Procédures sans réveil

512 souris vont être utilisées dans une procédure menée sous anesthésie, les souris étant tuées avant tout réveil. Le porteur mesure la libération de dopamine dans leur cerveau par microdialyse intracérébrale pendant environ quatre heures, après administration de THC, pour étudier le rôle d'un stéroïde dans les effets du cannabis. Il indique que les seuls effets possibles tiennent à l'anesthésie, maintenue jusqu'à la mort. Il affirme qu'aucune modélisation ne rend compte de cette complexité et juge "nécessaire" un modèle mammifère proche de l'homme.

Objectifs

Le but de notre projet de recherche est de mieux comprendre le rôle physiologique du stéroïde pregnénolone (PREG) dans la régulation CB1 impliquées dans les effets du cannabis. Notre stratégie est d'utiliser des souris génétiquement modifiées (CB1-E134G) dans lesquelles le site de liaison de la PREG a été perturbé. Le projet a pour but de mesurer la libération de dopamine dans le cerveau des souris « Knock-in » CB1-E134G en comparaison de souris exprimant un récepteur non muté (Wild-type, WT). Ces mesures de dopamine seront réalisées de base et en réponse à différents traitements pharmacologiques associé au THC (composé psychoactif du cannabis) dans différentes régions cérébrales. Plus particulièrement, la dopamine sera dosée par microdialyse intracérébrale couplée à la chromatographie à haute performance en phase liquide à détection ampérométrique, chez la souris anesthésiée.

Bénéfices attendus

Ce projet peut avoir comme bénéfices de mettre à jour les mécanismes cérébraux impliqués dans la régulation endogène mise en jeu dans les effets addictifs et toxiques du cannabis chez l’homme.

Procédures

Une seule procédure est utilisée dans ce projet. Cette procédure sans réveil se fera sous anesthésie générale. Cette intervention durera environ 4 heures.

Impact sur les animaux

La procédure entraînera peu d’effets indésirables pour l’animal. Les seuls effets indésirables possibles pourraient survenir à l’induction de l’anesthésie, voire durant le maintien de celle-ci (au maximum pendant une durée de 4h).

Devenir

A la fin de la procédure 1, la mise à mort sera faite par une personne habilitée par injection létale de pentobarbital sodique (Exagon, 300mg/kg) et de lidocaïne (Lurocaïne 30mg/kg) (volume d’injection 10ml/kg).

Remplacement

Les études in vivo sont nécessaires pour la compréhension de la physiologie et pour le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques. Notamment, l’utilisation d’animaux est nécessaire pour étudier la physiopathologie in situ de systèmes endogènes (l’action de la pregnénolone sur CB1) comprenant l’ensemble de leurs régulateurs et de leurs effecteurs. La complexité des mécanismes étudiés (l’étude des modifications de l’activité des neurotransmetteurs) ne permet pas de travailler uniquement sur des cellules et aucune modélisation mathématique ne peut rendre compte à ce jour de cette complexité. Aussi, l’espèce sélectionnée doit avoir une physiologie et un métabolisme le plus similaire possible à celui de l’homme. Ces raisons justifient l’emploi d’un modèle mammifère.

Réduction

Sur la base d’études préalablement réalisées au sein du laboratoire, nous utiliserons 16 animaux par groupe (8 mâles et 8 femelles), ce qui permettra de pouvoir réaliser des analyses statistiques cohérentes

Raffinement

Les procédures expérimentales seront développées de façon à réduire au maximum l’inconfort des animaux. Les souris seront hébergées dans une pièce dédiée, sous environnement contrôlé, et seront sous la prise en charge de personnes formées et compétentes. Les souris seront hébergées en cage collective, et seront mises en cage individuelle seulement pour les procédures qui nécessitent ce type d’hébergement. Les cages seront transparentes, et rapprochées les unes des autres permettant de maintenir des contacts visuels et olfactifs avec les congénères et un enrichissement permettra de réduire l’ennui et le stress. Dans le cadre du suivi du bien-être des animaux, il y aura une observation accrue des animaux et si nécessaire, une modification du protocole adaptée à l’état de l’animal sera mise en place.

