre étude, il nous est nécessaire d’utiliser des souris modifiées génétiquement afin de suivre le devenir de cellules spécifiques depuis le développement de l’embryon jusqu’au stade adulte pour comprendre en détail comment les vaisseaux sanguins et le sang se mettent en place. Pour cela des femelles gestantes seront utilisées pour collecter les embryons à différents stades de développement, ce qui nous permettra d’étudier la mise en place des vaisseaux sanguins et du sang au cours du temps. Des souris jeunes adultes (6 semaines) et adultes (4mois) seront également analysées pour vérifier comment les cellules se maintiennent au cours du temps ou s’il y a un remodelage post-natal