Procédures légères

58 ouistitis vont être utilisés, puis réutilisés dans d'autres protocoles, dans des procédures déclarées d'un niveau de souffrance léger. Chaque primate subit une fois par an des séances d'imagerie cérébrale et cardiaque sous anesthésie et un prélèvement sanguin, pour étudier le vieillissement cardio-cérébral. Le porteur présente ces interventions comme non invasives et indique que les animaux peuvent être inclus dans plusieurs protocoles au cours de leur vie. Il justifie le recours au primate par la possibilité d'études longitudinales sur un même individu et par le "besoin" d'un organisme vivant intègre.

Objectifs

Le vieillissement est un processus multifactoriel caractérisé par des modifications physiologiques à l’origine d’un déclin fonctionnel progressif, qui peut être à l’origine de plusieurs maladies chroniques, notamment cardiovasculaires et neurodégénératives. Ces maladies altèrent la qualité de vie et en limitent la durée. L’étude des processus de vieillissement est largement réalisée sur des espèces animales non primates, mais des différences fondamentales dans le processus de vieillissement entre les non-primates et les humains ont entravé la transposition directe des résultats à l'homme. Le marmouset (ouistiti commun, Callithrix jacchus), petit primate non humain (~350 g) à la durée de vie plus courte (~10 ans), a été proposé comme un modèle de vieillissement. Ce singe partage avec l'homme des traits génétiques, physiologiques et comportementaux similaires. Il présente un déclin de la fonction cardiaque, les caractéristiques des maladies neurodégénératives et de la neuroinflammation dans le cerveau, ainsi que des altérations cognitives. Le marmouset constitue un modèle adapté aux études sur le vieillissement: durée de vie compatible avec des analyses longitudinales, accès à un nombre raisonnable d’animaux élevés dans les mêmes conditions environnementales et alimentaires. Notre projet est destiné à intégrer les résultats issus de deux approches chez le marmouset: (1) identifier les signatures protéomiques plasmatiques liées à l'âge et au sexe (2) caractériser les phénotypes cardiaques et cérébraux (phénome cardio-cérébral) liés à l'âge chez les marmousets des deux sexes, afin de déterminer la relation entre le protéome circulant et le phénome cardio-cérébral en fonction de l'âge et du sexe. Etant donné que le concept de différences entre les sexes domine dans les processus de vieillissement chez les humains, il est essential de prendre en considération les mécanismes qui régissent les différences entre le sexe et l'âge pour, à terme, détecter, prévenir, ralentir ou même inverser les phénotypes associés à l'âge. L'IRM multimodale sera utilisée pour évaluer les fonctions ventriculaires cardiaques, mesurer les flux sanguins cérébraux et la perfusion cérébrale. Nous déterminerons la contribution des changements liés à l'âge et au sexe dans les phénotypes cardio-cérébraux, d’une part en comparant différents groupes de singes (vieux vs jeunes; mâles vs femelles), d’autre part en réalisant un suivi longitudinal individuel.

Bénéfices attendus

Des simulations numériques seront développées à partir des données expérimentales anatomiques et physiologiques que nous aurons recueillies chez le marmouset. Les modèles numériques marmouset seront comparés et corrélés au modèle homme que nous avons obtenu dans le cadre d’un autre projet, afin de valider : 1. les hypothèses que nous proposons sur le rôle du système cranio-spinal dans le vieillissement cérébral, 2. la transversalité effective de ce modèle animal à l’homme. Le couplage d’approches in vivo dans le respect de l’éthique animale et d’approches in silico va permettre d’évaluer les compatibilités homme/animal et d’améliorer notre connaissance des mécanismes de maladies neurodégénératives en particulier. De plus les données de l’analyse protéomique du plasma, les images issues des différentes modalités d’imagerie IRM, obtenues à partir d’une large gamme d’âges et pour les deux sexes, chez les marmousets, représentent un vivier considérable d’informations. De plus, les données biochimiques du plasma pourront être utilisées pour différents domaines de la recherche, non limités au système cardio-vasculaire et au cérébral. Les modèles développés seront disponibles en open source pour garantir une diffusion large au sein des communautés scientifiques et médicales. Cette démarche devrait permettre de réduire le nombre d’expérimentations chez l’animal, et potentiellement d’améliorer, voire développer des protocoles cliniques testables in silico en première approche.

Procédures

Les marmousets seront soumis à deux types d’intervention, 1 fois par an: -imagerie IRM sous anesthésie: une imagerie multimodale cérébrale (IRM 3T) d’une durée de 1,5h et une imagerie multimodale cardiaque (IRM7T) d’une durée de 1,5h (procédure 1) -prélèvement sanguin sous anesthésie (veine fémorale) qui nécessite 5 à 10mn (procédure 2) Les prélèvements sanguins seront réalisés autant que faire se peut lors de l’anesthésie des animaux pour une séance d’imagerie.

