Cochons

15 porcelets vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils sont infectés par le virus de la diarrhée épidémique porcine, puis reçoivent un antiviral en instillation nasale, avec des prises de sang et des écouvillonnages nasaux, rectaux et salivaires. Le porteur indique que l'infection peut provoquer diarrhées et vomissements, avec une mise à mort possible avant la fin selon les points limites, et que les porcs sont tués pour prélever leurs tissus. Il affirme que seuls les porcs sont sensibles à ce virus, ce qui rend selon lui leur utilisation 'indispensable'.

Objectifs

Le but de ce projet d’expérimentation animale est de valider l’utilisation d’antiviraux au niveau de la cavité nasale pour bloquer la transmission de virus à transmission aérosol. Il s'agit de démontrer la pertinence ou non d’un nouveau type de traitement antiviral, non invasif, pouvant être utilisé chez les porcelets pour prévenir la transmission des souches hautement pathogènes à transmission aeroportée du PEDV. Cette approche a été validée sur petits animaux (modèle rongeur avec le SARS-CoV-2). Le présent projet vise à valider cette approche sur de gros animaux (porcelets) en utilisant un virus porcin, le virus de la diarrhée épidémique porcine (PEDV), connu pour être transmis par voie respiratoire. Comme son action exacte dans la cavité nasale n’est pas décrite, le projet se déroulera en deux étapes. La première consistera à étudier les troubles provoqués par ce virus dans les fosses nasales. La seconde étape visera à valider un traitement antiviral en instillation nasale pour prévenir la contamination d’animaux par aérosol.

Bénéfices attendus

Les résultats obtenus à partir de l’expérimentation animale serviront preuve de concept et permettront de développer de nouvelles méthodes pour lutter contre les virus hautement pathogènes transmissibles par aérosol.

Procédures

Les prises de sang et les écouvillonnages (nasal, rectal et salivaire) à J0, J1 et J2 (et éventuellement à J3) seront réalisés par du personnel expérimenté. Administration d'un antiviral en intranasal.

Impact sur les animaux

L’infection pourrait engendrer dès le premier jour des symptômes de diarrhées et vomissement. Les animaux pourront être mis à mort avant la fin de l'expérimentation en fonction de la grille de points limtes définie.

Devenir

Les porcs seront mis à morts afin de prélever les tissus.

Remplacement

Le projet est basé sur la démonstration d’une faisabilité de traitement antiviral de la cavité nasal par antiviral pour bloquer une transmission aérosol d’un virus sur un animal de rente de grande taille. Seule une expérience sur animal permet de répondre à ces approches novatrices qui ont déjà été validées sur petit animal (Hamster). Les antiviraux développés contre le PEDV sont tout d’abord validés en systèmes in vitro (alternative qui est habituellement utilisées pour les infections virales de type lignées cellulaires et organoïdes) pour leur capacité à bloquer l’entrée du virus dans ses cellules cibles. Cette validation est un prérecquis pour envisager un blocage de la transmission par aérosol qui est au centre du présent projet. Cependant, il n’existe à l’heure actuelle aucun développement de ces alternatives in vitro, permettant d’étudier la transmission virale par aérosol qui doit donc être validée sur animal. Etant donné que seuls les porcs sont sensibles à l’infection par les virus de la PEDV et que nous voulons démontrer la pertinence d’un traitement d’antiviral sur des porcelets, l’utilisation de ces animaux est indispensable.

Réduction

La première procédure est exploratoire et nos expériences antérieures montrent que 3 porcelets est le minimum nécessaire pour étudier la présence ou non du virus dans les voies respiratoires. Pour la deuxième procédure le nombre d’animaux impliqué dans chaque groupe (n=4) constitue un minimum nécessaire pour des analyses statistiques compte tenu de la variabilité individuelle attendue sur les paramètres mesurés. De plus, l'équilibre des groupes en nombre permet d'offrir aux animaux des conditions de vie identiques en matière de surface et d’accès à l’auge par animal, évitant des soucis de concurrence, qui pourraient interférer avec les résultats de l'expérimentation.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en groupes stables avec enrichissement du milieu. Les animaux seront alimentés à volonté et auront accès à discrétion à de l’eau. Des objets manipulables seront mis à leur disposition. Des lampes chauffantes et une plaque de couchage leur offriront un confort optimum.

Choix des espèces

Ici, seuls les porcs sont sensibles à l’infection par les virus de la PEDV et comme nous voulons démontrer la pertinence d’un traitement d’antiviral sur gros animaux, l’utilisation des porcs est indispensable. Utilisation de porcelets de 4 à 6 semaines d’âge maximum pour que les porcelets soient sevrés et pour diminuer le risque d’apparition de symptômes comme les vomissements et diarrhées tout en favorisant l’infection.

Une chirurgie du thorax de trois heures pour implanter des sondes de mesure et un câble de stimulation cardiaque, puis, deux mois plus tard, deux interventions par voie percutanée à trois jours d'intervalle, la seconde s'achevant par la mise à mort : 80 porcs vont être utilisés, tous tués pour l'étude de leur cœur, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Après une période de repos, une insuffisance cardiaque leur est provoquée par une pression artérielle et une stimulation cardiaque élevées, et certains devraient mal la supporter selon le porteur, avec baisse d'activité, perte d'appétit et poids qui stagne ou baisse en fin de protocole. Une thérapie cellulaire censée régénérer le cœur est le premier traitement testé. Le texte ne dit ni comment la pression est élevée, ni combien de temps dure la stimulation, ni par quelle voie la thérapie est administrée, et qualifie d'"indolores" tous les autres actes.

