Mammifères "de rente"

30 cochons vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils sont infectés par un virus de la grippe porcine par voie trachéale puis, pour certains, par un second virus respiratoire par voie nasale, ce qui provoque fièvre, baisse d'appétit et troubles respiratoires, avant leur mise à mort pour prélever les poumons. L'étude porte sur l'effet de la grippe sur les cellules immunitaires pulmonaires, avec une visée d'élevage et un rapprochement annoncé avec la grippe humaine. Le porteur reconnaît l'existence de modèles in vitro mais les juge trop éloignés de "l'environnement pulmonaire complet".

Objectifs

En élevage porcin, les problèmes respiratoires sont responsables de pertes économiques importantes. Ces troubles sont fréquemment dus à une association d’agents pathogènes et sont alors rassemblés sous le nom de « Complexe Respiratoire Porcin ». Parmi les virus importants impliqués dans le complexe respiratoire porcin figurent les virus de la grippe porcine (swIAV) et celui du syndrome dysgénésique et respiratoire porcin (PRRSV) qui se retrouvent fréquemment associés en élevage. Pour comprendre les interactions entre ces deux virus, des expériences de co-infections ont été réalisées chez le porc. Ces études ont consisté soit à inoculer les porcs avec les deux virus en même temps ou bien à les inoculer de façon décalée en inoculant d’abord le virus PRRSV puis le virus swIAV quelques jours plus tard. Par ailleurs, la plupart des données récoltées concernent principalement les symptomes, les lésions ou bien la multiplication des virus, mais les réponses immunitaires ont été peu étudiées au niveau des poumons. Notamment, très peu de données sont disponibles sur les macrophages pulmonaires (grosses cellules immunitaires présentes dans le poumon et capables d’ingérer des particules) après infection grippale (swIAV) et/ou infection PRRSV alors que ces cellules font partie de la première ligne de défense contre les agents pathogènes et qu’elles sont la cible principale du PRRSV. Or, des études réalisées chez la souris et le singe ont montré que l’infection par le virus de la grippe pouvait diminuer le nombre de macrophages et influencer leur développement, ce qui pourrait largement influencer le devenir d’une infection ultérieure par un autre virus respiratoire. Dans ce contexte, cette étude a pour objectifs d’évaluer l’impact d’une infection grippale sur la population des macrophages pulmonaires, ainsi que sur les réponses précoces des porcs à une infection secondaire par un virus ayant pour cible ces cellules pulmonaires, à savoir le virus du PRRSV.

Bénéfices attendus

Les résultats de cette étude aideront à approfondir les connaissances sur l’immunité pulmonaire chez le porc, plus précisément sur l’impact de l’infection grippale sur les macrophages pulmonaires et sur leur rôle lors d’infections swIAV et PRRSV successives. A terme, ces résultats pourraient permettre d’imaginer de nouvelles stratégies préventives ou curatives des infections virales respiratoires chez le porc ciblant les macrophages. Par ailleurs, compte tenu des similitudes entre les infections grippales chez le porc et chez l’homme, les données récoltées au cours de ce projet pourraient également contribuer à une meilleure compréhension du rôle des macrophages au cours de l’infection grippale chez l’homme.

Procédures

Selon les groupes, les animaux recevront : - du virus grippal swIAV à J0 par voie trachéale puis du PRRSV à J7 par voie nasale (2 groupes de 5 porcs); - du swIAV uniquement à J0 par voie trachéale (1 groupe de 5 porcs); - du milieu de culture à J1 par voie trachéale puis du PRRSV à J8 par voie nasale (2 groupes de 5 porcs); - uniquement du milieu de culture à J1 par voie trachéale (1 groupe de 5 porcs) L’inoculation intra-trachéale prend environ 2 minutes alors que l’inoculation intranasale prend environ 30 secondes. Selon les lots, les porcs seront soumis à : 1/ des écouvillonnages nasaux sur animal vigile : 2 à 5 prélèvements selon les groupes Les écouvillonnages nasaux prennent environ 15 secondes par animal 2/ des prises de sang sur animal vigile : 2 à 5 prélèvements selon les groupes Les prises de sang prennent environ 15 secondes par animal

