Cochons

48 cochons vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Pendant 56 jours ils reçoivent des additifs alimentaires à base de plantes, subissent des pesées et deux prélèvements sanguins à la jugulaire par immobilisation au lasso, avant d'être tués pour prélever leur contenu intestinal, leurs muscles et leur graisse. L'objet du projet est de valider des additifs commerciaux réduisant les émissions d'ammoniac de l'élevage porcin intensif, en vue de leur mise sur le marché. Le porteur affirme que l'inconfort se limite au stress de la contention et présente l'expérimentation in vivo comme la suite de tests in vitro déjà probants.

Objectifs

Le projet présenté ici a pour objectif d’évaluer une solution pour atténuer les émissions gazeuses, spécialement d’ammoniac, enregistrées en élevage intensif des porcs. Les émissions atmosphériques de composés polluants sont au centre des préoccupations environnementales et concernent notamment le secteur de l’agronomie avec l’élevage porcin qui constitue un gros émetteur de gaz. Les émissions proviennent des déjections des animaux qui dépendent de la composition des régimes alimentaires et des performances des animaux. Les aliments à teneur élevée en protéines non valorisée par les animaux conduit à une excrétion d’azote importante sous formes d’azote fécal et d’azote urinaire composé d’urée, pour éliminer l’ammoniaque issu du catabolisme des protéines, rapidement converti en azote ammoniacal. Cet azote ammoniacal conduit à des émissions d’ammoniac (NH3) et de protoxyde d’azote (N2O), en bâtiment, au stockage et à l’épandage. Les mesures de réduction des apports azotés et donc de l’excrétion d’azote pourraient être utilisées à la fois pour réduire les émissions de gaz à effets de serre (GES) mais aussi et en priorité pour réduire les émissions d’ammoniac, compte tenu de ses effets sur la santé humaine, la santé animale, l’acidification et l’eutrophisation. Depuis plusieurs années, des stratégies ont été développées pour réduire les émissions d’azote, dont l’ammoniac. Une des stratégies vise notamment à optimiser l’alimentation animale (volailles et porcins), avec l’ajustement des apports protéiques dans les rations. En effet, une alimentation à basse teneur en protéines permet de réduire les quantités de protéines ingérées par les porcs, et donc les excrétions azotées des animaux ainsi que les pertes gazeuses associées, sous forme d’ammoniac. Une autre stratégie consiste aussi ces derniers temps à utiliser des extraits de plantes (extrait du thé vert, d'olive, de réglisse) comme additifs naturelles pouvant être ajoutées à la ration alimentaire pour empêcher efficacement la libération d’ammoniac dans l’air à différents niveaux.

Bénéfices attendus

Les émissions d'ammoniac provenant des élevage d'animaux font fréquemment l'objet de plaintes pour odeurs et de préoccupation en raison de la possibilité de leurs effets négatifs sur la santé des humains et des animaux. Les animaux peuvent développer une variété de troubles lorsqu'elles sont exposées à des niveaux élevés d'ammoniac pendant des périodes prolongées. Il est donc très important de développer des stratégies efficaces pour réduire les émissions de NH3 provenant des lisiers. Les résultats de ce projet permettront donc de valider l’utilisation d’inhibiteur d’uréase comme stratégie de réduction des émissions gazeuses en élevage porcins et comprendre leur mode d’action, et d’identifier de nouvelles substances qui contribueront à la rétention de l’azote.

Procédures

Les animaux seront soumis à la procédure pour une durée de 56 jours. Les animaux seront soumis au cours de la procédure à deux prélèvements sanguins au niveau de la veine jugulaire. Les deux prélèvements sanguins seront réalisés avec une période de récupération de 4 semaines entre les deux. Pour chaque prise de sang le temps de prélèvement ne dépassera pas 1 minute.

Impact sur les animaux

Perte de poids, ralentissement de la croissance en cas de réduction de l'ingestion alimentaire (palatabilité), refus d'alimentation. Stress dû à la conduite des animaux en vue de leur pesée individuelle. Inconfort et stress dus à l’immobilisation des animaux à l'aide d'un lasso pour la prise de sang.

Devenir

Tous les animaux entrant dans la procédure expérimentale seront mis à mort à l'issu de la procédure afin de réaliser des prélèvements d'échantillons biologiques (contenus intestinal, muscle, mesure d'épaisseur de graisse)

Remplacement

Le projet envisagé fait suite aux tests in vitro réalisés au préalable afin d'évaluer l'efficacité des substances testées. Les résultats ayant montré des résultats probants, la finalité de la démarche consiste ensuite à démontrer l’effet bénéfique de l’ajout des substances d’origine végétale sur la réduction de l’émission gazeuse tout en maintenant l’efficacité de croissance des animaux.

Réduction

Sur la base des résultats rapportés dans la littérature, l'addition de substance d'origine végétale a des effets positifs sur différents paramètres liés à l'accrétion protéique, la rétention d'azote par l'animal, paramètres cibles de décision dans ce projet pour montrer les effets bénéfiques de la supplémentation des additifs testés. Une approche statistique a permis d'évaluer la taille de l'échantillon nécessaire afin de montrer un effet attendu de 5 % .L'analyse statistique a montré que 12 animaux par lot étaient necessaires pour montrer une difference significative.