Impact sur les animaux

Les procédures expérimentales mises en oeuvre (imagerie IRM et prélèvement sanguin sous anesthésie), 2 fois/an ne génèrent pas de douleur et ne causent pas de dommage à l’animal. Les marmousets seront imagés dans la mesure où ils seront aptes à entreprendre le voyage prévu et la séance d’imagerie. Leur état de santé est contrôlé : avec courbe de poids, suivi de comportement de base, surveillance des interactions entre les animaux et de leur état physique par le personnel zootechnique Animalliance en charge de l’animalerie. Les animaux vigiles ne sont jamais soumis à l'isolement et la privation hydrique est limitée au jeûne imposé avant l'anesthésie. Pendant les séances d'imagerie, l'animal est maintenu dans des conditions de température adéquates et sa fréquence respiratoire suivie avec alarmes programmées en cas d’hyper ou d’hypo ventilation. La mise à mort sera pratiquée si des animaux âgés sont en état de souffrance liée à une altération de l’état général très prononcée (procédure valable pour toute l’animalerie marmouset, indépendante de l’étude présente).

Devenir

Les deux procédures expérimentales mises en oeuvre ne génèrent pas de douleur et ne causent pas de dommage à l'animal. Elles ne sont pas invasives et les interventions sur l'animal sont peu fréqentes (2 fois/an). Ainsi au cours même de l'étude, les animaux peuvent être impliqués dans des études comportementales, si ces dernières sont réalisées à intervalles préalablement définis. A la fin de l'étude les animaux peuvent être attribués à d'autres projets.

Remplacement

L’objectif du projet scientifique consiste à chercher, au cours du vieillissement, et en fonction du sexe, des relations entre des modifications dans les flux cérébraux, l'anatomie cérébrale, les fonctions cardiaques et des marqueurs sanguins. L’approche requiert l’intégrité de l’organisme vivant qui fournira à la fois des éléments physiologiques (métabolismes cérébral et cardiaque), anatomiques (taille et forme des structures cérébrales) et biochimiques (marqueurs sanguins). De plus cette étude s’inscrit dans le temps, sur une échelle de plusieurs années au cours desquelles les mêmes animaux seront suivis. Le modèle animal est justifié par la problématique du vieillissement des organes, et de leurs interactions, ainsi que par la nécessité de mesurer des phénomènes dynamiques, tels que les flux sanguins. Le modèle marmouset s’inscrit dans la proximité phylogénétique, anatomique et physiologique avec l’humain. C’est pour l’ensemble de ces raisons que ce projet ne pourrait être réalisé in vitro ou avec un modèle animal rongeur.

Réduction

Le nombre nécessaire et suffisant d’animaux a été établi lors de la conception du protocole expérimental par une approche méthodologique/statistique. L'étude vise à pouvoir exploiter la colonie de marmousets présente au CerCo avec une stratification en fonction de l'âge (jeunes adultes vs adultes âgés) et du sexe. Pour un risque de type I de 0,05 et de type II de 0.10, une modification théorique minimale de 20% des différentes variables avec des déviations standards de 15% nécessite 13 animaux par sous-groupe d'âge (4 sous-groupes : jeunes adultes, adultes, adultes vieillissants et sujets âgés). Si l'erreur de type II est fixée à 0.2 (valeur plus couramment acceptée), 10 animaux par sous-groupe doivent être étudiés. Il faut également considérer l 'éventuelle perte d'animaux. Ainsi, ce nombre est compatible avec la colonie présente dans l'animalerie. Les 4 sous-groupes pourront être regroupés en 2 groupes d’âges (jeunes 6ans). Il faut également considérer que ces animaux, impliqués dans une analyse de type transversal, seront intégrés dans une étude longitudinale, avec une exploration annuelle par imagerie et analyse du protéome sanguin. Les procédures n'étant pas ou peu invasives (prélèvement sanguin sous anesthésie) et à la fréquence d’une fois par an, les marmousets de l'étude pourraient être impliqués en parallèle dans d'autres études non invasives, telles que des études comportementales menées au laboratoire par d’autres chercheurs, dans le respect d’un planning partagé adéquat. De plus à la fin du projet, les animaux pourront être attribués à d'autres études. Les mêmes marmousets contribuent à plusieurs approches : imagerie avec plusieurs séquences d'imagerie et des prélèvements biologiques. Les résultats obtenus à partir des différentes procédures seront analysés séparément mais également fusionnés. Des corrélations seront recherchées entre le phénotype cardio-vasculaire et le protéome sanguin au sein des différents groupes d’âge, en fonction du sexe, afin de mieux comprendre les mécanismes physiopathologiques et neurodégénératifs liés à l’âge, et de l’interaction âge/sexe. En complément de l’analyse catégorielle, la méthode sera étendue à un modèle linéaire généralisé, qui permettra une définition plus fine des variations liées l’âge. Il sera ainsi possible de détecter des âges auxquels des modifications liées au vieillissement normal ou pathologique sont attendues, sans nécessiter une approche expérimentale supplémentaire.

