Procédures sans réveil

100 porcelets vont être utilisés dans une procédure menée sous anesthésie, les animaux étant tués avant tout réveil. Chaque porcelet subit pendant treize heures l'induction d'un choc septique par péritonite, une ouverture chirurgicale de l'abdomen et la pose de cathéters, pour mesurer la diffusion des anti-infectieux dans les tissus. Le porteur précise qu'un réveil est impossible car le choc et les souffrances d'organes seraient douloureux. Il indique aussi que ces animaux servent à former des médecins réanimateurs, formation qu'il présente comme "indispensable" à leur pratique.

Objectifs

Les états de choc sont la principale cause de décès des patients de réanimation. Ils sont à l'origine d'atteintes vasculaires responsables d'un mauvais fonctionnement des organes. Mieux comprendre les facteurs influençant ce mauvais fonctionnement des organes pourrait modifier le pronostic des patients. Deux types de traitements sont couramment utilisés. Le premier est le remplissage vasculaire (RV). Il consiste à perfuser au malade des produits pour augmenter son volume de sang. C'était l'objet de travaux précédents qui portaient sur l'évaluation de l'efficacité de différents liquides de RV pour traiter les états de choc infectieux chez le porcelet endormi (anesthésié) et sous respirateur. L'autre principal traitement des chocs infectieux est la prescription de médicaments pour tuer les bactéries ou les champignons (antibiotiques et antifungiques) responsables de l'infection. L'efficacité de ces médicaments dépend de leur quantité dans le sang et de leur capacité à aller dans les organes. L'objectif de ce projet consiste à étudier la concentration des anti-infectieux dans un modèle de choc infectieux pour mieux comprendre leur répartition lors de l'infection et pouvoir adapter les doses et les temps d'injection. Il s'agit de la deuxième étape d'étude sur cette thématique, faisant suite à un premier modèle de choc créé par injection intraveineuse de toxine de la bactérie Eschérichia Coli. Dans cette nouvelle étude nous avons décidé de tester un modèle de choc plus physiologique en induisant une péritonite (infection abdominale). Les animaux ne seront soumis qu'à une seule procédure sans réveil qui consistera dans un premier temps à induire un choc infectieux, puis ensuite à traiter les animaux avec le médicament à tester. Tout au long de de la procédure les animaux resteront anesthésiés et ventilés mécaniquement, leur évitant ainsi stress et douleur liée au choc. Nous étudierons la concentration des antibiotiques non seulement dans le sang, mais également dans les tissus par une technique de microdialyse qui permet de collecter des échantillons en temps réel et de réaliser des mesures sans avoir à prélever les tissus. L'atteinte des vaisseaux quant à elle sera étudiée par microcope laser. Cette technique avait déjà été utilisée dans nos projets précédents.

Bénéfices attendus

L'augmentation de la perméabilité vasculaire observée lors du choc septique et l'oedème tissulaire qui en découle influence la diffusion et la concentration des anti-infectieux dans l'organisme. Connaître cette atteinte microvasculaire et la modification de la pharmacocinétique des anti-infectieux lors du choc septique est fondamentale pour la prise en charge optimale des patients. L'étude pharmacologique nécessite un modèle reproductible stable, permettant une modélisation fiable. Le modèle porcin remplit toutes les conditions pour permettre de répondre à cette problématique. De plus, les groupes étudiés vont permettre de continuer l'étude de la micro-circulation par microscopie confocale lors du choc septique.

Procédures

La procédure complète se déroulera sur 13 heures : 1 heure environ pour la préparation de l'animal, 4 heures pour l'induction du choc septique, et 8 heures pour la collecte des données. En raison du choc septique et des souffrances d'organes, un réveil est impossible car responsable de douleur. La phase la plus douloureuse est la réalisation d'une microlaparotomie au niveau abdominal pour la mise en place d'une sonde urinaire. Elle sera réalisée après l'injection intraveineuse de sufentanil afin de prévenir la douleur. Cette ouverture chirurgicale permet également d'avoir accès au mésentère de l'intestion grêle afin de réaliser des images par Cellvizio (endomicroscope confocal laser) pour l'évaluation de la porosité des vaisseaux (ces images sont réalisées après injection intraveineuse de dextran 70 kda couplé à la fluorescéine).

Impact sur les animaux

Les animaux ne seront soumis qu'à une seule procédure sans réveil qui consistera dans un premier temps à induire un choc infectieux, puis ensuite à traiter les animaux avec le médicament à tester. Tout au long de de la procédure les animaux resteront anesthésiés et ventilés mécaniquement, leur évitant ainsi stress et douleur liée au choc induit. Nous étudierons la concentration des antibiotiques non seulement dans le sang, mais également dans les tissus par une technique de microdialyse qui permet de collecter des échantillons en temps réel et de réaliser des mesures sans avoir à prélever les tissus. L'atteinte des vaisseaux quant à elle sera étudiée par microcopie confocale. Cette technique avait déjà été utilisée dans nos projets précédents.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort en fin de procédure.

Remplacement

Il s'agit d'une étude descriptive qui a pour objectif de démontrer une théorie pharmacocinétique. Il n'existe pas de méthode alternative permettant d'atteindre cet objectif dans des conditions le plus proches possibles des cas cliniques.

Réduction

L'étude de la pharmacocinétique (devenir du médicament dans l'organisme) des anti-infectieux se fait par modélisation mathématique qui nécessite 8 données pour chaque temps de prélèvement. Afin d'anticiper des pertes dues à l'état de choc mais qu'il est difficile de prévoir, il a été décidé de relever ce nombre à 10. Ainsi pour chaque anti-infectieux, nous utiliserons un groupe de 10 porcelets et chaque animal sera son propre témoin. En considérant l'étude de 2 anti-infectieux par an, nous envisageons d'utiliser 20 animaux par an, soit 100 animaux sur 5 ans. L'ensemble des analyses statistiques sera effectuée par une équipe de médecins statisticiens agréés qui a validé ce modèle de cinétique dans des publications internationales. De plus, les animaux de ce projet permettront en parallèle de former les médecins réanimateurs à la réalisation de gestes sous échographie et à la prise en charge du choc infectieux, indispensable à leur pratique professionnelle et requise pour la validation de leur formation.