Impact sur les animaux

Suite à l’inoculation d’un virus grippal par voie trachéale, un épisode de fièvre est attendu, ne persistant guère plus de 4 jours, ainsi qu’une baisse d’appétit pendant les 3 à 4 jours suivant l’infection et des troubles respiratoires (respiration difficile, toux et éternuements) pendant la semaine suivant l’infection. En ce qui concerne l’inoculation par le PRRSV par voie nasale, les signes cliniques attendus se résument à un court épisode de fièvre modérée accompagné d’une légère baisse d’appétit. Chez les animaux co-infectés swIAV/PRRSV, on pourrait éventuellement observer une manifestation clinique légèrement supérieure à celle observée chez les animaux infectés par un seul virus.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure pour pouvoir récolter les poumons à partir desquels seront collectés les macrophages.

Remplacement

Il existe des modèles d’infection in vitro pour les virus swIAV et PRRSV. Ces modèles reposent le plus souvent sur l’infection d’un seul type cellulaire, notamment l’infection de cellules épithéliales pour le swIAV et l’infection de macrophages pour le PRRSV. Nous avons mis au point un modèle de co-culture cellulaire (cellules épithéliales + macrophages) dans lequel nous évaluons l’effet des infections simultanées ou successives par un swIAV et le PRRSV. Si ces modèles de co-culture cherchent à représenter ce qui peut se produire au niveau de l’arbre respiratoire, ils sont malheureusement encore loin de pouvoir reconstituer la grande complexité de l’environnement pulmonaire complet (manque de nombreux types cellulaires, absence de flore bactérienne, …), d’où l’intérêt d’avoir recours à une étude in vivo.

Réduction

Pour répondre aux objectifs de l’étude, il est nécessaire d’avoir 6 lots d’animaux à comparer : 2 lots inoculés au swIAV puis inoculés au PRRSV 7 jours plus tard (dont 1 mis à mort à 3 j et l’autre à 7 j post-infection PRRSV) ; 1 lot inoculé au swIAV uniquement ; 2 lots inoculés au PRRSV uniquement (dont 1 mis à mort à 3 j et l’autre à 7 j post-infection PRRSV) ; et 1 lot inoculé par du milieu de culture (témoin). Le nombre d’animaux a été déterminé de façon à pouvoir comparer statistiquement les résultats.

Raffinement

Chaque lot sera logé dans une animalerie différente contenant 2 parcs hébergeant chacun 2 ou 3 porcs. Les animaux seront élevés en groupes stables au cours de toute la durée du projet. Ils seront alimentés à volonté et auront accès à discrétion à de l’eau. Le confort thermique des animaux sera assuré par des lampes chauffantes et des plaques de couchage dans les jours qui suivent le sevrage. Ils auront accès à des jouets. Après chaque prélèvement, une récompense type grenadine sera distribuée aux animaux. Une attention particulière sera apportée au suivi clinique de chaque animal au quotidien pendant toute la durée de la procédure expérimentale. En cas d'atteinte d'un des points limites définis préalablement, les animaux seront mis à mort afin qu'ils ne souffrent pas.

Choix des espèces

Le porc est l’espèce cible du virus influenza porcins et du PRRSV. Les animaux seront sevrés à 4 semaines d’âge et inoculés à 8 semaines et demie d’âge. Cet âge correspond à la fin de la période de post-sevrage, à un moment où le système immunitaire est considéré comme mature. Dans nos conditions expérimentales, nous savons que des animaux de cet âge développent des symptômes grippaux lorsqu’ils sont inoculés par voie trachéale avec un swIAV, c’est pourquoi nous prévoyons d’inoculer les animaux à cet âge, par cette même voie.

24 moutons et cochons vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, une partie réutilisée et six tués à l'issue. Ils subissent des prélèvements sanguins très fréquents, jusqu'à dix-neuf par jour, et la pose de cathéters veineux et de sondes urinaires, pour étudier le devenir de molécules pharmacologiques chez ces espèces. Le porteur indique que les moutons privés d'accès veineux sont réformés puis, selon leur état, euthanasiés pour des travaux pratiques d'autopsie ou réutilisés pour des exercices de contention, tandis que les cochons sont tués mais réutilisés autant que possible pour l'entraînement chirurgical. Il conclut que la complexité des organismes impose une étude in vivo.