Choix des espèces

La souris est une espèce classiquement utilisées en neuropharmacologie expérimentale pour les études biochimiques et comportementales du mécanisme d’action des médicaments psychotropes et des substances susceptibles d’appartenir à cette catégorie. De plus, l’organisation du cerveau de cette espèce est très proche de celle du cerveau humain, et une littérature extensive et croissante permet une bonne planification des expériences. En particulier, la souris permet une modélisation par délétion génique (souris transgéniques), et une étude approfondie des facteurs impliqués dans la physiopathologie des affections neuropsychiatriques citées précédemment. Les expériences seront réalisées sur des animaux jeunes-adultes (entre 2 et 5 mois de vie).

120 porcs vont être utilisés dans des procédures chirurgicales menées sous anesthésie, les animaux étant tués avant tout réveil. Le porteur décrit des interventions d'environ deux heures, plusieurs chirurgiens en formation opérant le même animal le même jour, non pour produire des connaissances mais pour entraîner de jeunes chirurgiens et gastroentérologues. Il indique que l'ablation de tissus ou d'organes et les hémorragies rendraient les animaux invivables, justifiant la mort sans réveil. Il présente ces séances comme une "offre de formation" et affirme qu'il n'existe pas d'autre modèle vivant que l'animal avant le passage chez l'homme.

Objectifs

A l’heure où les recommandations de bonnes pratiques nous interdisent, à juste titre, l’enseignement initial de la chirurgie sur les patients, cette école de chirurgie et de pratiques interventionnelles forme des jeunes chirurgiens ou gastroentérologues en proposant un apprentissage intégré. L’objectif est de faciliter l’acquisition des techniques et des gestes opératoires à la fois par voie abdominale ouverte, laparoscopique répondant parfaitement aux besoins de simulations nécessaires à une formation pratique initiale et continue d’excellence. Ainsi cette école s’adresse à un large public de professionnels de santé à la fois pour formation initiale des internes, et la formation continue (chirurgiens ou praticiens gastroentérologues senior, IBODE, infirmières d’endoscopie). L’école regroupe plusieurs laboratoires qui permettent un apprentissage progressif. 1) Le laboratoire de simulation est une unité qui offre un entrainement sur simulateurs de chirurgie ou d’endoscopie : pelvi-trainer, simulateur robotique Da Vinci, permettant un apprentissage préalable de la gestuelle sur simulateur. 2) Le laboratoire d’anatomie complète l’offre de formation en permettant un apprentissage dans de véritables conditions opératoires humaines. 3) Enfin le laboratoire de chirurgie ouverte, laparoscopique (ou coelioscopique) sur grands animaux (porcs) permet un enseignement des techniques chirurgicales et interventionnelles dans des conditions physiologiques quasi équivalentes à la clinique humaine. Ce lieu d’enseignement est aussi le lieu de mise au point et d’évaluation des dispositifs mis sur le marché, avec perfectionnement de l’implantation de matériel et familiarisation avec de nouveaux matériaux, l’évaluation de technologies innovantes encore non développées en pratique courante chez l’homme.

Bénéfices attendus

L’objectif de ces séances est un apprentissage des compétences techniques de dissections de l’intestin, la réalisation de sutures et d’anastomoses et de ligature des pédicules vasculaires. Une grille d’évaluation des acquisitions est rendue à l’apprenant. L’évolution de l’acquisition des apprentissages sera évaluée au fur et à mesure des séances. L’objectif à plus long terme est l’apprentissage des techniques opératoires avant la réalisation de ceux-ci sur des patients.

Procédures

Les animaux seront soumis à une intervention chirurgicale d'en moyenne 2 heures, sans réveil

Impact sur les animaux

Toutes les procédures chirurgicales sont réalisées sous anesthésie générale avec suivi des constantes physiologiques, traitement analgésique approprié en fonction de la procédure de façon à contrôler la douleur lors de l’intervention chirurgicale. Un risque d’hémorragie existe, contrôlé par l’enseignement. Ce projet d’enseignement ne met en œuvre que des procédures, ou des suites de procédures sans réveil. Les porcs seront sédatés en continu et des antalgiques seront donnés tout le long de la procédure.

Devenir

Les procédures sont réalisées dans le cadre d’un apprentissage professionnelle, possiblement avec ablation de tissus, de vaisseaux ou d’organes, sutures internes, hémorragies, rendant possiblement certains organes non fonctionnels ou partiellement fonctionnels et qui ne permettraient pas de maintenir les animaux en vie dans de bonnes conditions.