Raffinement

Nous attacherons une importance majeure au raffinement des conditions d’hébergement et d'enrichissement pendant la période d'acclimatation d'une semaine. - Contact et observations quotidiennes par les soigneurs (apparence physique externe, comportement , réponses comportementales aux stimuli externes...). Toute anomalie est remontée au responsable du bien-être des animaux pour examen approfondi, traitements adaptés et/ou consultation du vétérinaire référent. - Environnement adapté et enrichi : les animaux sont hébergés en groupe. L'enrichissement est réalisé en créant une zone de repos couverte de litière, leur permettant de s'allonger tous ensemble et de répondre à leur comportement de fouissement. Ils disposent également de jouets suspendus à mordiller. - Procédure expérimentale réalisée par du personnel qualifié et expérimenté. L’animal reste sous anesthésie générale jusqu'au décès. Au cours des expérimentations, les animaux seront anesthésiés profondément Lors des quelques gestes invasifs et possiblement douloureux, un morphinique sera utilisé (SUFENTANIL 10 μg/h). La mise en place des cathéters sera réalisée sous échographie, évitant l'ouverture cutanée à l'exception de la ponction à l'aiguille. En raison du choc septique et des souffrances d'organes, un réveil est impossible car responsable de douleur. C'est la raison pour laquelle tous les animaux seront mis à mort en fin de procédure.

Choix des espèces

Le porc est un bon modèle d'étude cardio-vasculaire proche de la physiologie humaine. Le comportement hémodynamique et la vascularisation sont également proches de l'Homme, ce qui permet de se former sur l'animal avant l'usage chez l'Homme. De plus, notre équipe de recherche a acquis une expérience de plusieurs années sur ce modéle de grand animal permettant d'optimiser au mieux le modèle. Les animaux sont choisis au terme du post-sevrage à l'âge de 2-3 mois, pour des raisons techniques d'une part (poids entre 25 et 35 kg, permettant des groupes homogènes) et pour des raisons de coût d'autre part.

5 macaques rhésus vont être utilisés dans une procédure menée sous anesthésie, les animaux étant tués avant tout réveil. Chaque macaque subit une chirurgie du cortex visuel primaire puis jusqu'à douze heures d'enregistrements électriques, vasculaires et métaboliques sous stimulation visuelle, pour étudier le couplage neurovasculaire. Le porteur présente ces animaux comme déjà "destinés à l'euthanasie" pour raisons médicales ou comportementales et décrit leur usage comme une "valorisation" relevant de la réduction. Il ajoute que la proximité du cerveau du macaque avec celui de l'humain rend l'espèce irremplaçable.

Objectifs

Ce projet a pour finalité l’étude du couplage neurovasculaire chez l’animal anesthésié lors d’une expérimentation sans réveil. Deux grands principes seront étudiés dans ce projet : le couplage neuro-vasculaire, par l’enregistrement simultané de l’activité électrique neuronale à l’aide d’électrodes et de l’activité vasculaire à l’aide de l’imagerie fonctionnelle ultrasonore ainsi que le couplage « métabo-vasculaire » par l’enregistrement simultané de grandeurs métaboliques (comme la quantité locale de lactate, de glucose ou d’oxygène) et de l’activité vasculaire. Ces grandeurs seront enregistrées dans le cortex visuel primaire de macaques rhésus destinés à l’euthanasie dans un principe de valorisation et de réduction du nombre d’animaux utilisés à des fins scientifiques lors de procédures sans réveil uniquement. Le couplage neurovasculaire est une dynamique essentielle et encore mal comprise du fonctionnement neuronal, en effet, il permet d'apporter les nutriments et l'oxygène nécessaire au bon fonctionnement des neurones. Cette étude vise à mieux comprendre les dynamiques physiologiques mises en oeuvre lors de l'augmentation du besoin métabolique des neurones et de la glie afin d'affiner notre compréhension du couplage neurovasculaire. Par ailleurs, le cortex visuel est choisi car il permet d'effectuer des études passives et anesthésiées, une stimulation de la rétine pouvant engendrer des réponses vasculaires et neuronales malgré l'anesthésie. Les animaux engagés dans cette procédure seront exclusivement des animaux sur lesquels une réforme est envisagée aux vues de leur âge, état de santé, temps d'engagement dans des projets scientifiques. Les animaux n’auront pas été utilisés dans une procédure expérimentale entraînant une douleur intense, de l’angoisse ou une souffrance mais pourront présenter un état de bien-être dégradé et/ou une atteinte de leur santé, indépendamment des projets scientifiques dans lesquels ils ont été engagés. Ils ne seront pas compatibles avec les conditions de replacement telles que décrite dans la réglementation. L’objectif rejoint le principe de réduction puisque l’animal est ainsi valorisé dans une procédure sans réveil. Il est également prévu de distribuer les tissus biologiques n’ayant pas d’intérêt scientifique pour l’équipe, au sein d'un réseau de don d’organes.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra une compréhension plus fine du couplage neurovasculaire chez le macaque rhésus (sain ou ayant une maladie chronique, en fonction des propositions d’importation pour euthanasie reçues) afin de mieux comprendre le lien entre activité neuronale et activité vasculaire, mais aussi entre activité métabolique et vasculaire d’un point de vue intégré. En effet, les enregistrements vasculaires doivent être effectués sur l’animal vivant afin d’obtenir des données exploitables. celles-ci ne peuvent pas avoir lieu sur un animal décédé ou sur un organe en tranche car il est nécessaire d’avoir une activité cardiaque pour avoir une activité vasculaire. Grâce au réseau du don d’organes, les tissus biologiques éventuellement récupérés pourront être bénéfiques à la réalisation d’autres objectifs scientifiques, différents de ceux prévus dans cette étude.

Procédures

Les animaux seront soumis à une procédure de classe sans réveil d'une durée maximale de 12 heures comprenant une chirurgie réalisé en condition d'aseptie au niveau du cortex visuel primaire ainsi que des enregistrements de l'activité vasculaire (par ultrasons fonctionnels), électriques (par électrophysiologie) et métaboliques (avec des électrodes adaptées à ces enregistrements) durant des stimulations visuelles.

Impact sur les animaux

L’unique procédure de ce projet est une procédure sans réveil, il n’est pas attendu de nuisances particulières en dehors de la douleur liée à la chirurgie ou d'un risque d’hémorragie, de convulsions ou mauvaise réaction à l’anesthésie.