Raffinement

Le stress dû à la conduite des animaux en vue de leur pesée individuelle est réduit en réalisant les opérations de conduite jusqu’à la balance en évitant de claquer les portes des cages métalliques, en déplaçant les porcs en groupe (cage par cage) dans le calme en prenant en compte le point de balance de l’animal qui avance si l’opérateur est placé en arrière du point de balance et qui recule si l’opérateur est placé en avant du point de balance. L’opérateur doit porter une tenue de couleur sombre, et stimuler les animaux par la voix et la main afin de guider leur déplacement. Des panneaux de conduites, des tapettes en plastiques sont autorisés pour la conduite des animaux. La mesure du gras dorsal est réalisée au moment de la pesée au niveau de la balance afin d'éviter une manipulation supplémentaire des animaux ou directemnt dans la cage pour éviter de manipuler l'animal. Lors des prises de sang, chaque animal est présenté à l'aide d'un lasso en acier souple en bon état, maintenu à la main et tiré vers l’avant afin que la tête soit alors présentée légèrement relevée pour des porcs de plus de 30 kg. L’inconfort et le stress dus à l’immobilisation des animaux sont réduits par une manipulation compétente et rapide des animaux par les applicateurs de la procédure, par un prélèvement de faibles volumes de sang en fonction de la volémie et par l’application d’un point de pression sur le site de prélèvement comme décrit dans le procédure interne « Geste technique sur animaux vivants : prises de sang » qui définit le volume limite de prélèvement sanguin et les périodes de récupération nécessaires. A la fin de la prise de sang, l’animal peut être caresser au niveau du groin ou sous le cou. Les conditions d’hébergement des animaux sont définies de telle sorte que l’enrichissement des cages (ballons, croix, chaine), la densité des animaux par cage, ou encore les paramètres environnementaux (température et hygrométrie…) procurent le maximum de confort aux animaux, et restent supérieurs ou égaux à la législation en vigueur (Arrêté du 01/02/2013). Aucun animal ne reste isolé, en cage individuelle sans contact olfactif, auditif et visuel avec ses congénères, ceci afin de réduire au minimum l’angoisse et le stress des animaux..

Choix des espèces

Les additifs alimentaires développés sont destinés à être incorporés dans les aliments destinés aux porcins (porcs en croissance) qui représentent de ce fait la cible privilégiée des produits que nous voulons mettre sur le marché. Porcs : études avec des animaux sevrés à 28 jours d’âge au niveau de l’élevage et réceptionnés avec un poids vif de 28-32 kg en moyenne Les animaux sont utilisés au stade de l'engraissement qui constitue le stade de développement qui génère le plus d'émissions gazeuses, permettant ainsi d'évaluer les solutions proposées par ce projet.

10 porcs vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent la pose chirurgicale d'un cathéter dans la veine jugulaire, des gavages sous contention ferme et des prélèvements de sang répétés, pour établir la cinétique d'une association d'antibiotiques utilisée dans la filière porcine. Le porteur souligne une pose "moins invasive" et des prélèvements "totalement indolores" une fois le cathéter en place, et réutilise chaque animal pour deux voies d'administration. Il justifie la mise à mort par le prélèvement des muscles, du foie et des reins pour y doser les antibiotiques.

Objectifs

L'association d'antibiotiques sulfamides/triméthoprime est classiquement utilisée en médecine vétérinaire, notamment dans la filière porcine, pour traiter certaines infections. Le ratio de doses sulfamides/triméthoprime dans la quasi-totalité des spécialités vétérinaires mises sur le marché est de 5:1. Or, ce ratio n’a pas été établi à partir de données animales, mais est une transposition directe du ratio correspondant à l’association sulfaméthoxazole/triméthoprime (SMX/TMP) utilisée chez l’Homme. Un biais majeur de cette transposition réside dans le fait que les vitesses d’élimination des sulfamides (illustrées par leurs temps de demi-vie plasmatiques, t1/2 vie) peuvent être très variables selon l’espèce animale. Chez l’Homme, le SMX et le triméthoprime ont des t1/2 vie assez proches, permettant de maintenir un rapport de concentrations entre les deux antibiotiques constants au cours du temps et de conserver ainsi l’effet synergique entre eux. A l’inverse, chez les animaux de rente par exemple, certains sulfamides ont des t1/2 vie beaucoup plus longs que celui du triméthoprime. Les sulfamides seront alors présents beaucoup plus longtemps chez l’animal, d’où une perte probable de l’effet synergique recherché et par voie de conséquence de l’efficacité de l’association. L’ensemble de ces facteurs questionne la pertinence du ratio 5:1 des formulations vétérinaires, mais aussi les posologies recommandées (doses et/ou intervalles d’administration). Cette procédure expérimentale s’ajoute à une autre demande déjà validée par le comité d’éthique dans laquelle deux associations de sulfamide/TMP (sulfadiazine(SDZ)/TMP et sulfadiméthoxine(SDMX)/TMP), ayant des propriétés pharmacocinétiques distinctes, ont été étudiées chez le porc. L’objectif de cette nouvelle demande est d’ajouter une étude cinétique avec une 3e association (sulfaméthoxazole(SMX)/TMP) pour compléter les données pharmacologiques in vivo déjà obtenues avec les deux précédentes associations, permettant par la suite de consolider l’approche de modélisation pharmacocinétique/pharmacodynamique (PKPD) afin d’optimiser les posologies et schéma d’administration de ces molécules chez le porc.

Bénéfices attendus

La promotion de solutions thérapeutiques à base d’associations – entre antibiotiques ou entre antibiotiques et nonantibiotiques – tient une place importante dans les stratégies de lutte contre l’antibiorésistance. Lorsqu’elles associent 2 antibiotiques, ces solutions doivent viser à limiter l’émergence de résistances et non à élargir le spectre d’activité. Les formulations associant le TMP avec un sulfamide peuvent entrer dans la première catégorie, ce qui en fait une exception « vertueuse » parmi les associations disponibles en médecine vétérinaire dont la plupart ont été développées avec un objectif d’élargissement du spectre. Malheureusement, les formulations TMP/sulfamides destinées aux animaux ont été développées par transfert « aveugle » des données de la médecine humaine relatives à l’établissement d’une synergie, sans tenir compte des spécificités des espèces animales ou de leurs bactéries pathogènes. Les études pharmacocinétiques in vivo couplées au études pharmacodynamiques sur des bactéries pathogènes les plus fréquemment rencontrées vont à terme, permettre d’optimiser l’administration de l’association triméthoprime/sulfamide (doses, posologies) chez le porc.

Procédures

Pour réaliser la cinétique plasmatique, un cathéter central sera posé au niveau de la veine jugulaire externe grâce à un acte chirurgical réalisé sous anesthésie générale et échoguidé. Cette technique utilisant un échographe permet de réduire la durée de l’intervention par rapport à une chirurgie « classique » (de 1h30-2h à 30-45 minutes par animaux) tout en minimisant le risque infectieux (acte moins invasif). Cet acte chirurgical peut être source de stress et de douleur mais une contention maitrisée suivi d’une anesthésie/analgésie adaptée permettra de réduire au maximum ces désagréments. Une fois le catéther posé (avec une rallonge du connecteur), les prélèvements de sang seront totalement indolores, sans contention particulière et réalisé en moins d'une minute. Durant l'expérimentation une source de stress viendra des gavages qui nécessitent une contention ferme quisera effectuée par des opérateurs formés, assurant ainsi la sécurité des animaux et des opérateurs et minimisant les sources d’inconfort pour les animaux. Chaque manipulation de contention+gavage ne dure pas plus de quelques minutes (entre 3 et 4 minutes).

