Chiens
Epreuve Maladie de Carré (CDV) par voie intraveineuse chez le chien
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
150 chiens vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance allant de léger à sévère. Ils reçoivent un vaccin candidat une à cinq fois, puis le virus de la maladie de Carré injecté dans une veine sous anesthésie, avant des écouvillonnages oculaires et buccaux et des prélèvements sanguins répétés. Les chiens du groupe témoin ne sont pas vaccinés et développent la maladie, avec myoclonies, convulsions, vomissements, diarrhées et écoulements nasaux purulents. Cinq à six candidats vaccins pourront être testés de cette manière, le nombre de chiens étant fixé par les textes réglementaires que le porteur invoque comme cadre de l'étude.
Objectifs
Le projet a pour but d’évaluer l’efficacité d’un vaccin destiné au chien contre la maladie de Carré. Pour qu’un vaccin soit autorisé, il faut notamment démontrer que celui-ci apporte un effet bénéfique sur l’animal pour la pathologie considérée. Les études sont réalisées sur l’espèce cible (chien) pour s’approcher au mieux des conditions réelles d’utilisation (Pharmacopée Européenne et réglementations des pays destinataires). Pour démontrer l’efficacité d’un vaccin contre cette pathologie canine, une phase d’épreuve suit la phase d’administration du vaccin. L’épreuve correspond à l’administration d’un agent pathogène pour reproduire expérimentalement la pathologie.
Bénéfices attendus
La finalité de ces études est de permettre le développement de vaccins efficaces contre la maladie de Carré et donc de réduire l’impact des maladies infectieuses chez les chiens.
Procédures
Les nuisances prévues sur les animaux sont les suivants : - Administration du vaccin : 1 à 5 fois avec 2 à 5 semaines d’intervalle, sur tous les animaux en vigile, acte inférieur à 1 minute. - Administration de l’agent pathogène en intra-veineuse, 1 fois sur tous les animaux anesthésiés, acte inférieur à 10 minutes - Ecouvillons oculaires et buccaux sur tous les animaux en vigile, acte inférieur à 3 minutes - Prélèvements sanguins plusieurs fois pendant l’étude sur tous les animaux en vigile, acte inférieur à 1 minute. - Observation clinique quotidienne sur tous les animaux en vigile, 5 minutes/animal.
Impact sur les animaux
Les nuisances ou effets indésirables attendus sur les animaux sont les suivants : - La contention et la répétition d’actes techniques (administrations et prélèvements) peuvent occasionner un stress et éventuellement de la douleur. - Les écouvillons oculaires et buccaux peuvent provoquer une gêne pour l’animal. - Le développement de la pathologie peut donner lieu à des signes cliniques sévères (myoclonies, convulsions, diarrhées, vomissements, douleur abdominale, écoulement nasaux purulent, signes cutanés…) notamment chez les animaux non-vaccinés = animaux témoins dans les études d’efficacité.
Devenir
Tous les animaux sont euthanasiés en fin d'étude, pour des raisons de biosécurité liées à la catégorie de risque de l’agent biologique (ARG2), aucun chien administré (même protégé) ne peut ressortir du batiment (confinement BSL2).
Remplacement
Lorsque cela est possible, une première étape dans le projet de développement d’un vaccin consiste à tester in vitro différents candidats. Ceci permet une première sélection de ces derniers, réduisant ainsi le nombre de candidats à tester in vivo donc le nombre d’animaux utilisés. Une série de tests analytiques permet de garantir un certain niveau de sécurité pour les animaux recevant le produit. Un recueil d’informations est aussi apporté par la bibliographie lorsque cela est possible.
Réduction
Pour les études réglementaires, le nombre d’animaux est fixé par les textes. En amont, lors des phases recherche, les effectifs sont évalués au plus juste de façon à minimiser le nombre de chiens tout en permettant d’interpréter les résultats des études. 5 à 6 candidats vaccins pourront être testés.
Raffinement
Pour chaque étude, une période d’acclimatation systématique est prévue dans le but de limiter le stress des animaux et de stabiliser leur état physiologique (sauf cas exceptionnels subordonnés au protocole expérimental). Les conditions d’hébergement sont adaptées à l’espèce et à l’âge des animaux pour maximiser leur confort et leur bien-être. Dans le cas d’études sur jeunes animaux (moins de 7 semaines d’âge), les animaux seront hébergés avec leur mère ou une nourrice. Les animaux sont hébergés en groupe. Des enrichissements adaptés au milieu sont mis en place. La contention et les actes techniques sont réalisés par un personnel hautement qualifié. Ils peuvent avoir recours à une anesthésie et/ou une analgésie si l’acte ou l’animal le nécessite. Pour l’administration de l’agent pathogène en intra-veineuse, une anesthésie légère d’une durée d’environ 10 minutes est réalisée pour permettre la pose d’un cathéter et l’administration lente de la souche d’épreuve. Une surveillance accrue des animaux juste après cette administration (~2 à 3h) pour s’assurer du bon réveil des animaux et du bon déorulé de l’administration. Des points limites spécifiques de la pathologie sont définis. Ces critères sont en constante évolution de manière qu’ils reflètent au mieux l’expérience du terrain et l’état actuel des connaissances vétérinaires. Le personnel est formé et compétent pour identifier les cas pour lesquels l’animal n’est plus dans son état physiologique optimal. Une observation quotidienne ou bi-quotidienne des animaux est réalisée. Elle porte sur les points suivants : apparence physique externe, comportement spontané, comportement provoqué/réponse aux stimuli externes. La Structure du Bien Etre Animal (SBEA) garantit l’amélioration des techniques de soins et des conditions de vie des animaux.
Choix des espèces
L’évaluation sur espèce cible (chien) est une exigence règlementaire et le modèle optimal pour réaliser les études à ce stade de connaissance. En générale la vaccination s’effectue à 7 semaines d’âge, mais des animaux de 4 semaines pourront être inclus (animaux nés sur site ou chez un fournisseur). Dans ce cas les chiots seront hébergés avec leur mère ou une nourrice. Dans les études de durée d’immunité, les chiots sont vaccinés jeunes puis observés jusqu’à l’âge adulte pour tester la durée de protection conférée par le médicament. Pour la mise au point de modèle d’épreuve, des animaux adultes (> 12 mois) peuvent également être utilisés.
Epreuve CAV1 (Adénovirus Canin de type 1) par voie intra-veineuse chez le chien
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
Vaccinés une à cinq fois, puis infectés par l'adénovirus canin injecté dans une veine sous anesthésie, 50 chiens subissent ensuite des prélèvements sanguins répétés et une observation clinique quotidienne, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance allant de léger à sévère. Des chiots de quatre à sept semaines peuvent être inclus, hébergés avec leur mère ou une nourrice. Les chiens non vaccinés forment le groupe témoin et développent la maladie sans protection, avec diarrhées, apathie, hypothermie et douleur abdominale. Aucun ne ressort du bâtiment de confinement, tous sont tués en fin d'étude pour des raisons de biosécurité.
Objectifs
Le projet a pour but d’évaluer l’efficacité d’un vaccin destiné au chien contre l’Hépatite de Rubarth. Pour qu’un vaccin soit autorisé, il faut notamment démontrer que celui-ci apporte un effet bénéfique sur l’animal pour la pathologie considérée. Les études sont réalisées sur l’espèce cible (chien) pour s’approcher au mieux des conditions réelles d’utilisation (Pharmacopée Européenne et réglementations des pays destinataires). Pour démontrer l’efficacité d’un vaccin contre cette pathologie canine, une phase d’épreuve suit la phase d’administration du vaccin. L’épreuve correspond à l’administration d’un agent pathogène pour reproduire expérimentalement la pathologie.
Bénéfices attendus
La finalité de ces études est de permettre le développement de vaccins efficaces contre l’Hépatite de Rubarth et donc de réduire l’impact des maladies infectieuses chez les chiens.
Procédures
Les nuisances prévues sur les animaux sont les suivants : - Administration du vaccin : 1 à 5 fois avec 2 à 5 semaines d’intervalle, sur tous les animaux en vigile, acte inférieur à 1 minute. - Administration de l’agent pathogène en intra-veineuse, 1 sur tous les animaux anesthésiés, acte inférieur à 10 minutes - Prélèvements sanguins plusieurs fois pendant l’étude sur tous les animaux en vigile, acte inférieur à 1 minute. - Observation clinique quotidienne sur tous les animaux en vigile, 5 minutes/animal.
Impact sur les animaux
Les nuisances ou effets indésirables attendus sur les animaux sont les suivants : - La contention et la répétition d’actes techniques (administrations et prélèvements) peuvent occasionner un stress et éventuellement de la douleur. - Le développement de la pathologie peut donner lieu à des signes cliniques sévères (diarrhées, apathie, hypothermie, douleur abdominale) notamment chez les animaux non-vaccinés = animaux témoins dans les études d’efficacité.
Devenir
Tous les animaux sont euthanasiés en fin d'étude, pour des raisons de biosécurité liées à la catégorie de risque de l’agent biologique (ARG2), aucun chien administré (même protégé) ne peut ressortir du batiment (confinement BSL2).
Remplacement
Lorsque cela est possible, une première étape dans le projet de développement d’un vaccin consiste à tester in vitro différents candidats. Ceci permet une première sélection de ces derniers, réduisant ainsi le nombre de candidats à tester in vivo donc le nombre d’animaux utilisés. Une série de tests analytiques permet de garantir un certain niveau de sécurité pour les animaux recevant le produit. Un recueil d’informations est aussi apporté par la bibliographie lorsque cela est possible.
Réduction
Pour les études réglementaires, le nombre d’animaux est fixé par les textes. En amont, lors des phases recherche, les effectifs sont évalués au plus juste de façon à minimiser le nombre de chiens tout en permettant d’interpréter les résultats des études. 3 à 4 candidats vaccin pourront être traités
Raffinement
Pour chaque étude, une période d’acclimatation systématique est prévue dans le but de limiter le stress des animaux et de stabiliser leur état physiologique (sauf cas exceptionnels subordonnés au protocole expérimental). Les conditions d’hébergement sont adaptées à l’espèce et à l’âge des animaux pour maximiser leur confort et leur bien-être. Dans le cas d’études sur jeunes animaux (moins de 7 semaines d’âge), les animaux seront hébergés avec leur mère ou une nourrice. Les animaux sont hébergés en groupe. Des enrichissements adaptés au milieu sont mis en place. La contention et les actes techniques sont réalisés par un personnel hautement qualifié. Ils peuvent avoir recours à une anesthésie et/ou une analgésie si l’acte ou l’animal le nécessite. Pour l’administration de l’agent pathogène en intra-veineuse, une anesthésie légère d’une durée d’environ 10 minutes est réalisée pour permettre la pose d’un cathéter et l’administration lente de la souche d’épreuve. Pour les chiots (inférieurs à 6 mois), le volume administré est de 1.0mL. Pour les animaux adultes, le volume administré ne dépassera pas 10mL. Une surveillance accrue des animaux juste après cette administration (~2 à 3h) pour s’assurer du bon réveil des animaux et du bon déorulé de l’administration. Des points limites spécifiques de la pathologie sont définis. Ces critères sont en constante évolution de manière qu’ils reflètent au mieux l’expérience du terrain et l’état actuel des connaissances vétérinaires. Le personnel est formé et compétent pour identifier les cas pour lesquels l’animal n’est plus dans son état physiologique optimal. Une observation, a minima, quotidienne des animaux est réalisée. Elle porte sur les points suivants : apparence physique externe, comportement spontané, comportement provoqué/réponse aux stimuli externes et détection des signes cliniques de la maladie. La Structure du Bien Etre Animal (SBEA) garantit l’amélioration des techniques de soins et des conditions de vie des animaux.
Choix des espèces
L’évaluation sur espèce cible (chien) est une exigence règlementaire et le modèle optimal pour réaliser les études à ce stade de connaissance. En générale la vaccination s’effectue à 7 semaines d’âge, mais des animaux de 4 semaines pourront être inclus (animaux nés sur site ou chez un fournisseur). Dans ce cas les chiots seront hébergés avec leur mère ou une nourrice. Dans les études de durée d’immunité, les chiots sont vaccinés jeunes puis observés jusqu’à l’âge adulte pour tester la durée de protection conférée par le médicament. Pour la mise au point de modèle d’épreuve, des animaux adultes (> 12 mois) peuvent également être utilisés.