Raffinement

Les interventions sur l’animal sont réduites au minimum (anesthésie), toutes les approches d’imagerie étant non invasives. Les animaux vivent en contact (au moins visuel, olfactif et auditif) avec l’ensemble des congénères de la même pièce. Les durées de séparation (contact physique) avec les congénères de la même cage/volière sont limitées. Les procédures ne génèrent pas d’isolement social ni de douleur. Les déplacements des marmousets entre l’animalerie et les machines IRM sont réalisés avec des animaux anesthésiés (Alfaxan, 0.25ml) pour limiter le stress. Les privations alimentaires et hydriques ne sont appliquées qu’en prévision d’une anesthésie. Les anesthésies (isoflurane ~2% dans O2) sont surveillées (monitoring de la respiration et du rythme cardiaque). Lors des séances IRM, le dispositif dans lequel les animaux anesthésiés sont installés est maintenu à la température de 27.5°C. Le suivi sanitaire des animaux est assuré par le personnel zootechnique : courbe de poids, surveillance de comportement de base et des interactions entre les animaux et de leur état physique. Une vétérinaire peut également être amenée à intervenir si un examen clinique est nécessaire, et décider du maintien de l’animal dans l’étude. En cas de blessures, le traitement consistera en des injections d'antibiotique (Clamoxyl 0.1ml/kg)par animal pendat 5 à 7 j) et d’anti-inflammatoire (Dexadreson ou Diurizone, 0,05 ml/kg soit environ 0,015 ml/animal), qui seront complétées par l’application de pommades antibiotiques (Duphader, Predniderm, Fucidine). Des injections d’un antibiotiqueadapté (metronidazole) et d’antispasmodique (Estocélan 0,1ml/kg soit environ 0,03ml/animal) seront faites aux animaux présentant des problèmes gastriques. En cas de diarrhées, du phosphaluvet est donné (1ml/kg soit environ 0,3ml par animal) sur quelques jours. Un dispositif de protection destiné à réduire le dommage auditif lié au fonctionnement de l’IRM (procédure expérimentale 1) est à l’étude (‘mini-casque’ ou bouchon d’oreilles).

Choix des espèces

Dans le cadre de l’analyse des processus de vieillissement, le marmouset Callithrix jacchus offre la possibilité de réaliser des études longitudinales sur un même animal sur une échelle de temps bien plus courte que chez l’homme (en étant de plus inclus dans plusieurs protocoles d’imagerie). Ce modèle présente l’avantage, en regard d’autres modèles (rongeurs « humanisés », microcèbe), d’une proximité phylogénétique avec l'homme. D'autres travaux au laboratoire s'intéressent aux aptitudes cognitives de ces singes en fonction de l'âge). Ainsi il est possible sur ce modèle de mener des travaux qui permettront d’analyser l’évolution des interactions entre différents biomarqueurs cérébraux, vasculaires, cardiaques et sanguins en corrélation avec les aptitudes cognitives. Une étude comparable en terme de nombre d’animaux, d’espace et de durée de projet relative à la longévité de l’espèce ne peut être envisagée, en conditions de laboratoire, chez le macaque, modèle PNH classique. L'analyse est destinée à définir in fine des marqueurs précoces du vieillissement du système cardio-cérébral. La gamme d’âges devra être suffisamment étendue. Les marmousets inclus dans les études seront des adultes, à partir du stage jeune adulte jusqu'au stade gériatrique. La cohorte participant aux études sera dichotomisée d’une part en adultes jeunes entre 2,5 et 6 ans, et d’autre part en adultes vieillissants et âgés au-delà de 6 ans, puis stratifiée en 4 sous-groupes d’individus: jeunes adultes (2,5-4 ans), adultes (4-6 ans), adultes vieillissants (6-9 ans) et sujets âgés (>9 ans) si la composition de la colonie (âge, sexe, effectif/classe d’âge) de marmousets le permet.

275 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures déclarées d'un niveau de souffrance léger. Chaque animal subit jusqu'à cinq injections sous-cutanées, un prélèvement sanguin et des tests comportementaux nommés, mesure des vocalisations, test d'enfouissement et test des trois chambres, dans un modèle d'autisme induit par activation immunitaire de la mère pendant la gestation. Les souris sont ensuite tuées par dislocation cervicale pour prélever le sang et les organes. Le porteur juge "nécessaire" d'étudier le comportement sur l'animal, les modèles cellulaires ne venant selon lui qu'après la caractérisation comportementale.

Objectifs

Les troubles du spectre autistique (TSA) touchent une personne sur 100. Il s’agit d’un trouble neuro-développemental caractérisé par des anomalies de la communication sociale ainsi que des comportements stéréotypés et des intérêts restreints. Cependant, derrière cette définition générale se trouve un spectre clinique large et hétérogène. Récemment, la piste d’une activation du système immunitaire de la mère durant la grossesse (MIA) a été suspectée par des études épidémiologiques puis confirmée par des modèles animaux. Grâce à une collaboration étroite entre psychiatres et immunologistes, des données cliniques combinées avec des modèles animaux, nous permettrons de mieux comprendre les toubles autistiques des patients. En effet, dans notre projet, nous allons développer des modèles murins d’autisme liés à une MIA afin de mieux comprendre et de caractériser expérimentalement les conséquences de ces modifications neuro-immunologiques in vitro et in vivo. Nous examinerons également le comportement de ces modèles animaux. Nous explorerons donc, sous des angles très divers, les relations entre immunologie et susceptibilité aux troubles du spectre autistique.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus sont multiples: 1- Permettre une meilleure compréhension des mécanismes pathologiques en lien avec l'immunité dans le champ de l'autisme 2- Identifier des sous-groupes homogènes de patients à l'aide de biomarqueurs diagnostiques 3- Développer une prise en charge thérapeutique spécifique pour ces patients

Procédures

Les animaux seront soumis à: 1- des analyses comportementales (vocalisation (5 minutes), test d'enfouissement (20 minutes), test des 3 chambres (20 minutes). Chaque animal ne sera soumis à chaque test qu'une seule fois. 2- une injection sous-cutanée de produits pharmaceutiques non iatrogènes, répétée au maximum 5 fois et un prélèvement sanguin qui ne sera réalisé qu'une seule fois.