Remplacement

Bien que la formation se fasse de façon progressive sur des simulateurs, puis au laboratoire d’anatomie, il n’existe pas à l’heure actuelle d’autres modèles de formation aux procédures chirurgicales sur sujets vivants permettant d’éviter ou de remplacer l’utilisation d’animaux avant de passer chez l’homme.

Réduction

De façon à réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés, différentes phases de l’apprentissage sont développées en amont aux laboratoires de simulation et d’anatomie. De plus les différentes procédures ’apprentissage sont réalisées le même jour sur un même animal par plusieurs chirurgiens en formation. Une grille standardisée d’évaluation des acquis des apprenants servira de référence pour justifier du nombre nécessaire de séances de formation, comprenant x procédures, pour acquérir les compétences par chaque individu et définir le nombre minimum d’animaux nécessaires à chaque formation.

Raffinement

Avant procédure, les animaux peuvent être hébergés selon leur taille et leur comportement, par 1, 2 ou 3 par boxes, au sein d’une même pièce. Un enrichissement alimentaire et par jeux est fourni de façon variée aux

Choix des espèces

L’anatomie du porc au niveau thoracique, abdominal et pelvien, ainsi que sa physiologie sont très proches de celles de l’homme, et de ce fait représente un très bon modèle vivant d’apprentissage et d’entrainement des diverses procédures chirurgicales avant d’approfondir l’apprentissage en chirurgie humaine. Il s’agit de jeunes animaux de 5/8 mois d’environ de 80Kg pour la formation en chirurgie digestive, selon les besoins anatomiques de chaque formation.

8 macaques à longue queue vont être utilisés dans des procédures menées sous anesthésie, les animaux étant tués avant tout réveil. Chacun subit l'ablation chirurgicale des glandes parathyroïdes et jusqu'à huit prélèvements sanguins, pour mettre au point une technique créant une hypoparathyroïdie. Le porteur indique que la mise au point de la technique chirurgicale interdit le réveil des animaux. Il affirme que le primate non humain est l'espèce non-rongeur la plus pertinente et qu'aucune méthode in vitro ne mesure le calcium sur un "organisme entier".

Objectifs

L'hypoparathyroïdie est caractérisée par une diminution de la production de l’hormone parathyroïdienne. Chez l'homme, elle est souvent causée par une maladie auto-immune ou suite à une chirurgie au niveau des glandes thyroïde ou parathyroïde. L’hormone parathyroïdienne (ou PTH) participe avec la vitamine D au métabolisme et à la régulation du calcium de l'organisme. Les symptômes de l'hypoparathyroïdie sont dus à une baisse de la concentration du calcium dans le sang (ou hypocalcémie) et consistent en des fourmillements dans les mains ou autour de la bouche et des crampes musculaires. Le traitement comprend en première intention une supplémentation en calcium et en vitamine D. Ce traitement n’est pas idéal sur tous les patients car il ne permet pas une régulation très fine de la calcémie au cours de la journée (pics d'hypercalcémie suivis de phases d'hypocalcémie). De plus, ce traitement ne permet pas de diminuer le risque de complications à long terme de l'hypoparathyroïdie (complications rénales et osseuses principalement). Dans ce cas des traitements hormonaux sont nécessaires. Très peu de traitements de ce type existent à ce jour. L'objectif de ce projet est de mettre au point la technique chirurgicale permettant de développer un modèle d'hypoparathyroïdie sélective (sans insuffisance thyroïdienne associée) chez le primate anesthésié.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus sont la mise au point de la technique chirurgicale permettant de réaliser l’ablation sélective des glandes parathyroïdiennes tout en respectant l’intégrité de la glande thyroïdienne et ainsi augmenter le taux de succès dans la mise en place d'un modèle pertinent pour évaluer les effets bénéfiques et /ou l'absence d'effets délétères de nouveaux traitements hormonaux visant à corriger l'hypoparathyroïdie en médecine humaine et vétérinaire . sachant que chez l’homme cette pathologie touche 40 personnes sur 100000. Pour l’animal, les bénéfices attendus sont une acquisition de connaissances sur l’espèce utilisée (primate non humain) par le développement d’outils de raffinement de plus en plus adaptés et le choix de l’espèce la plus prédictive en fonction de l’objectif scientifique attendu.