Devenir

Euthanasie des animaux. Il s’agit d’une expérimentation terminale dans un processus de valorisation scientifique d’animaux destinés à l’euthanasie. A l'issue de cette dernière, un don de tissus sera effectué dans une optique de réduction de nombre d'animaux utilisés à des fins scientifiques afin de valoriser l'animal.

Remplacement

Le remplacement de l’animal n’est pas envisageable pour atteindre les objectifs fixés dans ce projet, les couplages « neuro-vasculaire » et « métabo-vasculaire » nécessitant un fonctionnement normal du système cardio-vasculaire, il n’est pas possible d’utiliser des systèmes computationnels ou autres dispositifs alternatifs à l’utilisation d’animaux. Le singe rhésus est utilisé pour sa proximité anatomo-fonctionnelle avec le cerveau humain et ne peut être remplacé par une autre espèce.

Réduction

Seuls des animaux en fin de procédure dont l’euthanasie est envisagée pour des raisons médicales ou comportementales seront utilisées dans ce projet. En aucun cas un animal naïf ou réutilisable en tant que modèle pour la recherche scientifique ou replaçable ne sera prévu pour cette procédure. Plus largement, les animaux destinés à entrer dans ce projet sont également tracés pour la distribution des tissus biologiques au sein du réseau d'un réseau de don d'organe, permettant de réduire le nombre d’animaux utilisés en recherche, en faisant bénéficier au plus grand nombre de tissus simiens suite à l’euthanasie. Un total de cinq animaux est prévu sur ce projet.

Raffinement

La méthodologie utilisée dans ce projet a auparavant été mise au point chez le rongeur de laboratoire et il s’agit d’une mise en place chez le primate anesthésié avant l’utilisation de ce protocole chez le primate éveillé. Les protocoles anesthésiques et analgésiques sont quant à eux mis à jour et raffinés par la SBEA dans une démarche d’amélioration continue des pratiques. La douleur liée à la chirurgie est prise en charge de manière multimodale par des antalgiques. Par ailleurs afin de minimiser le stress et l’angoisse des animaux importés à des fins d’expérimentation terminale, ceux-ci seront importés uniquement deux jours avant la date prévue d’euthanasie (arrivée dans l’animalerie à J-2, stabulation à J-1 et euthanasie à J0) pour limiter la durée d’un hébergement individuel et ne pas perturber les animaux présents dans l’animalerie, ils seront maintenus en isolement dans un pièce d’hébergement (pas de contact visuel, sonore, olfactif). Un enrichissement adapté (vidéo, jouets manipulables, etc.) sera distribué. Pour les animaux déjà présents dans l’animalerie, ceux-ci sont hébergés dans les mêmes conditions qu’auparavant tel que décrit dans l’agrément de l’animalerie avec dans la mesure du possible un hébergement en paire ou ou avec un contact visuel et olfactif de ses congénères, une alimentation adaptée à l’espèce ainsi qu’un programme de bien-être et d’enrichissement spécifique. Des points limites sont également définis dans la procédure expérimentale.

Choix des espèces

Les macaques possèdent une architecture cérébrale semblable à celle de l’Homme, avec notamment un cortex plissé présentant de nombreux gyri et sulci. De plus, leur métabolisme est plus proche du métabolisme humain que ne l’est le métabolisme du rongeur, les deux espèces (hommes et macaques) appartenant à l’infra-ordre des catarrhiniens. De plus, le cortex visuel des primates est particulièrement développé et sa structure est stable à travers les espèces de catarrhiniens, donc l’étude vasculaire, électrophysiologique et métabolique chez le primate anesthésié est une expérimentation appropriée pour la compréhension du fonctionnement du système nerveux central chez l’Homme. Les animaux seront à un stade adulte. Il s’agit d’animaux adultes destinés à l’euthanasie pour des raisons médicales ou comportementales (maladie chronique, âge avancé, troubles du comportement, etc.) dans un but de réduction du nombre d’animaux utilisés à des fins scientifiques.

20 souris vont être utilisées dans des procédures menées sous anesthésie, les animaux étant tués avant tout réveil. Elles subissent une imagerie échographique puis une IRM des pattes antérieures pour comparer les propriétés mécaniques des muscles de souris saines et de souris déficientes pour le gène KLF10. Le porteur souligne le caractère peu invasif de l'imagerie, l'anesthésie servant surtout à immobiliser l'animal, mais prévoit une mise à mort par dislocation cervicale sous anesthésie en fin de procédure. Il affirme qu'aucun modèle alternatif ne reproduit un muscle fonctionnel et que la souris est le seul animal porteur de cette déficience génétique.

Objectifs

Chez l’homme, le gène étudié a une influence majeure sur le développement et le fonctionnement du cerveau, du pancréas, des os ainsi que des muscles, du sein et des ovaires. Son expression anormale a une influence sur le développement de cancers, de maladies osseuses et de pathologies cardiaques. Toutefois, alors que fortement exprimé dans les muscles, son lien avec le fonctionnement musculaire reste aujourd’hui encore sous-étudié et incompris. Dans ce contexte, dans ce projet, nous comparons le développement des muscles chez des sujets sains avec des sujets chez qui le gène étudié ne s’exprime pas (lignées de souris présentant la déficience de ce gène) afin d’en isoler l’influence. La comparaison entre sujet sain et déficient s’effectuera alors grâce à des approches in vivo par imagerie médicales, par IRM et par ultrasons (approche nommée élastographie), afin de comparer les propriétés mécaniques des muscles des pattes antérieures. A l’exception de l’anesthésie, non utilisée chez les patients humains mais nécessaire pour immobiliser temporairement les animaux, ces approches in vivo, non invasives et sans douleur par imagerie ici adaptées aux petits animaux sont couramment utilisées dans différents services hospitaliers en routine clinique.

Bénéfices attendus

Le rôle du gène étudié a été mis à jour initialement dans les cellules osseuses. Compte tenu de l'avancée des découvertes actuelles, le gène KLF10 pourrait avoir une très grande importance dans de nombreuses maladies musculaires (telle que la myopathie de Duchenne caractérisée par des lésions musculaires importantes) et pendant la cicatrisation musculaire. La perspective de cette étude sera de caractériser le rôle étudié dans les pathologies musculaires pour aboutir à moyen terme à un protocole de diagnostic sans douleur basé sur l’imagerie médicale et à plus long terme à de nouvelles stratégies thérapeutiques.