Production de sang et sérum canin servant de base à la production d’un vaccin à usage vétérinaire
- Production de routine
- Tests réglementaires
La production annuelle de sang et de sérum est fixée par les besoins d'un donneur d'ordre qui fabrique un vaccin vétérinaire contre la piroplasmose. 100 chiens vont être utilisés pour cela, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance modérés à sévères. Chaque semaine au maximum, ils sont amenés en salle de prélèvement et saignés à la veine jugulaire sans anesthésie, de l'âge de 12 mois jusqu'à 5 ou 8 ans. Le porteur reconnaît que le confinement en bâtiment clos provoque stéréotypies, crainte et dominance, surtout chez les plus âgés, et qu'un comportementaliste canin consulté n'a pas réussi à intéresser ces chiens-là aux nouveaux enrichissements. 40 chiens doivent être proposés à l'adoption, les plus vieux étant jugés non réhabilitables et tués à l'issue.
Objectifs
Ce projet a pour objectif de produire du sang et du sérum canins servant de base à la production d'un vaccin à usage vétérinaire. Le vaccin produit avec ces dérivés sanguins permet de protéger les animaux contre une maladie parasitaire transmise par les tiques : la piroplasmose. Cette maladie peut être sévère, voire mortelle pour l’animal. La production annuelle est fonction des besoins estimés annuellement par le donneur d’ordre pour produire le vaccin à usage vétérinaire.
Bénéfices attendus
Ce projet permet la production d’un vaccin vétérinaire luttant contre une maladie parasitaire (transmise par les tiques) chez les animaux pouvant être sévère, voire mortelle pour les animaux.
Procédures
L’ensemble des chiens est soumis à des prélèvements sanguins au maximum une fois par semaine. Ces prélèvements sont réalisés à la veine jugulaire sur animaux vigiles. Lors d’une séance de prélèvement, le chien est amené avec ses congénères de son box dans la salle de prélèvement où ils restent une dizaine de minutes avant de retourner dans leur box d’hébergement. Le prélèvement en lui-même dure quelques minutes par chien. Le volume et la fréquence des prélèvements sont définis en fonction des recommandations internationales. - De manière standard, les prélèvement sont suivis d’une semaine de repos. Occasionnellement, les prélèvements sont suivis d’une période de repos plus longue (par exemple à l’occasion de leur vaccination et/ou vermifugation où ils ont deux semaines de repos). A la fin de la procédure expérimentale, si la réhabilitation de l’animal n’est pas possible et que son état le permet, un dernier prélèvement est prélevé avant sa mise à mort.
Impact sur les animaux
Au moment du prélèvement sanguin, les animaux subissent une nuisance limitée liée au stress de la contention et de l’introduction d’une aiguille entrainant une sensibilité légère et transitoire au point d’introduction. Les animaux sont hébergés durant toute la durée du projet dans un environnement protégé en bâtiment clos. De par leur gabarit et leur comportement naturel, les enrichissements standards ne sont pas adaptés. La durée de confinement pour chaque chien peut entrainer des perturbations comportementales (dominance, stéréotypie, stress). Ils peuvent par exemple être plus craintifs à la vue de nouveaux éléments ou dominant envers leur congénère. Ces troubles du comportement sont surtout présents chez les chiens les plus âgés, moins réceptifs aux efforts renforcés menés sur les enrichissements et la socialisation par la SBEA depuis plus de deux ans. Le travail de socialisation et enrichissement de l’environnement en amont de l’inclusion, depuis leur jeune âge, contribuera à raffiner ce mode d’hébergement pour les derniers chiens inclus ces deux dernières années. De plus, pour ces chiens inclus depuis 2 ans maximum, la durée de confinement sera réduite ce qui contribuera à faciliter leur réhabilitation à la fin du projet.
Devenir
Pour les animaux réceptifs aux actions de socialisation mise en place par la SBEA, tout sera mis en œuvre pour qu’ils puissent être mis à l’adoption dans de bonnes conditions à l’issue du projet. La décision de cette réhabilitation se fera au cas par cas, sur avis vétérinaire, et avec la collaboration d'associations spécialisées. Pour les plus vieux chiens, déjà inclus dans ce projet, la procédure expérimentale s’arrêtera au maximum à leur 8 ans. Ces animaux moins réceptifs aux actions de socialisation ne pourront probablement pas être réhabilité et seront donc mis à mort à l’issu du projet. Cette décision sera prise au cas par cas, sur avis vétérinaire.
Remplacement
L'utilisation de chiens sur ce projet est justifiée car il n’existe pas de méthode alternative pour produire des dérivés sanguins permettant la fabrication du vaccin vétérinaire concerné.
Réduction
Aucune approche statistique n’est réalisée pour ce projet. Le nombre d’animaux utilisés correspond au minimum requis pour répondre au besoin en sang et sérum du producteur du vaccin. Il a été déterminé en fonction du volume de sang pouvant être prélevé sur les chiens (selon les recommandations internationales) et de la durée d’utilisation de ces animaux.
Raffinement
La fréquence et le volume des prélèvements sanguins respectent les recommandations internationales. Les volumes prélevés sont adaptés aux besoins du laboratoire producteur du vaccin et sont évalués chaque année. Un suivi attentif des animaux est réalisé afin de détecter tout signe de douleur ou d’inconfort au cours du prélèvement et dans les heures suivantes. Des compléments minéral et vitaminé sont donnés aux animaux à l’issue de la séance afin d’optimiser leur récupération. Ces compléments sous forme de comprimés appétents sont perçus comme une friandise permettant un renforcement positif de l’intervention. Afin de s’assurer de la bonne santé des animaux, en plus de leur observation quotidienne réalisée par le personnel soigneur, un examen vétérinaire est réalisé une fois par trimestre. Les chiens sont pesés une fois par mois et l’alimentation est adaptés en fonction. Des analyses sanguines sont effectuées régulièrement. Les animaux présentant la moindre pathologie sont pris en charge par le vétérinaire, mis au repos et exclus temporairement des séances de prélèvements. Ils sont suivis jusqu’à leur plein rétablissement. Au plus tard à l'âge de 8 ans (âge de réforme) les animaux sont exclus du pool. Un comportementaliste canin a été consulté et sur la base de ses recommandations, de nouveaux enrichissements sonore, visuel, lumineux ont été mis en place progressivement ainsi que des jeux et tunnels dans les box et des séances de socialisation avec l’homme. Cependant les bénéfices sont plus visibles chez les derniers chiens inclus dans ce projet. En effet il reste difficile d’intéresser les chiens les plus âgés aux nouveaux enrichissements. La SBEA a établi un plan d’action pour améliorer encore les interactions avec ces chiens et continue de mettre en place de nouveaux enrichissements. Ces actions devraient permettre de réhabiliter au moins les plus jeunes chiens à la fin de ce projet.
Choix des espèces
L’objectif de ce projet est de produire du sang et du sérum canins, donc à partir de prélèvements sanguins sur des chiens. En raison de la fréquence et du volume des prélèvements sanguins réalisés, les animaux utilisés sont des chiens adultes. Les animaux sont prélevés de l'âge de 12 mois à 5 ou 8 ans maximum en fonction de la procédure expérimentale.
Travaux pratiques de physiologie cardiovasculaire et respiratoire chez le chien
- Enseignement supérieur
Illustrer un cours théorique de physiologie cardiovasculaire déjà donné en salle, telle est la finalité des séances où 32 chiens vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Chaque chien est mis à jeun moins de seize heures, ausculté par des étudiants vétérinaires, puis anesthésié jusqu'à une heure par un enseignant, deux fois par an au maximum et pendant trois ans. Aucun n'est tué, tous sont proposés à l'adoption, le porteur précisant qu'il est plus facile de les faire adopter avant quatre ans. Il ajoute que ces chiens ne sont pas achetés pour ces travaux pratiques mais déjà présents au chenil pour d'autres expériences, et compte les anesthésies répétées sur les mêmes individus parmi ses mesures de réduction.
Objectifs
Ces séances de TP ont pour objectif de faciliter l'acquisition des connaissances en physiologie cardiovasculaire et respiratoire chez les étudiants vétérinaires. Ils ont pour but d'illustrer l'enseignement théorique effectué en salle au préalable.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus sont une meilleure compréhension, par les futurs vétérinaires, de la physiologie cardiovasculaire et respiratoire, une première approche de l'anesthésie des carnivores et un apprentissage de cette pratique.
Procédures
Mise à jeun (alimentation seulement, pas de mise à jeun hydrique) : au maximum deux par année espacées de maximum 1 mois, mise à jeun de moins de 16h. Anesthésie : au maximum deux par année espacées de maximum 1 mois, 1h au maximum
Impact sur les animaux
Les animaux sont soumis à une contention légère par les étudiants vétérinaires lors de l'auscultation pré-anesthésie. Ils sont ensuite anesthésiés par l'enseignant vétérinaire (après mise à jeun seulement alimentaire de moins de 16h, pas de mise à jeun hydrique). Aucune procédure invasive n'est réalisée sur les animaux.
Devenir
Les animaux seront hébergés au maximum trois ans dans l'établissement utilisateur car il est plus facile de les proposer à l'adoption avant 4 ans.
Remplacement
Les mécanismes nerveux de régulation de la pression artérielle et de la pression partielle en oxygène ne peuvent être observés que sur un animal vivant sur lequel une légère perturbation de l'homéostasie a été induite (par une anesthésie dans ce projet). L'utilisation d'un chien d'expérimentation permet de réaliser une anesthésie sur un animal parfaitement sain, ce qui limite fortement la survenue d'effets indésirables.
Réduction
Si chaque chien subissait une anesthésie par an et que nous changions de lot de chiens tous les ans, il faudrait 16 séances de TP * 5 ans = 80 chiens pour la totalité du projet. Le projet prévoit cependant que chaque chien puisse être réutilisé pendant 3 ans, le nombre de chien utilisé pour le projet serait alors de 16 séances de TP * 2 lots de chiens =32 chiens pour la totalité du projet. Ces chiens pourront également être anesthésiés au maximum 2 fois par an, ce qui réduit le nombre de chiens à 16 séances de TP * 2 lots de chiens / 2 anesthésies = 16 chiens. Dans les faits, selon l'avis du vétérinaire référent, certains chiens ne pourront pas être anesthésiés deux fois par an pendant 3 ans, le nombre de chiens utilisés sur les 5 ans sera donc au minimum de 16 chiens et au maximum de 32 chiens. De plus, les chiens utilisés pour ces TP ne sont pas spécifiquement achetés et hébergés en chenil pour ce TP. Il s'agit de chiens prévus pour d'autres expérimentations non douloureuses et présents dans le chenil pendant la période d'enseignement.
Raffinement
Afin de participer à la séance de TP, les étudiants doivent participer à des séances théoriques préparatoires en salle. Pour faciliter la manipulation par les étudiants, les chiens sont régulièrement habitués à être manipulés lors de séances de socialisation et de medical training mises en oeuvre par des professionnels de l'éducation canine. Nous pourrons également profiter de l'anesthésie pour effectuer des soins vétérinaires courants le cas échéant (soins des griffes ou des dents par exemple). Les chiens seront proposés à l'adoption à l'issue des séances de TP. Des points limites adaptés ont été définis, notamment pour déterminer si une chienne est apte à participer au TP une nouvelle fois ou si elle doit être proposée à l'adoption.
Choix des espèces
Ce TP est destiné aux étudiants vétérinaires. Le chien est une espèce d'intérêt pour les étudiants qui permet la compréhension de mécanismes physiologiques complexes mais aussi l'apprentissage des gestes techniques qu'ils réutiliseront dans leur pratique en clinique (auscultation, pose de cathéter, injection intramusculaire, intubation trachéale, ...) Les chiens seront âgés de 1 à 4 ans. En effet, il est préférable de faire l'anesthésie sur un chien adulte mais pas trop âgé pour que les animaux ne présentent pas de contre-indication à l'anesthésie. De plus, l'utilisation de chiens de moins de 4 ans permet de les faire adopter plus facilement après les sessions de TP.