Procédures

Les animaux de ce projet subiront : - Une ablation des glandes parathyroïdiennes sous anesthésie générale avec une analgésie morphinique suivant les bonnes pratiques vétérinaires. Les animaux resteront anesthésiés pendant toute la durée de l’expérience et ne seront pas réveillés en fin d’expérience - Une série de prélèvements de sang (maximum 8 prélèvements sous anesthésie) en respectant les recommandations du NC3R’s et de l’article « Good practice guide to the administration of substances and removal of blood, including routes & volumes » de l’EFPIAECVAM (2001) pour les volumes maximum prélevés.

Impact sur les animaux

L'intégralité de la procédure est réalisée sous anesthésie. Une chirurgie pour ablation des glandes parathyroïdes suivant protocole chirurgical et analgésique maitrisé sera réalisée sur les animaux, et cette chirurgie sera suivie de prélèvements de sang .

Devenir

L'objectif de ce projet étant le développement - mise au point et raffinement d'une nouvelle technique chirurgicale, les animaux ne pourront pas être réveillés en fin de procédure.

Remplacement

Dans le cadre du développement de nouveaux médicaments, ce projet est réalisé chez le primate non-humain car il n’existe pas de méthode de substitution (in vitro ou in silico) pour évaluer les effets d’une nouvelle molécule sur le métabolisme et la régulation du calcium dans l'organisme sur des sujets atteint d'hypoparathyroïdie. Ou si elles existent, elles ne sont pas suffisantes pour répondre aux objectifs scientifiques du projet. En effet, l’objectif principal de ce projet est de mesurer les taux de PTH et de calcium circulant dans le sang, ce qui n’est pas possible de mesurer sur des cellules ou organes isolés mais qui nécessite un organisme entier dont la physiologie est fonctionnelle. Or, avant toute administration à l’homme, l’animal constitue un passage obligatoire pour l’évaluation de l’efficacité, la toxicité et la pharmacocinétique d’un candidat médicament. A ce jour, le primate non humain est l’espèce non-rongeur qui est la plus adaptée à ce type de modèle d’étude.

Réduction

Un nombre minimal et suffisant d’animaux est utilisé afin de mettre au point et de raffiner la technique chirurgicale. Les prélèvements sanguins réalisés au cours de l’expérience sur un animal seront exploités immédiatement pour décider si oui ou non un animal supplémentaire sera utilisé.

Raffinement

Dans ce projet, le raffinement sera obtenu par : • la mise au point de procédures rigoureuses, • un suivi quotidien de l’état de santé des animaux avant l'anesthésie,• La détermination des points limites, • Le recours aux procédures d’euthanasie dès que nécessaire, • Un protocole analgésique adapté pour la chirurgie , • La réduction du volume sanguin prélevé grâce à l’amélioration de la sensibilité des méthodes d’analyse, • La familiarisation des animaux aux procédures de contention pour l'induction de l'anesthésie.

Choix des espèces

Le primate non humain a été démontré comme étant l'espèce animale non rongeur la plus pertinente pour le développement de traitement hormonal de l'hypoparathyroïdie. A savoir que par exemple chez le chien, à la différence de l’humain, la forte capacité d'excrétion calcique spécifique à cette espèce provoque une toxicité rénale et en particulier un risque de calcul urinaire. Animaux adultes. Ce projet n’a pas pour objectif d’étudier les effets du produit sur l’animal à d’autres stades de développement.

432 souris vont être utilisées dans une procédure menée sous anesthésie, les animaux étant tués avant tout réveil. Elles reçoivent des injections d'anticorps et une induction de l'inflammation de l'oreille par une huile irritante, une cytokine ou une lésion des vaisseaux au laser, suivie d'une imagerie puis d'une mise à mort par dislocation cervicale, pour étudier le rôle des plaquettes dans la thrombo-inflammation. Le porteur présente le modèle comme peu invasif et n'attend "pas d'effets indésirables majeurs". Il affirme que les modèles in vitro ne reproduisent pas la complexité du processus et que les plaquettes, cellules sans noyau, ne peuvent être cultivées.

