Résumé non technique d'un projet d'expérimentation animale publié sur ALURES le 29/04/2025
("EC NTS/RA identifier" : NTS-FR-364531)
Un guide vissé sur le crâne, saillant sous la peau, sert à injecter des cellules de glioblastome humain dans le cerveau de 152 rats athymiques, opération de deux heures sous anesthésie, tandis que 38 rats au système immunitaire intact reçoivent la même greffe. Les 190 animaux sont utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère et tous tués à l’issue, la tumeur provoquant des troubles neurologiques dont la perte d’équilibre. Le porteur écrit que ce guide se trouve à un endroit que les pattes du rat ne peuvent pas atteindre, qu’aucune modification du comportement n’a été observée, et que « rien n’indique » que les séances d’imagerie hebdomadaires soient source d’inconfort. La mise à mort est fixée à trois semaines après le traitement, au motif qu’au-delà la tumeur serait trop grosse et que les animaux finiraient par en souffrir.
Objectifs et bénéfices escomptés du projet
Décrire les objectifs du projet.
Le glioblastome (GBM) est la tumeur cérébrale la plus commune et la plus agressive avec une médiane de survie de 15 mois malgré les traitements de première ligne. Certaines tumeurs sont inopérables, diminuant d’autant les perspectives thérapeutiques. La thérapie photodynamique interstitielle (iPDT) est une procédure qui permettrait de cibler et traiter ces tumeurs profondes inopérables. Le principe de cette thérapie repose sur l’activation par la lumière d’une molécule qui s’accumule préférentiellement dans les cellules cancéreuses ce qui induit leur destruction. Les études antérieures du laboratoire nous ont permis de valider la faisabilité du projet, et de mettre en évidence des limites associés à la résistance à ce traitement : la variabilité des modèles cellulaires et l’export des molécules photosensibles. Outre un effet antitumoral direct, l’iPDT peut générer une réponse immunitaire spécifique et nous souhaitons en mesurer les paramètres. Ainsi, ce projet permettra (i) de réaliser une preuve de concept préclinique de l’efficacité de l’iPDT dans le GBM, indispensable à la mise en place de futurs essais cliniques chez l’Homme ; (ii) de proposer une revue des modèles cellulaires applicables en expérimentation animale du GBM humain (non disponible à ce jour dans la littérature), (iii) ouvrir des pistes pour améliorer l’efficacité thérapeutique en combinaison aux inhibiteurs d’ABCG2, et (iv) analyser le développement de la réponse immunitaire. Ce projet sera donc bénéfique à moyen/long terme pour les patients atteints de glioblastome (santé humaine) et pour la communauté scientifique travaillant sur le sujet (recherche fondamentale).
Quels sont les bénéfices susceptibles de découler de ce projet?
Les bénéfices attendus de cette étude sont multiples. Nous pourrons évaluer de l’effet de la thérapie photodynamique (PDT) sur les modifications de structure, de forme et de fonction des tumeurs, en corrélation avec la survie des animaux. Cet aspect permettra de mieux justifier l’utilisation de la PDT interstitielle dans le traitement du glioblastome, pour la mise en place d’un premier essai clinique en France. Elle nous permettra également de mesurer l’effet combinatoire du blocage chimique/médicamenteux du transport de la molécule photosensible sur le plan de la tolérance au traitement et de la survie globale des animaux. Cet aspect permettra, en cas de résultats favorables, de mettre en place dans un deuxième temps un essai clinique utilisant ce médicament. Nous pourrons évaluer l’effet de la PDT interstitielle sur les modifications du système immunitaire. Cet aspect permettra à la communauté scientifique de mieux comprendre l’implication du système immunitaire dans le processus de guérison, et d’éventuellement associer la PDT à des thérapies favorisant une réponse du système immunitaire pour révolutionner la prise en charge de cette maladie. Cette étude nous permettra de mieux documenter l’effet de la PDT interstitielle en fonction de la composition cellulaire des glioblastomes. A l’heure actuelle, seule la lignée cellulaire humaine de glioblastome est véritablement documentée, ainsi de plus amples expérimentations permettront d’étoffer la bibliographie sur le sujet et d’aider d’autres projets sans pour autant recourir à l’expérimentation animale inutilement.
Nuisances prévues
À quelles procédures les animaux seront-ils soumis en règle générale?