Objectifs

L’insuffisance cardiaque est une maladie grave qui se définit par l’incapacité du coeur à pomper suffisamment de sang pour répondre aux besoins de l’organisme. Elle survient généralement chez des individus majoritairement âgés dont la santé est fragilisée depuis plusieurs années par des troubles cardiaques ou respiratoires ou par de l’hypertension. Elle se présente par un essoufflement et une fatigue disproportionnés par rapport à l’effort produit, d’abord uniquement à l’effort, puis aussi au repos. Dans les cas les plus avancés apparaissent d’autres symptômes plus invalidants tels toux nocturne, oedème (des poumons, des membres inférieurs). Le nombre de cas d’insuffisance cardiaque a augmenté au cours des 30 dernières années, en raison du prolongement de l’espérance de vie des personnes atteintes. L’insuffisance cardiaque est une cause importante de mortalité chez les personnes âgées, et le taux de survie 5 ans après le diagnostic est d’environ 50%, avec au moins 165000 hospitalisations et plus de 70000 décès annuels en France. C’est pourquoi nous étudions l’insuffisance cardiaque (à fonction systolique conservée) avec un modèle de porc à pression artérielle et stimulation cardiaque élevées, car nous avons grand besoin de comprendre sa physiopathologie et de trouver de nouvelles stratégies visant à prévenir ou à réduire la progression du dysfonctionnement du coeur. Notre projet prévoit d’utiliser au maximum 80 porcs sur 5 ans. La fréquence cardiaque, la taille du cœur, l’anatomie coronaire, l’innervation, la circulation collatérale native du porc sont très proches de celle de l’Homme. Le plan général du projet est de pratiquer une chirurgie afin d’implanter des sondes de mesure de l’activité cardiaque et un câble de stimulation de pacemaker, et après une période de repos, d’induire une insuffisance cardiaque afin d’évaluer l’effet d’un traitement thérapeutique grâce aux sondes implantées, mais aussi grâce à des mesures échocardiographiques et aux analyses de sang et de tissus cardiaques prélevés. Le premier traitement prévu est une thérapie cellulaire permettant une régénération du tissu de l’organe. D’autres traitements pourront être testés par la suite.

Bénéfices attendus

Le projet permet d’évaluer de manière très prédictive des stratégies de protection cardiaque, dont les résultats bénéfiques à long terme valent autant pour la santé humaine que pour la santé animale, et jouent sur l’amélioration globale de la qualité de vie, grâce à une amélioration de la fonction cardiaque.

Procédures

Chaque animal sera soumis 1 seule fois à une chirurgie thoracique réalisée sous anesthésie générale d’environ 3 heures, puis environ 2 mois plus tard à un acte chirugical percutané sous anesthésie générale d’environ une demie-heure, puis 3 jours plus tard à un acte chirugical percutané sous anesthésie générale se terminant par la mise à mort. Tous les autres actes sont indolores et consistent en des soins, ou à des échocardiographies ou à des enregistrements de paramètres hémodynamiques effectués sous sédation légère afin que l’animal soit bien calme.

Impact sur les animaux

L’insuffisance cardiaque se caractérisant essentiellement par une fatigue chronique, il est probable qu’un certain nombre d’animaux supportent moins bien ce traitement, ce qui entrainera une baisse d’activité et une perte d’appétit avec une stabilisation, voire une légère baisse de leur poids en toute fin de protocole.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort pour récupérer le coeur afin d'en faire l'étude histologique.

Remplacement

Aucune méthode alternative ne permet actuellement de tester totalement une stratégie de protection cardiaque sans passer finalement par l’expérimentation animale. Les traitements envisagés ont déjà été testés in vitro ou sur des animaux de petite taille (rongeurs) aux caractéristiques cardiaques trop dissemblables de l’Homme. Seuls des essais effectués sur un modèle d’étude cardiaque proche de l’Homme sont scientifiquement acceptables pour envisager une extrapolation vers la pratique clinique humaine.

Réduction

Il est prévu d’utiliser le minimum d’animaux pour chaque stratégie testée, et le nombre par lot est fixé à 8. De plus, à chaque fois que c’est possible, les animaux des lots témoins sont mutualisés pour chaque stratégie.

Raffinement

Des antalgiques, des anesthésiques et des tranquillisants sont utilisées à des doses adaptées (voir détails plus bas). Nous ne pensons pas observer de différences comportementales entre avant et après les actes chirurgicaux. Des signes indicatifs de gêne inhérents au modèle expérimental seront probablement observés en fin de protocole, et cette période sera particulièrement surveillée afin qu’elle soit le plus courte possible pour l’animal. Ils sont suivis quotidiennement et bénéficient de sciure pour satisfaire leurs réflexes de fouissage, et d’objets « manipulables » pour améliorer leur qualité de vie. Ils sont logés à plusieurs avant leur chirurgie.

Choix des espèces

L’animal choisi est le modèle le plus adapté pour ce projet, et validé depuis plusieurs années dans notre laboratoire. Le porc, par sa fréquence cardiaque, la taille de son myocarde, son anatomie coronaire, son innervation et l’absence de circulation collatérale native, est un modèle proche de l’Homme. Il permet de réaliser des études précliniques très prédictives sur le plan cardiovasculaire. A 2 mois ½ (25kg), âge minimal souhaité et poids maximal souhaité.

320 porcs vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal est immunisé de façon répétée puis subit des prélèvements de sang portant sur plus de 10 % du volume sanguin sans reconstitution, avant une exsanguination finale sous anesthésie pour récolter le sérum. Le porteur indique maintenir les animaux en vie de 11 à 24 mois pour produire ces anticorps destinés à la transplantation et à la cancérologie. Il justifie le choix du porc par le volume de sérum récolté, un animal remplaçant selon lui plus de cent "petits animaux".