Objectifs

Les plaquettes jouent un rôle principal dans l’arrêt des saignements et elles sont aussi impliquées en thrombose artérielle. De plus, les plaquettes sont impliquées dans l’inflammation puisqu’elles peuvent interagir directement (interaction physique) ou indirectement (via la sécrétion de cytokines et des chimiokines) avec les cellules immunitaires. Ces processus de thrombose artérielle et d’inflammation sont largement imbriqués, conduisant à un processus global appelé thromboinflammation. Le rôle des récepteurs plaquettaires comme la GPIb, la GPVI et les intégrines dans ce processus est encore mal connu à ce jour. Comprendre leur rôle permettrait ainsi d’identifier des approches thérapeutiques afin de limiter la thromboinflammation et la formation de thrombi qui en découle. Le projet a pour but d’une part de développer un nouveau modèle de thromboinflammation au niveau de l’oreille couplé à de l’imagerie intravitale non invasive permetant l’observation des interactions entre les plaquettes et le système immunitaire inné ; et d’autres part d’évaluer le rôle des plaquettes et de récepteurs plaquettaires (GPIb, GPVI, intégrines) dans ce processus. Cette méthode non invasive a pour avantage de limiter au strict minimum les manipulations qui pourraient engendrer une réaction inflammatoire non spécifique, comme une chirurgie par exemple, mais aussi réduire la souffrance animale.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus du projet portent sur deux aspects différents : •Premièrement la mise en place d’un nouveau modèle utile à la communauté scientifique permettant l’étude de la throboinflammation in vivo et de manière non invasive chez la souris. •Deuxièmement, l’étude de la formation de la thromboinflamation à l’échelle cellulaire et l’identification des mécanismes mis en jeux. •Troisièmement, l’identification d’acteurs clés impliqués dans la thromboinflamation pouvant s’avérer être de futur cibles thérapeutiques.

Procédures

L’ensemble de la procédure expérimetale est réalisée sous anesthésie générale et elle est sans réveil. Tous les animaux subiront : •Une anesthésie par injection intraperitoneal d’un mélange Kétamine/Xylazine •Nettoyage de la peau de l’oreille ainsi qu’une brève dépilation à la crème dépilatoire •Une injection rétro-oribtale pour les : a.Souris WT traitées avec l’anticorps anti-GPIbα R300 à 2,5 mg/kg. b.Souris hGPVI traitées avec l’anticorps anti-hGPV1 ACT017 à 8 mg/kg. c.Souris hGPIb traitées avec l’anticorps anti-hGPIb Alma12 à 1mg/kg. Pour les souris thrombopéniques traitées au R300, un prélèvement sanguin sera réalisé avant injection de l’anticorps R300 et un second prélèvement sera réalisé 30min après injection de l’anticorps R300 pour s’assurer de la thrombopénie. Le volume de sang prélevé au niveau de la veine de la queue est de 10 µL à chaque prélèvement. •Une injection dans la veine de la queue d’une solution de bleu evans pour le marquage de vaisseaux,de DioC6 pour le marquage des plaquettes ainsi que d’anticorps pour le marquage des cellules immunitaires. •Maintien de l’anesthésie par inhalation d’isoflurane •Imagerie par microscopie multiphonique

Impact sur les animaux

Nous ne nous attendons pas à des effets indésirables majeurs sur les animaux etant donné que nous cherchons à mettre en place une technique là moins invasive possible. De plus les souris seront anesthésiées tout au long de la procédure qui est sans réveil. Nous pouvons cependant nous attendre lors de l’expérimentation à une baisse de la fréquence cardiaque, respiratoire ainsi qu’une baisse de température dû à l’anesthésie de l’animal. Ces paramètres seront surveillés, la concentration d’anesthésique gazeux sera ajustée si nécessaire et l’animal sera réchauffé tout au long de la procédure L’inflammation sera quant à elle induite par déposition sur la peau de l’oreille de souris d’huile de croton irritante ou par injection intradermique de TNFα ou par ablation laser contôlée au niveau du vaisseau d’intérêt. La thromboinflammation induite étant localisée au niveau de l’oreille de la souris, nous ne nous attendons pas à l’apparition d’effets indésirables majeurs, éventuellement une réaction inflammatoire localisée.

Devenir

A l’issue de la procédure expérimentale les animaux seront mis à mort par dislocation cervicale sous anesthésie générale. En effet, le projet porte sur l’étude de l’initiation de la thromboinflammation et de l’interaction des plaquettes avec les cellules immunitaires lors de ce processus, les temps tardifs ne seront pas étudiés dans ce projet.