Impact sur les animaux

Pour réaliser la cinétique plasmatique, un cathéter central sera posé au niveau de la veine jugulaire externe sous anesthésie générale, de façon écho-guidée et en respectant une asepsie rigoureuse. Cette technique permet de minimiser le risque infectieux (acte moins invasif qu’une chirurgie « classique ») ainsi que le temps d’anesthésie de l’animal. Une fois le cathéter posé (avec une rallonge du connecteur), les prélèvements de sang seront totalement indolores et sans contention particulière. Durant l'expérimentation une source de stress viendra des gavages qui nécessitent une contention qui sera effectuée par des opérateurs formés, assurant la sécurité des animaux et des opérateurs et minimisant les sources d’inconfort pour les animaux. Chaque manipulation de contention+gavage ne dure pas plus de quelques minutes (2 à 3 minutes).

Devenir

Chaque porc sera mis à mort à l’issu de l’expérimentation dans des conditions éthiques et les tissus d’intérêts (muscles, foie, reins) seront récoltés pour le dosage des antibiotiques.

Remplacement

Il n’existe actuellement pas de méthodes non-animales de remplacement pour suivre la cinétique plasmatique (tout en incluant les variabilités inter-individuelles) des molécules qui est une étape préliminaire à l’approche PK/PD envisagée.

Réduction

L’utilisation de 5 animaux par voie d’administration (IV ou voie orale VO) soit un total de 10 animaux est un minimum pour pouvoir correctement estimer la variabilité inter-individuelle des paramètres pharmacocinétiques (clairance, etc) par une approche de population (modèle non-linéaire à effet mixte). De plus, l’approche en « cross-over » permet de limiter le nombre nécessaire d’animaux en les ré-utilisant pour tester les deux voies d’administration (IV et VO) pour l’association sulfaméthoxazole (SMX)/TMP en incluant une période de wash-out adaptée pour garantir la fiabilité des résultats. Une fois le modèle PK développé et fiable, il permettra d’étendre l’exploration à d’autres posologies sans la nécessité d’utiliser d’autres animaux.

Raffinement

Les porcs seront hébergés par 2 lors de la phase d’acclimatation (7 jours) puis seront seuls par case (sur caillebotis) après la pose du cathéter afin de limiter les risques d’arrachement. Néanmoins, des barrières entre cases permettent un contact visuel, olfactif et tactile (groin à groin) entre porc voisin. Des jouets seront mis à disposition : balle, ainsi que jouets à macher suspendus. Les prises de sang répétées seront effectuées après la pose chirurgicale de cathéters (avec anesthésie et analgésie suffisante pour les animaux) pour limiter la douleur lors des prélèvements sanguins ainsi que le stress généré. Les cathéters seront protégés avec un bandage adéquat vérifié régulièrement et changé s’il devient trop souillé. Un suivi-post opératoire individuel des animaux sera effectué et une analgésie sera mise en place si nécessaire (paracétamol +/- analgésique de type morphinique) même s’il est peu probable d’avoir un tel recours en raison de la méthode très peu invasive de pose du cathéter. Le début de la cinétique ne se fera qu’au minimum 24h après la pose du cathéter. La contention lors du gavage sera effectuée par des opérateurs formés pour assurer la sécurité des animaux et des opérateurs tout en minimisant les sources d’inconfort pour les animaux. Cependant, des points limites et critères d’arrêt ont été définis afin de permettre une intervention rapide sur les animaux.

Choix des espèces

Il s’agit de l’espèce cible pour l’étude pharmacocinétique de l’association sulfamethoxazole(SMX)/TMP. Au début de l’expérimentation, les porcs seront sevrés, et auront un poids d’environ 25-30 kg. Cet intervalle de poids permet une manipulation aisée des animaux (sécurité des opérateurs, diminution du stress des animaux).

1200 animaux, dont 500 souris, 500 rats, 80 macaques crabiers, 80 porcs et 40 chiens, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, la grande majorité étant tuée et environ 38 non-rongeurs réutilisés ou adoptés. On leur induit des lésions par des produits chimiques administrés jusqu'à deux mois, avec prélèvements répétés, pour rechercher des biomarqueurs de toxicité. Le porteur décrit une baisse d'activité, une perte de poids et des atteintes d'organes, la plupart des animaux étant tués pour analyse anatomo-pathologique. Il présente le recours à l'animal comme "requis" pour transférer ces données à la clinique et estime à 10 à 15 % les non-rongeurs réutilisables.

Objectifs

Un médicament n’est mis sur le marché et rendu disponible aux patients qu’après une longue phase de Recherche et de Développement. Le défi majeur pour la recherche biomédicale est de découvrir de nouveaux médicaments plus efficaces et mieux tolérés. Actuellement, de nouveaux besoins et enjeux apparaissent, notamment le développement et l’intégration de biomarqueurs au sein même des études chez l’animal de laboratoire afin de permettre une meilleure sélection des candidats médicaments, l’accélération du développement, l’amélioration du suivi personnalisé et du taux de réussite. Un biomarqueur est « une caractéristique biologique mesurable liée à un processus normal ou non. En médecine, il est utilisé pour le diagnostic, la réponse à un traitement ou la toxicité d’une molécule et est dosé préférentiellement dans le sang ou l’urine ». Ce projet utilise des modèles animaux de lésions/atteintes fonctionnelles chimio- ou génétiquement induites avec pour objectifs d’une part d’évaluer des biomarqueurs de toxicité précoce (trouver de nouveaux biomarqueurs plus précoces, plus spécifiques, plus sensibles et qualifier leur cinétique d’apparition), et d’autre part d’évaluer l’efficacité de nos candidats médicaments (par exemple diminution de toxicité hépatique ou rénale) grâce au suivi de ces biomarqueurs. Il nécessite la mise en œuvre de modèles animaux rongeurs ou non-rongeurs mimant le processus complet le plus proche de l’Homme.