Evaluation préclinique de produits de santé pour la chirurgie cardiovasculaire
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
Chiens : 100
Cochons : 600
Chèvres : 80
Moutons : 170
600 porcs, 500 lapins, 170 moutons, 100 chiens et 80 chèvres vont être utilisés pour tester des stents, des prothèses vasculaires et des valves cardiaques avant leur mise sur le marché. Chaque animal subit une implantation chirurgicale d'une à quatre heures selon la difficulté de l'accès au cœur, avec un risque d'hémorragie ou d'ischémie, parfois suivie d'une biopsie d'une heure et de séances d'imagerie dans un autre établissement. 950 sont utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, 160 dans des procédures sévères, 240 sont opérés sans jamais être réveillés, et les 1 450 sont tués pour l'examen des tissus au contact du dispositif. Le donneur d'ordre commande ces essais et s'engage à ne pas les faire refaire à l'identique, le porteur indiquant par ailleurs que la réglementation impose le recours aux animaux avant tout test clinique.
Objectifs
Ce projet vise à évaluer la tolérance (ou sécurité) ainsi que la performance (ou efficacité) des produits de santé en chirurgie cardiovasculaire (exemple : stent, prothèse vasculaire, valve cardiaque...). Ces produits destinés à être mis en contact avec le corps humain doivent être préalablement testés pour garantir le bon rétablissement des patients après chirurgie, et pour garantir leur efficacité lors de l'utilisation clinique. La réglementation exige de prouver l'efficacité des produits de santé et de réduire au minimum le risque de réactions indésirables avant de proposer un produit sur le marché. Compte-tenu de la complexité des mécanismes de régulation d'un organisme vivant, le recours au modèle animal est nécessaire pour répondre aux objectifs du projet. Certains projets nécessiteront des séances d'imagerie (scanner, IRM), qui seront externalisés dans des établissements utilisateurs partenaires disposant de l'ensemble des équipements nécessaires pour la conduite des examens.
Bénéfices attendus
Ce projet permet d'obtenir dans différents modèles animaux des données de performance et de tolérance des produits de santé en chirurgie cardiovasculaire. Ainsi, il est possible d'étudier ces produits en vue de répondre aux exigences des autorités réglementaires dans l'obtention d'une autorisation de mise sur le marché, élargissant l'offre et améliorant ainsi les chances de guérison et/ou le confort des patients.
Procédures
Pour l'ensemble des procédures, tous les animaux seront soumis à une intervention chirurgicale afin d'implanter le dispositif médical à tester (cette intervention chirurgicale peut durer entre 1h et 3h voire 4h pour les chirurgies les plus compliquée (accès au cœur par exemple). Cette intervention a toujours lieu sous anesthésie générale (chimique et gazeuse), et analgésie. L’antibiothérapie est ajoutée au cas par cas en fonction de l’invasivité de la chirurgie et des risques infectieux associés. Des prélèvements sanguins peuvent etre réalisés en cours d'étude. Ceux-ci pourront se faire sous anesthésie ou non, selon le contexte de réalisation de cet acte (en cours de chirurgie, pendant le temps de l’étude ou juste avant l’euthanasie des animaux en fin d’étude). Un prélèvement intermédiaire ou biopsie peut être réalisé en cours d'étude (durée de l'intervention estimée à 1h) afin de suivre l'évolution de la réaction des tissus au contact du dispositif. Cette intervention se fera systématiquement sous anesthésie générale (chimique et gazeuse) et analgésie. D'autres type d'interventions non douloureuses, de type scanner ou radiographies pour observer le dispositif en cours d'étude, peuvent être réalisées sous anesthésie légère (en général, en fonction de la durée de l'étude, 1 à 3 sessions d'imagerie peuvent etre envisagées en cours d'étude). Le scanner ou l'IRM seront externalisés dans des établissements utilisateurs partenaires, la durée de l'intervention est d'environ 1h pour le scanner, et 1h30 pour l'IRM.
Impact sur les animaux
Les nuisances ou effets indésirables ne pouvant être résolus par des mesures de raffinement sont, selon les procédures, la survenue d'un hématome ou oedème au niveau du site opératoire, une hémorragie (perte de sang) ou ischémie (manque de perfusion sanguine d'organes) en raison des sites d'implantation (vaisseaux, coeur...). Les douleurs post-opératoires peuvent apparaitre et seront prises en charge par des mesures de raffinement. Les nuisances attendues en lien avec les séances d'imagerie sont le transport entre les établissements utilisateurs, pouvant être une source de stress. Les animaux recevront une anesthésie fixe afin de réaliser l'imagerie, pouvant induire un stress. Du produit de contraste pourra être injecté grâce à un cathéter en intraveineux. Une légère perte de poids (non systématique) pourrait être observée dans les quelques jours suivant l'anesthésie.
Devenir
Pour répondre aux objectifs de chacune des procédures du projet, des observations post-mortem sont nécessaires. En effet, la sécurité des produits est évaluée en observant la réaction des tissus au contact du dispositif à tester, et ceci se fait par prélèvements des tissus et organes entourant le produit, afin de réaliser des analyses microscopiques (histologie notamment, qui est la meilleure méthode d'évaluation des effets locaux induit par un produit étranger à l'organisme, comme l'inflammation par exemple). De même la performance peut, elle aussi, être évaluée par des tests spécifiques sur les organes et le dispositif prélevé (exemple : tests mécaniques sur des prothèses vasculaires pour évaluer l’élasticité du greffon). En raison des objectifs des procédures de ce projet, il n'est pas possible de maintenir en vie les animaux utilisés.
Remplacement
A ce jour, il n'existe pas de méthode alternative permettant d’évaluer la performance et la tolérance locale des produits de santé cardiovasculaire, en raison des interactions complexes s'établissant entre le tissus ciblé (exemple : vaisseaux, coeur) et le dispositif lui-même. De plus, l’utilisation d’animaux est requise dans la réglementation que doivent suivre les tests précliniques sur les dispositifs médicaux, avant de pouvoir lancer les tests cliniques.
Réduction
Le donneur d'ordre demandant la réalisation de ces tests s'engage à ne pas faire renouveler à l'identique un essai déjà mené précédemment. Par ailleurs pour réduire le nombre d'animaux inclus en étude, il est possible d'utiliser un même groupe "controle" (produit dont l'effet est déjà connu), pour plusieurs groupes "test" recevant des produits à tester différents. Les études de screening précédemment citées permettent également de sélectionner un produit test qui présente le plus d'intérêt à être développé, réduisant de ce fait le nombre de tests sur des produits ayant un intérêt moindre. Les études dites "pilotes" sur quelques animaux seulement, peuvent aussi servir à orienter les choix de poursuite de développement d'un produit ou le choix du modèle expérimental le plus approprié (matériel ou abord chirurgical le plus adéquat…), avant d'entamer les études réglementaires à plus grande échelle et devant répondre aux normes en vigueur pour l'élaboration du dossier pour la mise sur le marché (nombre d'animaux minimum, durée de mise en contact minimum, etc).
Raffinement
Afin de limiter le stress des animaux, une période d’acclimatation pendant laquelle ils ne subissent aucune manipulation non indispensable est réalisée à leur arrivée dans l’établissement utilisateur. Ensuite, avant la chirurgie, une période d’habituation aux actes spécifiques est réalisée si nécessaire pour réduire l’aspect anxiogène de ces manipulations (contention, palpation, isolement, mise en place de gilets pour porter les constituants de certains dispositifs). Des enrichissements sont présents dans l’environnement des animaux (en fonction de l'espèce : jouets, plateforme de repos, augmentation de la quantité de litière…), et ces mesures sont renforcées en phase post-opératoire (ajout d’enrichissements alimentaires par exemple pour certaines espèces). La chirurgie est réalisée sous anesthésie chimique et gazeuse et analgésie (à base de morphiniques). En cas de signes de douleur et signes cliniques, le traitement adapté sera mis en place. Les animaux sont suivis de façon quotidienne sur la base des critères suivants : apparence et état général, consommation alimentaire et hydrique et transit, attitude, comportements, signes cliniques. Les signes cliniques servant de points limites sont listés dans le document joint en annexe, pour la prise de décision des mesures à mettre en place pour limiter les souffrances. Si le traitement mis en place n'a pas d'effet, l'animal est euthanasié. En phase postopératoire, le suivi est renforcé et des soins post-opératoires spécifiques peuvent être mis en place (surveillance ou réfection des pansements, désinfection des sites chirurgicaux…). En cas d’anomalie clinique, sanitaire ou comportementale, l’équipe vétérinaire assure l’examen clinique et le suivi de l’animal, afin de mettre en place une gestion adéquate de la douleur ou de l’anomalie constatée. Le risque infectieux est controlé par l'administration d'antibiotiques. Les transports des animaux vers les établissements utilisateurs partenaires (séance d'imagerie) seront organisés dans le respect du bien-être animal et de la réglementation en vigueur. Un contrôle clinique de chaque animal est réalisé par du personnel qualifié au départ et à l'arrivée. Lors des séances d'imagerie externalisées, une période de repos de minimum 1h sera respectée entre la réception des animaux et l'anesthésie et entre le réveil et le transport retour. Le risque d'hypothermie sera contrôlée grâce à la température de la salle, l'isolation du sol, les couvertures, lampes chauffantes.
Choix des espèces
L’espèce animale choisie est définie dans les textes de référence (normes). Les produits de petite taille/miniaturisés seront testés préférentiellement chez le lapin. Les produits de taille importante seront préférentiellement testés chez le chien, les ovins/caprins ou les porcins. Lorsque plusieurs espèces répondent aux critères, le choix est arbitré par la durée de l’essai (pour une étude sur le long terme, utilisation d’espèces à longue durée de vie), ainsi que sur les similarités avec l’Homme. Par exemple, le chien est une espèce communement utilisée dans certains types de test car la thrombose induite par un dispositif médical a tendance à se déclencher plus rapidement que chez l'Homme. Les ovins et les porcins sont généralement de bons modèles en raison des similarités cardiovasculaires et hématologiques avec l'Homme. Les critères pris en considération dans le choix du stade de développement sont les suivants : 1.Suivi des recommandations des textes de référence Le stade de développement est exprimé en âge ou en poids. Dans la plupart des cas, l’utilisation d’animaux adultes est recommandée. 2.Propriétés intrinsèques du produit à tester En l’absence de recommandation particulière dans le(s) texte(s) de référence et si la nature du produit le requiert, le stade de développement est pertinemment sélectionné en fonction de l'utilisation clinique du produit ou de sa taille. En l’absence d’exigence particulière, l’utilisation d’animaux au stade adulte est privilégiée. 3.Cas particulier des porcs domestiques Pas de recommandation spécifique réglementaire d’où choix d’utiliser des porcs domestiques en croissance (âgés d’au moins 8 semaines). Etant donné les conditions d’hébergement, le comportement social et la manipulation des animaux, l’utilisation de porcs domestiques en croissance est la plus appropriée dans ce projet.
Evaluation du bénéfice de l’imagerie scanner dans différents domaines thérapeutiques chez le lapin, le porc, la brebis et le chien.
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Troubles musculosquelettiques
Chiens : 12
Cochons : 12
Moutons : 12
Amenés depuis un autre établissement le matin et ramenés le soir même, 12 chiens, 12 porcs et 12 brebis sont anesthésiés le temps d'une séance de scanner, à laquelle s'ajoutent 12 lapins hébergés sur place. Les procédures sont déclarées d'un niveau de souffrance léger et aucun des 48 animaux n'est tué dans le cadre de ce projet. Les lapins peuvent recevoir une anesthésie par jour pendant sept jours, pour un maximum de cinq scanners corps entier ou dix scanners ciblés, avec injection possible d'un produit de contraste. L'étude sert à préparer d'autres projets, ceux qui évalueront des candidats médicaments, et à l'issue les chiens, porcs et brebis repartent vers de nouvelles procédures expérimentales, quatre lapins seulement étant proposés à l'adoption.
Objectifs
L’objectif du projet est d’évaluer la faisabilité, la plus-value et les bénéfices scientifiques et/ou éthiques (réduction du nombre d’animaux nécessaire) de l’imagerie scanner dans différents projets relatifs à des aires thérapeutiques différentes : cardio-vasculaire, maladie de l’os et du cartilage, implants, … Ainsi, ce projet servira d’étude pilote afin de tester la faisabilité de l’imagerie (répondre à la question est-il possible de visualiser et/ou quantifier l’organe/tissu cible ?) et tester différents protocoles d’imagerie (injection ou non de produit de contraste, temps d’acquisition, paramètres scanner…) permettant d’obtenir des acquisitions optimales nécessaire pour répondre à l’objectif scientifique des études principales. La réalisation de scanner pourra être réalisé sur 4 espèces en fonction des besoins scientifiques des études principales : chez le lapin, la brebis, le porc ou le chien. Les résultats obtenus permettront d’intégrer de l’imagerie scanner ultérieurement dans le cadre d’étude précliniques d’évaluation de candidats médicaments. Les études principales cités ci-dessus feront l’objet de demande d’autorisation de projet spécifique pour chacune d’entre elles. Les animaux seront fournis par un second EU. Il s'agit donc d'un projet multisite qui se déroule sur 2 EU différents.