Remplacement

Le but de ce projet est d’évaluer le rôle des plaquettes et de la GPIb, de la GPVI ainsi que des intégrines β1 et β3 dans un processus complexe et intégré qu’est la thromboinflammation. Les modèles in vitro n’étant pas assez sophistiqués pour reproduire toute la complexité de ce processus, un modèle in vivo sera utilisé. De plus, les plaquettes sont des cellules anucléées qui ne peuvent être cultivées, empêchant tout modèle reposant sur la culture cellulaire.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés lors de cette étude sera réduit au minimum sans impacter la validité des résultats. Les effectifs sont calculés suivant la loi normale N(µ ; σ). Le critère recherché est la comparaison de moyennes. On aboutit à n=16/d² avec d=|µ1 - µ2|/σ Pour cette étude in vivo, le nombre d’animaux par lot est n=16. Nous utiliserons des tests de Mann-Whitney pour la comparaison de 2 groupes et un test Kruskal-Walis post-test Dunn pour les comparaisons multi-groupes. De plus, le modèle expérimental sera validé sur un groupe maximum de 48 souris avant l’utilisation d’autres lignées de souris d’intérêts. Suite à la mise au point du modèle expérimental, seules les 2 techniques d’induction de la thromboinflammation les plus efficaces seront conservées pour la suite du travail afin de limiter au maximum le nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

Les conditions d’hébergement des animaux sont optimisées par l’enrichissement des cages avec des carrés de cellulose, bâtonnets de coton, frisure de papier, ce qui leur permet de compartimenter leur environnement selon leurs besoins. Les animaux, entre 2 et 5 par cage, ont un accès permanent à l’eau de boisson et à la nourriture. Les conditions de travail pour l’utilisation de modèles animaux ont été raffinées afin de limiter leur angoisse, stress et douleur lors des manipulations. Pour ce faire, des points limites spécifiques ont été établis pour chaque procédures. Ces points limites permettront de soustraire l’animal aux procédures expérimentales et ainsi limiter la souffrance et l’inconfort de l’animal. Lors des procédures, les animaux sont anesthésiés, maintenus à une température de 38°C par l’utilisation d’une plaque chauffante (tout au long de la procédure). Pendant toutes les expérimentations, les animaux sont surveillés par du personnel qualifié. Cette étude nécessitera l’utilisation de 432 souris.

Choix des espèces

La souris est un animal pour lequel les modèles d’étude in vivo sont largement répendus et maitrisés. Les techniques de mutagenèse ont permis de générer des souris sur un même fond génétique (C57BL/6J ) : - N’exprimant pas la GPVI : souris GPVI-/- - Exprimant la GPVI humaine : souris hGPVI, permettant de tester des anticorps anti-GPVI humaine chez la souris - N’exprimant pas L’intégrine β1 plaquettaire : souris PF4Cre+/ β1flox/flox (PF4Cre-β1-/-) - N’exprimant pas L’intégrine β3 plaquettaire : souris PF4Cre+/ β3flox/flox (PF4Cre-β3-/-) - N’exprimant pas Les intégrines β1 et β3 plaquettaires : souris PF4Cre+/ β1β3flox/flox (PF4Cre-β1β3-/-) - Exprimant la GPIb humaine : souris hGPIb, permettant de tester des anticorps anti-GPIb humaine chez la souris. Ces lignées sont parfaitement adaptées à cette étude et constituent des outils originaux et uniques. La déficience des gènes des récepteurs GPVI, β1 et/ou β3 ainsi que l’expression de la GPVI ou de la GPIb humaines n’induit pas d’effet indésirable notable chez les souris. Ces souris seront utilisées en comparaison de souris contrôles Wild-Type (WT) et PF4Cre+. Les animaux seront utilisés au stade adulte entre 8 et 24 semaines. Cet âge correspond à la période permettant l’utilisation de souris pubères et ne présentant pas encore syndrome de vieillissement. Nous réaliserons des groupes homogènes en âge.

35 souris vont être utilisées dans une procédure menée sous anesthésie, les animaux étant tués avant tout réveil. Génétiquement modifiées pour le gène COUP-TFI, elles reçoivent une injection puis une perfusion intracardiaque terminale, pour étudier le développement du cortex cérébral et un syndrome humain rare. Le porteur signale de possibles troubles comportementaux légers, qu'il dit atténués par l'enrichissement de la cage. Il affirme que l'étude fine du développement cérébral ne peut être remplacée par des approches de modélisation ou des cultures in vitro.