Bénéfices attendus

L’identification, la cinétique d’apparition et la validation de nouveaux biomarqueurs comme indicateurs de toxicité précoce permettra de sélectionner les candidats médicaments les plus prometteurs et/ou d’arrêter plus précocement le développement de molécules ayant un profil toxicologique non acceptable au regard de l’indication thérapeutique. À plus long terme, les biomarqueurs les plus pertinents pourront être proposés comme outils futurs d’adaptation dans les essais cliniques (diagnostic, médecine personnalisée, etc.). L’évaluation d’efficacité de candidat-médicament sur des atteintes lésionnelles ou fonctionnelles établies, via le suivi de biomarqueurs permettra, à terme, de proposer des médicaments capables d’améliorer le confort des patients et leur observance au traitement.

Procédures

Pour induire une lésion ou une atteinte fonctionnelle modérée, un produit est administré aux animaux, par différentes voies (principalement orale et intraveineuse) de façon quotidienne ou hebdomadaire sur une durée maximale de 2 mois. Des prélèvements associés à une contrainte légère de quelques minutes (en début et fin d’étude) sont nécessaires pour caractériser des biomarqueurs d’intérêt ; leur fréquence et volume sont conformes aux recommandations éthiques en vigueur et sont réalisés sous anesthésie/analgésie quand ils sont invasifs ( entre 15 et 30 minutes). Des mesures comme par exemple la température corporelle (avec une puce électronique), le poids ( 2 fois par semaine) sont réalisées en fonction de l’objectif de l’étude. La durée maximale des études sera de 2 mois.

Impact sur les animaux

Les effets attendus chez les animaux seront limités à une contrainte modérée. Ils correspondent aux conséquences de l’atteinte fonctionnelle et/ou lésionnelle ainsi que celles de l’administration des candidats médicaments pouvant se traduire chez l’animal par exemple par une baisse d’activité, une perte de poids, une modification de la température corporelle. Par ailleurs, les prélèvements nécessaires au suivi des biomarqueurs peuvent entraîner des nuisances de courte durée (ex : contention, isolement de l’animal de quelques heures pour le recueil d’urine).

Devenir

Ce type d’étude nécessite le plus souvent une analyse anatomo-pathologique terminale pour évaluer les atteintes sur les organes et tissus. C’est seulement lorsque les objectifs de l’étude ne nécessitent pas cette analyse et que les atteintes/lésions sont réversibles que certains animaux non-rongeurs pourront être ré-utilisés après approbation du vétérinaire. L’estimation de ce nombre d’animaux est d’environ 10-15%. Certains de ces animaux pourront être proposés à l’adoption via des associations et des structures d’accueil spécifiques et en accord avec les autorités compétentes.

Remplacement

Le recours à l’animal de laboratoire est requis pour avoir la possibilité d’identifier ou de valider des biomarqueurs présents dans les fluides biologiques ou certains tissus (ex : sang, salive, urines, fèces, liquide cérébro-spinal, peau, moelle osseuse) et de transférer les connaissances scientifiques acquises au cours de ces études aux études cliniques. La médecine translationnelle s’appuie sur les progrès de la recherche faite avec des modèles animaux pour développer de nouvelles techniques médicales pour le suivi des effets d’un médicament. Ce projet s’inscrit dans une démarche globale qui intègre revue bibliographique, tests in vitro (cellulaires et organoïdes) voire données recueillies chez les patients, ce qui permet de limiter le recours à l’animal de laboratoire.

Réduction

Le nombre d'animaux par groupe et le nombre de groupes sont définis sur des bases scientifiques (bibliographie et données historiques) et/ou avec l’apport des biostatistiques afin d'avoir un effectif minimum mais statistiquement exploitable pour pouvoir interpréter les différents effets. De plus, lorsque les objectifs d’étude le permettent et en accord avec le vétérinaire, certains animaux peuvent être réutilisés, ce qui participe à diminuer le nombre total d’animaux utilisés. Ce projet permet indirectement de réduire le nombre d’animaux utilisés dans d’autres projets de Sécurité Préclinique grâce l’utilisation de ces biomarqueurs.

Raffinement

Ce projet fait l’objet d’une démarche qualité rigoureuse avec la réalisation des études par du personnel formé et compétent, le respect des impératifs éthiques tels que les modalités d’administration et de prélèvements réalisés sous anesthésie-analgésie pour les plus invasifs, l’hébergement et l’enrichissement du milieu spécifique pour chaque espèce étudiée. La contrainte des prélèvements / administrations sous contention est minimisée par la mise en place d’habituations et la distribution de récompenses alimentaires (renforcement positif). L’état clinique des animaux est surveillé au moins quotidiennement, des pesées ou autres mesures (températures, examens sanguins, etc.) sont réalisées régulièrement afin d’anticiper au maximum l’apparition de toute douleur et d’appliquer des mesures spécifiques (changement de dose, arrêt anticipé de l’étude, mise en place de soins de support/analgésie) mis en place par le responsable d’étude en concertation avec le vétérinaire.

Choix des espèces

Le choix de l’espèce pour les études précliniques de toxicologie générale est défini par les lignes directrices internationales (ex ICH, OCDE) définissant qu’elles doivent être conduites à la fois chez le rongeur (rats, souris) et chez le non-rongeur (mini-porcs, chiens ou primates non humains). C’est sur ces mêmes espèces que seront réalisées les études d’évaluation ou de validation de biomarqueurs de toxicité afin de pouvoir mettre en évidence un lien entre la toxicité observée et la variation du ou des biomarqueurs. Les animaux utilisés sont des animaux sevrés, juvéniles ou adultes pour évaluer de manière satisfaisante le profil des biomarqueurs.

110 miniporcs vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent la pose d'un cathéter et d'une sonde, une chirurgie digestive de une à quatre heures et des prélèvements sanguins répétés, pour comparer des techniques de chirurgie de l'obésité et leurs effets sur le glucose. Le porteur décrit une douleur post-opératoire, une perte de poids, une mobilité réduite et des stéréotypies pendant les trois à quatre semaines du protocole. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ne peut remplacer l'étude de ces interactions entre organes et que les biopsies terminales ne sont pas compatibles avec la survie des animaux.