Objectifs

L'objectif de ce programme est de produire des anticorps polyclonaux glyco-humanisés porcins anti-cellules tumorales, pour des applications de développement clinique en transplantation et en cancérologie. Cette saisine est un amendement à l’autorisation APAFIS dans le but d’optimiser le protocole d’immunisation avec notamment la recherche de la meilleure voie d’administration.

Bénéfices attendus

Contrairement à d’autres espèces animales, l’être humain et certains primates non humains n’expriment pas les enzymes alpha-1,3-galactosyl-transférase (GGTA1) et cytidine monophosphate-N-acetylneuraminic acid hydroxylase (CMAH), responsables respectivement de la synthèse de motifs alpha 1,3-galactose (Gal) et acide N-glycolyl-neuraminique (Neu5Gc) à la surface cellulaire. Il existe naturellement chez l’homme des anticorps dirigés contre ces xéno-antigènes Gal et Neu5Gc. Ainsi l’administration d’anticorps d’origine animale entraine habituellement l’apparition d’effets délétères (maladie sérique et allergie) du fait de la présence de ces xéno-antigènes. Nous avons développé une plate-forme de sérothérapie passive originale permettant la production d’anticorps polyclonaux glyco-humanisés (GH-pAb), issus d’animaux modifiés génétiquement, knock-out pour GGTA1 et CMAH. Nos anticorps polyclonaux glyco-humanisés présentent un certain nombre d’avantages : 1- une absence d’effets xénogéniques délétères (allergies et maladie sérique), 2- une efficacité lytique accrue vis-à-vis des cellules ciblées, 3- une activité anti-inflammatoire. 4- une spécificité démontrée par une série d’analyses histologiques sur tissus humains.

Procédures

Prélèvements de sang sous tranquillisation (animaux à moins de 120 kg de poids vif) sur 25% des animaux (catégorie des porcs entre 70- 120 kg de poids vif). La procédure de prélèvement sous tranquillisation a une durée de : - 5 minutes pour l’administration injectable; - 5 minutes pour le temps d’attente de l’effet de la tranquillisation et - 5 minutes de prélèvements avec les préparations, soit un total de 15 minutes / porc. Prélèvements de sang sur des animaux sous tranquillisation et anesthésie gazeuse. Immunisations des animaux sous tranquillisation et anesthésie gazeuse sur 75% des animaux (catégorie des porcs entre 120 - 200 kg de poids vif). La procédure de prélèvement sous tranquillisation avec une anesthésie gazeuse a une durée de : - 5 minutes pour l’administration injectable - 5 minutes pour le temps d’attente de l’effet de la tranquillisation ; - 10 minutes pour l’administration injectable de l’anesthésique et le branchement de masque pour l’anesthésie gazeuse - 5 minutes de prélèvements avec les préparations, - 10 minutes de réveil soit un total de 35 minutes / porc. *Il est à noter que plusieurs animaux peuvent être manipulés en même temps (5 porcs par équipe de 3 techniciens). Les temps pris par les procédures vont s’intercaler ce qui permet aux opérateurs de réduire le temps global des procédures.

Impact sur les animaux

Les nuisances provoquées par les prélèvements ou les vaccinations sont inclues dans la catégorie modérée selon la référence : Arrêté du 1er février 2013 relatif à l’évaluation éthique et à l’autorisation des projets impliquant l’utilisation d’animaux dans des procédures expérimentales - Exemples de différents types de procédures expérimentales définies selon chaque classe de gravité sur la base de facteurs liés au type de procédure expérimentale : a) Application fréquente de substances d’essai produisant des effets cliniques modérés et prélèvements d’échantillons sanguins (> 10 % du volume sanguin) chez un animal conscient pendant quelques jours, sans reconstitution du volume sanguin ;

Devenir

A la fin du programme d’immunisation, une exsanguination finale (euthanasie) sera effectuée sous anesthésie profonde afin de collecter le maximum de sérum hyper-immun qui sera ensuite utilisé pour la production de substance médicamenteuse. L'euthanasie des animaux sera effectuée à la fin du programme ou en cas de développement d’une non-réponse aux vaccinations par surdose d'anesthésie ou par un euthanasiant.

Remplacement

Plusieurs laboratoires ont cherché à remplacer la production d’anticorps polyclonaux (pAbs) à partir d’animaux donneurs par une production in vitro, recréée en bioréacteur à partir de l’information génétique extraite des donneurs et triée par phage-display. Cependant, malgré plus d’une décennie de R&D, les systèmes de production de pAbs in vitro n’ont pas permis d’atteindre les rendements requis pour la production de lots cliniques. En outre, ce type d’anticorps n’est pas disponible actuellement en Europe et ne pourrait pas couvrir les besoins des patients européens. De plus, le remplacement des pAbs rendant actuellement des services thérapeutiques essentiels (existant principalement dans les domaines de l’envenimation, de la transplantation et de l’anémie aplastique sévère) par des produits obtenus in vitro nécessiterait un développement complet, passant par une nouvelle recherche pré-clinique (chez l’animal) et clinique, chez des patients qui pourraient être aussi privés du traitement incluant de nouvelles phases 1, 2 et 3. Il s’agit typiquement d’un travail prenant plusieurs années (de quelques années à 10 ans).