Bénéfices attendus
Ce projet contribuera à évaluer si l’utilisation de l’imagerie scanner dans des études d’efficacité de nouveaux médicaments / d’implants, de tolérance locale, … peut-être avantageuse afin de répondre à des objectifs précis sans avoir recours à l’euthanasie des animaux à chaque délai et donc en réduisant ainsi le nombre d’animaux inclus dans ces études. Ce projet permettra également de valider l’utilisation de l’imagerie scanner en tant que méthode d’analyse précise et robuste dans les études principales d’efficacité.
Procédures
Les animaux seront soumis à 1 session d’imagerie scanner pour les porcs, brebis et chiens et au maximum 1 session d’acquisition scanner sera réalisé par jour pendant 7 jours pour les lapins (1 session d’imagerie correspond à une anesthésie mais pouvant servir à la réalisation de plusieurs acquisitions scanner dans la foulée pour tester différents paramètres). Au maximum, durant toute l’étude, 5 scanners corps entier pourront être réalisés ou 10 scanners ciblés sur une région afin de minimiser la dose d’irradiation reçue. Une session d’imagerie (anesthésie comprise) durera en moyenne entre 20 et 45 minutes (maximum 1 heure).
Impact sur les animaux
Les brebis, porcs et chiens seront transportés vigiles entre leur EU d’origine et notre EU. L’aller-retour se fera dans la même journée. Ces transports peuvent être une source de stress. Les brebis, porcs et chiens seront mis à jeun avant l’examen scanner. Les animaux recevront une anesthésie en fixe (chien, porc et brebis) ou gazeuse (lapin) afin de réaliser l’imagerie scanner pouvant induire un stress. Lors de cette même anesthésie, un produit de contraste pourra être injecté grâce à un cathéter en intraveineux. Une légère perte de poids (non systématique) pourrait être observé dans les quelques jours suivant l’anesthésie.
Devenir
Les animaux ayant simplement été utilisés pour des actes d’imagerie non invasives (n’étant pas infectés ou traités avec un traitement pouvant causer des effets secondaires à long terme), les animaux pourront être, après une période de réhabilitation, réintégrés dans une nouvelle procédures expérimentales. Pour les lapins, certains d'entre eux pourront être proposés à l'adoption.
Remplacement
Au cours de ce projet, l'objectif sera de tester la faisabilité de l’imagerie (répondre à la question est-il possible de visualiser et/ou quantifier l’organe/tissu cible ?) chez le lapin, la brebis, le porc ou le chien. Il n'existe donc pas actuellement de méthodes alternatives permettant de modéliser un corps entier ou certains organes/tissues en imagerie scanner afin de tester différents paramètres d'imagerie (paramètres scanner, injection ou non de produit de contraste, ...). L'utilisation d'animaux dans cette procédure expérimentale est donc nécessaire.
Réduction
Le recours à l’imagerie médicale par scanner (CT) permet de suivre, au cours du temps, les mêmes animaux sans avoir à les euthanasier pour réaliser des analyses histologiques par exemple. Ce projet permettra donc à terme, grâce au recours au scanner, de diminuer le nombre d’animaux inclus dans les études d’efficacité finales. L’objectif de ce projet, étant de mettre au point et de tester des protocoles expérimentaux permettant d’obtenir des images scanner exploitables pour répondre à des objectifs scientifiques d’autres projets, entre 1 et 3 animaux par étude seront utilisés (au maximum 12 lapins, 12 brebis, 12 porcs et 12 chiens). Sauf en cas d’atteintes des points limites, les animaux ne seront pas euthanasiés à l’issu de ces actes d’imagerie et seront retournés dans leur établissement d’origine pour les porcs, brebis et chiens. Pour les lapins, ils seront, autant que possible, inclus dans d’autres protocoles expérimentaux ou utilisés dans le cadre de la formation du personnel et/ou adoptés selon la procédure mise en place au sein de notre EU.
Raffinement
Pour les lapins, une période d’acclimatation de 7 jours à minima sera respectée. Ces animaux seront hébergés en groupes, en parc, pendant toute la durée de l’étude (sauf exception : bagarre ou blessure justifiant un isolement de l’animal sur recommandation du vétérinaire) avec des enrichissements appropriés tels que des bâtonnets de bois à ronger, du foin, des balles, une plateforme et cachette. Ils seront suivis quotidiennement afin de détecter précocement tout signe clinique anormal et ainsi mettre en place rapidement des mesures de soutien (désinfection de plaies, isolement, réhydratation …) ou mise à mort en cas d’état clinique irréversible. Les lapins seront pesés une fois par semaine afin de suivre l’évolution de leur poids. La fréquence des pesées pourra être augmentée suivant l’état clinique des animaux et le nombre d’actes d’imagerie réalisé par animal. Une évaluation clinique des animaux sera basée sur différents critères adaptés à l’espèce. Pour les espèces: brebis, porcs et chiens, un transport sera organisé dans le respect du bien-être animal et de la réglementation en vigueur entre les deux EU. Des tapis anti-dérapants seront mis en place. Un contrôle clinique de chaque animal sera réalisé par du personnel qualifié (vétérinaire, technicien ou zootechnicien) au départ et à l’arrivée. Afin de limiter le stress des animaux, une période de repos de minimum 1h sera respectée entre la réception des animaux et l’anesthésie pour les acquisitions scanner, et entre le réveil des animaux et le transport retour. Du gel oculaire de type vaseline ou Ocrygel sera appliquée au niveau de la cornée lors des anesthésies des animaux afin d’éviter tout assèchement oculaire. Une attention particulière sera portée à la lutte contre l’hypothermie : température de la salle, l’animal est placé sur le sol équipé d’un isolant avec des couvertures si besoin. Des lampes chauffantes seront rajoutées si nécessaire. En cas de doute, une mesure de la température rectale sera réalisée.
Choix des espèces
Les espèces (lapins, brebis, porcs et chiens) seront utilisés au stade adulte (à partir de 10 semaines pour les lapins, 4 mois pour les porcs et 12 mis pour les brebis et chiens). Les espèce et les stades de développement ont été choisies en fonction des espèces et des stades de développement qui seront utilisées à la suite de ce projet pour évaluer l’efficacité de nouveaux candidats médicaments. L’adéquation entre les espèces et leur stade de développement de l’étude de mise au point et les études principales d’efficacité ultérieures est indispensable pour éviter tous biais expérimentaux.
Etude pharmacocinétique de nouveaux produits vétérinaires chez le chien.
- Recherche appliquée
- Maladies animales
- Tests réglementaires
- Toxicologie et autres tests de sécurité
Élevés par un fournisseur installé sur le même site que le laboratoire, 300 chiens vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, puis restent disponibles pour d'autres expériences après une période de repos. Chacun subit douze à trente prélèvements de sang, quatorze possibles sur les seules 24 premières heures d'après la description des procédures et seize d'après celle des nuisances, l'administration du produit testé, et parfois trois à six ponctions de la vessie à travers la paroi abdominale sous anesthésie locale. Le porteur reconnaît que le stress engendré par ces prélèvements répétés sera "non négligeable" pour l'animal. Aucune analyse statistique n'est prévue, le nombre d'animaux étant ajusté et justifié par le "Donneur d'Ordre" pour chacune des deux à cinq études menées chaque année.
Objectifs
L’objectif de ce projet est d'étudier la pharmacocinétique de nouveaux produits vétérinaires chez le chien.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra la mise à disposition de nouveaux produits permettant de mieux protéger/traiter les chiens face à différentes maladies canines.
Procédures
Les interventions suivantes seront réalisées sur l'ensemble des chiens : 1) Prélèvements sanguins sur animaux vigiles (quelques secondes) : plusieurs prélèvements sanguins espacés de façon croissante et régulières durant toute la durée de l’étude soit 12 à 30 prélèvements selon la durée de la procédure (avec un maximum de 14 prélèvements sur 24 heures). 2) Administrations du produit sur animaux vigiles (quelques secondes) selon la posologie, la fréquence et la voie d’administration recommandée par le fabricant. 3) Prélèvement éventuel d’urine par ponction de la vessie échoguidée à travers la paroi abdominale sur animaux vigiles (ou tranquillisés) avec une anesthésie locale (intervention de quelques dizaines de minutes) : plusieurs prélèvements espacés de quelques jours, soit 3 à 6 prélèvements selon la durée de la procédure.
Impact sur les animaux
Aucun effet indésirable n’est attendus suite à l’administration du produit d’essai dont la non-toxicité et la tolérance locale aura au préalable été vérifiée par le Donneur d'Ordre. Selon la voie testée (Sous-cutanée, Intra-musculaire), seule l’administration des produits pourra entrainer une nuisance correspondant à l’introduction de l'aiguille pour l’injection entraînera une douleur légère de courte durée . Les prélèvements des animaux peuvent entrainer un stress physique de l’animal lié à sa contention répétée et l’introduction de l’aiguille entraînera une douleur légère et transitoire au point de prélèvement. Jusqu’à 16 prélèvements sanguins pouvant être réalisés les 24 premières heures, le stress engendré par cette action répétée sera non négligeable pour l’animal.
Devenir
A l’issue du projet tous les animaux seront disponibles pour une autre procédure expérimentale, suite à un repos suffisant.
Remplacement
Le recours aux chiens sur ce projet est justifié car ils représentent l’espèce cible du produit en développement et qu'il n’existe pas de méthode alternative pour ce type de test. La pharmacocinétique du produit doit être optimisée et validée pour le bon développement du traitement. L’étude sur l’espèce cible est une étape obligatoire pour le développement et la mise sur le marché d’un nouveau médicament vétérinaire.
Réduction
Aucune approche statistique ne sera réalisée pour ce projet. Le nombre d’animaux utilisés correspond au minimum pour que chaque test inclut le nombre d’animaux requis afin d’obtenir des résultats interprétables, selon les guidelines européennes (EMA/CVMP/EWP/133/1999-Rev.1 et EMA/CHMP/CVMP/JEG :450091/2012). Le nombre d’animaux sera ajusté et justifié par le Donneur d’Ordre pour chaque étude en fonction des besoins définis par les objectifs scientifiques et des données bibliographiques existantes sur la molécule testée. Le nombre d’animaux pourra être réduit par des études en cross-over après un temps de repos suffisant.
Raffinement
Les conditions d’hébergement sont adaptées à l’âge des animaux avec divers enrichissements (jouets, tunnel/plateforme). Des isolements relatifs (les animaux restent en contact visuel, olfactif et sonore avec leurs congénères) pourront être appliqués dans les quatre heures suivant l’administration du traitement. Tout sera mis en œuvre pour limiter le stress qui pourrait être induit sur les animaux avec une surveillance accrue des animaux pendant cette période. Tout au long de la procédure, les animaux auront accès à volonté à l'eau et une alimentation adaptée sous forme de croquettes sera distribuée de façon à répondre à leurs besoins énergétiques. Pour obtenir une absorption similaire du produit sur chaque individu, les condition d'alimentation des animaux pourront être standardisées avant le traitement avec par exemple une mise à jeun la veille au soir de l’administration du produit (pour une durée maximum de 16 heures), ou au contraire une ration équivalente pour tous les animaux dans les heures précédant le traitement. L’établissement se trouvant sur le même site que le fournisseur, les animaux ne subiront pas le stress lié au transfert (transport et changement d’environnement, de nourriture, de personnel…). Les volumes et les fréquences de sang prélevés et les doses administrées respecteront les recommandations internationales de bonnes pratiques. Les éventuels prélèvements d’urine seront réalisés par cystocentèse échoguidée sur un animal anesthésié localement au point de prélèvement. Les animaux auront préalablement été habitués à la contention sur le dos nécessaire à ce type de prélèvement. En cas d’apparition d’un signe de souffrance ou d’un signe clinique inatendu chez l’animal (exemple : vomissements très intenses à répétition, prostration de l’animal, difficultés respiratoires…), il sera pris en charge par le vétérinaire désigné et pourra recevoir un traitement adapté pour le soulager et si nécessaire être exclus de la procédure expérimentale. Ce projet incluant 300 animaux permettra de réaliser 2 à 5 études par an.