Objectifs

Les objectifs de ce projet sont donc : - L’amélioration des connaissances sur le fonctionnement de l’intestin et sur son implication dans la survenue du diabète de type 2 - L’évaluation d’un nouvel outil permettant de quantifier l’absorption du glucose par l’intestin en vue de l’utiliser ultérieurement dans des études cliniques chez des patients présentant un diabète de type 2 - La meilleure compréhension des effets de la chirurgie de l’obésité - Le développement de nouvelles techniques de chirurgie de l’obésité et la compréhension de leurs effets sur le métabolisme

Bénéfices attendus

A court et moyen termes, ce projet donnera lieu à plusieurs publications scientifiques ainsi que des communications orales lors de congrès nationaux et internationaux. A long terme, la validation du D-xylose comme marqueur de l’absorption intestinale du glucose permettra de pouvoir évaluer cette variable in vivo chez l’homme, et quantifier de manière fiable l’absorption intestinale, afin de pouvoir personnaliser la prise en charge chirurgicale en réduisant les effets indésirables. L’étude des mécanismes d’action sur l’homéostasie glucidique des nouvelles techniques de chirurgie bariatrique en cours de diffusion permettra une meilleure compréhension de celles-ci, ce qui permettrait une meilleure adéquation du type de procédure selon les patients, en vue d’une amélioration de l’efficacité et la diminution des effets indésirables post opératoires.

Procédures

- Pose de catheter central sous anesthésie générale, sur tous les animaux, 1 fois, 30 min. - Pose de sonde nasogastrique sous anesthésie générale, sur tous les animaux, de 2 fois à 6 fois, 30min. - Prélèvements sanguins via le cathether central, animaux vigiles, sur tous les animaux, de 2 fois à 6 fois par animal, les prelèvements auront lieu à T-120, T0, T15, T30, T60, T90, T120, T180, T240, T300, T360 minutes ou à T-10, T0, T15, T30, T60, T90, T120 et T180 (minutes), le volume total par prélèvement n’excèdera pas 160ml par animal. -Réalisation d’un repas test standardisé par voie orale (par la sonde nasogastrique) ou jéjunale, animaux vigiles, 2 à 6 fois, 10min. -Chirurgie digestive, sous anesthésie générale, sur tous les animaux (1 par animal), de 1h à 4h. -Pose de sonde urinaire, sous anesthésie générale, sur 6 animaux, 30 min. -Réalisation d’un transit oesogastroduodénale par la sonde nasogastrique, sur 20 animaux (partie 2), 2 fois, 1heure. -Sacrifice et biopsies chirurgicales, sous anesthésie générale, tous les animaux, 1 fois, 2heures.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables post opératoires attendus sont les suivants : douleur, perte de poids, diminution de l’appétit, mobilité réduite, confusion, stéréotypies. Ces effets pourront survenir pendant toute la durée du protocole (3-4 semaines) mais sont particulièrement attendus en période post opératoire.

Devenir

Aucun animal n'est gardé en vie à l'issue de chaque procédure. En effet, la réalisation de biopsies terminales en fin de procédure, en particulier intestinales, n'est pas compatible avec la survie de l'animale.

Remplacement

Nous ne pouvons pas « Remplacer » l’utilisation d’animaux car nous étudions des mécanismes physiologiques. En effet, nous étudions les interactions entre les différents organes à un niveau de biologie intégrative et nous étudions des nouvelles techniques chirurgicales ce qui rend impossible l’utilisation de modèles in vitro. En revanche, les données recueillies sur miniporcs serviront à l’élaboration de modèles computationnels visant à modéliser le contrôle glycémique post prandial chez des patients après chirurgie bariatrique. Ainsi même si nous ne pouvons nous passer du modèle animal actuellement, nous espérons pouvoir à terme nous en affranchir grâce à l’utilisation de ce nouveau modèle computationel.

Réduction

Nous utiliserons un minimum d’animaux pour notre étude qui correspond à une étude préclinique en vue d’une étude clinique future. Il est à ce jour impossible de calculer le nombre nécessaire d’individu dans chaque groupe car nous ne pouvons pas encore quantifier l’effet attendu de chaque technique en cours d’évaluation sur le phénotype. Cependant, par rapport aux études antérieurement réalisées sur le miniporc dans notre laboratoire, un nombre minimal standardisé de miniporc nécessaire par groupe a été établi. Les estimations déclarées ici sont maximales et nous pourrons réduire le nombre d’animaux en cours de protocole si l’effet attendu a pu être constaté.

Raffinement

Les procédures de raffinement suivantes seront appliquées : -Condition standard d'hébergement conformément à la réglementation : hébergement individuel, 12 heures d'éclairage par jour, enrichissement du milieu : jouets. -Prélèvements et expérimentations menés dans des pièces réservées à cet effet et différentes des locaux d’hébergement. -Administration d’anesthésiques et d’analgésiques adaptés : Fentanyl 1.3mg/kg par voie transdermique au niveau du cou (efficacité analgésique 7 jours), buprénorphine 0.5ml/10kg toutes les 8 heures en intra-musculaire, anti-inflammatoire non stéroidien (méloxicam) 1ml/10kg en intra-musculaire. -Soins apportés au besoin après avis vétérinaire (infection cathéters, ...). -Les animaux présentant au moins un point limite sont retirés de l’étude et mis à mort (prostration, immobilité, appétence, perte de poids) si nécessaire. -Une période de 10 jours d’adaptation sera appliquée à chaque animal entrant.