Procédures

Les animaux seront soumis aux interventions suivantes incluses dans la procédure expérimentale effectuée successivement sur chaque animal : 1) Imagerie échographique des pattes antérieures de l’animal sur une machine commerciale clinique pour imagerie anatomique et mesure des caractéristiques mécaniques des muscles. (procédure de 30 minutes) 2) Installation dans un imageur IRM petit animal pour l'imagerie de l’anatomie, de l’orientation des fibres musculaires et des propriétés mécaniques des muscles par élastographie (procédure de 30 minutes). Ces acquisition seront effectuées sous anesthésie monitorée des animaux, en imageant deux sortes de muscles afin d’en dissocier les caractéristiques : un muscle aux fibres rapides et un muscle aux fibres lentes.

Impact sur les animaux

De par la nature minimalement invasive du protocole d'imagerie (au maximum insertion d'une aiguille d'acupunture), les effets indésirables correspondent exclusivement à un potentiel inconfort lié à l'anesthésie, incluant un possible refroidissement, et au potentiel stress pouvant être ressenti par l'animal avant expérimentation. Afin d'y remédier au maximum, une période d'acclimatation sera respectée, le milieu enrichi par du papier cardé, les armoires régulés en température et en humidité et un tapis chauffant sera utilisé pendant la durée totale de l’expérimentation. Les seuls effets indésirables notables sont liés à la souche utilisée. L’inhibition de ce gène est susceptible d’engendrer des changements structurels des muscles squelettiques tels que de l'hypertrophie, le passage de fibres à contractions lentes en fibres à contractions rapides ou encore des changements dans la masse musculaire.

Devenir

A l'issu de chaque procédure d'imagerie, les souris seront euthanasiées par dislocation cervicale sous anesthésie. Cette méthode sera appliquée en fin de procédure ou en cas d’atteinte des points limites. La vérification de la mort se fera par observation de l’arrêt respiratoire et cardiaque, ainsi que par observation de l’opacité des yeux.

Remplacement

Bien qu'un modèle alternatif tissulaire de muscle in vitro soit en cours de développement, il ne peut reproduire les phénomènes que nous souhaitons étudier. L’utilisation d’un animal est donc une nécessité et ne saurait être remplacé à l'heure actuelle.

Réduction

Nous utiliserons des tests statistiques nous permettant d’évaluer le rôle du gène étudié dans le fonctionnement du muscle. Le nombre d’animaux tient compte des besoins expérimentaux et statistiques tout en réduisant le nombre d’animaux au minimum.

Raffinement

Concernant les souris KLF10-KO, le phénotype ne présente aucune douleur/souffrance aux animaux. Toutes les souris seront acclimatées à l'animalerie 4 à 8 j avant le début des expérimentations. Les souris disposeront de nourriture et d’eau à volonté, avec un maximum de 2 animaux par cage. L’environnement est contrôlé (température et humidité), avec un éclairage artificiel avec photopériodes 7h-19h. Du papier cardé sera disposé dans les cages afin d'enrichir le milieu. Le jour de la procédure, les animaux seront anesthésiés individuellement par voie gazeuse. La profondeur de l’anesthésie sera évaluée par le réflexe palpébral. L’hypothermie due à l’anesthésie sera évitée grâce à un tapis chauffant pendant la durée totale de l’expérimentation. De l'ocrygel sera appliqué sur les yeux pour éviter leur dessèchement. Toute la procédure sera effectuée avec l'objectif de maximiser le bien-être des animaux et de limiter la souffrance et la détresse. Nous avons mis en place un suivi des animaux et des traitements de la douleur.

Choix des espèces

Il n'existe à l'heure actuelle aucune modèle alternatif permettant de reproduire un muscle fonctionnel (lent ou rapide). Nos précédentes études nous ont permis d'établir la robustesse et l'intérêt pour cette problématique de santé public de ce modèle de souris inhibant l'expression du gène étudié. La souris constitue aujourd'hui le seul animal présentant un modèle avec inhibition de l'expression de ce gène. Les tests seront effectués sur les muscles squelettiques de souris adultes (3 mois, phénotype non dommageable dans cette tranche d’âge). Ce stade a été choisi pour rester dans la continuité de précédents travaux déjà publiés. Un des objectifs majeurs de nos travaux est de développer un modèle numérique du muscle de souris sain et avec déficience du gène étudié (modèle essentiellement basé sur les données acquises par imagerie médicale) pour la compréhension puis le diagnostic des effets de ce gène.

1 200 animaux non-humains, 600 souris et 600 rats, vont être utilisés dans des procédures classées sans réveil, pour former le personnel aux gestes de prélèvement et d'injection. Chaque animal peut subir jusqu'à deux voies de prélèvement et deux voies d'injection, avec un maximum de trois essais infructueux par méthode, avant d'être tué au CO2. Le porteur présente cette formation comme un moyen d'améliorer le "bien-être" animal et la fiabilité des résultats, et prévoit d'utiliser des animaux de réforme voués à l'euthanasie. Il affirme que ces gestes ne peuvent être appris de façon réaliste sur simulateur et juge l'usage de l'"organisme entier" incontournable.

Objectifs

Les mauvais gestes de prélèvement ou d'injection chez les petits animaux peuvent engendrer des dommages ou du stress pour l'animal. Ces perturbations peuvent avoir un impact significatif sur le bien-être de l’animal et sur la valeur scientifique des résultats. L’objectif de ce projet est d'assurer une formation continue de qualité pour notre personnel ou utilisateurs afin d'améliorer le bien-être animal, de diminuer le nombre d'animaux utilisés dans les différents projets et de contribuer au bon déroulement des protocoles expérimentaux.

Bénéfices attendus

Ce projet fait appel à différentes procédures expérimentales à visée éducative. Il a pour but de raffiner les procédures de prélèvement et d'injection afin d’éviter la souffrance des animaux, de réduire le nombre d’animaux et d’obtenir des résultats scientifiques plus fiables et reproductibles.