Objectifs

Que ce soit pour le développement de nouvelles méthodes d’investigation clinique pour l’homme ou l’animal en médecine vétérinaire ou que ce soit pour l’évaluation de molécules pharmacologiques, il est nécessaire de procéder en deux phases : - le développement préclinique, - puis le développement clinique. Ici, nous nous intéressons uniquement à la phase préclinique. Le développement préclinique a, entre autres, pour objectif de définir l’activité pharmacologique, pharmacocinétique et toxicologique des molécules étudiées.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra à court terme de développer de nouvelles méthodes d’investigation cliniques utiles à la fois en médecine vétérinaire (notament sur les espèces de rentes qui sont souvent négligées) et en recherche préclinique. Ce projet permettra également d’identifier les effets pharmacologiques des molécules étudiées ou leur devenir chez le mouton ou le porc, ainsi que d’évaluer leur toxicité éventuelle. Ce projet devrait donc permettre à long terme d’améliorer les soins cliniques apportés aux animaux d’élevage et fournir des informations précliniques (grace aux données pharmacocinétiques ou pharmacodynamiques) qui peuvent être utilisées par la suite par l’ensemble de la communauté scientifique.

Procédures

Des prélèvements sanguins fréquents sont prévus. Notre protocole prévoit de réaliser au maximum 19 prélèvements de 3 ml par jour. Ceci représente 57 ml de sang prélevés par animal par jour ce qui correspond à moins de 2% du volume sanguin du mouton. Des prélèvements d'urine peuvent être nécessaires et se feront à l'aide d'une sonde urinaire préalablement mise en place. Les prélèvements sanguins ou urinaires ne durent pas plus de 30 secondes chacun y compris le temps de rinçage du cathéter pour les prélèvements sanguins.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables sont classés selon leur fréquence d’apparition. Les mesures correctives mises en place sont précisées. Catheter veineux : - Rare (moins de 10 cas/an dans notre structure): Risque de thrombose du catheter. En l'absence d'arguments bibliographiques, il n’est pas possible de proposer une recommandation concernant l’utilisation d’un verrou héparine, ou d’un verrou au sérum physiologique seul le rinçage régulier et biquotidien avec du serum physiologique hépariné semble efficace à titre préventif. Si cet événement survient, le cathéter est retiré. Soit un nouveau cathéter est mis en place sur un autre site sous anesthésie/tranquilisation, soit l’animal est exclu de l’étude. Dans tous les cas l’animal reste sous surveillance pendant plusieurs jours. - Assez Rare (Moins 1 cas/an dans notre structure): Inflammation locale ou infection. Afin d’éviter cela, toutes les précautions d’aseptie et d’antisepsie lors de manipulation du cathéter sont mises en place. Avant la manipulation du cathéter, un traitement hygiénique (gants et bouchon du catheter) par friction désinfectante à l'aide d'un gel ou d’une solution hydro-alcoolique est réalisé. Le site d’insertion du cathéter est examiné au moins une fois par jour à la recherche de signes locaux. La réfection du pansement est réalisée uniquement s’il est décollé ou souillé. Le cathéter est retiré en cas de complication locale ou de suspicion d’infection systémique. Effet sur l’animal : gène et douleur au niveau du site de l’affection et signes généraux possibles. Lors de la survenue de cette affection, l’animal est exclu de l’étude, traité et placé sous surveillance. - Très Rare : phlébite suite à la pose du cathéter veineux. Effet sur l’animal : gène et douleur au niveau du site de l’affection et signes généraux possibles. Dans ce cas l’animal est exclu de l’étude, traité et placé sous surveillance. Dans les cas les plus graves l’animal est euthanasié. Sonde urinaire : - Risque d’infection urinaire : La sonde est retirée, l’animal est traité et placé sous surveillance. - Risque d’arrachement de la sonde : rare. L’animal est traité et placé sous surveillance. Afin de limiter les risques d’arrachement les sondes urinaires sont suturées lors de la pose. Les moutons peuvent rester en groupe mais les porcs sont placés en cage individuelles tout en leur permettant de conserver des interractions sociales avec leurs congénères placés dans les cages adjacentes.