Choix des espèces

Des études précédentes menées au laboratoire ont permis de valider des techniques de chirurgie bariatrique sur modèle de Miniporc. Ce modèle nous a déjà permis de comprendre les effets métaboliques du gastric-bypass. Dans le but de comparer les résultats de ce projet avec ceux des études antérieures, il est important de conserver ce même modèle qui a déjà prouvé sa validité. Par ailleurs, le porc présente des similarités métaboliques et morphologiques avec l'Homme permettant de transposer les mêmes techniques chirugicales ainsi que les mêmes évaluations métaboliques que chez les patients. Enfin, par rapport au porc charcutier adulte, le mini-porc est une souche dont la taille et le poids adulte permettent une stabulation moins compliquée que des porcs classiques (300kg à l’age adulte), plus lourds chez lesquels il aurait fallu utiliser des individus juvéniles au métabolisme différent de l’individu adulte. Animaux jeunes adultes (1 an environ)

Les cathéters testés sont des prototypes destinés à des partenaires industriels, qui doivent obtenir une certification réglementaire avant leur mise sur le marché. 125 jeunes cochons et 125 brebis adultes, soit 250 animaux non-humains, vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue. Sous anesthésie générale, chacun passe deux à quatre heures d'IRM ou de scanner, puis une opération de quatre à six heures où le cathéter crée entre cinq et vingt lésions dans le cœur, avec des risques de paralysie du nerf phrénique, de fibrillation ventriculaire et de saignement. Une partie est soumise à nouveau, un à trois mois plus tard, à quatre à six heures d'imagerie et de cartographie, et certains peuvent porter une maladie cardiaque provoquée auparavant, sans que le résumé dise comment. Le porteur écrit que ces dispositifs ont "un marché mondial en pleine croissance".

Objectifs

Le projet a pour objectif d’évaluer l’efficacité et la sécurité de prototype de cathéters de diagnostic ou de traitement par ablation pour les troubles du rythme cardiaque. Pour cela l’évaluation préclinique est obligatoire, via l’utilisation de modèles animaux, sains ou malades, en conditions proches de la clinique, avant leur utilisation chez l’homme. Les cathéters sont des dispositifs médicaux manœuvrables à l’intérieur des gros vaisseaux et du cœur et permettent aux cardiologues soit de diagnostiquer une maladie cardiaque soit de la traiter. Les cathéters d’ablation sont des dispositifs médicaux utilisés pour le traitement de maladies cardiaques. Ils permettent grâce à une électrode positionnée à leur extrémité, de causer une cautérisation ou une lésion contrôlée dans le cœur. Cette lésion interrompt les circuits favorisants l’activation désynchronisée du muscle cardiaque. Les cathéters de diagnostic eux, utilisent plusieurs électrodes positionnées en différentes configurations géométriques pour capturer les signaux du cœur et aider à trouver les sources anormales d’activation cardiaque. Le projet permettra de valider les paramètres suivants de prototypes de cathéter avant de pouvoir être utilisés chez le patient : les aspects ergonomiques (robustesse et préservation de l’intégrité mécanique, manœuvrabilité d’un cathéter, capacité à atteindre les cibles cardiaques), l’efficacité (capacité à cibler les points de contrôle lors du diagnostic, capacité à induire des lésions durables sur toute l’épaisseur du myocarde) et enfin la sécurité (risques de créer des caillots de sang pouvant être responsables d’AVC, risque d'endommager les organes adjacents…). Lors de procédure médicale réalisée chez le patient (identique à celle réalisée dans le projet), les patients sont conscients (sédation légère), avec une gestion de la douleur par voie médicamenteuse ajustée par pallier en fonction de la réponse du patient au traitement. Les tests réalisés chez les modèles animaux se déroulent en anesthésie générale. L’objectif de ce projet est de travailler sur des prototypes des cathéters qui devraient permettre une manœuvrabilité optimale, montrer une absence ou minimisation des risques collatéraux pendant la procédure, et provoquer des lésions du tissu cardiaque ayants des effets durables sur les propriétés électriques du cœur traité, afin de pouvoir les proposer à terme dans la prise en charge de maladies cardiaques.

Bénéfices attendus

Les tests des cathéters sur les animaux pour les thérapies du trouble du rythme cardiaque sont fondamentaux pour confirmer que les prototypes atteignent les niveaux de sécurité, d'efficacité et d'ergonomie attendus. L’évolution permanente des dispositifs médicaux dans la prise en charge des patients met en évidence l’intérêt des cathéters pour le diagnostic et le traitement par ablation thermique et non-thermique de certaines maladies cardiaques, ces dispositifs ont donc un marché mondial en pleine croissance. Les tests précis et éthiques ouvriront aux partenaires industriels et aux collaborateurs la possibilité de passer à la phase suivante d'investigation chez les patients, ce qui leur permettra d'obtenir la certification réglementaire pour mettre leurs dispositifs sur le marché.

Procédures

Toutes les procédures et les étapes décrites dans ce projet se déroulent sous anesthésie générale. Nous allons utiliser des cochons jeunes ou des brebis adultes, selon la disponibilité et la nécessite d’effectuer un protocole chronique ou aigü. Nous prévoyons d’utiliser maximum 250 animaux en 5 ans. Les animaux pourront être sains ou être des modèles de maladies cardiaques précédemment créés. Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : examens d’imagerie non-invasifs par IRM et/ou scanner CT (durée 2-4 heures), une opération (identique à celle réalisée chez le patient) pour le test des cathéters sous imagerie par rayons X (durée 4-6 heures). En fonction dudispositif médical à tester, certains animaux pourront avoir une phase de récupération et de répétition, d’un à trois mois après l’ablation, de l’imagerie et cartographie diagnostique afin d’évaluer les résultats chroniques de l’intervention réalisée (durée 4-6 heures)

Impact sur les animaux

Les niveaux de stress et les effets cardiaques dus aux thérapies de diagnostic et d'ablation sont identiques à ceux que connaissent les patients en milieu clinique. Les effets secondaires peuvent être une paralysie temporaire du nerf phrénique ou du diaphragme, un déclenchement de tachycardies ventriculaire débordantes en fibrillations ou un saignement aux sites d’introduction des cathéters.

Devenir

A la fin du projet les animaux seront euthanasiés afin de réaliser des analyses ex-vivo, les organes pourront également être proposés à d'autres équipes de recherche.

Remplacement

A ce jour, pour les objectifs envisagés dans ce projet, nous n’avons pas à disposition d’autres options pour le test de cathéter d’ablation et diagnostic que d’utiliser des modèles animaux. Nous pouvons obtenir des modèles cellulaires en laboratoire pour des analyses préliminaires, mais ces modèles qui se basent sur les cellules cardiaques n'offrent que des résultats extrêmement simplifiés par rapport au cœur entier. Les modèles tissulaires ex vivo ne peuvent pas nous permettre d’observer les effets du remodelage à long terme qui certifie la validation des cathéters pour leur utilisation en clinique.