Procédures

Les injections (per os - gavage, intraveineuse directe, intrapéritonéale, sous cutanée) seront faites sur animaux vigiles (rat et souris). Une anesthésie générale à base d’Isoflurane (4% pour induction et entre 1.5 à 2.5% pour le maintien) et une analgésie à base de buprénorphine (0.05mg/kg pour les rats et 0.1mg/kg pour les souris 30 minutes avant les manipulations) seront utilisées pour tous types de prélèvements sanguins. Nous prévoyons au maximum deux voies de prélèvements et deux voies d’injection par animal. Le nombre d’essai infructueux ne dépassera pas 3 par méthode. Le temps de manipulation pour chaque animal est estimé à 5 minutes. Après quoi, l’assistance de l’encadrant est demandée pour effectuer un dernier geste technique. Le volume total des prélèvements/animal ne dépassera pas 10 % du volume sanguin total (souris et rat).

Impact sur les animaux

Les injections seront faites avec du sérum physiologique au volume adapté au poids de l’animal (stérile, isotonique, ph physiologique et réchauffé) qui ne cause aucune douleur pour les animaux. Pour les prélèvements le nombre d’essai devrait se limiter à trois (ponctions). Par la suite l’assistance de l’encadrant doit être demandée. L’arrêt de saignement doit être assuré avant de retourner l’animal dans sa cage. Dans le cas d'une mauvaise manipulation, l’encadrant jugera du besoin de remplacement de l’animal, ou le cas échéant si un point limite est atteint de la mise à mort de l’animal.

Devenir

A la fin de chaque séance de formation, les animaux ayant subi des interventions d’injection et/ou de prélèvement ne seront pas conservés en vie pour éviter des souffrances inutiles, ils sont mis à mort par CO2.

Remplacement

L’apprentissage des procédures de prélèvement et d’injection chez les petits animaux comme la souris et le rat ne peut être simulée de façon réaliste et didactique. En outre, il n’est pas possible d’apprendre à faire par des prélèvements rétro-orbitaires ou sous maxillaires sur des vaisseaux artificiels. L’usage de l’organisme entier est incontournable.

Réduction

Les études statistiques requises habituellement dans les études scientifiques ne peuvent pas être appliquées car le projet est pour but éducatif. Le nombre des animaux est évalué en fonction du nombre des participant à cette formation. Pour réduire le nombre d’animaux commandés, nous utiliserons des souris et des rats provenant de notre établissement (animaux de réformes ou de génotype non désirés destinés à l’euthanasie).

Raffinement

Avant les procédures, Les animaux sont hébergés en groupes sociaux, dans des environnements enrichis par la présence de tunnel en carton pour les rats, des maisonnettes en plastique et dôme pour les souris, au sein d’une animalerie exempte de pathogènes et dont les paramètres physiques et sanitaires sont strictement contrôlés. L'alimentation et l'eau seront distribué à volonté. Les injections seront faites avec du sérum physiologique qui sera réchauffé à l’aide d’un bain-marie ou tapis chauffant afin d’éviter la diminution de la température corporelle lors de l’administration.

Choix des espèces

Notre animalerie héberge principalement des rats et souris. La majorité des demandes de travaux pour les procédures d’injection et de prélèvement dans notre établissement utilisateur concernent principalement les deux espèces souris et rat. Afin de rentabiliser le nombre de souris, nous allons utiliser des souris de réforme en provenance de notre établissement qui doivent être mise à mort : souris en fin de reproduction, ou souris sauvage issus des différents accouplements des lignées transgéniques (2-3 mois). Dans le but de faciliter la contention, manipulation et injection pour les participants, nous utiliserons des rats adultes de 300 à 350 g commandés chez un fournisseur agréé.

22 cochons vont être utilisés dans des procédures menées sous anesthésie générale, les animaux étant tués avant tout réveil. Chacun subit une coronarographie puis une ouverture du thorax, avant exsanguination et prélèvement du cœur, en une intervention d'environ 90 à 120 minutes. Le porteur cherche à valider un protocole d'imagerie des artères coronaires sur une machine de perfusion cardiaque, pour mieux évaluer des greffons avant transplantation. Il affirme que les petits animaux n'offrent pas un système vasculaire assez proche de l'humain et retient le porc, livré à environ 55 à 60 kg.

Objectifs

Les objectifs de notre étude sont les suivants : 1)Valider un protocole de coronarographie sur machine de perfusion cardiaque ex vivo ; 2)Définir un profil de biomarqueurs pour les dommages cardiaques induits par une exposition à des doses de RI faibles à modérées en caractérisant et en identifiant la cinétique des biomarqueurs circulants après irradiation du cœur perfusé ex vivo ; 3)Etudier la biodistribution du produit de contraste iodé et son impact sur la qualité de perfusion ex vivo et la viabilité myocardique ; 4)Etudier la faisabilité d’approches non invasives alternatives à la coronarographie pour le dépistage de la maladie coronaire sur le cœur perfusé ex vivo : application du coroscanner et de la micro-vasculoscopie.

Bénéfices attendus

La transplantation cardiaque est le traitement de référence de l’insuffisance cardiaque avancée avec un taux de survie >60% à 10 ans. Nous proposons dans ce projet de recherche de valider un protocole d’imagerie coronaire ex vivo par coronarographie, mais également d’évaluer la faisabilité du coroscanner dans cette indication ce qui permettrait d'évaluer correctement les greffons cardiaques préservés sur machine de perfusion ex-vivo avant la transplantation.

Procédures

L'ensemble des animaux seront soumis, sous anesthésie générale à coronarographie suivie d'une sternotomie médiane, avant exsanguination et prélèvement cardiaque. La totalité de la procédure sous anesthésie générale sera d'environ 90-120 min.

Impact sur les animaux

L’ensemble des procédures expérimentales sera réalisé sous anesthésie générale. A aucun moment l’animal ne sera conscient ni susceptible de ressentir la douleur. S'agissant de procédures expérimentales sans réveil, aucun effet indésirable ni nuisances ne sont attendus pour l'animal qui sera euthanasié en fin de procédure.

Devenir

L'ensemble des procédures impliquent l'explantation du coeur ce qui rend la réutilisation, le replacement ou l'adoption des animaux inenvisageable.

Remplacement

Nous avons pratiqué une expérimentation préliminaire sur modèle in silico simulant la position du cœur sur la machine de perfusion lors d’une exposition aux rayonnements faiblement ionisants.