Impact sur les animaux

Dans notre projet, les animaux subissent soit des injections sous-cutanées et un prélévement sanguin, soit des tests comportementaux. Dans le cas des injections sous-cutanées et du prélévement sanguin, une attention particulière sera portée à la surveillance des potentielles infections et/ou signes d'inflammation au niveau des sites d'injection. Par expérience, nous savons que les produits utilisés dans notre projet sur les groupes d'animaux ne présentent aucun effet dommageable sur les souris. Pour réduire au maximum les effets indésirables de nos procédures sur les animaux, les manipulations seront réalisées par du personnel expérimenté et compétent. Cela permettra de diminuer la douleur mais aussi le stress généré aux animaux. Enfin un suivi quotidien des animaux sera réalisé afin de veiller au bon état de santé de ces derniers. L'application de la surveillance des points limites décrits dans chaque procédure sera utilisée pour détecter au plus vite le moindre problème chez les animaux.

Devenir

Euthanasie par dislocation cervicale afin de récuperer le sang et les organes et de réaliser des analyses immunologiques.

Remplacement

Les marqueurs de l’autisme sont comportementaux (anomalies de la communication sociale et comportements stéréotypés). Il est donc nécessaire d’étudier le comportement des modèles afin d’identifier clairement les mécanismes liés aux MIA (activation du système immunitaire de la mère durant la grossesse). Les modèles cellulaires ne pourront être utilisés qu’une fois que les anomalies comportementales auront été caractérisées chez les modèles murins. Par ailleurs, aucun modèle alternatif et aucune approche in vitro satisfaisante n’existe et ne peut être utilisé pour répondre aux questions posées. Seul le modèle animal permet d’évaluer l’efficacité́ des approches thérapeutiques. Nous avons choisi d’utiliser un modèle murin, qui permet de répondre aux questions scientifiques posées et pour lequel nous avons toute l’expertise et les outils nécessaires.

Réduction

Afin de réduire au maximum le nombre d'animaux utilisés, nous avons calculé le nombre nécessaire en fonction de la puissance nécessaire. Afin de palier à la variabilité inhérente aux tests comportementaux (vocalisation, test d'enfouissement, 3 chambres), il est nécessaire de tester 15 souris par groupe pour obtenir des résulats robustes, dans le respect de la règle des 3R. Pour comparer les différents groupes et utilisant 15 souris par groupes, nous utiliserons donc des tests statistiques adaptés limitant le nombre d'individus.

Raffinement

Les animaux seront stabulés en portoirs ventilés avec un système d'abreuvement automatique et accès illimté à la nourriture. Les conditions de température et d'hygrométrie seront controlées et stables. Le cycle d'éclairage sera de 12h/jour. Les animaux seront hebergés ensemble et l'isolement sera limité aux conditions expérimentales décrites. Dans le cas d'isolement, un enrichissement avec du coton et un maison en carton sera apporté et le temps d'isolement sera limité au maximum. Les animaux seront surveillés quotidiennement et un soin particulier sera apporté à la surveillance des points limites des souris isolées (comportements répétitifs, automutilation, perturbation de l'activité motrice).

Choix des espèces

La souris est un modèle important en immunologie et particulièrement dans les modèles de pathologies psychiatriques tels que l'autisme. En effet, la souris est un animal spontannément social et ses comportements normaux commencent à être de mieux en mieux connus, La souris a donc été choisie car elle permet d'analyser les symptômes cores de l'autisme c'est-à-dire (i) les anomalies précoces de la communication par l’évaluation des vocalisations ultrasoniques dès 7 jours de vie, (ii) les comportements répétitifs par le test d'enfouissement et (iii) la perte d'appétence sociale par le tests des 3 chambres. Ces deux dernières évaluations seront réalisées sur des souris adultes entre 7 et 9 semaines de vie.

216 animaux, 108 chats et 108 chiens, vont être utilisés dans des procédures déclarées d'un niveau de souffrance léger, puis réutilisés dans d'autres protocoles. Chaque animal subit trois anesthésies à un mois d'intervalle pour quantifier la plaque dentaire et évaluer l'effet d'un aliment sur le tartre, dans une démarche de recherche et développement de l'industrie de l'alimentation animale. Le porteur indique que les animaux seront réutilisés dans des protocoles d'appétence et de digestibilité. Il affirme qu'aucune autre étude ne peut servir d'alternative au protocole en place.