Objectifs

Ce projet a pour objectif d’étudier les mécanismes majeurs à la base du développement du système nerveux en posant des questions clés sur la façon dont le cortex s'organise pendant la vie embryonnaire. La souris est utilisée comme modèle du développement du cortex cérébral pour mieux comprendre les mécanismes à la base des troubles du développement chez l’humain afin de permettre une meilleure prise en charge des patients et d’identifier des pistes thérapeutiques potentielles. Le gène COUP-TFI, appelé aussi NR2F1 chez l’Homme, et dont des mutations ont été trouvées chez plusieurs patients est à l’origine de troubles cognitifs. Ce gène est exprimé à des stades spécifiques au cours du développement et agit dans des régions et populations distinctes du cortex cérébral. Dans le cadre de ce projet, des souris génétiquement modifiées pour ce gène seront comparées avec des souris contrôles pour les types cellulaires impliqués.

Bénéfices attendus

Les lignées de souris utilisées dans le cadre de ce projet reproduisent une maladie génétique humaine rare (OMIM #615722, Syndrome d'atrophie optique Bosch-Boonstra-Schaaf) et représentent donc un excellent modèle pour comprendre les mécanismes à la base de ces défauts génétiques afin de permettre une meilleure prise en charge des jeunes patients et d’identifier des pistes thérapeutiques potentielles.

Procédures

1 injection intrapéritonéale et 1 perfusion intracardiaque sous anesthésie générale.

Impact sur les animaux

Certains des animaux utilisés peuvent montrer de façon ponctuelle de légers troubles comportementaux comme de l'hyperactivité. Cependant, ces troubles sont facilement atténuables par la présence d’enrichissement dans la cage.

Devenir

Mise à mort.

Remplacement

L’étude fine du développement des différentes structures du cerveau ne peut être remplacée par des approches de modélisation ou par des cultures in vitro.

Réduction

Le nombre d'animaux pour chaque expérience est limité à celui nécessaire statistiquement à la validation d'un effet significatif.

Raffinement

En accord avec la règle des 3Rs, la qualité de la contention et la sureté des gestes seront assurés par des utilisateurs compétents et formés. L’état des animaux sera contrôlé quotidiennement et un enrichissement est prévu dans chaque cage. Au cours de la procédure terminale de perfusion, l’efficacité de l’anesthésie et de l’analgésie sera vérifiée (surveillance de la fréquence respiratoire, absence de réponse aux stimuli douloureux, absence d’augmentation de la tension musculaire dans la région de l’incision).

Choix des espèces

Le modèle souris a été choisi en raison de ses similarités génétiques avec l'homme, ainsi que de la facilité avec laquelle son génome peut être manipulé et analysé. Grâce aux progrès des technologies de manipulation génétique, il est aujourd’hui possible d’annuler l’expression d’un gène ou d’en induire son expression ectopique in vivo. Ces approches conduisent à une connaissance très approfondie du rôle de protéines ciblées dans un contexte physiologique, au cours du développement de l’organisme et de la différenciation cellulaire. Les manipulations génétiques permettent de simuler in vivo des altérations de l’expression de gènes ou de la physiologie cellulaire, caractéristiques de pathologies humaines. La génération et l’analyse de ces modèles pourront être utiles dans la compréhension des mécanismes à la base de la maladie génétique et au développement de nouvelles thérapies pharmacologiques et cellulaires. Ces animaux seront utilisés au stade adulte afin d’observer les effets de l’inactivation du gène sur un organe mature.

9 babouins vont être utilisés dans une procédure menée sous anesthésie, les animaux étant tués avant tout réveil. Le porteur indique que la colonie, naturellement infectée par le virus STLV, a été destinée à la mise à mort dans le cadre de la "gestion sanitaire" du centre, avant qu'un grand prélèvement sanguin puis une injection mortelle ne soient décidés pour récupérer du matériel biologique. Il présente cette procédure terminale comme la "meilleure façon de valoriser scientifiquement, et en conséquence éthiquement" la situation. Il qualifie le modèle primate d'"incontournable", cette colonie étant selon lui la seule d'Europe présentant ces caractéristiques.