Réduction

Afin de réduire le nombre d’animaux nécessaires à l’étude, deux animaux seront utilisés à la phase préliminaire pour déterminer le protocole d’acquisition des images coronarographiques qui sera ensuite appliqué dans chacun des groupes (incidence des acquisitions, dose irradiée, quantité d’agent de contraste). Le nombre d’animaux par groupe sera fixé à 6 afin de pouvoir réaliser des tests de comparaison statistique entre les groupes. Au total 22 animaux seront utilisés pour cette étude.

Raffinement

Période d’acclimatation d’une semaine minimum entre l’arrivée à l’animalerie du laboratoire et l’inclusion dans le protocole de recherche. Hébergement en groupe de deux pour favoriser le contact régulier entre congénères. Environnement adapté à chaque phase de l’expérimentation pour réduire l’angoisse des animaux (accompagnement et anxiolyse durant le transfert depuis l’animalerie jusqu’en salle d’intervention). Procédures expérimentales réalisées par du personnel qualifié et expérimenté (chirurgiens séniors, techniciens anesthésistes) permettant un temps interventionnel réduit au maximum. Privilégier les ponctions vasculaires (artérielles et veineuses) percutanées échoguidées afin de réduire la souffrance, le risque de saignement et le risque infectieux.

Choix des espèces

Nous avons choisi un modèle porcin pour différentes raisons: -Les modèles ‘petits animaux’ ne permettent pas d’avoir un système vasculaire suffisamment proche de l'Homme (vaisseaux trop petits principalement), et nous ne pouvons pas de façon réaliste réduire toute la taille du système afin de l’adapter à de petits animaux -Le porc est un modèle de référence pour les procédure endovasculaires, bien documenté. Son anatomie cardiovasculaire facilite la réalisation de la coronarographie et des canulations artérielle et veineuse nécessaires pour sa perfusion isolée ex vivo. La modélisation chirurgicale est facilitée par l’usage du gros animal, ce qui contribue à limiter le nombre d'aniamux nécessaire. Les porcs sont livrés à environ 16 semaines d'âge soit environ 55-60 kg afin de faciliter les abords vasculaires périphériques par voie percutanée et d'avoir des diamètres de vaisseaux compatibles avec les dispositifs à évaluer.

8 porcs vont être utilisés dans des procédures menées sous anesthésie, les animaux étant tués avant tout réveil. Chaque porc subit une chirurgie de deux heures puis un arrêt cardio-respiratoire provoqué de dix minutes, avec deux prélèvements sanguins, pour tester un prototype de stimulation électrique externe pendant la réanimation cardiopulmonaire. Le porteur indique que les animaux restent anesthésiés en permanence et que la profondeur de l'anesthésie est vérifiée régulièrement. Le bénéfice annoncé, une meilleure reprise de l'activité cardiaque, est formulé au conditionnel.

Objectifs

L'arrêt cardiaque extra-hospitalier correspond à l'arrêt brutal et inattendu des battements du cœur, souvent appelé "crise cardiaque". Cette situation frappe environ 40.000 personnes par an en France et 300.000 à 400.000 en Europe. Lorsque cela survient, l'urgence est la mise en place de soins de réanimation cardiopulmonaire, s'appuyant sur un massage cardiaque, l'appel des secours et l'usage d'un défibrillateur semi-automatique. Une fois les services de secours médicalisés sur place, une réanimation cardiopulmonaire avancée est mise en place, incluant une intubation endo-trachéale (sonde dans la trachée) et une ventilation mécanique (respiration) du patient par des machines spécifiques. Des molécules peuvent aussi être administrées pour essayer de faire repartire le coeur. Dans certains cas, ces soins ne suffisent pas. Dans ce contexte, le but de l’étude est d’évaluer l’impact d’un nouveau prototype de stimulation électrique transthoracique (pacing). Ce dispositif pourrait permettre d'augmenter la performance d'un massage cardiaque lors d'une réanimation avec certains rythmes cardiaques particuliers (très faible fréquence cardiaque sans contraction effective). Pour montrer cette amélioration de la performance de la réanimation, il faut étudier la pression de perfusion coronarienne. Il nous faudra déterminer si le pacing permet d’obtenir une pression de perfusion coronarienne dépassant le seuil critique de 20mmHg pour obtenir une réanimation cardiaque efficace sur les animaux. Nous utiliserons un modèle porcin d’arrêt cardiaque présentant des rythmes ne nécessitant pas de choc électrique.

Bénéfices attendus

L’utilisation du prototype de stimulation transthoracique pendant la réanimation cardiopulmonaire permettrait une amélioration de la performance du massage cardiaque et in fine la reprise d’une activité électrique et contractile.

Procédures

Nous utiliserons 8 porcs. Pour cela, tous les animaux seront soumis à une procédure chirurgicale d'une durée de 2 heures et à un arrêt cardio-respiratoire d'une durée de 10 minutes. Deux prélèvements sanguins à l'état anesthésié seront réalisés pendant la procédure. Les animaux seront mis à mort à la fin du protocole.

Impact sur les animaux

Dans ce projet, les animaux seront anesthésiés tout le long de la procédure. Nous vérifierons très régulièrement la profondeur de l’anesthésie afin de s’assurer qu’aucune souffrance ne soit possible pour l’animal. La profondeur de l'anesthésie est évaluée par la disparition du réflexe palpébral , une relaxation de la mâchoire et l'absence de réflexes de retrait de la patte.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort en fin de protocole.

Remplacement

L’arrêt cardiaque est une situation qui induit une dysfonction de plusieurs organes après la réanimation. Le caractère intégratif de l’affection ne permet pas de la reproduire in vitro ou in silico (absence de Remplacement possible). L’étude de médicaments ou dispositif permettant de lutter contre ses séquelles doit se faire une vivo, en utilisant des animaux à des fins scientifiques.

Réduction

S’agissant d’une étude de preuve de concept, cette étude inclura uniquement 4 animaux par groupe (un groupe Témoin et un groupe "Pacing")Le critère de jugement principal sera la pression de perfusion coronarienne, calculée au cours du massage cardiaque comme la différence entre la pression artérielle systémique et la pression atriale droite en fin de décompression. Ce critère permettra d’évaluer le prototype de stimulation électrique transthoracique. Les critères secondaires d’investigation seront les pressions artérielles systémiques systoliques, diastoliques au cours du massage cardiaque et la pression atriale droite. Nous comptabiliserons simplement le nombre d’animaux pour lesquels une pression de perfusion coronarienne supérieure à 20 mmHg peut être observée lors du pacing. Si cela se présente sur un seul animal, cela pourra justifier des études complémentaires sur un nom. Ce chiffre est plus lié à un nombre suffisant au-delà duquel, s’il n’est pas possible d’atteindre le seuil de 20mmHg de pressions coronarienne sur au moins un animal, nous pourrons estimer que le bénéfice est trop « rare » pour mériter des investigations plus lourdes.