Réduction

Le choix du porc comme espèce pour l’immunisation nous permet de réduire le nombre d’animaux vaccinés par rapport à d’autres espèces habituellement utilisées (comme le petits animaux), du fait du volume important de sérum pouvant être collecté sur un animal dans le respect des règles éthique. Un porc peut ainsi produire autant de sérum que plus de 100 petits animaux. Aucun test statistique ne soutient cette comparaison qui est évidente à l’ égard de la différence de taille entre ces espèces (un porc pesant en moyenne 110 Kg). En outre, le porc est maintenu en vie pendant une période de 11 à 24 mois, alors que les protocoles de prélèvement de sérum sur petit animal comprennent en général une à 2 prises de sang avant mise à mort par exsanguination. Ces 2 facteurs justifient les différences importantes dans le nombre d'animaux nécessaires pour collecter une quantité identique de sérum, lorsque des porcs sont choisis et non des petits animaux (tels que des lapins). En outre, dans cette étude nous souhaitons optimiser le protocole d’immunisations des animaux. C’est pour cette raison que nous réalisons cet amendement. L’objectif de ce protocole est d’induire une meilleure réponse immune humorale par rapport aux protocoles précédemment utilisés, en améliorant l’utilisation des adjuvants, la quantité d’antigène injectée et les voies d’injection. Obtenir un protocole optimisé nous permettra d’obtenir une meilleure réponse humorale et donc de réduire le nombre d’animaux nécessaires pour l’obtention de doses thérapeutiques d’anticorps.

Raffinement

Les conditions d’hébergement, l’enrichissement, les procédures de renforcement positif (jus de pomme) et le suivi des animaux par les animaliers et le vétérinaire, ainsi que les procédures analgésiques sont mises en place pour prévenir la douleur, et respecter le bien-être animal. Les animaux vont profiter de plusieurs éléments de matériaux manipulables pour pouvoir manifester leur comportement naturel de fouissement, de recherche de nourriture et environnemental. Les animaux dans le bâtiment spécialisé porc doté d’une climatisation et chauffage spécifique pour chaque catégorie, vont bénéficier de l’accès à la paille dans des nourrisseurs spécifiques pour compléter l’apport des fibres nécessaires en plus de la nourriture et avoir la possibilité de manifester leur capacité de fouissement. Plusieurs jouets vont être rajoutés dans les cases de chaque catégorie : brosses pour les reproducteurs, chaines avec des balles, tasseaux de bois attachés des parois, objets en caoutchouc mâchonnables spécifiques pour le porc. Un arbuste dans un pot va compléter l’environnement de chaque salle des animaux en procédure. Au cours de la semaine de la mise-bas, les truies et les cochettes vont recevoir des matériaux de nidification en quantité suffisante (sacs de jute, journaux, sciure de bois) pour le calme des animaux et l’amélioration des mises bas. Les truies et les cochettes vont mettre bas dans des cages spécifiques « liberté » qui permettent de bloquer les truies pendant les 72 h autour de la mise bas pour éviter l’écrasement des porcelets. Ensuite les animaux vont être libérés et avoir la possibilité de bouger dans toute la case de 6.5 m² pour pouvoir s’occuper des leurs porcelets jusqu’au sevrage. L’optimisation du protocole d’immunisation permettra également d’améliorer les conditions d’injections chez les porcs (diminution du nombre et du volume d’injection).

Choix des espèces

Le porc, de par son poids important, permettra de récolter un volume optimisé de sérum sur un nombre plus réduit d’animaux. Ainsi, un animal vacciné dès l’âge de 5 mois, avec une vaccination itérative maintenue pour une période de 11 mois consécutifs, peut produire suffisamment d’anticorps pour soigner de 100 à 1000 patients (en fonction de la dose administrée dans les indication de Transplantation ou d’oncologie). Les porcelets sont élevés puis immunisés à partir d’un minimum de 6 semaines d’âge (> 20Kg). Les sérums hyper-immuns seront prélevés sur des porcs par prises de sang répétées 35 jours après la première vaccination dans le respect des normes éthiques de volume et de fréquence de prélèvement : Arrêté du 1er février 2013 relatif à l’évaluation éthique et à l’autorisation des projets impliquant l’utilisation d’animaux dans des procédures expérimentales - Exemples de différents types de procédures expérimentales définies selon chaque classe de gravité sur la base de facteurs liés au type de procédure expérimentale : a) Application fréquente de substances d’essai produisant des effets cliniques modérés et prélèvements d’échantillons sanguins (> 10 % du volume sanguin) chez un animal conscient pendant quelques jours, sans reconstitution du volume sanguin ;

75 mini-porcs vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit par voie rectale un produit destiné à provoquer une inflammation du côlon, subit des coloscopies et des IRM sous anesthésie, puis l'administration orale ou rectale d'un anticorps. Le porteur indique que l'induction de l'inflammation peut entraîner saignements, douleurs, diarrhées et déshydratation, et que les animaux sont tués par injection intracardiaque en fin de protocole. Il décrit le mini-porc comme le "modèle le plus adapté" pour tester une nouvelle forme orale d'un médicament déjà commercialisé en perfusion.