Choix des espèces
Le chien est l’espèce cible du produit en développement. La pharmacocinétique du produit doit être optimisée et validée pour le bon développement du nouveau traitement. Il n’existe pas de méthode de remplacement pour ce type d’évaluation. Chiens en bonne santé de plus de 6 mois, correspondant au stade de développement indiqué pour le traitement vétérinaire.
Réalisation d’études de pharmacocinétique/pharmacodynamie chez le chien
- Recherche appliquée
- Maladies animales
250 chiens vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, chacun pouvant subir jusqu'à 22 prises de sang par semaine, environ 16 sur 24 heures avant une semaine de repos, sans dépasser 15 % de son volume sanguin. Ils reçoivent les produits testés par voie intraveineuse, orale, intramusculaire, sous-cutanée ou topique, et l'urine est recueillie en cage à métabolisme ou par sondage de l'urètre, au plus une fois par semaine pour les mâles, avec un isolement jusqu'à 24 heures. Il s'agit de mesurer le devenir dans le sang de principes actifs et d'excipients, surtout pour de futurs médicaments vétérinaires, sur des chiots comme sur des adultes selon la molécule. Les 250 chiens sont gardés en vie à la fin de la procédure et peuvent ensuite être réutilisés. Le porteur compte environ 50 chiens par an et précise qu'il n'y a "pas d'approche statistique prévue".
Objectifs
L'objectif de ce projet est de pouvoir tester différents principes actifs ainsi que différents excipients chez le chien et d'obtenir des données pharmacocinétiques et pharmacodynamiques. La pharmacocinétique et la pharmacodynamie sont des disciplines qui étudient le devenir de la molécule dans l’organisme. Le devenir du médicament selon les doses utilisées et sa voie d'administration sont étudiés chez l'animal: son absorption, sa distribution par la circulation sanguine, son métabolisme, son élimination. Les chiens sont régulièrement utilisés pour la recherche biomédicale dans les domaines de santé animale (espèce cible) mais aussi dans les domaines de santé humaine.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus sont de pouvoir identifier de nouveaux principes actifs candidats pour de futurs médicaments, de déterminer les paramètres pharmacocinétiques des l'éléments tests et de montrer que cela n'a pas eu d'impact au niveau clinique en suivant certains paramètres hématologiques, biochimiques impact sur la pharmacodynamie. Ce projet est nécessaire pour trouver de nouveaux principes actifs pour de futurs médicaments vétérinaires.
Procédures
Les animaux seront soumis à des administrations (intraveineuse, orale, intramusculaire, sous cutannée ou topique) . Pour cela les animaux auront une contention manuelle légère. la durée d'un administration est inférieure à la minute. Il y aura des prélèvements sanguins. Dans ce cas le nombre de prélèvements sanguins sera limité à 22 maximum par semaine (environ 1 mL prélevé) et une période de récupération sera respectée ( à minima 1 semaine). Les volumes de sang prélevé seront généralement de 1 mL environ. Aprés un total d'environ 16 prélèvements sanguins sur 24h une période de récupération d'au minimum 7 jours sera respectée. Dans tous les cas, le volume des prélèvements sera réduit au minimum pour chaque protocole, sans jamais dépasser 15% du volume sanguin de l’animal, et une période de récupération adaptée sera respectée : 1 semaine suite à un prélèvement de 7.5% du volume sanguin, 2 semaines pour 10%, 4 semaines pour 15%. La durée d'un prélèvement sanguin est inférieur à la minute. La période de récupération pourra être allongée si nécessaire. Les animaux peuvent être soumis à un recueil d'urine. Soit cela se fera par miction spontanée (aucun geste n'est fait à l'animal), soit prélèvement urinaire par cathétérisation urétral ( contention manuelle légère). Durée de l'ordre de la minute. Une seule cathétérisation maximum pour les chiens males sur une semaine. Dans le cadre de recueil d'urine l'animal sera dans des conditions d'hébergement individuel pour une durée maximale de 24h avec de l'enrichissement autant que possible et un contact visuel et auditif entre ses congénères. Les protocoles avec collecte d'urine sont trés peu fréquents. Généralement les animaux sont mis en condition individuelle pour de l'observation, en box avec contact visuel et auditif entre les animaux, avec présence de tablette systématiquement , et jouets autant que possible.
Impact sur les animaux
Les gestes techniques réalisés dans ce projet seront: - des administrations ( par voie intraveineuse, orale, sous cutanée), : cela peut engendrer du stress lié à la contention - administration intramusculaire: cela peut également engendrer du stress lié à la contention, et peut être une gêne musculaire juste aprés administration. - Des prélèvements sanguins. Cela pourra engendrer du stress à la contention. Il peut y avoir également des douleurs au niveau du site de prélèvement. Le recueil d'urine par miction spontannée doit se faire via l'utilisation de cage à métabolisme, cela peut engendrer un incorfort de l'animal, un stress lié à l'hébergement.
Devenir
Tous les animaux seront gardés en vie à la fin de cette procédure.
Remplacement
Pour les études rentrant dans le scope de ce projet, le responsable de chaque étude s'assurera qu'il n'y a pas de methode de remplacement possible. Aucune méthode alternative ne permettant actuellement de reproduire la diffusion d’un produit dans le sang des animaux au niveau de l'organisme entier, il est indispensable de recourir à l’animal entier. Les essais in vitro sont des tests de cinétique de dissolution et de désagrégation d'un produit. Les essais ex vivo sont des tests qui s'effectuent directement sur des organes ou tissus isolés. Ces techniques de remplacement ne peuvent pas être appliquées dans ce projet.
Réduction
250 animaux sont inclus dans ce projet pour une durée de 5 ans. cela représente environ 50 animaux par an. On calculera pour chaque produit à tester le nombre d’animaux nécessaire, il sera, pour chaque protocole, toujours réduit au minimum, en tenant compte de la variabilité des résultats attendus. Il n'y a pas d'approche statistique prévue.
Raffinement
Les chiens seront hébergés par groupe entre 2 et 4 animaux par groupe. De l'enrichissement (exemple: tablettes, jouets: balles, cordage) sera présent dans chaque box autant que possible. Un suivi quotidien (voir plusieurs fois par jour) sera mis en place pour l'observation générale des animaux et la détection précoce de signe clinique pour une prise en charge rapide d'éventuels effets secondaires (observation de l'état de santé général, observation des sites de prélèvement, observation du comportement de l'animal...) Toute intervention sur l'animal sera effectuée par une personne habilitée et expérimentée afin de réduire au minimum le stress. Des points limites sont mis en place, il peut s'agir de : - problème de comportement général. Cela peut être des secousses au niveau de la tête, des temblements, des troubles de la fréquence cardiaque, de la prostration. En fonction de l'intensité et de la fréquence du ou des signes observés l'animal sera exclu du projet et un traitement ( antispasmodique, antiarythmique par exemple) pourra être prescrit par le vétérinaire responsable. - forte fièvre ( à partir de 40 °C) Possibilité d'administrer des antipyrétiques - douleur au niveau des sites de prélèvements. De la glace pourra être appliquée si besoin. La période de repos entre 2 phases pourra être augmentée. - forte diarrhée et vomissement à répétition seront considérés comme points limites. Possibilité d'administrer des antivomitifs ou antidiarrhéiques.
Choix des espèces
Espèce cible pour les médicaments vétérinaires Pour les produits humains, l'utilisation des chiens est bien décrite et caractérisée dans la littérature et leur utilisation est conseillée pour les essais de produits pharmaceutiques. Chiot, jeune adulte ou adulte cela dépendra de la molécule à tester et de la cible thérapeutique.
Etude de l’efficacité et de la tolérance d’une thérapie génique dans le modèle canin de la Mucopolysaccharidose de type IIIA (Maladie de San Filippo A)
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
- Troubles nerveux
Injectés à trois mois d'âge par voie intraveineuse, mis à jeun douze heures avant chaque anesthésie, ponctionnés du liquide céphalo-rachidien six à neuf fois, passés quatre à cinq fois à l'IRM pendant une heure trente et sous immunosuppresseur oral pendant toute l'étude : quatorze chiens porteurs d'une mutation reproduisant la maladie de San Filippo A vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le traitement immunosuppresseur peut provoquer diarrhées, vomissements, atteintes cutanées et sanguines, prises en charge par un traitement symptomatique. Le porteur affirme qu'aucun effet indésirable n'est attendu des injections, des prises de sang ni des ponctions de liquide céphalo-rachidien. Trois ou neuf mois après l'injection, les quatorze chiens sont tués pour prélever leurs tissus.
Objectifs
La Mucopolysaccharidose de type IIIA (MPS3A), ou maladie de San Filippo A, est une maladie rare dite de surcharge, et qui affecte 0.7 à 1.8 nouveau-nés pour 100000 naissances en Europe. La maladie survient lorsque des enzymes nécessaires à la dégradation et au stockage de molécules de sucres complexes font défaut à l'organisme : ainsi ce déficit engendre une accumulation toxique de ces molécules dans de nombreux organes dont le foie, la rate et surtout le cerveau. La maladie de San Filippo A est caractérisée par une atteinte sévère du Système Nerveux Central qui débute le plus souvent entre 2 et 6 ans avec un retard du développement psychomoteur, des troubles du comportement, un défaut d'attention, une hyperactivité et une agressivité. La régression des acquisitions intellectuelles est rapide et sévère. Dans la phase finale les patients deviennent grabataires et développent une encéphalopathie profonde. Le décès survient généralement au décours d'une surinfection respiratoire avec une espérance de vie de l'ordre de 15 à 20 ans. Actuellement, aucun traitement approuvé ne peut aboutir à la guérison. Les seuls soins apportés visent à traiter les complications liées à la maladie et améliorer la qualité de vie des malades et de leur entourage. Le produit de thérapie génique que nous souhaitons tester vise à corriger le déficit de l'enzyme à l'origine de la maladie. L'objectif principal de ce projet est de réaliser une étude de biodistribution, d'efficacité et d'évaluation de la tolérance chez le modèle animal du chien MPS3A après administration par injection intraveineuse du produit de thérapie génique, sur un suivi de 3 mois et de 9 mois post-injection.
Bénéfices attendus
Le syndrome de San Filippo A, MPS3A, est la conséquence d'une accumulation de molécules du sucre, partiellement dégradées, dans les tissus de l'organisme. Ceci est le fait d'une mutation génétique qui affecte l'activité d'une enzyme nécessaire pour cette dégradation. Ces molécules mal dégradées, qui ne peuvent pas être éliminées, entravent le développement normal du cerveau puis détruisent les cellules du cerveau. Les premiers symptômes de la maladie associent un retard du développement cognitif associé à une hyperactivité, un comportement autistique et des troubles du sommeil. Chez l'Homme, ils apparaissent habituellement avant l'âge de 3 ans. Par la suite, l'atteinte neurologique entraîne une déficience intellectuelle et une réduction des capacités motrices qui aboutissent à la perte d'autonomie vers l'âge de 10 ans et un décès survenant le plus souvent entre 15 et 20 ans. Actuellement, cette pathologie est incurable, le traitement n'est que symptomatique. L'évaluation d'approches thérapeutiques reste donc essentielle pour évoluer vers la mise en place d'un réel traitement curatif pour ces patients. La thérapie génique est une des approches prometteuses qui permettrait de traiter la cause moléculaire de la maladie. Pour évaluer de telles approches thérapeutiques, avoir un modèle animal pertinent est nécessaire pour pouvoir réaliser des études précliniques nécessaires (preuves de concept de l'efficacité des produits thérapeutiques, études de dose...). Le présent projet vise à évaluer l'efficacité d'un traitement de thérapie génique sur des chiens atteints de la maladie. C'est une étape essentielle dans le développement préclinique qui permettra à terme de proposer un traitement curatif aux patients atteints. Elle permettra ainsi de générer toutes les données précliniques, mais aussi la tolérance globale de l'approche avec le suivi par imagerie par résonnance magnétique, et des bilans sanguins réguliers. Le but global de l'étude est de soutenir la demande d'un essai clinique de phase I/II chez des patients souffrant de la maladie de San Filippo.