Réduction

Notre stratégie pour réduire le nombre d’animaux utilisés repose sur la maximisation du nombre de sites que nous pouvons traiter par ablation. Dans l’objectif de réduire au maximum le nombre d’animaux, nous prévoyons d’effectuer certaines évaluations en parallèle (ex : évaluer un cathéter diagnostic et un cathéter d’ablation), si leur coévaluation n’affecte pas les résultats attendus. Si un cathéter montre des limitations importantes en termes de sécurité et/ ou de fiabilité, l’évaluation sera arrêtée ou suspendue en l’attente d’une amélioration du dispositif par le constructeur. De même, si l’évaluation statistique atteint une puissance suffisante, aucun autre animal ne sera inclus dans l'évaluation du cathéter d'intérêt. Chez un jeune porc ou un jeune mouton, nous pouvons effectuer entre 5 et 20 lésions en considérant à la fois les ventricules et les oreillettes. Cela nous donne suffisamment de répliques techniques pour rendre les résultats plus robustes et réduire l’erreur apportée par la variabilité biologique et anatomique individuelle. Cette confiance nous permet d’utiliser la quantité minimale de 5 animaux par conditions afin d’avoir une puissance statistique acceptable. En outre, dans le cas où le paramétrage des thérapies doit être testé en amont du test sur le tissu cardiaque, nous pouvons tester différentes conditions sur les muscles de la cuisse.

Raffinement

Pendant la procédure, les animaux sont maintenus sous anesthésie générale avec une surveillance constantes de leurs paramétres vitaux (fréquence cardiaque, pression sanguine, tempérautre...). Ceux-ci nous permettent d’apporter la nécessaire hydratation ou de fournir des antiarythmiques en cas de risque de fibrillation ventriculaire. Un défibrillateur est toujours disponible en salle d’opération pour éviter la mort précoce de l’animal durant les tests. Pendant l’hébergement, l’animal est placé dans des locaux adaptés, avec les méthodes de raffinement appropriées pour son espèce (groupe social, enrichissement adapté). Les animaux sont suivis quotidiennement par le personnel formé, qui peut intervenir rapidement auprès du vétérinaire et du responsable de projet pour adapter les soins analgésiques si nécessaire. Si une étape du protocole chronique affecte l’état de santé au point d’atteindre l’un des points limites sans qu’aucune action ne puisse permettre un retour à l’état basal alors le protocole sera interrompu et l’animal mis à mort selon les modalités éthiques.

Choix des espèces

Parmi les modèles animaux ayant des caractéristiques anatomiques et fonctionnelles proche de l’homme (mouton, cochon, chèvre, chien), le cochon et le mouton ont été retenus car ces modèles sont bien décrits et caractérisés et constituent une référence dans la communauté scientifique. De plus le personnel impliqué dans ce projet possède une expertise établie de la gestion de ces modèles animaux. Stades de développement des animaux inclus : - Porc : jeune de 50-70kg environ (environ de 4-5 mois) - Ovins : adultes à partir de 12 mois Au stade défini, et pour les deux espèces, la taille et les caractéristiques du cœur des animaux sont proches de celle de l’homme ce qui permet une évaluation fiable des dispositifs médicaux.

8 cochons miniatures vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, puis gardés vivants pour être réutilisés dans un autre projet. Chaque animal subit une chirurgie abdominale de trois heures pour la pose de cathéters, puis trois séances de prélèvements sanguins de sept heures après ingestion d'une farine d'insectes, pour mesurer la vitesse de digestion d'un ingrédient protéique destiné à l'alimentation humaine. Le porteur indique que la chirurgie peut provoquer des douleurs abdominales dans les jours suivants, et fixe un point limite de mise à mort en cas de perte de poids supérieure à 20 %. Il affirme que la biodisponibilité des nutriments "ne peut pas" être reproduite in vitro et présente le miniporc comme un modèle proche de l'appareil digestif humain.

Objectifs

Cette étude entre dans le cadre de la caractérisation de la qualité nutritionnelle d’un nouvel ingrédient protéique obtenu à partir d’insectes comestibles. Ce nouvel ingrédient est destiné à la consommation humaine. Au-delà de la composition en acides aminés indispensables et de la digestibilité dans l’intestin grêle, la qualité nutritionnelle d’une protéine dépend de la vitesse à laquelle elle est digérée, paramètre qui va influencer l’efficacité d’utilisation métabolique des acides aminés qui la compose. Ce projet a pour objectif d’évaluer la vitesse de digestion des protéines du nouvel ingrédient à base d’insecte en suivant l’évolution de la concentration en acides aminés dans le sang, suite à un repas test contenant cet ingrédient protéique, chez le miniporc.

Bénéfices attendus

Cette étude permettra de cibler un ensemble de produits alimentaires dans lesquels, la farine pourra être introduite et ceci pour répondre à des besoins spécifiques. Elle va également nous permettre de préconiser la temporalité de la consommation de ce produit. En effet, l’ingrédient à tester ne répondra pas de la même manière, selon certaines conditions physiologiques et selon la cinétique d’absorption. Les résultats de cette étude permettront d’envisager les prochaines investigations pour compléter la caractérisation de l’ingrédient. Eventuellement, imaginer une étude sur modèle in vivo dans l’objectif d’étudier ses effets à plus long terme sur une situation physiologique ou physiopathologique précise. La notion de qualité protéique est aujourd’hui très recherchée par le particulier et notamment chez le sportif. Aussi on accorde également de l’importance à la qualité des protéines dans d’autres conditions, comme le vieillissement, la dénutrition, en post chirurgies lourdes. Cette première étude d’analyse de la qualité des protéines permettra de préciser les futures investigations concernant cet ingrédient.