Objectifs

L’inflammation chronique de l’intestin et du côlon (MICI) regroupent la maladie de Crohn (MC) et la rectocolite hémorragique (RCH). Selon l'Association François Aupetit (AFA), 8000 nouveaux cas sont diagnostiqués chaque année en France. Les traitements conventionnels des MICI sont à base d’antiinflammatoires (acide 5-amino-salicylique, Pentasa®), de corticoïdes ou d’immunosuppresseurs (Azathioprine). Dans cet arsenal thérapeutique, l'utilisation des anticorps monoclonaux anti-TNF en monothérapie s’avère être efficace, notamment sur les cas compliqués. Ce sont les molécules les plus puissantes disponibles actuellement en clinique. En 2014, 3 formes de ce médicament à base d’anti-TNF ont obtenu l’autorisation de mise sur le marché (AMM) en France pour le traitement des MICI administré par perfusion. Leurs indications ciblent le traitement de la maladie de Crohn et la rectocolite hémorragique modérée à sévère chez les patients réfractaires aux traitements conventionnels cités ci-dessus. Cependant, les effets secondaires de ces nouveaux médicaments sont parfois importants pour les patients, notamment l’apparition des saignements liées à l’injection répétée par voie intraveineuse de ce médicament. De façon intéressante, nous avons développé une autre forme de ce médicament de manière à l’administrer par voie orale. Cette voie permettra ainsi d’éviter ces effets secondaires. Cependant, l’efficacité de ce médicament administré par voie orale reste à démontrer. Cette recherche préclinique chez le mini-porc permettra de valider d’une part la faisabilité et la tolérance de la voie orale pour l’administration de ce médicament et d’autre part, l'efficacité thérapeutique de son activité anti-inflammatoire dans un contexte pathologique. Cette étude comportera deux grands objectifs : (1) Valider un modèle animal (mini-porc) qui développe la maladie de l’inflammation chronique de l’intestin et du colon, (2) confirmer la sécurité et l’efficacité du traitement administré par voie orale par rapport à la voie parentérale (perfusion) et rectale.

Bénéfices attendus

Notre étude apportera la validation préclinique d’une formulation pharmacologique innovante permettant d’administrer un traitement anti-TNF par voie orale. De manière générale, cette étude apportera un intérêt clinique majeur chez les patients souffrant de pathologies chroniques et déjà sous traitement parentérale (perfusion). L’utilisation d’une nouvelle forme galénique innovante s’accompagnera d’une meilleure tolérance et d’une action d’installation plus rapide que les traitements actuellement mises sur le marché. Les bénéfices attendus par l’utilisation d’un bio-médicament avec une nouvelle forme galénique administrée par voie orale sont nombreux : 1. Une libération locale ciblée de la substance active au site d'action. 2. Réduction des infections à répétitions. 3. Une meilleure observance du traitement liée à un mode d’administration plus simple, sans les contraintes de stockage et de stérilisation retrouvées avec les formes injectables. 4. diminution importante de la charge hospitalière (soulagement du système économique de la santé) 5. La fabrication d'une forme galénique sèche (comprimé) est simple et moins couteuse.

Procédures

Les animaux seront soumis à une injection par voie intra-rectale (induction de l’inflammation par 2,4,6 trinitrobenzene sulfonic acid (TNBS) et le Dextran Sulfate Sodium (DSS) + injection du traitement en solution ou dispersion), un gavage (administration des comprimés) et deux examens d'imagerie pour l’évaluation et le suivi du traitement (coloscopie + IRM avec injection de produit de contraste sous anesthésie générale). L’administration du médicament par voie orale à travers la sonde nasogastrique et par voie rectale à l’aide d’une canule rectale (dispositif médical) après fixation d’une seringue va durer approximativement 10-15 min. Une surveillance rapprochée des animaux sera effectuée afin de s’assurer de la tolérance des interventions.

Impact sur les animaux

La plupart des animaux notamment ceux inclus dans les phases 1 (sauf lot 1.1 : contrôle négatif), 2 et 3 (modèle de MICI), seront soumis à une injection d'un produit pouvant être irritant par voie rectale, afin de déclencher une inflammation colique. Cette intervention nécessite une anesthésie générale et l'utilisation d'une procédure de coloscopie. Cette intervention peut entrainer un saignement du colon, les animaux peuvent ressentir des douleurs, rarement une modification du poids (+/- 10%), des diarrhées pouvant entrainer une déshydratation. Par ailleurs, un stress lié à l'administration du traitement orale sera remédié avec une prémédication. Le traitement peut nécessiter une courte sédation de l'animal car le comprimé de 5 mm de diamètre ne doit pas être croqué (comprimé enrobé). Les animaux seront euthanasiés par l'injection létale intracardiaque du T61 à la fin du protocole expérimental ou lorsqu’un des points limites sera atteint.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés à chaque date (Mois 3 : Phase 1 et 2, Mois 12 : Phase 3), puis une autopsie (évaluation macroscopique des tissus) et des prélèvements de tissus biologiques pour une analyse moléculaire et histologique seront effectués. Les animaux seront euthanasiés à la fin de la procédure ou en cas d’apparition d’un point de limite.

Remplacement

Pour réaliser cette étude préclinique, nous utiliserons un modèle de maladie inflammatoire chronique intestinale (MICI) chez le mini-porc pour mimer la pathologie chez l’homme. Il s’agit d’un modèle animal le plus adapté d’une part par les ressemblances anatomiques et processus physiopathologiques du tube digestif avec l’homme, et d’autre part par sa corpulence proche de la taille humaine. Cette étude comporte la sécurité et l’efficacité de la forme galénique du traitement antiinflammatoire des MICI ciblant la partie distale de l’intestin. De ce fait, il n’est pas possible de remplacer l’utilisation du modèle animal par une évaluation in vitro ou ex vivo ou un modèle d’intestin artificiel « in silico ». Une administration des comprimés à taille humaine chez la souris ou le rat n’est pas réalisable, elle ne reflèterait pas les conditions physiopathologiques observées chez l’Homme. De plus, ce mammifère est le plus couramment utilisé dans les évaluations pharmacologiques des MICI. A notre connaissance, aucune étude expérimentale n’a évalué à ce jour l’efficacité d’un bio-médicament sous une forme galénique par voie orale. L’utilisation chez le mini-porc d’un bio-médicament sous une nouvelle forme galénique (développé en collaboration avec un industriel) permettra de démontrer la preuve de concept in vivo (efficacité, tolérance et sécurité) dans le traitement des MICI avant la réalisation des premiers essais cliniques sur l'homme.