Procédures
Chaque animal inclus dans cette étude sera soumis aux interventions suivantes : Procédure d'injection intraveineuse : Effectuée sur animal vigile ou sédaté (si besoin). Durée de l'intervention : environ 30 minutes. Prélèvements sanguins : Effectués soit vigiles sous légère contention (animaux sociabilisés et habitués aux manipulations), soit sous anesthésie (anesthésie destinée à une imagerie par résonance magnétique ou prise de sang). Total de 6 prélèvements sanguins pour les animaux suivis 3 mois, et 9 pour les animaux suivis 12 mois. Durée de l'acte : environ 5 minutes. Prélèvements de liquide céphalo-rachidien : Effectués par ponction, réalisés par des vétérinaires spécialistes sous anesthésie générale et analgésie. Total de 6 prélèvements pour les animaux suivis 3 mois, et 9 pour les animaux suivis 12 mois. Durée de l'acte : environ 10-15 minutes. Imagerie par résonance magnétique : Effectuée sous anesthésie générale et analgésie. Total de 4 examens pour les animaux suivis 3 mois, et 5 pour les animaux suivis 12 mois. Durée de l'acte : environ 1h30. Traitement immunosuppresseur : Administré par voie orale tout au long de l'étude. Durée de l’acte : environ 1 minute.
Impact sur les animaux
L'injection du vecteur thérapeutique par voie intraveineuse et les prélèvements sanguins sont des gestes peu invasifs pour lesquels aucun effet indésirable n'est attendu. Ces 2 actes seront réalisés sur animal vigile, sauf si une anesthésie est déjà prévue pour les autres gestes. Il est à noter qu’un jeûne d’une durée maximale de 12 heures sera mis en place avant leur anesthésie. Une nausée pourrait survenir dans les heures suivant l’anesthésie, cependant il est important de noter que les injections n’auront aucun impact sur leur consommation alimentaire ou hydrique. Avec ce protocole et par les expériences passées, il n'est pas attendu de réaction douloureuse. Les tests d’imagerie, examens non invasifs, seront réalisées sur les animaux anesthésiés. Les ponctions du liquide céphalo-rachidien seront réalisées par des vétérinaires spécialistes maitrisant ce geste technique sous anesthésie générale et analgésie adaptées. Il n'est pas attendu d'effet indésirable. Afin de limiter toute réaction inflammatoire au moment des injections du produit thérapeutique, un protocole d’immunosuppression sera mis en place tout au long de l'étude. Des effets secondaires d'ordre digestif tel que diarrhée et vomissements peuvent parfois être observés ainsi que des atteintes cutanées et hématologiques. Un traitement symptomatique pourra alors être mis en place avec un suivi rapproché des animaux concernés. Le phénotype ne devient dommageable qu'après 18 mois d’âge, voire après. L'évolution de la maladie est très lente. Si le phénotype se déclarait, il restera léger au vu de la période de suivi des animaux. De plus des examens cliniques et spécifiques sont prévus régulièrement et permettront d'adapter les soins.
Devenir
Les 14 animaux inclus dans ce projet seront suivis pendant une période de 3 ou 9 mois post-injection du produit thérapeutique, puis euthanasiés pour permettre le prélèvement de tissus post-mortem. La fin de protocole et euthanasie de tous les animaux est indispensable pour obtenir ces prélèvements, nécessaires à la réalisation des analyses moléculaires et histologiques prévues dans le cadre du projet. Ces analyses ne peuvent être effectuées sur des animaux vivants.
Remplacement
Toutes les études in vitro possibles ont été effectuées en amont de ce projet, en particulier la démonstration de la fonctionnalité des vecteurs. Nous arrivons ici aux dernières étapes précliniques nécessaires pour une demande d'essai clinique de phase I/Il pour lesquelles l'utilisation d'un modèle gros animal, permettant la mise en place d'approche chirurgicale similaire à celle effectuée sur les patients dans l'essai clinique est indispensable et nécessite donc l'utilisation de cette lignée de chiens MPS3A. Il n'existe pas aujourd'hui de méthode alternative pour tester l'effet d'un traitement de thérapie génique in vivo. Nous savons que l'efficacité du transfert du gène dans une lignée cellulaire in vitro n'est pas comparable à ce qui peut se passer in vivo dans un organisme entier. L'animal est le seul organisme vivant permettant d'étudier l'impact d'un transfert du gène dans différents types cellulaires (différents organes) et sur son phénotype, en lien avec le mode d'administration utilisé et la dose administrée. L'utilisation d'un modèle animal, d’autant plus un chien MPS3A, est donc essentielle pour l'évaluation préclinique de produits thérapeutiques pour le traitement de la Mucopolysaccharidose de type 3A.
Réduction
Un total maximum de 14 animaux sera utilisé comprenant : 3 animaux injectés avec du véhicule (2 euthanasiés 3 mois post injection et le troisième euthanasié 9 mois post injection), 9 animaux recevant l’administration du vecteur dont 6 euthanasiés à 3 mois post injection et 3 euthanasiés à 9 mois post injection, et 2 animaux non injectés (un suivi 3 mois et un suivi 9 mois). Ce nombre d'animaux par groupe a été évalué pour être un nombre minimal, sans qu'il soit excessif, permettant d'assurer la robustesse des résultats. Il est basé sur notre expérience de précédents projets et des données sur les autres modèles, lors desquels des résultats cohérents et reproductibles ont pu être obtenus dans des groupes de cette taille. Une analyse statistique sera réalisée pour les mesures où le nombre d'échantillons permettra d'avoir une puissance statistique suffisante.
Raffinement
Les procédures utilisées sont adaptées pour éviter tout inconfort de l'animal, et sont réalisées par du personnel formé et expérimenté. Le bien-être animal passera notamment par : 1. De bonnes conditions d'hébergement selon la réglementation en vigueur. Pour leur bien-être les animaux seront hébergés en groupe et recevront un enrichissement adapté (jeux divers disponibles dans les box, sociabilisation avec présence humaine, éducation, toilettage). Cet enrichissement serait renforcé si un animal se retrouvait en hébergement seul. 2. Un suivi régulier des animaux (observations biquotidiennes, pesées régulières, analyse du comportement). 3. Afin de suivre efficacement l'état de santé des animaux et mettre rapidement en place une action, une liste de points limites a été établie. Elle permet de définir une conduite à tenir afin d'arrêter, minimiser ou diminuer toute souffrance à l'aide de mesures comme un traitement adapté ou une mise à mort anticipée. 4. La mise en place de mesures adaptées en fonction des interventions éventuelles (anesthésie et analgésie si nécessaire, antibiothérapie, immunosuppressions, etc.). De plus, le nombre d'anesthésies sera minimisé en regroupant les procédures (prise de sang - volume adapté à la taille des animaux et validé par le vétérinaire, ponction du liquide céphalo-rachidien ) au sein d'une même anesthésie.
Choix des espèces
Le choix du chien comme modèle d'étude (mix beagle et Zealand Huntaway) est basé sur la prédisposition raciale à la même mutation génétique chez l'homme lors de la Mucopolysaccharidose de type III A. Chez le chien, une anomalie génétique conduit comme chez l'homme au développement anormal du cerveau et à des troubles moteurs. De plus la transmission génétique est la même que chez l'homme en étant autosomale récessive. Le choix de l'espèce est également basé sur son homologie avec l'homme, au niveau des plans anatomiques et fonctionnels du système nerveux central et du point de vue immunitaire (tolérance semblable). Dans l'étude clinique, les enfants seront traités entre 4 et 12 mois. Les animaux seront injectés à l'âge de 3 mois et 15 mois. C'est un âge auquel les animaux sont considérés comme "juvéniles" ou « jeunes adultes », et mimant donc le stade auquel des patients atteints du syndrome de San Filippo pourraient être injectés lors d'un futur essai clinique (enfants de moins de 5 ans).
Evaluation préclinique de produits de santé pour l’orthopédie
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
Cochons d'Inde : 120
Lapins : 540
Chiens : 240
Chèvres : 330
Moutons : 660
Le nombre de moutons, chèvres, chiens, lapins, rats et cobayes opérés dépend des études signées avec des donneurs d'ordre, pour tester des dispositifs médicaux orthopédiques avant leur mise sur le marché. 2 100 animaux non-humains vont être utilisés, 660 moutons, 330 chèvres, 240 chiens, 540 lapins, 210 rats et 120 cobayes, tous tués à l'issue pour examiner les tissus autour du dispositif, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré ou sévère. Chacun subit une chirurgie de trente minutes à trois heures pour recevoir l'implant, certains une seconde pour le retirer, avec des prises de sang et jusqu'à trois séances d'imagerie sur des études qui peuvent durer plusieurs années, et le porteur cite parmi les risques une infection et un déficit moteur des membres postérieurs. Il affirme que leur utilisation "est requise dans la réglementation", et indique que lapins, cobayes et rats sont aussi choisis "pour des raisons économiques et éthiques", par exemple pour des études de faisabilité menées sur des individus venus d'études précédentes.
Objectifs
Ce projet vise à évaluer la tolérance (ou sécurité) ainsi que la performance (ou efficacité) des produits de santé en orthopédie . Ces produits destinés à être mis en contact avec le corps humain doivent être préalablement testés pour garantir le bon rétablissement des patients après chirurgie, et pour garantir leur efficacité lors de l'utilisation clinique. La réglementation exige de prouver l'efficacité des produits de santé et de réduire au minimum le risque de réactions indésirables avant de proposer un produit sur le marché. Compte-tenu de la complexité des mécanismes de régulation d'un organisme vivant, le recours au modèle animal est nécessaire pour répondre aux objectifs du projet.
Bénéfices attendus
Ce projet permet d'obtenir dans différents modèles animaux des données de performance et de tolérance des produits de santé en orthopédie. Ainsi, il est possible d’étudier ces produits en vue de répondre aux exigences des autorités réglementaires dans l'obtention d'une autorisation de mise sur le marché, élargissant l’offre et améliorant ainsi les chances de guérison et le confort des patients humains traités.
Procédures
Pour l'ensemble des procédures, tous les animaux seront soumis à une intervention chirurgicale afin d'implanter le dispositif médical à tester (cette intervention chirurgicale peut durer entre 0h30 et 3h00). Cette intervention a toujours lieu sous anesthésie générale (chimique et gazeuse), analgésie et antibiothérapie . Certains animaux peuvent être soumis à une intervention chirurgicale supplémentaire si le but de l'étude est aussi d'évaluer la cicatrisation après retrait du dispositif de son site d'implantation (cette intervention chirurgicale peut durer entre 00h30 et 3h00). Cette intervention aura lieu dans les mêmes conditions que celles précédemment citées. Des prélèvements sanguins peuvent être réalisés en cours d'étude. Ceux-ci pourront se faire sous anesthésie ou non, selon le contexte de réalisation de cet acte (en cours de chirurgie, pendant le temps de l’étude ou juste avant l’euthanasie des animaux en fin d’étude). D'autres type d'interventions non douloureuses, de type scanner ou radiographies pour observer le dispositif en cours d'étude, peuvent être réalisées sous anesthésie légère (en général, en fonction de la durée de l'étude (plusieurs années possibles), 1 à 3 sessions d'imagerie peuvent etre envisagées en cours d'étude.
Impact sur les animaux
Les nuisances ou effets indésirables pouvant survenir chez les animaux sont, selon les procédures, les suivants : - douleur et stress liés à la chirurgie (nuisance modérée). - perte de poids ou d’appétit liée aux effets de l’anesthésie et/ou de la chirurgie, pendant quelques jours (nuisance légère)- risque infectieux lié à la chirurgie (nuisance modérée à sévère)- hématome ou oedème au niveau du site opératoire, pouvant entrainer une gêne locomotrice en plus de la douleur (exemple : déficit sensitif et/ou moteur des membres postérieurs) (Nuisance légère à modérée).
Devenir
Pour répondre aux objectifs de chacune des procédures du projet, des observations post-mortem sont nécessaires. En effet, la sécurité des produits est évaluée en observant la réaction des tissus au contact du dispositif à tester, et ceci se fait par prélèvements des tissus et organes entourant le produit, afin de réaliser des analyses microscopiques (histologie notamment, qui est la meilleure méthode d'évaluation des effets locaux induit par un produit étranger à l'organisme, comme l'inflammation par exemple). De même la performance peut, elle aussi, être évaluée par des tests spécifiques sur les organes et le dispositif prélevé (exemple : tests mécaniques sur des vertèbres pour évaluer la fusion dans le cadre de la procédure de stabilisation de la colonne vertébrale ). En raison des objectifs des procédures de ce projet, il n'est pas possible de maintenir en vie les animaux utilisés.