Procédures

Chaque animal subira une seule demi-journée (3h) d’intervention chirurgicale (1h de préparation pré-opératoire, et 2 h entre l’incision cutanée et le réveil de l’animal). Une période de récupération de 15 jours est laissée pour chaque animal, entre la chirurgie et la première journée de prélèvements. Chaque animal participera au final à 3 cinétiques post-prandiales d’une durée de 7h suivie d’une période de récupération de 7 jours entre chaque cinétique. Lors d’une journée de prélèvement, les animaux recevront le matin comme seul aliment une des modalités à tester (TM, TMB ou WB). Des prélèvements de sang seront réalisés simultanément dans les 2 cathéters avant et après le repas selon la cinétique suivante : -0,5h, 0, 0,25h, 0, 5h, 1h, 1h30, 2h, 3h, 5h et 7h, soit au total 10 prélèvements sanguins en simultanés sur chaque vaisseau pour chaque animal. Pour chacune des journées de prélèvements, 2.7 ml de sang seront prélevés sur chaque cathéter selon la cinétique suivante : -0,5h, 0, 0,25h, 0, 5h, 1h, 1h30, 2h, 3h, 5h et 7h après le repas. Ce qui représente un volume total de 54 ml par cinétique (2.7 mL x 2 cathéters x 10 temps), ce qui est acceptable pour des animaux de plus de 35 kg.

Impact sur les animaux

Des douleurs abdominales peuvent être ressenties par l’animal suite à l’intervention chirurgicale. Elles peuvent se manifester dans les premiers jours suivant l’opération, mais après cette période de récupération, elles restent mineures.

Devenir

Tout les animaux seront gardés en vie dans l'objectif d'être réutilisés pour un autre projet de recherche faisant l'objet d'une autre demande d'autorisation de projet.

Remplacement

La biodisponibilité des nutriments fait intervenir de nombreux processus biologiques coordonnés et régulés, qui à ce jour ne peuvent pas être reproduits in vitro. Le porc présente un certain nombre de similitudes anatomiques et physiologiques avec l'homme. C’est la raison pour laquelle il est fréquemment utilisé comme modèle pour les études de nutrition. Le mini-porc permet de travailler sur des adultes (à stabilité pondérale) d'une taille compatible avec l'expérimentation animale. Il présente de plus l'avantage d'avoir un système digestif très proche de celui de l'Homme et d'accepter de manger tous types d'aliments.

Réduction

L'effectif prévu dans le schéma expérimental (6 animaux inclus dans le schéma expérimental) est réduit à son minimum en tenant compte de la variabilité du principal paramètre mesuré (apparition des acides aminés dans le sang), estimée à partir de nos précédentes études sur la biodisponibilité des nutriments réalisées avec un design expérimental similaire. Cette variabilité est liée non seulement de la variabilité interindividuelle des animaux, mais aussi à la qualité des prélèvements effectuées et à la précision des données obtenues par l’analyse biochimique. Ces aspects sont parfaitement maitrisés par les expérimentateurs du projet qui ont une longue expérience dans le domaine. Le fait d’utiliser un schéma expérimental en carré latin permet de diminuer significativement le nombre d’animaux utilisés (chaque animal étant son propre témoin). Après analyse de la fonction de répartition de la loi de Chi2, un nombre minimal de 6 animaux par conditions expérimentales est nécessaire pour obtenir une différence significative à 5% entre les lots sur le critère principal (biodisponibilité du fructose). 2 mini-porcs supplémentaires sont également prévus pour faire face aux aléas (mauvaise récupération chirurgicale des mini-porcs, perte précoce de perméabilité des cathéters, ...). L’approche développée sera peu invasive, et peu traumatisante pour l’animal. La douleur imposée aux animaux pendant l’expérimentation est liée à l’acte chirurgical. Les animaux recevront pendant 6 jours un traitement analgésique et spamolytique, mais après cette période de récupération, elles restent mineures. Pendant la période de récupération, les animaux sont surveillés régulièrement (visite toutes les 2 h pendant la journée). L'évaluation de la gêne et de la douleur est faite par observation du comportement des animaux : reprise de l'alimentation, du transit intestinal, posture, vocalises, réactivité et la température corporelle.

Raffinement

Les douleurs potentielles que pourraient ressentir les animaux pendant l’expérimentation sont liées à l’acte chirurgical. Celui-ci est réalisé sous anesthésie gazeuse, avec l’injection d’un dérivé morphinique avant l’incision cutanée, toutes les précautions sont ainsi prises pour éviter la douleur pendant le temps opératoire. Celle-ci peut se manifester dans les premiers jours suivant l’opération. Afin de la prévenir et de la limiter au maximum, les animaux reçoivent un traitement antalgique systématique à base d’AINS. Pendant toute la durée de l’expérimentation, les animaux sont surveillés régulièrement (visite toutes les 2 h pendant la journée). L'évaluation de la gêne et de la douleur est faite par observation du comportement des animaux : reprise de l'alimentation, du transit intestinal, posture, vocalises, réactivité et la température corporelle. Les critères d’arrêt concernent essentiellement la période de récupération post-opératoire. Si l’alimentation et le transit digestif ne sont pas normalisés au bout de 10 jours, malgré les soins apportés pour soulager la douleur et stimuler la motricité intestinale et/ou si une perte de poids supérieure à 20% du poids avant l’apparition des premiers signes cliniques d’altération de l’état physiologique est observée, nous discuterons avec le personnel de l’animalerie, afin de décider si l’animal sera soigné ou euthanasié. Pendant toute la durée de la période d'expérimentation, les animaux seront hébergés dans des cages au sol de taille réglementaire avec des copeaux de bois comme litière leur permettant de réaliser une activité de fouissage, et avec des parois latérales en plexiglass pour que les animaux puissent se voir et interagir entre eux. Leur environnement est enrichi à l’aide d’une chaîne en métal fixée sur les parois et de ballons. La pièce est à température régulée. Les animaux ont libre accès à l'eau.

Choix des espèces

Le porc présente un certain nombre de similitudes anatomiques et physiologiques avec l'homme. C’est la raison pour laquelle il est fréquemment utilisé comme modèle pour les études de nutrition. Le mini-porc permet de travailler sur des adultes (à stabilité pondérale) d'une taille compatible avec l'expérimentation animale. Il présente de plus l'avantage d'avoir un système digestif très proche de celui de l'Homme et d'accepter de manger tous types d'aliments. Ces animaux sont utilisés dans la très grande majorité des études réalisées auparavant dans notre équipe de recherche, ce qui facilite la comparaison des données issues des diverses expérimentations réalisées. La procédure expérimentale est réalisée sur des animaux en fin de croissance (âge>10 mois), afin de bénéficier d'une stabilité pondérale pendant la totalité de la période d'intervention.