Réduction

La réalisation des procédures par un chirurgien clinicien rompu à ces manipulations garantit une bonne reproductibilité et permet de limiter le nombre d’animaux à engager dans les protocoles. De surcroît, le nombre des animaux choisis permet de réaliser une étude comparative entre les groupes d’animaux sains et avec un MICI induite. Ce qui permet de valider le modèle pathologique. Ensuite, une étude d’efficacité du traitement selon le mode d’administration « orale versus intra-rectal » sera réalisée pour comparer les groupes traités avec les non-traités « placebo ». Nous avons montré que la procédure expérimentale parfaitement maîtrisée permet une évaluation efficace de l'induction ciblée de l'inflammation au niveau du colon. Il est prévu d’évaluer l'efficacité des formes galéniques innovantes pour une période de 5 ans sur 75 mini-porcs, soit 15 mini-porcs par an en moyenne. Nous envisageons de faire des groupes de 6 à 7 mini-porcs. Ce nombre est le minimum possible, puisqu’il tient compte des analyses statistiques et des éventuelles pertes de mini-porcs pendant l'anesthésie ou des procédures liées à l’induction de l'inflammation. Nous allons réaliser des tests statistiques de comparaison entre les différents groupes de type « Mann-Whitney » non paramétrique. Les différences entre les groupes seront jugées statistiquement significatives lorsque la valeur P est inférieure à 0.05.

Raffinement

La procédure expérimentale est conçue pour garantir le bien-être de l’animal et réduire au maximum l’inconfort, le stress et la souffrance de l’animal. Les mini-porcs seront hébergés dans un environnement en accord avec la norme européenne 2010/63/UE. La douleur liée aux interventions chirurgicales est une douleur ponctuelle réversible qui fera l’objet d’une surveillance de l’animal. Les animaux seront particulièrement surveillés après l'induction de l'inflammation pour visualiser tout signe de complications post-opératoires imprévues qui nécessiteraient l’euthanasie de l’animal. Ainsi, les équipes impliquées dans le projet sont constituées de spécialistes des approches in vivo chez l'animal, ce qui assure des pratiques expérimentales maitrisées, ainsi qu'un soin et un hébergement des animaux dans des conditions optimales. Médecins, chirurgiens, vétérinaires et animaliers spécialisés associeront leurs compétences pour assurer la meilleure prise en charge des animaux (analgésiques en pré- et post-opératoire et médication spécifique pour limiter les éventuelles douleurs induites par l'inflammation). Les membres de l'équipe possèdent la formation "concevant et réalisant" et la formation de chirurgie chez l'animal (AUEC).

Choix des espèces

Le modèle d'induction de l'inflammation chronique de l'intestin (MICI) chez le mini-porc sera utilisé pour évaluer et caractériser l’efficacité in vivo de nouvelles formes galéniques. C’est l’un des meilleurs modèles d’étude des MICI puisqu’il permet de s'approcher aux conditions physiopathologiques observées chez l'homme (similitudes de l’anatomie de l'appareil digestif, de la composition de la flore intestinale et du temps de transit). De surcroît, ce modèle permettra d’utiliser des technologies perfectionnées utilisées en pratique clinique courante chez l'Homme (IRM, coloscopie) dans le diagnostic, le contrôle, le traitement et le suivi de la maladie. Cette étude préclinique permettra ainsi une meilleure compréhension de la physiopathologie des MICI et leur traitement. L’objectif est de confirmer la preuve de concept in vivo avant de passer aux études cliniques chez l'Homme. - Dans un premier temps, les mini-porcs seront utilisés pour valider l’induction de l’inflammation chronique intestinale chez le groupe non-traité et le groupe traité par voie intra-rectale avec le bio-médicament. Ce dernier est administré soit en solution ou en dispersion d’un comprimé broyé contenant la dose thérapeutique de l’anticorps monoclonal afin de montrer d’abord son efficacité locale. L’induction de la maladie et l’efficacité locale du bio-médicament seront évaluées par le calcul des scores Wallace (étude macroscopique : extension des lésions) et Ameho (étude microscopique : immuno-histologie) et par le dosage des marqueurs biologiques (réponses inflammatoires, dosage des cytokines, MPO, TNFα, numération formule sanguine, …). -Dans un deuxième temps, les mini-porcs seront utilisés dans le cadre d'efficacité de la thérapie par voie orale. - Puis, afin de se rapprocher de la clinique en termes de taille et de structure anatomique de l'appareil digestif humain, le modèle du grand mammifère mini-porcs de type Gottingen adultes (40 à 60 kg) sera utilisé pour évaluer l’efficacité, la sécurité et la répétabilité de la thérapie à long terme (6-12 mois).

52 mini-porcs vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit deux à quatre interventions chirurgicales sous anesthésie, la dernière sans réveil, avec des effets attendus comme douleur, perte de poids et troubles neurologiques. L'objet est d'optimiser la greffe de cellules endocriniennes encapsulées pour le diabète de type 1 et l'hypoparathyroïdie. Le porteur présente le porc comme un modèle proche de l'homme, après des essais déjà menés sur des rongeurs.