Remplacement
L’utilisation d’animaux est requise dans la réglementation. A ce jour, il n'existe pas de méthode alternative permettant d’évaluer la performance et la tolérance locale des produits de santé en orthopédie.
Réduction
Pour réduire le nombre d'animaux inclus en étude, il est possible d'utiliser un même groupe "contrôle" (produit dont l'effet est déjà connu) pour plusieurs groupes "test" recevant des produits à tester différents. Les études de screening précédemment citées permettent également de sélectionner un produit test qui présente le plus d'intérêts à être développé, réduisant de ce fait le nombre de tests sur des produits ayant un intérêt moindre. Les études dites "pilotes", sur quelques animaux seulement, peuvent aussi servir à orienter les choix de poursuite de développement d'un produit ou le choix du modèle expérimental le plus approprié (matériel ou abord chirurgical le plus adéquat…), avant d'entamer les études réglementaires à plus grande échelle et devant répondre aux normes en vigueur pour l'élaboration du dossier pour la mise sur le marché (nombre d'animaux minimum, durée de mise en contact minimum, etc). Le nombre d’animaux est arbitré à partir du nombre de sites requis en analyse. Le nombre total d’animaux utilisés dépend directement du nombre d’études signées avec les différents donneurs d’ordre durant les 5 années du projet. De cette façon, le nombre d’animaux précisé ci-dessus constitue une estimation basée sur l’historique des essais conduits durant ces dernières années. De plus les normes requierent un nombre minimal d'animaux par produit analysé et par délai d'analyse, et le type de dispositif implanté ne permet pas toujours la réalisation d'un grand nombre de sites par animal. Le nombre d’études sur 5 ans est donc estimé à 36 (3 x 12 procédures expérimentales ; pour 660 ovins ; 330 caprins ; 240 chiens ; 540 lapins ; 210 Rats ; 120 cobayes).
Raffinement
Des mesures sont mises en place pour limiter : - Le stress des animaux : Avant la chirurgie, une période d’habituation aux actes spécifiques est réalisée si nécessaire, pour réduire l’aspect anxiogène de ces manipulations. Des enrichissements sont présents dans l’environnement des animaux (en fonction de l'espèce : jouets, plateforme de repos…), et ces mesures sont renforcées en phase post-opératoire (ajout d’enrichissements alimentaires…). - La douleur des animaux : En phase post-opératoire, les suivis sont renforcés et completée par des scores de suivi de la douleur. La présence d'un vétérinaire sur site permet également la réalisation de soins post-opératoires spécifiques et adaptés. Les signes cliniques servant de points limites sont listés dans le document joint en annexe, pour la prise de décision des mesures à mettre en place pour limiter les souffrances.
Choix des espèces
L’espèce animale choisie est définie dans le(s) texte(s) de référence. Les produits de petite taille/miniaturisés seront testés préférentiellement chez les rongeurs ou le lapin. Les produits de taille importante seront préférentiellement testés chez le chien ou les ovins/caprins. Lorsque plusieurs espèces répondent aux critères, le choix est arbitré par la durée de l’essai (pour une étude sur le long terme, utilisation d’espèces à longue durée de vie). Le choix entre les grands modèles repose aussi sur les similarités avec l’Homme : - Caractéristiques anatomiques (structure des os, épaisseur du cartilage...), poids, propriétés mécaniques et régénération osseuse des ovins/caprins et des chiens - Caractéristiques anatomiques et mécaniques des lapins, des cobayes et des rats. Ces espèces sont souvent utilisées également pour des raisons économiques et éthiques (exemple : réalisation d’études de faisabilités via la réutilisation d’animaux d’études précédentes ) - Colonne vertébrale uniforme et régulière simplifiant les procédures chirurgicales, structure et biomécanique de la colonne lombaire et thoracique similaires.
Etudes de toxicologie chez le chien
- Recherche appliquée
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
- Toxicologie et autres tests de sécurité
Tués à l'issue des études pour que leurs organes passent en anatomopathologie, 2 160 chiens vont être utilisés dans ce projet de toxicologie réglementaire, 156 d'entre eux pouvant être réutilisés dans une autre étude si le vétérinaire l'autorise. 624 subissent des procédures d'un niveau de souffrance léger, 1 536 d'un niveau modéré. Ils reçoivent un candidat médicament par voie orale, intramusculaire, sous-cutanée ou intraveineuse, quotidiennement ou à intervalles plus espacés, pendant des études qui peuvent durer 52 semaines, avec jusqu'à une vingtaine d'interventions par animal et par semaine et des mises en diurèse de seize heures. Le porteur affirme que l'évaluation de la toxicité chez une espèce non-rongeur est "indispensable" avant tout essai clinique et qu'aucune méthode in vitro ne la remplace, "en raison notamment de la complexité que représente un organisme vivant".
Objectifs
Dans un cadre réglementaire, le projet réalisé vise à permettre l'évaluation du potentiel toxique d'un candidat médicament dans le cadre de son développement préclinique. Cette évaluation chez une espèce non-rongeur est indispensable pour chaque nouveau candidat médicament avant de démarrer les essais cliniques chez l'homme, et avant toute autorisation de mise sur le marché. Ce projet permet également d’évaluer la tolérance/sécurité du candidat-médicament dans l’espèce cible dans le cadre du développement du médicament vétérinaire.
Bénéfices attendus
Le développement de composés pharmaceutiques requiert des explorations in vivo chez une espèce non-rongeur ainsi que des études réglementaires à proprement parler. Ces études peuvent être demandées par les autorités réglementaires, pour affiner ou mettre en place des conditions expérimentales, ou pour répondre à des questions de sécurité. Ces études peuvent donc servir à affiner les expériences en amont des études réglementaires qui devront être réalisées par la suite, en permettant de limiter le nombre global d'animaux utilisés dans le développement d'un produit. Elles peuvent aussi directement contribuer à assurer la sécurité non-clinique des médicaments en comprenant mieux leurs mécanismes.
Procédures
Traitements répétés : Les animaux sont traités, par différentes voies (principalement orale et injection intramusculaire, sous-cutanée ou intraveineuse) de façon journalière, hebdomadaire ou de manière plus espacée (ex : toutes les 2 semaines, mensuel, pour des composés biologiques), avec le produit d’intérêt. La durée des administrations est généralement rapide (quelques secondes à quelques minutes) et peut atteindre 3 heures maximum, dans le cas de perfusions intraveineuses. La durée des études peut être courte (un jour) ou longue (en général de 1, 3 ou 6 mois voire 52 semaines pour les études règlementaires). Des prélèvements sanguins et urinaires sont également possibles pour bilan hémato-biochimique ou hormonal par exemple ; ils sont réalisés à une fréquence et aux volumes conformes aux recommandations éthiques en vigueur. Tout prélèvement dépassant ces recommandations devra être justifié et fera l'objet d'une réévaluation par le comité d'éthique (balance bénéfice/ contrainte pour l'animal). La manipulation des animaux durant les interventions est généralement inférieure à 1 heure par animal par jour (en considérant, par exemple, une journée avec 1 administration + 6 prélèvements sanguins soit environ 30 min). Jusqu’à une vingtaine d’interventions peuvent être réalisées par animal et par semaine (en considérant, par exemple, une administration quotidienne et 12 prélèvements sanguins dans la semaine). Une mise en diurèse, n’excédant pas 16h est aussi possible.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables attendus correspondent : - aux effets pharmacologiques du produit administré, - à l’inconfort lié aux procédures (prélèvements, administration répétée), - aux effets systémiques (ex : pertes de poids, baisse de consommation alimentaire) qui peuvent être observés, - conditions d’hébergement en individuel quand requis par les procédures (ex : pour suivre la consommation alimentaire individuelle). L’hébergement individuel ne peut excéder 4h par jour. Les seules exceptions sont pour la collecte d’urine sur la nuit (sur une période de 16h maximum) et pour les enregistrements des paramètres cardiovasculaires (sur une période de 24h selon la technologie utilisée).
Devenir
Procédure 1 : études préliminaires Les animaux impliqués dans ce type d’études peuvent être ré-utilisés dans une étude si aucune analyse histopathologique n’est requise en fin d’étude, que le type de composé testé est compatible avec une réutilisation de l’animal, et que leur état clinique le permet, après évaluation par le vétérinaire. Dans ce cas, les animaux sont remis dans leur lieu d'hébergement habituel. Des animaux utilisés avec suivi de télémétrie lors de ces études peuvent être euthanasiés en fin de procédure si la durée de vie de l’émetteur implanté arrive à échéance. Procédure 2 : Étude de toxicologie subchronique (2 à 4 semaines) et chronique (13 à 52 semaines) chez le chien Les études de toxicologie règlementaire incluent généralement une analyse histopathologique pour évaluer les potentiels effets toxiques sur les organes et tissus. Les animaux sont euthanasiés à l’issue de la procédure. Procédure 3 : Evaluation des fonctions cardiovasculaire et respiratoire chez le chien conscient par télémétrie Les animaux de la procédure 3 sont ensuite utilisés dans les procédures 1 et 2. Leur finalité relève des procédures 1 et 2.
Remplacement
L’évaluation de la toxicité de candidats médicaments selon les règlementations en vigueur nécessite encore l’utilisation d’animaux, et ces études ne peuvent pas être réalisées in vitro. Il n'existe pas encore de méthode alternative in vitro pour mettre en évidence certains effets, et pour ce type de procédures de traitement identiques à celles utilisées chez l'homme ou chez l’animal (produit vétérinaire), en raison notamment de la complexité que représente un organisme vivant, et en particulier des réponses immunitaires.
Réduction
Le nombre d'animaux par groupe est le minimum permettant une analyse statistique fiable, conformément aux recommandations des lignes directrices. En se basant sur des tests statistiques, comprenant a minima des tests de normalité, d’analyse de la variance et tests comparant les moyennes des groupes. Le nombre d’animaux utilisés est le minimum possible en fonction de ces considérations et des objectifs de l’étude. En incluant dans une même étude (i.e. sur les mêmes animaux), l’évaluation toxicologique et l’évaluation des paramètres de pharmacologie de sécurité, le nombre d’animaux utilisés est très nettement réduit.
Raffinement
L'état général des animaux est surveillé quotidiennement à plusieurs reprises. L’attention portée aux animaux et leur surveillance clinique sont adaptées aux études, en tenant compte des points limites éthiques établis par procédure. Les paramètres suivants sont contrôlés régulièrement (selon les signes attendus) afin d’évaluer l’état de santé des animaux. Tout symptôme est signalé au Directeur d’étude et au vétérinaire. pour application des points limites (ex. en cas de plaie et/ou douleur, possibilité de traitement avec un cicatrisant cutané local et/ou un anti-inflammatoire, un antibiotique). D’autres traitements peuvent être mis en place suivant les recommandations des vétérinaires, selon les observations, conditions d’expérimentation. Des points limites sont définis pour envisager les situations où il s'avère nécessaire d'arrêter le traitement ou d'euthanasier précocement un animal. Une attention est portée à l'enrichissement environnemental (ex. types de jeux, nourriture, renforcement positif, habituation suffisante aux procédures, …). L’aménagement des box avec des rampes, plateformes, une communication entre les box permet aux animaux d’exprimer les comportements physiologiques et activités qu’ils auraient dans leur habitat naturel, tel que courir, grimper et sauter. Des séances de caresses et/ou de sociabilisation peuvent également être effectuées. L’hébergement est groupé permettant les interactions sociales entre congénères, mais individuel si dicté par l’objectif de l’expérimentation ou en cas d'incompatibilité sociale ou si l’état de l’animal l’exige. La justification scientifique de l'hébergement individuel doit être apportée et des éléments d'enrichissement supplémentaires sont utilisés (ex. jeux, contacts humains plus fréquents). L’évaluation des paramètres de pharmacologie de sécurité est effectuée par télémétrie, permettant l’obtention de données fiables, sur des périodes de temps prolongées, et avec des contraintes sur l’animal minimisées.