Devenir

Pour les moutons : Les animaux n’ayant plus d’accès vasculaires jugulaires ne peuvent être réutilisés et sont donc réformés. Parmi ces animaux réformés, certains (en accord avec le vétérinaire responsable) sont euthanasiés puis utilisés à des fins pédagogiques (TP d’autopsie). Les animaux n’ayant plus d’accès vasculaires jugulaires ne peuvent être réutilisés et sont donc réformés. Parmi ces animaux réformés, ceux présentant un bon état de santé peuvent être ré-utilisés à des fins pédagogiques (TP contention, TP tonte). Les animaux non réformés peuvent être ré-utilisés en expérimentation après une période de repos d’au moins trois semaines avec un suivi médical. L’avis d’un vétérnaire sera requis avant toute réutilisation. Pour les porcs : Les animaux sont tous mis à mort à la fin de l’expérimentation. Toutefois, nous ferons en sorte qu'un maximum d'animaux soient réutilisés, notamment à des fins pédagogique (TP autopsie, entrainement à des gestes chirurgicaux spécifiques, …).

Remplacement

La finalisation de méthodes d’investigation cliniques ou l’application de méthodes d’investigation clinique d’une espèce à une autre ne peuvent être réalisées par définition qu’in vivo. Les effets des molécules pharmacologiques étudiées peuvent être évaluées au préalable par l’obtention de données in vivo ou ex vivo. Cependant, du fait de la complexité des organismes, les effets multiples sur plusieurs organes ne peuvent être étudiés qu’in vivo. Les études in vivo permettent ainsi une analyse et une prédiction plus fiable de la pharmacocinétique animale et également humaine d'après des données d'études scientifiques. Néanmoins, avant nos études, les caractéristiques physico-chimiques des produits sont évaluées in vitro et une recherche bibliographique approfondie est menée.

Réduction

Nous utilisons le nombre le plus réduit possible d’animaux notamment en réalisant lorsque cela est possible des essais croisés avec des périodes de washout. Les études de pharmacocinétique sur animaux s’effectuent habituellement (selon la littérature) avec des groupes de 6 à 8 animaux par test. Une approche statistique permet de déterminer le nombre d'animaux minimum nécessaire pour l'étude.

Raffinement

Les animaux sont acclimatés et maintenus en groupe tant que c'est possible. Ils ne sont isolés que lorsqu'ils sont équipés de cathéters qu'un congénère pourrait détériorer. Auquel cas on maintient entre eux un contact visuel et olfactif et notre équipe continue à entretenir un contact social. Les catheters sont entretenus régulièrement pour éviter qu'ils ne se bouchent. Toutes les phases douloureuses sont anticipées par des traitements analgésiques. Au terme des protocoles, un examen clinique permet de déterminer si les animaux sont réutilisables pour un autre protocole. Nous veillons à limiter le nombre d'utilisations, pour éviter de trop solliciter les animaux qui sont soit placés, soit inclus dans un protocole qui termine par l'euthanasie. Par ailleurs, le plan de prélèvements sanguins est conçu de sorte à ne jamais prélever un volume de sang supérieur à 7,5% du volume circulant de l'animal. De même, les volumes administrés ne dépasseront pas les recommandations communément admises dans "A Good Practice Guide to the Administration of Substances and Removal of Blood, Including Routes and Volumes". Les points limites spécifiques sont repris dans une grille de scoring de la douleur. Cette grille est élaborée à partir de critères d'observation des animaux d'une part (porcs : posture, activité et interraction avec congénères / ovins: idem +rumination) et de critères de mesures objectives comme la prise de boisson, de nouriture, la température corporelle, la prise de poids, les paramètres physiologiques (fréquence respiratoire, fécès). Au niveau des sites d'implantation des cathéters les signes de chaleur ou de douleur et l'évaluation de son intensité est réalisée par du personnel formé. En cas de doute le vétérnaire est imédiatement informé et passe dans l'heure qui suit. En cas d'hyperthermie les animaux sont immédiatement traités par des anti-pyrétiques ou des anti-inflammatoires. Les points limites conduisant à l'éviction de l'animal sont : complications liées à la mises en place des cathéters et de la sonde urinaire comme de la fièvre ne retrocédant pas aux anti-pyrétiques dans les 48h (ou moins si très élevée ou si d'autres signes de douleur), abcès ne régressant pas suite au traitement, déshydratation, léthargie ou prostration persistante associée aux autres signes. Ces situations ne sont que très rarement rencontrées dans ce type d'étude.