Objectifs

Pour évaluer l’efficacité d’un aliment sur le développement de la plaque dentaire et du tartre chez le chat et le chien, il est nécessaire de procéder à des évaluations : -Capacité du produit à induire un croquage et à brosser la surface dentaire, -Evaluation des formes, tailles et textures des aliments (secs ou humides) sur le comportement masticatoire (préhension, mastication et déglutition), -Evaluation des formes, tailles et textures des compléments alimentaires (barres à mâcher ou récompenses) sur le comportement masticatoire (préhension, mastication et déglutition). -Quantification de la plaque dentaire sur chien et chat sous anesthésie.

Bénéfices attendus

La validation des produits développés avant mise sur le marché et diffusion à grande échelle (réseau élevage, réseau clinique, magasins spécialisés), -La reformulation de ces produits pour améliorer leur efficacité sur la plaque dentaire et sur le tartre et garantir une meilleure santé bucco-dentaire aux chats et aux chiens, -La mise en place de protocoles de recherches pour trouver de nouvelles solutions nutritionnelles limitant le développement de la maladie parodontale, -La justification scientifique des claims dentaires apposés sur les packagings, -La création d’un certain nombre de documents pour l’interne et à destination des différentes filiales.

Procédures

3 anesthésies seront réalisées avec 1 mois d’intervalle.

Impact sur les animaux

Les animaux seront sous anesthésie. L'anesthésie et l'utilization de analsésiques réduiront la douleur et la souffrance de l'animal. Les animaux ne souffriront pas pendant ce protocole et pourront se réveiller de manière contrôlée et sûre. Le risque d'anesthésie sera minimisé grâce à un schéma thérapeutique adéquat ainsi qu'à une surveillance constante de la fréquence cardiaque, de la fréquence respiratoire et d'aures signes vitaux par une équipe vétérinaire expérimentée et formée.

Devenir

Les animaux seront reutilisés dans autres protocoles appetance, Digestibilité RSS.

Remplacement

Le protocole et les procédures utilisés sont conformes aux standards AAFCO et suivent le processus normal d’évaluation des projets R&D. De plus, aucune autre étude ne peut être utilisée comme alternative à celle actuellement en place.

Réduction

Le projet prévoit 8 à 10 animaux validés à la fin de l’étude avec une possibilité d’exclusion de 2 individus maximum. Aucune douleur, ni souffrance mentale ou physique n’est causée aux animaux au cours de ces tests. Et une attention permanente est portée à chaque animal durant la journée, leur lieu de vie étant à côté de celui des animaliers.

Raffinement

La douleur chez l'animal sera limitée par l'utilisation adéquate d'analgésiques pendant et aprés les tests, ainsi que d'une anesthésie volatile fournie avec de l'oxygène qui permettra de réaliser le protocole en toute sécurité et sans souffrance physique ou mentale pour l'animal. Et une attention permanente est portée à chaque animal durant la journée, leur lieu de vie étant à côté de celui des animaliers. Conditions d’hébergement des chats: Les chats vivent par groupes de 12 au maximum, dans des pièces collectives conformes à la réglementation en vigueur : propres, sécuritaires, éclairées par la lumière du jour et suffisamment grandes pour dissocier les zones d’alimentation, des zones de défécation/miction, ainsi que des zones de jeux. Une litière, changée quotidiennement, est à disposition des animaux et les pièces sont nettoyées tous les jours. Du matériel permettant aux chats de se cacher, des coussins, des perchoirs et des griffoirs sont installés dans chaque pièce. Enfin, des passages réguliers sont opérés par les animaliers en charge des animaux. De plus, chaque animal sort régulièrement de sa pièce et se promène dans les parcs extérieurs (minimum 25 minutes par jour). Conditions d’hébergement des chiens: Les petits chiens vivent par groupes de 8, dans des pièces collectives conformes à la réglementation en vigueur : propres (nettoyage quotidien), sécuritaires, éclairées par la lumière du jour et suffisamment grandes. Ces pièces comprennent une partie intérieure et extérieure. De plus, chaque animal sort régulièrement de son box et se promène au sein des animaliers ou dans les parcs extérieurs (minimum 4 heures). Les moyens et grands chiens vivent en box individuels conformes à la réglementation en vigueur : propres (nettoyage quotidien), sécuritaires, éclairés par la lumière du jour et suffisamment grands. Chaque box comprend une partie intérieure et extérieure, et communique avec un box voisin où vit également un chien, pour favoriser la sociabilisation. De plus, chaque animal sort quotidiennement dans les parcs extérieurs (minimum 4 heures).

Choix des espèces

Chaque espèce animale possède ses propres caractéristiques dentaires et dans le cas du chien, il existe de grandes variations de morphologies bucco-dentaires. Il est donc important d’utiliser les espèces auxquelles les aliments sont destinés. De plus, il n’existe pas à ce jour de modèle qui puisse approcher la digestion, l’absorption et la métabolisation d’un aliment complet ou complément alimentaire chez ces espèces. Il faut donc passer par des essais in vivo au cours desquels les chats et chiens reçoivent la formulation de l’aliment à évaluer. Enfin, des études in vitro n’apporteraient aucune information pertinente. Chats et chiens femelles et mâles âgés de 2 mois à 8 ans.