Objectifs

Les objectifs de ce projet sont multiples. De manière générale, il s’agit d’optimiser les techniques de transplantation de cellules endocriniennes, ici îlots de Langerhans pour le traitement du diabète de type 1, et cellules parathyroïdiennes pour le traitement de l’hypoparathyroïdie. Cette optimisation se fera en étudiant les performances apportées par l’encapsulation des cellules et par le choix de sites alternatifs. De manière plus précise : - Développement d’un dispositif d’encapsulation de cellules endocriniennes pour la greffe : choix du biomatériau selon sa biocompatibilité et choix de son meilleur site d’implantation - Evaluation de l’apport bénéfique apporté par l’encapsulation sur la greffe d’îlots de Langerhans et de cellules parathyroïdiennes, en matière de survie et de fonction du greffon, dans un cadre d’autogreffe. - Evaluation l’intérêt de site alternatifs accessibles par voie endoscopique mini-invasive tels que la sous-muqueuse gastrique et rectale (sans encapsulation au sein de dispositifs).

Bénéfices attendus

A court et moyen terme, ce projet donnera lieu à plusieurs publications scientifiques ainsi que des communications orales lors de congrès nationaux et internationaux. A long terme, les résultats de cette étude permettront : - de pouvoir transplanter des îlots de Langerhans chez des patients diabétiques au sein de sites alternatifs moins invasifs que celui actuel (intrahépatique via un accès par la veine porte, nécessitant une laparotomie) - de développer une thérapie innovante, efficace et durable de l'hypoparathyroïdie - de limiter la perte de fonction du greffon au cours du temps - de diminuer les traitements immunosuppresseurs, très contraignants et à haut risque d'effets secondaires chez les patients

Procédures

Au cours de ce projet, les animaux seront répartis en 4 différents groupes. La nature et le nombre d’interventions auxquelles les animaux seront soumis dépendra des groupes formés. Les animaux du groupe 1 seront soumis à deux interventions chirurgicales sous anesthésie générale, dont la deuxième sera sans réveil. Ces interventions dureront au maximum 2 heures. Les animaux du groupe 2 seront soumis à 3 interventions chirurgicales sous anesthésie générale, dont la dernière sera sans réveil. Ces interventions dureront entre 30 minutes et 2 heures maximum et seront espacées dans le temps. Les animaux de la procédure 3 seront soumis à 4 interventions chirurgicales sous anesthésie générale, dont la dernière sera sans réveil. Ces interventions dureront entre 30 minutes et 2 heures maximum et seront espacées dans le temps. Des prélèvements de sang seront également effectués sur ces animaux, de manière vigile, à plusieurs reprises (maximum 7 fois). Ces prélèvements se déroulement sans douleur, grâce à la pose d’un cathéter de longue tenue au tout début du protocole (lors du premier bloc opératoire). Enfin, les animaux de la procédure 4 seront soumis à 6 procédures chirurgicales effectuées sous anesthésie générale, dont la dernière sera sans réveil. Ces interventions dureront entre 30 minutes et 2 heures maximum et seront espacées dans le temps. Deux de ces interventions n’impliqueront pas d’incision chirurgicale. Des prélèvements de sang seront également effectués sur ces animaux, de manière vigile, à plusieurs reprises (maximum 7 fois). Ces prélèvements se déroulement sans douleur, grâce à la pose d’un cathéter de longue tenue au tout début du protocole (lors du premier bloc opératoire).

Impact sur les animaux

Les effets indésirables post opératoires attendus sont les suivants : douleur, perte de poids, diminution de l’appétit, mobilité réduite, confusion, troubles neurologiques et métaboliques, stéréotypies. Ces effets pourront survenir pendant toute la durée du protocole (jusqu'à 3 mois) mais sont particulièrement attendus en période post opératoire.

Devenir

Aucun animal n'est gardé en vie à l'issue de chaque procédure. En effet, la réalisation de biopsies terminales en fin de procédure, en particulier estomac et rectum, n'est pas compatible avec la survie de l'animale.

Remplacement

L'objectif de ce projet est de développer de nouveaux dispositifs d'encapsulation améliorant la survie et la fonctionnalité d'îlots de Langerhans et de cellules parathyroïdiennes greffés au sein d'un organisme, dans une optique thérapeutique contre le diabète de type 1 et l'hypoparathyroïdie. Au sein de ce projet, nous souhaitons évaluer la tolérance de ces dispositifs par l'organisme, la survie des cellules greffées et leur fonctionnalité in vivo, ainsi que le potentiel intérêt de sites alternatifs pour la greffe tels que la sous-muqueuse gastrique et rectale. Il s'agit donc d'une approche d'ordre physiologique et intégrée à un organisme, d'où la nécessité d'utiliser des animaux pour ce projet. Nous ne pouvons donc pas remplacer l'utilisation d'animaux car nous souhaitons évaluer le comportement du greffon in vivo.

Réduction

Nous utiliserons un minimum d’animaux pour notre étude qui correspond à une étude préclinique en vue d’une étude clinique future. Il est à ce jour impossible de calculer le nombre nécessaire d’individu dans chaque groupe car nous ne pouvons pas encore quantifier l’effet attendu de chaque technique en cours d’évaluation sur le phénotype. Cependant, par rapport aux études antérieurement réalisées sur le miniporc dans notre laboratoire, un nombre minimal standardisé de miniporc nécessaire par groupe a été établi. Les estimations déclarées ici sont maximales et nous pourrons réduire le nombre d’animaux en cours de protocole si l’effet attendu a pu être constaté.