Choix des espèces

Les études de pharmocinétique ou de pharmacodynamie réalisées in vivo et ex vivo permettent d’orienter les conclusions et de mieux cibler des molécules intéressantes en santé humaine et animale. Cependant, du fait de la complexité des organismes, l’obtention de résultats précis et fiables nécessite obligatoirement de mettre en place un modèle animal. Par ailleurs, le choix d’animaux de grande taille (tels que le porc et le mouton) permet d’évaluer les effets de molécules d’intérets dans ces espèces qui peuvent constituer les espèces cibles. Ce choix permet également de faciliter les corrélations entre l’animal et l’humain du fait d’un poids similaire (mouton de 60 kg avec un volume sanguin proche de celui de l’homme) ainsi que parfois d’une physiologie plus proche en particulier chez le porc. Par exemple pour l’étude de molécules ayant une distribution hépatique, il est important de vérifier la physiologie de la libération de la bile dans le modèle animal. Or, la composition de la bile chez le porc est très similaire à celle de l’Homme. De même, la physiologie rénale du porc ressemble fortement à celle de l’Homme.

4 vaches laitières vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, puis réintégrées à un troupeau laitier et susceptibles de repasser dans d'autres protocoles après deux mois. Pendant quatorze semaines, dont quatre périodes de dix-huit jours à l'attache, elles subissent une vingtaine de prélèvements de contenu digestif et des prises de sang par période, des collectes d'urine et de fèces, et le port de harnais que le porteur reconnaît susceptibles de provoquer des irritations. L'objectif est de comparer la valeur nutritionnelle de tourteaux extraits avec un composé bio-sourcé plutôt qu'à l'hexane, un solvant neurotoxique, et d'estimer le rôle du rumen dans l'absorption du phosphore. Le porteur affirme qu'une mesure de référence est une "nécessité" faute de données suffisantes pour des modèles mathématiques ou des tests in vitro.

Objectifs

Les tourteaux sont le résidu solide obtenu lors du traitement des graines oléagineuses en vue de l’extraction d’huile. Du fait de leur forte teneur en protéines, ils constituent une matière première clé pour équilibrer les rations des animaux d’élevage. Aujourd’hui, la majorité des tourteaux résultent d’une extraction des huiles à l’hexane qui est une substance neurotoxique, ainsi qu’un perturbateur endocrinien. Une alternative à l’hexane pourrait être un composé bio-sourcé, issus de coproduit alimentaire. Une question est de déterminer si la valeur nutritionnelle pour les vaches laitières des tourteaux issus de l’extraction par ce composé bio-sourcé reste suffisamment similaire aux tourteaux extraits à l’hexane pour permettre leur usage généralisé en élevage. Par ailleurs, un autre enjeu autour de l’usage des tourteaux est l’impact de l’usage du tourteau de soja dans les émissions de gaz à effet de serre, via notamment la déforestation que sa culture provoque. Le tourteau de colza produit plus localement semble une bonne alternative à la seule limite qu’il est plus riche en phosphore. Son usage dans des rations de vaches laitières entraine ainsi une excrétion accrue de phosphore, susceptible de provoquer des phénomènes d’eutrophisation. Une partie significative du phosphore contenu dans les tourteaux est sous forme de phytates, non absorbable au niveau intestinal. Chez les animaux monogastriques, l’addition de phytases dans les rations a permis de réduire significativement les apports de phosphore en permettant une meilleure absorption intestinale de ce dernier. Chez les ruminants, la flore microbienne ruminale produirait des phytases mais on ne sait pas si leur quantité est suffisante pour que le phosphore soit bien absorbé dans les rations à base de colza. Du fait du développement de l’usage du tourteau de colza, il est donc aujourd’hui nécessaire d’évaluer le rôle des phytases ruminales sur des rations à base de tourteau de colza afin de juger de la pertinence d’ajouter aux rations des ruminants des phytases de synthèse comme chez les monogastriques.