Objectifs

Dans le cadre de la gestion sanitaire des colonies de notre centre, nous avons décidé de mettre à mort notre colonie de babouins naturellement infectés par STLV. Cette décision a été prise par la Direction et l’équipe de vétérinaires du centre avec l’accord d'un Groupe de Recherche national expert en l'utilisation du modèle primate en expérimentation animale. Plusieurs équipes de recherche nationales et internationales ont exprimé leur souhait de récupérer le maximum de matériel biologique de ces animaux pour leurs recherches. Un des prélèvements les plus importants est le sang frais. Le grand volume de sang requis (environ 500mL) rend très difficile un prélèvement post-mortem. Une fois ce prélèvement sanguin réalisé, l’animal sera euthanasié et le reste des prélèvements (environ 20 prélèvements tissulaires différents) se fera en post-mortem. Le présent projet décrira la procédure d ‘anesthésie, le prélèvement sanguin et la mise à mort des animaux. Tous ces gestes seront réalisés par l’équipe vétérinaire du établissement utilisateur. Les animaux seront capturés le jour même du prélèvement et de l’euthanasie. Les femelles seront transférées à l’aide des nids de transfert à des cages individuelles pour faciliter l’induction des animaux. Le mâle sera anesthésié à distance par fléchage

Bénéfices attendus

Lobjectif de ce projet est d'analyser les conséquences moléculaires (intégration provirale et expression du provirus, induction d'instabilités génétiques dont des mutations somatiques et des défaut de caryotypes), cellulaires (altération des voies de signalisation, modification de la fonction du centrosome, prolifération et apoptose cellulaires) et immunologiques (modification de l'immunophénotype dans le sang) de l'infection par STLV-1.

Procédures

Prelevements sanguin sur animal anesthesie. Ce prélèvement durera 30’ aprox. Les animaux seront euthanasiés an fin de prélèvement.

Impact sur les animaux

Le prelevement sanguin se fera avec l'anesthésié profonde de l'animal (administration intramusculaire d’un mélange de kétamine à la posologie de 4mg/kg et de médétomidine à la posologie de 40µg/kg), une injection mortelle de Doléthal® (pentobarbital) est réalisée par voie intraveineuse à la posologie de 180 mg/kg (soit 1mL/kg). Aucune nuisance ou effet indesirable est attendu sur les animaux.

Devenir

Aucun animal ne sera gardé en vie. Tous les animaux (i.e. 9) de la colonie seront mis à mort. La mise à mort de ces animaux se fait dans le cadre de la gestion sanitaire du centre d’élevage. La participation dans une procédure terminale de ces animaux nous paraît la meilleure façon de valoriser scientifiquement (et en conséquence, éthiquement) cette situation.

Remplacement

Pour l’étude de cette maladie, le modèle primate est incontournable. Les individus qui participeront à cette étude sont des individus naturellement infectés par le STLV et, à notre connaissance, la seule colonie Européenne de PNH à des fins scientifiques avec ces caractéristiques. Les échantillons obtenus ne peuvent donc pas être obtenus ni sur d’autres modèles animaux, ni sur des cultures cellulaires.

Réduction

Tous les animaux (i.e. 9) de la colonie seront mis à mort. La mise à mort de ces animaux se fait dans le cadre de la gestion sanitaire du centre d’élevage. La participation dans une procédure terminale de ces animaux nous paraît la meilleure façon de valoriser scientifiquement (et en conséquence, éthiquement) cette situation.

Raffinement

Les animaux de cette colonie font partie du même groupe social et ils sont hébergés dans un grand parc extérieur d’environ 500m2 aménagés avec différentes structures en bois pour faciliter l’utilisation de tout l’espace (i.e. enrichissement structurel). Ils ont libre accès à deux installations intérieures d’environ 60m2 climatisés. Les animaux font partie d’un programme d’enrichissement alimentaire approuvé par le SBEA qui consiste en plusieurs moments de nourrissage par jour avec l’utilisation de fruits, légumes et grains divers tous les jours, l’utilisation d’un substrat biologique de type paille/foin pour promouvoir le fourragement des individus (comportement typique de tout primate) ainsi que d’améliorer leur confort. Lors de tout prélèvement, les animaux seront anesthésiés profondément pour éviter toute douleur ou souffrance.

Choix des espèces

Les effets pathologiques du virus sur l’ensemble d’un organisme ne peuvent êtres étudiés à ce jour que par le prélèvement direct des tissus provenant d’animaux infectés par le rétrovirus STLV. De plus, et à notre connaissance, il n’existe pas à ce jour de biothèque proposant ce type d’échantillons. La colonie de babouins olive proposée est la seule colonie, a notre connaisance, naturelelment infecte par le virus STLV.