Raffinement

Les animaux sont hébergés dans des boxes individuels « contigus » avec la possibilité d’interagir (se sentir, s’entendre, se « renifler » à travers les grilles …). Si besoin, les jouets peuvent être renouvelés. Les animaux seront maintenus sous anesthésie générale, avec administration d’antalgiques puissants, tout au long de la procédure.

Choix des espèces

Notre choix s’est porté sur l’espèce porcine compte tenu de sa proximité avec l’homme au vu de sa masse corporelle, de son anatomie cardiaque et des valeurs usuelles des paramètres hémodynamiques. Porcs de 30 kg.

300 rats vont être utilisés dans des procédures menées sous anesthésie, les animaux étant tués avant tout réveil. Chaque rat subit une chirurgie permettant d'enregistrer et de stimuler le système nerveux sympathique, puis est mis à mort en fin d'intervention. Le porteur, une société, indique vouloir développer un dispositif médical contre l'obésité par stimulation électrique, et affirme qu'aucun test in vitro validé n'offre d'alternative pour un phénomène jugé trop complexe. Il présente les traitements actuels comme insuffisants pour justifier ce développement.

Objectifs

L'objectif de ce projet est de développer un dispositif médical contre l’obésité par stimulation bioélectronique du système nerveux sympathique chez le rat. De nombreux arguments et données scientifiques sont en faveur de l’existence d’une modulation neuronale du système nerveux sympathique pour traiter l’obésité. En effet, les signaux acheminés (nommés afférences) par le système nerveux sympathique jouent un rôle important dans la prise alimentaire: -1/3 des neurones spinaux sont sensibles à la distension stomacale, également nommé gastroparésie trouble fonctionnel digestif caractéristique de l’obésité, généralement chronique et caractérisé par un ralentissement de la vidange de l’estomac, en l’absence de tout obstacle mécanique. -Les afférences sympathiques sont sensibles à l’augmentation de glucose dans le duodénum. - L’inhibition des afférences sympathiques augmente la prise alimentaire. La stimulation du système nerveux sympathique pourrait être une solution permettant de lutter contre l’obésité. Les traitements actuels sont inefficaces. En effet, les traitements existants les plus efficaces sont le by-pass gastrique et la chirurgie bariatrique dont les effets passent par le système nerveux sympathique. Cette hypothèse d’une implication du système nerveux sympathique a été testée chez le rat. Cependant, ces deux traitements sont très invasifs et entraînent des effets indésirables (troubles digestifs, vomissement…) chez l’humain. Le développement d’un dispositif médical permettant par électrostimulation du système sympathique la régulation de la prise alimentaire pourrait être un outil très prometteur afin de lutter contre l’obésité. Les avantages de ce dispositif seraient : - de cibler les effets de l’électrostimulation par une organisation régionale du système sympathique - d’activer un arc reflexe simple - Une localisation anatomique qui rendrait le positionnement du dispositif accessible par voie dorsale - Une mise en œuvre peu invasive. Un dispositif similaire d’électrostimulation a déjà été approuvé en 2014 par la FDA pour le traitement de douleurs dorsales réfractaires à la chirurgie.

Bénéfices attendus

Les traitements actuels ne permettent pas de lutter efficacement contre l’obésité (Muller et al. Nat Rev Drug Discov 2021). Les deux traitements les plus efficaces sont le by-pass gastrique et la chirurgie bariatrique qui sont des traitements lourds, engendrant de nombreux effets secondaires. Par conséquent, le développement de traitements moins invasifs, plus efficaces et sans effets secondaires est nécessaire pour lutter contre l’obésité.

Procédures

La procédure de ce projet est sans réveil. Les animaux seront soumis à une procédure chirurgicale afin de réaliser les enregistrements/stimulation du système sympathique. Les animaux seront euthanasiés à la fin de la procédure.

Impact sur les animaux

La procédure mise en œuvre dans ce projet est une procédure sans réveil. La chirurgie et les enregistrements/stimulations seront menés dans le respect de la règle des 3R avec des protocoles d’anesthésie/analgésie adaptés à l’espèce de façon limiter au maximum la douleur.

Devenir

Les animaux inclus dans une expérimentation seront tous mis à mort à la fin de la procédure expérimentale.

Remplacement

Il n’existe aucune méthode in vitro validée scientifiquement ou test in vitro connu qui offrirait une alternative à l’expérimentation animale pour répondre aux questions adressées dans ce projet. Le phénomène d’obésité ne peut être étudié correctement in vitro car il s’agit d’un phénomène complexe et doit donc être étudié chez l’animal, intégrant l'ensemble de la biologie d'un organisme vivant. L’utilisation d’un modèle expérimental in vivo est donc un prérequis à la phase de développement clinique. Nos expérimentations au sein de la société, même si elles nécessitent l’utilisation d’animaux, sont pratiquées avec un souci permanent de réduction du nombre d’animaux et de bien-être pour les animaux en expérimentation. Toutes les expériences sont réalisées dans le respect éthique de la règle des 3 R.

Réduction

Le nombre de rat a été réduit autant que possible, tout en étant suffisant pour l'obtention de résultats exploitables. L'évaluation du nombre d'animaux nécessaire a été effectuée par un test statistique. Les résultats seront analysés avec GraphPad Prism. Nous adapterons les tests statistiques en fonction de la distribution des observables, qu'elle soit normale (tests paramétriques : t-test pour comparer 2 échantillons, ANOVA pour comparer le nombre d’échantillons) ou non (tests non paramétriques : Mann-Whitney ou Kruskall Wallis). De plus des dispositions sont prises pour éviter tout double emploi injustifié des procédures expérimentales. Cette procédure est menée au sein d'une société qui effectue une planification rigoureuse des expériences menées. Elle ne duplique en aucun cas une autre procédure expérimentale.