346 oiseaux, 208 poules et 138 cailles, vont être utilisés dans des procédures déclarées d'un niveau de souffrance léger. Les interventions se limitent à des collectes de semence et des inséminations, mais les mâles sont maintenus en cage individuelle en raison de leur agressivité, pour une étude sur la cryoconservation du sperme aviaire au service de la filière volaille et de la biodiversité. Le porteur indique que les animaux sont gardés vivants puis proposés à d'autres expérimentations à la fin du projet. Il affirme qu'aucune alternative in vitro n'existe pour produire des spermatozoïdes fécondants chez ces espèces.

Objectifs

A l’échelle mondiale, le maintien de la diversité génétique des espèces animales est un enjeu majeur, notamment pour les espèces de rente comme les volailles représentant la première source de protéines animales pour l’alimentation humaine. Actuellement, la sélection des races basées sur des critères de croissance s’accompagne d’une réduction majeure de la diversité génétique. La conservation des ressources génétiques est donc cruciale pour protéger la biodiversité, restaurer des espèces ou races menacées et contrer les épidémies ou les accidents de reproduction. De nos jours, la cryoconservation des spermatozoïdes est l'approche la plus répandue car elle se base sur la collecte de grandes quantités de cellules, le respect du bien-être animal (prélèvement non-invasif) et la possibilité d’un stockage long. Cependant chez les espèces aviaires, ces protocoles sont longs et fastidieux, dépendants de la fertilité des animaux, ainsi que des espèces et races considérées. De plus, les taux de fertilité après décongélation sont plus faibles que ceux obtenus avec de la semence fraiche. Des optimisations sont donc encore nécessaires afin de tendre vers un protocole applicable à toutes les espèces et races aviaires, notamment celles présentant une faible fertilité des mâles. L’amélioration de ces protocoles passe nécessairement par la compréhension des mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués dans les capacités fécondantes des spermazotoïdes. Ces mécanismes connus, il est alors possible d’identifier des leviers d’amélioration de la conservation de la semence aviaire. Ainsi, les objectifs de ce projet sont multiples. Tout d’abord, nous souhaitons mieux comprendre les mécanismes moléculaires sous-jacents à la fécondance d’un spermatozoïde, dans deux espèces aviaires d’interêts agronomique et scientifique, la caille et la poule, en comparant de façon individuelle la qualité des spermatozoïdes d'animaux de haute fertilité à ceux d'animaux de basse fertilité. Ces données nous permettrons dans un second temps d'améliorer les protocoles déjà existants de cryoconservation de la semence pour les espèces et races domestiques françaises. Ce projet, finance par le CRB anim (ANR-11-INBS-0003), a débuté en 2016 et se finit fin juin 2022, sous la DAP APAFIS#4026-2016021015509521 qui se termine en février 2022. La présente DAP a pour objet de poursuivre les expérimentations déjà débutées (animaux déjà présents) sur la période de février à juin 2022.

Bénéfices attendus

Les protocoles de cryoconservation de la semence aviaire actuellement disponibles présentent certaines failles. En effet, seuls les individus ayant une bonne fertilité au départ présentent une bonne capacité de cryoconservation avec une bonne fertilité observable après décongélation. Il est donc nécessaire de mieux comprendre les mécanismes moléculaires impliqués dans la fécondance du spermatozoïde aviaire, en comparant des animaux présentant un haut et un faible taux de fertilité, pour identifier des leviers d'amélioration de la cryoconservation de la semence aviaire. De plus, le protocole actuellement le plus répandu utilise comme cryoprotectant (agent de protection des cellules contre les dommages de la congélation), le glycérol. Or cette substance est associée à une forte réduction de la fertilité des animaux lorsqu'elle subsiste dans les échantillons de semence inséminés. Aujourd’hui, il est donc nécessaire de supprimer le glycérol par des moyens longs et complexes. Nous avons pour objetif de développer de nouvelles approches pour retirer cette substance, reposant notamment sur un gel colloïdal. Enfin, sur la base de nos données obtenues chez la poule, nous travaillons également à l’élaboration d’un protocole de cryoconservation de la semence de caille, procédure jusqu’à présent non décrite.

Procédures

Les seules interventions prévues sont la collecte de semence chez les mâles et les inséminations des femelles. Ces deux interventions sont non invasives et couramment menées en élevage. La seule procédure est l'hébergement des mâles en cage individuelle (entre 30 et 60 semaines d'âge) car les mâles sexuellement matures sont agressifs les uns envers les autres et il est impossible de les mettre avec les femelles pour éviter les inséminations non contrôlées. L’hergement en cage individuelle est donc la seule solution pour éviter les accidents d’élevage (agressivité) et certifier la justesse des données (insémination des femelles non contrôlées).

Impact sur les animaux

Le prélèvement de semence est un acte non invasif chez les espèces caille et poule. Cependant, afin de limiter le stress lié à la manipulation, seuls trois prélèvements seront effectués par semaine. Les inséminations artificielles sont des procédures classiquement développées en élevage sans stress pour les animaux. Nous limitons cependant le nombre d’insémination à cinq par mois afin de limiter tout stress lié à la manipulation excessive des individus. L’hébergement des mâles en cage individuelle (nécessaire car les mâles sexuellement matures sont agressifs les uns envers les autres) mais également la présence de différents individus dans les cages des femelles (mise en place de hiérarchie) peuvent être source d’inconfort et de stress. En cas d’arrêt de ponte, d’un mâle ne donnant plus de semence, de diarrhée, de prostration, de l’absence de chant ou de caquètement, ou de tout autre signe de maladie même bénigne, l’intervention d’un vétérinaire est prévue. Après traitement, la décision que l’animal réintègre ou non l’expérimentation se fera en fonction de son état de santé.