Pendant 10 jours, les 190 animaux seront manipulés régulièrement pour les habituer au contact humain et réduire leur stress. Le projet se déroulera en deux phases. Dans la première, des cellules tumorales seront greffées dans le cerveau de 152 rats sans système immunitaire et de 38 rats avec système immunitaire. Cette opération, qui dure environ 2 heures, sera réalisée sous anesthésie et comprendra l’insertion d’un guide sur leur crâne pour permettre l’injection précise des cellules. Deux jours après l’implantation, une imagerie sous anesthésie générale d’une durée d’une heure sera effectuée pour vérifier la localisation et la taille de la tumeur. La seconde phase consistera à appliquer un traitement. 50 rats ne recevront pas de traitement, tandis que 140 recevront une molécule photosensible qui ira s’accumuler dans les cellules tumorales. Parmi eux, 70 auront également un médicament qui bloque la sortie de cette molécule des cellules tumorales. Cette phase de traitement dure environ deux heures. Elle est effectuée sous anesthésie générale. Une fibre optique sera placée pour activer la molécule à l’aide d’un faisceau lumineux, ce qui provoquera la mort des cellules tumorales. Les animaux seront suivis par imagerie (toujours sous anesthésie générale) chaque semaine, et du sang sera prélevé sur les rats avec système immunitaire pour suivre leur réponse au traitement. À la fin du protocole, les rats seront euthanasiés et leur cerveau sera analysé.
Quels sont les effets/effets indésirables prévus sur les animaux et la durée de ces effets?
Le protocole de greffe est une opération chirurgicale risquant d’entraîner une douleur aiguë, en particulier cutanée. Celle-ci fera l’objet d’une analgésie. La procédure de greffe passe par l’implantation d’un guide fixé au crâne pour guider l’aiguille et la fibre. Ce guide dépasse de la peau du crâne mais à un endroit que les pattes du rat ne peuvent pas atteindre, l’empêchant de se blesser, et il n’a pas été observé de modifications du comportement précédemment. Rien n’indique que le passage en imagerie soit vecteur d’inconfort ou de douleur chez le rat. La procédure est, de plus, non-invasive, et les animaux sont anesthésiés. Concernant les effets de la tumeur induite : le grossissement de la tumeur peut provoquer des troubles neurologiques, le plus visible et fréquent étant la perte d’équilibre. La désorientation manifeste ou un trouble moteur sera considéré comme le début d’un processus n’ayant pas vocation à s’améliorer après analgésie et conduira à la mise à mort de l’animal. De même, la perte de poids de plus de 15% sur une période de trois jours sera également considérée comme un point limite, ainsi que tout trouble de l’alimentation ou prostration prolongés au-delà de 24h ; et conduiront à la mise à mort de l’animal.
Justifier le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure.
Le glioblastome étant une maladie cancéreuse incurable du cerveau, tous les animaux seront euthanasiés. Cette euthanasie sera effectuée : soit 3 semaines après le traitement (au-delà, la tumeur serait trop grosse et les animaux finiraient tôt ou tard à en souffrir) soit avant, si nous apercevons des signes de souffrance qui ne peuvent pas être résolus avec des soins simples. Cette euthanasie sera effectuée sous anesthésie générale, sans douleur ni inconfort.
Application de la règle des "3R"
1. Remplacement
Les méthodes de laboratoire ont déjà été employées pour restreindre les hypothèses de travail. De nombreuses expérimentations de thérapie photodynamique (PDT) ont été faites sur les cellules cancéreuses qui seront employées dans ce projet, mais la validation expérimentale du concept de PDT interstitielle (iPDT) stéréotaxique et de son évaluation à l’imagerie implique de travailler sur le vivant. Il est en effet nécessaire de se rapprocher au maximum des conditions dans lesquelles les patients humains sont diagnostiqués et seront traités. Il est important de prendre en compte à la fois les modalités de croissance de la tumeur et son lien avec l’environnement qui la voit croître ; il n’est, à l’heure actuelle, pas possible de mimer efficacement la croissance des vaisseaux sanguins, la mort spontanée des tissus tumoraux parfois observée, l’effet sur les tissus sains environnants des différents messagers chimiques libérés par les cellules, de l’effet d’un système immunitaire sur la croissance tumorale et sa réponse à la PDT. Les différents travaux déjà menés sur modèle murin sont intéressants et confirment l’efficacité de ce traitement et la possibilité d’obtenir des informations pertinentes à l’imagerie pour évaluer la réponse. Cependant, ces données sont encore imparfaites et l’approche multimodale, avec une confrontation des informations d’imagerie est ce qu’il y a de plus performant. La PDT antitumorale est en cours d’essai sur le glioblastome chez l’homme avec des résultats prometteurs mais tout changement ou ajout au traitement doit être validé par une étude préclinique, ce qui n’est possible efficacement que sur l’animal. De plus, les études précliniques permettent d’obtenir des informations histologiques et de corréler celles-ci à ce que l’on observe en imagerie.