Raffinement

Les procédures de raffinement suivantes seront appliquées : -Condition standard d'hébergement conformément à la réglementation : hébergement individuel, 12 heures d'éclairage par jour, enrichissement du milieu : jouets. - Prélèvements et expérimentations menés dans des pièces réservées à cet effet et différentes des locaux d’hébergement. -Administration d’anesthésiques et d’analgésiques adaptés : anesthésie gazeuse et opioïdes et/ou anti-inflammatoires -Soins apportés au besoin après avis vétérinaire (infection cathéters, ...). -Les animaux présentant au moins un point limite sont retirés de l’étude et mis à mort (prostration, immobilité, appétence, perte de poids) si nécessaire. -Une période de 10 jours d’adaptation sera appliquée à chaque animal entrant.

Choix des espèces

Le modèle pré-clinique porcin est un modèle à haute valeur translationnelle : sa proximité avec l'Homme est très grande, d'un point de vue métabolique, physiologique, ou encore anatomique. Par ailleurs, il permet une bonne transposition des techniques chirurgicales et présente un métabolisme glucidique semblable. La tolérance du dispositif et son effet sur la survie et la fonctionnalité des cellules greffées ayant déjà été étudié sur modèle rongeur, l'objectif serait de reproduire ces études mais sur un modèle à plus grande valeur translationnelle, afin de pouvoir transposer cette innovation thérapeutique directement sur l'Homme. Des miniporcs seront alors utilisés : ils présentent une taille et un poids adulte raisonnables permettant une stabulation moins compliquée que des porcs charcutiers (300 kg à l'âge adulte), plus lourds chez lesquels il aurait fallu utiliser des individus juvéniles au métabolisme quelque peu différent des individus adultes. Les animaux utilisés seront des jeunes adultes (d'au moins 1 an). Leur taille et leur poids permettra de faciliter les techniques chirurgicales et les prélèvements sanguins. Par ailleurs, leur métabolisme glucidique sera d'autant plus proche des patients adultes, cible de cette innovation thérapeutique.

3 porcs vont être utilisé·es, gardés en vie et réutilisés, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les animaux sont maintenus en contention dans un hamac et subissent jusqu'à quatorze prélèvements sanguins en vingt-quatre heures, pour mettre au point une technique de micro-échantillonnage de sang. Le porteur indique que la contention peut être source de stress et que les prélèvements peuvent provoquer douleur et hématomes. Il affirme qu'il est "indispensable" de recourir à "l'animal entier" faute de méthode reproduisant la diffusion d'un produit dans le sang.

Objectifs

L'objectif de ce projet est la mise au point de méthodologie de micro échantillonnage de sang (maximum 200µL de sang prélevé) pour réduire l'invasivité des prélèvements sanguins lors d'études pharmacocinétiques à venir.

Bénéfices attendus

Les techniques de micro-échantillonnage permettent de réduire au minimum le volume de sang prélevé sur les animaux. Cela présente des avantages par rapport à la diminution du nombre d'animaux utilisé et l'amélioration des aspects liés au bien-être animal.

Procédures

Les animaux seront soumis à une contention pour réaliser les prélèvements sanguins. Contention manuelle via l'utilisation d'un hamac. La durée de la contention sera d'environ 1 minute. Il y aura 14 prélèvements de sang au maximum sur 24h. La durée d'un prélèvement de sang est inférieure à la minute

Impact sur les animaux

Dans ce projet, les animaux seront soumis à des prélèvements sanguins uniquement. Les animaux seront contentionnés via un hamac. La contention via le hamac peut être génératrice de stress. Les prélèvements sanguins se feront au niveau des veines auriculaires, veines mammaires, veines caudale et veines saphènes. Les prélèvements peuvent engendrer de la douleur, des hématomes au niveau des sites de prélèvements. Si tel est le cas des analgésiques pourront être appliqués si nécessaire sur décision du vétérinaire responsable.

Devenir

Tous les animaux seront gardés en vie à la fin de cette procédure.

Remplacement

Aucune méthode alternative ne permettant actuellement de reproduire la diffusion d’un produit dans le sang des animaux au niveau de l'organisme entier, il est indispensable de recourir à l’animal entier. Aucune méthode alternative ne permet d'évaluer l'efficacité d'un produit test chez le mini-porc. Les tests in vitro, ou les tests sur organe isolé ne peuvent pas traduire de la réponse d'un organisme entier. Il n'existe pas de modèle animal synthétique qui permette de mettre au point cette méthode.

Réduction

Trois animaux sont prévus dans ce projet. C'est le nombre minimal de replicats pour definir une bonne reproductibilité technique. Aucune approche statistique n'a été réalisé, mais les réplicats constituent d'importants contrôles de la qualité de la conduite des expériences et les test statistiques non paramétriques de type Mann-Whitney peuvent être utilisé dès n=3.

Raffinement

Les animaux seront hébergés par 3. De l'enrichissement (exemple: balle, jouet suspendus) seront présents autant que possible dans les boxes. Un suivi bi quotidien (voir plus) sera mis en place pour l'observation générale des animaux et la détection précoce de signe clinique pour une prise en charge rapide d'éventuels effets secondaires. Les animaux seront préalablement habitués à la contention dans un hamac et à la manipulation des zones d'intérêt. Un analgésique local ou du froid pourra être utilisé pour limiter la douleur de la piqûre de la zone d'intérêt. Les effets secondaires peuvent être de la douleur ou un hematome au site de prélèvement qui ne sera alors plus utilisé.

Choix des espèces

Espèce de choix pour ce type de projet. Necessité de développer cette technique pour cette espèce. Jeune Adultes. Animaux adultes necessaire pour ce type de projet. Animaux qui ont fini leur croissance.