Devenir

Les animaux sont maintenus en vie tout au long du projet. Les animaux seront proposés pour d'autres expérimentations à la fin du projet auprès de l'unité expérimentale.

Remplacement

Ce projet concerne la reproduction d’espèces aviaires. A l’heure actuelle, aucune alternative in vitro n’existe pour la production de spermatozïdes fécondants ou de fécondation in vitro chez ces espèces.

Réduction

Nous travaillons actuellement sur 48 coqs et 66 cailles mâles. D’après notre expérience, ces chiffres nous permettent de constituer des groupes de mâles de faible fertilité entre 5 et 10 individus, permettant des analyses statistiques concluantes sur les taux de fertilité (évalués sur les nombres d’œufs fertilisés par chi2). Pour déterminer précisement la fertilité d’un mâle, l’insémination de 8 ou de 4 femelles par mâle pour respectivement les espèces poule et caille est généralement préconisée. Afin de limiter le nombre d’animaux, nous n’étudions pas la fertilité de tous les mâles en même temps. En effet, nous effectuons plusieurs campagnes d'analyse de la fertilité (4 pour les cailles et 3 pour les poules) durant lesquelles la fertilité individuelle de maximum 18 mâles cailles et 20 coqs est étudiée sur respectivement 72 et de 160 femelles. La fertilité des individus se maintenant généralement dans le temps, les groupes ainsi identifiés de bons et mauvais reproducteurs peuvent ainsi être constitués pour l’ensemble du protocole. Ainsi, ce projet concerne 48 coqs et 160 poules (soit 208 poules) mais également 66 cailles mâles et 72 cailles femelles (soit 138 cailles), soit 346 animaux au total. L'analyse de la fertilité des mâles actuellement en expérimentation (APAFIS#4026-2016021015509521 ) est aujourd'hui en cours.

Raffinement

Aucune douleur particulière n'est attentue avec ce protocole. De plus, les mâles sont entrainés au moins deux fois par semaine au prélèvement de semence par massage dorsal depuis l’âge de 30 semaines afin de limiter tout stress lié à la manipulation. Cependant, tout signe de stress accru notamment lié aux manipulations répétitives est fortement surveillé. En cas d’arrêt de ponte, d’un mâle ne donnant plus de semence, de diarrhée, de prostration, de l’absence de chant ou de caquètement, ou de tout autre signe de maladie même bénigne, l’intervention d’un vétérinaire est prévue. Après traitement, la décision que l’animal réintègre ou non l’expérimentation se fera en fonction de son état de santé.

Choix des espèces

La caille et la poule sont deux espèces à fort interêt agronomique mais également des espèces modèles pour les autres espèces aviaires. En effet, la cryoconservation de la semence de ces deux espèces est un enjeu important pour la filière volaille (maintien des lignées/races à fort potentiel) mais les protocoles développés pour ces deux espèces serviront également de base pour la cryoconservation de la semence d'autres espèces aviaires. Les animaux doivent être matures sexuellement afin d’étudier leur reproduction, soit entre 30 et 60 semaines d’âge.

1 400 rats et 350 souris vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Dans le cadre de prestations réglementaires pour des laboratoires, ils reçoivent des substances dont l'innocuité est en cours d'étude, subissent des prélèvements sanguins répétés, puis sont mis à mort pour prélever moelle osseuse et côlon en vue de tests de génotoxicité. Le porteur déclare des impacts "néant" et présente ces tests comme un préalable prédictif d'une activité cancérogène avant des études plus longues. Le choix des rongeurs est renvoyé aux lignes directrices de l'OCDE.

Objectifs

Dans le cadre de ses activités de prestation, le laboratoire de toxicologie réalise des tests de toxicologie sous Bonnes Pratiques de Laboratoire pour le compte de laboratoires pharmaceutiques, chimiques… Ces études sont réalisées dans le cadre de l’évaluation du risque toxicologique des substances. Les résultats sont destinés à compléter les dossiers de demande d’autorisation.

Bénéfices attendus

Ces études sont réalisées dans le cadre de l’évaluation du risque toxicologique des substances. Les résultats sont destinés à compléter les dossiers de demande d’autorisation.

Procédures

Le prélèvement des hématies et réticulocytes circulants est réalisé avant tout traitement (taux basal) puis 28 et/ou 45 jours après le dernier traitement au niveau de la veine caudale ou au sinus retro-orbital après anesthésie à l’isoflurane. Jusque 100 μL de sang sont prélevés à chaque prélèvement

Impact sur les animaux

Néant

Devenir

Animaux mis à mort en fin de traitmeent pour le prélèvement des organes d'intérêt tets du micronoyau au niveau de la moelle ossseuse et du colon ou test des comètes. Animaux traités par un produit dont l'inocuité est en cours d'étude

Remplacement

Génération de données sur le produit à étudier avant d’entreprendre des études de toxicologie (plus longues et nécessitants plus d’animaux) obligatoires, les tests de génotoxicité étant des tests à court-terme prédictifs d’une activité cancérogène. Peuvent-être intégrés dans les dossiers de demande d’autorisation à fournir aux autorités d’enregistrement. Peuvent-être utilisés dans le cadre d’activité de recherche.