2. Réduction
Le nombre d’animaux à utiliser est évalué au plus juste à 190 animaux. Nous avons pu définir que selon la procédure et les attentes en termes de résultats des groupes de 8 animaux seraient suffisants pour obtenir une puissance statistique élevé. Bien qu’insuffisante, l’expérimentation en laboratoire nous a permis de réduire les hypothèses de travail et, par conséquent, le nombre de groupes d’animaux à utiliser dans ce projet, réduit à 3. Les groupes ne seront pas formés dès le départ, mais les animaux seront commandés au fur et à mesure de l’avancement du projet. Ainsi, nous éviterons de générer de nouveaux modèles animaux qui ne seraient pas nécessaires ; la marge demandée concernant le nombre d’animaux par groupe doit rester une précaution, et les personnes affectées à ce projet mettront tout en œuvre pour qu’il soit inutile de les mettre à contribution. D’autre part, s’agissant de l’emploi de cellules tumorales peu répandues dans la littérature, la réduction ne se fera pas que sur notre projet : les résultats obtenus, une fois publiés, permettront à d’autres équipes travaillant sur des sujets similaires ou dans le même domaine de mieux s’orienter sans devoir utiliser autant d’animaux qu’il aurait été nécessaire en partant de rien. Une attention particulière sera portée à la réduction du risque de mortalité pendant les procédures, notamment dans la gestion de l’anesthésie. Si, au cours des procédures expérimentales, la méthode d’anesthésie s’avère poser problème, nous nous concerterons avec le personnel impliqué pour définir la meilleure option de remplacement. Nous ajoutons que l’utilisation, à la fois de rat avec ou sans système immunitaire permet en une procédure de répondre à la fois aux questions sur l’effet des molécules bloquant le transport du médicament, mais aussi d’analyser le système immunitaire, en éliminant un maximum de biais méthodologiques.
3. Raffinement
Les animaux seront acclimatés 10 jours dans leur salle d’hébergement. Ils seront inspectés quotidiennement pour déceler tout mal-être, blessure ou dommage comportemental, dès leur arrivée à l’animalerie par les personnes participant directement aux procédures (pour habituer et sociabiliser les rats). Un enrichissement est prévu dans les cages (tubes de cartons, carrés de cellulose). Durant les procédures, les animaux seront en anesthésie gazeuse profonde et sous analgésique ; en fonction de la durée des procédures, une seconde injection d’analgésique sera effectuée avant le réveil. En cas de mauvaise tolérance du traitement ou de l’évolution tumorale, un traitement symptomatique par anti-inflammatoires permettra de diminuer efficacement la souffrance de l’animal. S’il y a lieu, les personnes devant effectuer les gestes chirurgicaux ou de prélèvements seront formés ou remis à niveau en utilisant des rats de taille similaire mais fraîchement décédés ou bien sortant d’une procédure tierce dont ils ne doivent pas se réveiller. En cas de blessure physique, des soins seront apportés par le personnel. La sensibilisation du personnel au contact des animaux reste une de nos priorités, et tout sera mis en œuvre pour que les rats soient traités avec grand soin. Des points limites ont été définis avant l’expérimentation et dans le cas où ceux-ci seraient atteints ou que le traitement analgésique n’aurait pas d’effet, les animaux seront mis à mort selon la méthode définie à distance des autres animaux. Les points limites de notre étude concernent les conséquences de la chirurgie et celle de l’évolution du volume de la tumeur dans la boite crânienne du rat. Ainsi, l’activité motrice des animaux sera suivie en pré- et post-opératoire quotidiennement en cage ; s’agissant de tumeurs cérébrales, toute perte d’équilibre ou désorientation manifestes sera considérée comme le signe d’un dommage cérébral impossible à soigner efficacement et entraînera la mise à mort de l’animal. La mesure du poids de l’animal sera réalisée quotidiennement : une perte de poids de plus de 15% par rapport au poids avant greffe s’étalant sur plus de trois jours consécutifs, entrainera la mise à mort de l’animal. L’aspect général de l’animal (aspect du poil, couleur de l’œil) ainsi que son comportement : activité d’exploration, prostration, cris… seront observés, et corrélés entre eux pourront mener à la mise à mort de l’animal.
Expliquer le choix des espèces et les stades de développement y afférents.
Le choix s’est porté sur le rat pour des questions de gabarit de l’animal : le cerveau des souris est trop petit pour être pertinent, et de plus gros animaux poseraient un problème de logistique inutile. D’aute part, le rat est bien documenté pour ce type de protocoles, en termes de bibliographie expérimentale mais aussi anatomique. Nous avons choisi des animaux athymiques, unique espèce utilisée dans le cas de xénogreffes de cellules tumorales humaines, qui sont des rats nude mâles, âgés de 8 semaines au moment des greffes. Des rats âgés de 8 semaines sont utilisés, à un stade où leur conformation crâniene correspond à celle de l’atlas de stéréotaxie employé.