Choix des espèces
L’évaluation de la toxicité et la sécurité de candidats médicaments (pour la santé humaine et animale), selon les règlementations en vigueur nécessite encore l’utilisation d’animaux, une espèce rongeur et une espèce non-rongeur. Ce projet décrit ces études pour l’espèce chien. Les études sont menées en fonction de ce qui est prévu ensuite chez l’Homme (mode d’administration, durées de traitement…). Pour les médicaments vétérinaires, les études sont généralement à réaliser dans l’espèce cible, telle que le chien, compte tenu de la spécificité de chaque espèce animale. L'évaluation de la toxicité d'un candidat médicament ne peut pas être réalisée in vitro. Il n'existe pas de méthode alternative in vitro pour ce type de procédures de traitement identiques à celles utilisées chez l'homme ou chez le chien, pour les produits vétérinaires destinés à cette espèce, en raison notamment de la complexité que représente un organisme vivant. Les chiens sont usuellement âgés de 4 à 9 mois au début de l'étude. Des animaux plus jeunes, mais sevrés (à partir de 8 semaines), de même que des animaux adultes plus âgés (12 à 24 mois) peuvent être utilisés, pour que la population animale participant à l’étude soit représentative de la population humaine cible, ou de la population de chien cible dans le cas d’études pour un médicament vétérinaire.
Utilisation d’un modèle de prurit chez le chien pour des études précliniques d’efficacité (screening et développement)
- Recherche appliquée
- Maladies animales
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
Provoquer des démangeaisons chez des chiens en bonne santé pour trier des molécules candidates à la mise sur le marché : c'est l'objet de ce projet, qui concerne 200 chiens dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Chacun peut recevoir jusqu'à cinq injections intraveineuses d'une solution prurigineuse, espacées d'une semaine, chaque crise durant environ deux heures pendant lesquelles il se gratte, se lèche et se mordille. S'y ajoutent des prises de sang sur animal éveillé et, à l'occasion, des raclages ou des biopsies de peau, le porteur affirmant qu'aucune méthode alternative ne reproduit un comportement de prurit et que cette étape reste "indispensable". Aucun chien n'est tué : 180 seront réutilisés dans d'autres projets, 20 proposés à l'adoption.
Objectifs
L’objectif du projet est d’utiliser un modèle validé de prurit transitoire et modéré, provoqué par une administration intra-veineuse dune solution prurigineuse chez le chien, pour la sélection de futures molécules thérapeutiques pouvant entrer dans la composition de nouveaux médicaments destinés à une mise sur le marché pour traiter entre autres, la dermatite atopique canine (DAC) ou d’autres pathologies entraînant des comportements de prurit chez le chien. L’utilisation a de ce modèle maitrisé permettrait d’évaluer, premièrement l’efficacité, secondairement la tolérance, le profil pharmacocinétique de molécules et également de suivre l’évolution de certains bio-marqueurs de l’inflammation dans notre modèle avec et sans traitement.
Bénéfices attendus
La DAC est la deuxième cause de démangeaisons chez le chien avec environ 10% de la population canine mondiale touchée. C’est une dermatose inflammatoire, prurigineuse liée à une prédisposition génétique associée au développement d’allergie à des allergènes variés entrainant des altérations de la barrière cutanée. Elle se caractérise par du prurit, des lésions cutanées plus ou moins caractéristiques et nécessite des soins coûteux et chronophages de la part du propriétaire tout au long de la vie de l’animal. Sa gravité réside principalement dans son impact sur la qualité de vie du chien et de son propriétaire. Tout ceci pouvant, à terme, être une cause de demande d’euthanasie. Le traitement et la gestion à long terme de la dermatite atopique sont difficiles. La majorité des traitements anti-inflammatoires ou immunomodulateurs sont susceptibles de causer des effets secondaires, surtout quand ils sont utilisés à forte dose et/ou de façon répétée, quotidienne ou prolongée. La recherche de nouveaux traitements pour un contrôle efficace et sûr de cette maladie chronique doit être évaluée sur l’espèce de destination lors d’un épisode clinique. La maitrise et le maintien d’un modèle induisant des signes cliniques similaires aux crises de prurit observées chez les chiens souffrant de DAC spontanée, permettent d’évaluer l’efficacité d’un traitement dans des conditions réelles, d’améliorer les phases de screening de nouvelles molécules et ainsi de sélectionner plus vite et de façon plus sûre, des molécules présentant une probabilité de succès importante sur un nombre optimisé d’animaux. Un modèle de prurit présente plusieurs avantages par rapport aux dermatites atopiques de terrain. Lors d’un comportement de prurit expérimental, les caractéristiques du prurit sont suivies en temps réel et en continu pendant toute la période d’expression, standardisée lors de la validation du modèle. Un suivi rapproché par des personnes formées dans des conditions standardisées permet une évaluation de l’efficacité. Ce modèle permet aussi une évaluation de la tolérance, du profil pharmacocinétique des molécules testées et offre la possibilité de rechercher et/ou de suivre l’évolution des bio-marqueurs d’intérêt. C’est un grand avantage de pouvoir récolter autant d’informations dans l’espèce de destination par procédure expérimentale dans un modèle transitoire, représentatif d’un comportement observé dans la DAC spontanée.
Procédures
Au cours de ces études, les animaux pourront recevoir, par voie intraveineuse, une solution entrainant des démangeaisons raisonnables et contrôlées. Ses administrations pourront être répétées au cours d'une étude, sans toutefois dépasser les 5 fois avec au minimum 1 semaine de récupération entre les administrations. Des voies d'administration telles que la voie intramusculaire, la voie sous-cutanée, la voie transcutanée ou la voie orale pourront être utilisée pour l'administration du produit a tester. Les volumes administrés seront en accord avec les bonnes pratiques vétérinaires. Selon l’objectif de l’étude, des prélèvements sanguins pourront être réalisés. Ces derniers sont réalisés sur animaux vigiles. Les volumes totaux de sang prélevés suivent les volumes définis pour respecter le bien-être animal. Exceptionnellement, selon l’objectif de l’étude, des prélèvements de cutanés par raclage ou biopsie pourraient être réalisés. Selon les prélèvements à réaliser, une anesthésie associée à une analgésie adaptées seront mises en place selon les procédures en vigueur de l'établissement utilisateur.
Impact sur les animaux
Les chiens recevant une injection d’une solution prurigineuse développent des signes modérés et transitoires de prurit, pouvant provoquer de l’inconfort : grattage, léchage, mordillements ou frottements de n’importe quelle partie du corps. Les signes cliniques apparaissent généralement dans les 30 minutes après l’injection et tous les signes de prurit disparaissent spontanément quelques heures après cette injection (le plus généralement dans les 2 heures suivant l’injection). Des prélèvements sanguins répétés pourront également générer un inconfort. Des biopsies de peau pourraient être collectées peuvent également générer un inconfort et/ou une douleur légère à modérée. Avant de conduire des études d’efficacité en utilisant ce modèle, des informations de tolérance chez le chien sont disponibles pour les produits à tester (dose maximale tolérée chez le chien et/ou une autre espèce pertinente, effets secondaires potentiels). Des réactions d’intolérance sévère liées aux produits évalués ne sont donc pas attendues. Les phases de traitement/prélèvements sur un animal vigile peuvent occasionner un(e) léger(e) stress/gêne/contrainte en raison de la légère contention nécessaire pour le traitement/recueil des échantillons le cas échéant.
Devenir
Ils seront réintroduits dans la colonie des animaux hébergés dans les locaux de l’EU. Les informations concernant chaque animal sont conservées et consultées avant une réutilisation potentielle d’un animal dans un autre projet.
Remplacement
Il n’existe pas de méthodes alternatives permettant de reproduire un comportement clinique de prurit chez le chien et d’évaluer l’impact de nouvelles molécules sur l’intensité de l’expression clinique de la crise de prurit. L’utilisation de techniques in vitro préalables à l’utilisation de ce modèle in vivo permet de sélectionner en amont des molécules avec un fort potentiel d’activité sur le processus d’apparition du prurit impliquant certaines interleukines et ainsi de minimiser le recours au modèle in vivo. Cependant, la complexité des mécanismes biologiques en jeu ne pouvant pas être reproduite in vitro, cette étape demeure indispensable avant de prendre une décision sur la potentielle efficacité clinique d’une molécule chez le chien et l’éventuelle poursuite de son développement à des fins thérapeutiques.
Réduction
Les comportements de prurit présentent une variabilité entre individus. L'expérience avec ce type de modèle nous montre qu'il faut déterminer le nombre minimal d'animaux par groupe permettant d’obtenir des résultats exploitables et répétables. Ce sont le plus souvent, des études de preuve de concept/pilotes, étapes précoces de l'évaluation d'un nouveau produit/composé actif utilisant 3 à 6 animaux par groupe, qui permettront de déterminer le nombre d’animaux nécessaires pour des études ultérieures réglementaires. L'évaluation et l'interprétation des résultats sont faites avec une échelle de score adaptée pour ce modèle. Il est possible de réduire le nombre d'animaux par groupe, au cas par cas, selon la finalité de la procédure expérimentale. Cette décision sera dûment justifiée dans le plan d'étude spécifique dans le cadre de ce projet. Dans le plan d'étude, le nombre d'animaux par groupe sera toujours argumenté et justifié sur la base des informations déjà disponibles, de manière à optimiser l'utilisation des animaux et à en réduire leur nombre tout en s'assurant que ce nombre d'animaux permette d'atteindre l'objectif de l'étude, c'est-à-dire que les résultats de l'étude permettent de prendre une décision sur le niveau de sensibilisation et/ou l'efficacité du produit/des produits évalués. En plus d'étudier le contrôle du prurit (effet pharmacodynamique), l'utilisation d'un modèle permet d’obtenir éventuellement un profil pharmacocinétique en parallèle. Ces paramètres pourront être combinés et permettre par modélisation pharmacocinétique/pharmacodynamique (PK/PD) d’établir une relation entre l’effet et la dose et ainsi proposer une dose thérapeutique adaptée. Lors de ce modèle pourra aussi être réalisée une évaluation de la tolérance générale de la molécule. Toutes les informations obtenues lors d’une seule étude sur ce modèle permettent de diminuer le nombre d’études à réaliser pour statuer sur l’intérêt d’une nouvelle molécule ou de contribuer au développement d’une molécule à des fins thérapeutiques, et de ce fait, de diminuer le nombre d’animaux utilisés.
Raffinement
Les animaux sont observés et manipulés quotidiennement depuis leur arrivée sur le site afin de les habituer à la contention et au contact du personnel formé et impliqué dans les études. Les traitements et prélèvements sont réalisés généralement sur animaux vigiles selon les procédures en vigueur au sein de l’EU. Pour les chiens, une contention légère est suffisante pour l’administration du traitement et les collectes d’échantillons, et elle n’induit pas de nuisance au bien-être des animaux autre que d’être maintenus pendant des temps très courts. Les volumes prélevés et les temps de récupération des animaux sont déterminés de manière anticipée pour s’assurer que le bien-être ne sera pas altéré. Dans le cas d’administrations ou de prélèvements spécifiques (biopsie de la peau ), les animaux pourront être anesthésiés localement ou totalement pendant la durée de l’acte. L’anesthésie et le réveil des animaux se feront sous la surveillance d’un vétérinaire et selon les procédures en vigueur au sein de l’EU. Dans le cadre de ce Projet, les animaux sont préalablement testés pour leur capacité à exprimer un comportement de prurit modéré, reproductible, contrôlable et de durée limitée (environ 2h). Depuis leur inclusion dans une étude du projet jusqu’à la fin de la phase animale, les animaux sont observés quotidiennement par du personnel formé. Des observations plus fréquentes (toutes les 15 minutes) sont prévues après l’injection de la solution prurigineuse et l’administration des produits testés, pendant au moins 2h30, pour s’assurer que l’apparition des signes cliniques attendus (prurit) n’entraine pas de dégradation importante de l’état général et du bien-être de l’animal ainsi qu'une bonne tolérance au traitement. Le comportement général, la respiration, le grattage et l’aspect de la peau sont évalués avec une grille qui permet de définir si les réactions sont absentes, légères, modérées ou sévères. Ces critères constituent des points limites qui une fois atteints ou dépassés, entraineront un examen vétérinaire et éventuellement l’administration d’un traitement adapté à sa condition clinique. La réaction aigue induite et l’inconfort que l’injection de prurigineux engendre, peuvent être contrôlés avec des molécules anti-prurigineux. La grille d’évaluation des observations et les points limites sont validés par le comité d’éthique et pourront être révisés après analyse rétrospective par la SBEA, des résultats obtenus pendant chaque étude.
Choix des espèces
Les produits vétérinaires doivent réglementairement être testés dans l’espèce pour laquelle le produit est développé (animal de « destination »), dans ce cas, le chien. Les modèles seront réalisés chez des chiens jeunes adultes sains, c’est à dire des animaux de plus de 6 mois avec un système immunitaire mature.