Réduction

Les tests peuvent être coiplés entre eux afin d'étudier plusieurs end-points à la fois (mutation géniques, chromosomiques et lésions primaires de l'ADN), sur les même animaux, et ce afin de réduite le nombre d'animaux utilisés

Raffinement

Les animaux montrant des signes de souffrances liéesà l'action du produit à étudier sont mis à mort.

Choix des espèces

Le Test du micronoyau et le test des comètes ont une ligne directrice OCDE (respectivement, 474 et 489) chez le rongeur. Le test de mutation au niveau du gène Pig-A n’a pas de ligne directrice finalisée de l'OCDE, mais un SPSF (standard project submisson form) est en cours. Le test du micronoyau au niveau du colon n'a pas de ligne directrice, mais il suit la publication de Vanhauwaert et al. 2001. 5-7 semaines selon les recommandations de l'OCDE 474 et 489

160 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Porteuses d'une mutation reproduisant la sclérose latérale amyotrophique, elles sont suivies par IRM et spectroscopie sous anesthésie à différents stades de la maladie, puis mises à mort par inhalation de CO2 pour prélever cerveau et moelle épinière. Le porteur qualifie l'imagerie de "totalement non invasive et atraumatique" et affirme qu'aucun modèle in vitro ou informatique ne peut remplacer l'animal entier. Le modèle est décrit comme un phénotype dommageable encore peu caractérisé, dont ce projet vise surtout la description.

Objectifs

La sclérose latérale amyotrophique (SLA) ou maladie de Charcot est une maladie neurodégénérative fréquente, dont la prévalence est de 4 à 6/100 000. Elle est caractérisée par la mort progressive et sélective des motoneurones dans le cerveau et la moelle épinière, ce qui provoque une paralysie fatale. L’évolution naturelle aboutit au décès, avec une médiane de survie de 40 mois. Il a été mis en évidence une agrégation anormale de la protéine TDP-43, dans certaines régions du système nerveux central ainsi qu’une mutation du gène codant pour cette protéine. Il existe un modèle transgénique de souris TDP-43-A315T qui possède une mutation du gène codant pour la protéine TDP43. Par contre, ce modèle est très peu caractérisé à ce jour. Il s’agit d’un modèle à phénotype dommageable.Le but de ce projet est de caractériser le modèle de façon non invasive in vivo par Imagerie par Résonance Magnétique (IRM) et Spectroscopie par Résonance Magnétique (SRM) tout au long du développement de la pathologie. L’IRM (Imagerie par Résonance Magnétique) et la SRM (Spectroscopie par Résonance Magnétique) sont deux techniques d’imagerie et de spectroscopie particulièrement adaptées à l’étude du cerveau et de la moelle épinière. L’imagerie va fournir des images qui peuvent être analysées pour en extraire des paramètres tissulaires ou morphologiques, et la SRM fournit des spectres permettant de quantifier plusieurs métabolites cérébraux (choline, créatine, NAA, inositol, glutamate, glutamine).

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus sont une meilleur compréhension du développement de la pathologie pour laquelle il n'existe pas de médicament mise à part les antidouleurs

Procédures

Les séquences d'IRM et de SRM sont d'une durée maximale de 2h et seront réalisées 1 fois. pour chaque stade

Impact sur les animaux

les séances d'imagerie IRM sont totalement non invasives et atruamatiques. Le seules "nuisances" possibles sont celles liées à la piqure d'aiguille lors de l'injection de l'agent de contraste. L'agent de contraste dotarem est celui utilisé en routine clinique donc sans effet secondaire

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à chaque stade après les acquisitions IRM et SRM par inhalation de CO2. Le cerveau ainsi que la moelle épinière seront prélevés.

Remplacement

La compréhension du modèle chez l'animal est indispensable avant de pouvoir envisager de passer chez l'Homme. Les mammifères sont des animaux proches de l’Homme au niveau du fonctionnement de l'organisme. Aucun modèle expérimental in vitro ou aucune modélisation informatique n’est à même de remplacer l’animal entier pour étudier la mise en place de la SLA.

Réduction

le nombre d’animaux utilisé sera réduit au minimum nécessaire pour obtenir des résultats statistiquement pertinents et reproductibles.

Raffinement

Raffinement: Les animaux seront suivis quotidiennement. Ils sont anesthésiés pour les actes IRM et SRM qui sont deux techniques d’imagerie non invasives. Les animaux seront hébergés 5 par cage et en portoir ventilé. Un enrichissement est mis en place avec des tubes, du côté et des petites maisonnettes en plastique.

Choix des espèces

Cette étude sera réalisée sur des souris mutantes TDP-43-A315T Les souris auront entre 2 et 3 mois, les premiers symptômes de la maladie apparaissant vers 3-4 mois