Raffinement

Dès leur arrivée, les animaux seront hébergés dans des cages collectives avec un environnement enrichi (par exemple : igloos, briques de bois à grignoter, ambiance sonore dans la salle, commutation progressive de la lumière, etc.). Suivra alors une période d’acclimatation de 5 jours minimum, pendant laquelle aucun geste technique lié à la procédure expérimentale ne sera réalisé. Les conditions d’hébergement et de soins, et les méthodes utilisées ont été choisies et conçues de manière à réduire au maximum toute douleur, angoisse ou dommages durables que pourraient ressentir les animaux. Le contrôle mortalité des animaux sera effectué quotidiennement sans exception (Week-ends & jours fériés) par du personnel compétent et qualifié. Le bien-être des animaux sera évalué quotidiennement par l’observation des signes cliniques. Soins : Des points limites ont été établis afin d’anticiper toute dégradation de l’état de santé général des animaux et, le cas échéant, d’appliquer des protocoles de soins adaptés.

Choix des espèces

L’espèce rat sera utilisée en raison des données de la littérature démontrant une implication du système nerveux sympathique dans la prise alimentaire sur ce modèle. Ce modèle sera par la suite transposé à l’humain. Utilisation d’animaux adultes car l’objectif est le développement d’un dispositif médical pour les sujets adultes.

110 rats vont être utilisés dans des procédures menées sous anesthésie, les animaux étant tués avant tout réveil. Chaque rat subit une ouverture de la cage thoracique et un enregistrement de l'activité cardiaque de moins de quarante-cinq minutes, avant l'euthanasie. Le porteur indique tester des peptides rendus sensibles à la lumière pour contrôler optiquement le rythme cardiaque, et affirme que seule l'expérimentation animale permet de valider l'intérêt clinique de l'approche. Il s'agit d'une preuve de concept, les perspectives thérapeutiques étant renvoyées à des étapes ultérieures.

Objectifs

Les troubles du rythme cardiaque d’origine génétique, médicamenteuse ou bien secondaires à une pathologie cardiaque ischémique conduisent dans de nombreux cas à des syncopes et des morts subites, le plus souvent au repos ou lors du sommeil. Les approches thérapeutiques actuelles requirent l’implantation d’un défibrillateur automatique ou bien l’utilisation de molécules anti-arythmiques dont la fenêtre thérapeutique est étroite en raison des effets secondaires associés à ces molécules. L'objectif de ce projet est de démontrer la possibilité de contrôler optiquement et in vivo l’activité électrique cardiaque dans un modèle de rat sauvage en utilisant des peptides préalablement rendus photo-sensibles. Les composés sont injectés sous forme inactive. L’illumination à 365-405 nm permet un clivage du groupement protecteur et donc l’activation du peptide dans les zones illuminées uniquement. Ces peptides ont été sélectionnés in vitro pour leurs effets sur des cibles thérapeutiques potentielles identifiées lors d’études précédentes. Ainsi, par cette approche de contrôle optique de l’activité électrique cardiaque, il sera par la suite possible de cibler les zones arythmogènes du cœur dans des modèles murins arythmiques ou bien chez le gros animal.

Bénéfices attendus

Ce projet devrait permettre : 1. de faire la preuve de concept du contrôle optique de l’activité de composés ciblant les canaux ioniques présents dans le cœur et impliqués dans la génération des arythmies cardiaques, et 2. de contrôler la survenue d’arythmies cardiaques en s’affranchissant des effets secondaires dans les zones du cœur non ciblées, offrant ainsi de nouvelles perspectives thérapeutiques.

Procédures

La totalité des animaux sera soumise à une thoracotomie et un enregistrement électrocardiographique 6 dérivations. Le temps total de l’intervention sera inférieur à 45 min.

Impact sur les animaux

La procédure expérimentale mise en œuvre lors de ce projet nécessite la mise en place d’une thoracotomie. La gestion préopératoire de la douleur doit empêcher la survenue d’effets indésirables. Il s’agit d’une procédure sans réveil qui ne nécessite donc pas d’analgésie post-opératoire. Une étude précédente a démontré en aigu et chez la souris, l’absence d’effets indésirables de l’injection d’un peptide protégé comme réalisé dans cette étude. De plus l’ensemble de la procédure sera faite sous anesthésie avec sacrifice de l'animal en fin d'examen.

Devenir

A l’issue de la procédure, tous les animaux sont euthanasiés par injectionintrapéritonéale de dose léthale de pentobarbital sodique (120 mg/kg) après sédation.

Remplacement

Cette étude requiert une exploration fonctionnelle afin de valider in vivo une approche de contrôle optique de l’activité électrique cardiaque. Seule l'expérimentation animale peut permettre de déterminer si l’approche testée présente un intérêt clinique en limitant la survenue d’arythmies. Les peptides qui seront testés chez la souris ont été sélectionnés pour leurs effets sur nos cibles thérapeutiques à l'issue d'un screening réalisé sur des lignées cellulaires, réduisant ainsi le recours au modèle animal.

Réduction

Un maximum de 110 rats seront utilisés dans cette étude. Au fur et à mesure de l'inclusion des données, des analyses statistiques seront réalisées. Si une différence statistiquement significative entre les rats du groupe contrôle et ceux recevant une illumination apparait (une valeur de p

Raffinement

Avant la procédure, Les rats seront hébergés par couple en cages ventilées enrichies de tunnels pour se camoufler, ou de papier pour fabriquer des nids. Toutes les procédures seront réalisées sous anesthésie (isoflurane) avec une prise en charge analgésique adaptée. Les peptides à tester, sous leur forme protégée, ayant été sélectionnés pour leur absence d’activité sur leurs cibles, nous n'anticipons pas de douleur ou d'effets indésirables suite à leur injection. Toutefois, si l'un des peptides devait entrainer des effets indésirables détectables sous anesthésie, comme des difficultés respiratoires ou des convulsions, l'examen serait interrompu et le rat euthanasié. Au cours de la chirurgie, un saignement abondant non maitrisable ou bien une extubation de l’animal conduirait à une euthanasie de celui-ci.

Choix des espèces

Le rat constitue un bon modèle pour l’études des arythmies cardiaques et de part la taille du cœur, offre une approche plus aisée que la souris pour le contrôle optique et localisé de l’activation des composés injectés. L'étude sera réalisée sur des rats adultes de 8-10 semaines pour faciliter les abords chirurgicaux.