Bénéfices attendus

Si les résultats de ce projet sont concluants, c’est-à-dire si la valeur nutritionnelle des tourteaux résultant d’une extraction au composé bio-sourcé est comparable à celle des tourteaux extraits à l’hexane, l’adoption de ce nouveau procédé d’extraction permettra de réduire les risques de maladies professionnelles des ouvriers des usines d’extraction liés à la manipulation de l’hexane et à limiter la diffusion de résidus d’hexane dans les produits animaux destinés à la consommation humaine. Des tests urinaires réalisés en Europe ont montré que la moyenne de la population présente des teneurs urinaires en 2,5-haxanedione résultant du métabolisme de l’hexane supérieurs au niveau d’exposition jugé comme acceptable pour la santé. A contrario, l’EFSA (European Food Safety Authority) a tranché que le composé bio-sourcé testé dans ce projet ne présentait pas un risque de résidus problématiques dans les produits animaux. D’autre part, l’estimation du rôle du rumen dans le devenir des phytates sur des rations à base de tourteau de colza chez les vaches laitières permettra d’objectiver les bénéfices d’une supplémentation en phytases de synthèse. Ceci pourra constituer une piste pour ajuster au mieux les supplémentations en phosphore des vaches sur ce type de ration, afin de répondre à leur besoin physiologique tout en limitant les rejets de phosphore dans l’environnement et les risques d’eutrophisation.

Procédures

Cet essai concerne des animaux vigiles qui seront mobilisés durant 14 semaines (2 semaines de mesures de référence, puis 4 périodes de 3 semaines). Cette durée inclura 4 périodes de 18 jours pendant lesquelles les vaches seront à l'attache. Des prélèvements de contenus digestifs et de sang dans la veine caudale seront réalisés sur la dernière semaine de chaque période. Les prélèvements de contenu digestifs seront au nombre de 20 par vache et par période et chaque prélèvement durera moins de 5 minutes. Les prises de sang en veine caudale seront au nombre de 4 par vache et par période et chaque prélèvement durera moins de 2 minutes. Des collectes totales d’urine et de fèces seront aussi réalisées pendant 5 jours consécutifs par période, en continu. Des mesures de l’activité fermentaire du rumen seront aussi réalisées.

Impact sur les animaux

Pour ce projet les vaches devront être maintenues à l’attache pendant une période de deux semaines et quatre périodes de 18 jours. Pour limiter les effets d’une telle pratique sur les articulations, chacune de ces périodes sera espacée de trois jours pendant lesquels les vaches seront laissées en liberté dans la stabulation afin qu’elles puissent marcher librement. Pour limiter le stress lié à l’isolement social, les vaches attachées seront logées dans la même pièce et séparées par des pare-bottes, ce qui leur permettra de se sentir et de s’entendre. Pour limiter les stress sociaux liés aux séquences de 3 jours pendant lesquels les vaches seront en liberté ensembles, elles seront regroupées en liberté dans une case de la stabulation qui leur sera dédiée et isolée du reste du troupeau. Pour la collecte séparée de l’urine et des fèces, des harnais de collecte d’urine seront posés sur les vaches à la fin de chaque période expérimentale, soit pendant 5 jours à 4 reprises espacées de 16 jours. Ces derniers peuvent induire un risque d’irritations. Ces périodes avec harnais sont limitées en nombre et en durée au maximum pour limiter ce risque, et espacées pour permettre aux vaches d’avoir totalement cicatrisé entre les périodes le cas échéant. Par ailleurs, les dispositifs de prélèvement digestif entrainent peu de nuisances avérées chez les vaches équipées par rapport aux autres vaches. Ceci est garanti par un suivi journalier afin de vérifier que les dispositifs sont bien bouchés en dehors des périodes de prélèvements.

Devenir

A l’issue de la procédure les animaux seront réintégrés dans un troupeau de vaches laitières soumis à une conduite classique d’élevage laitier. Après un délai d’au moins 2 mois, certaines de ces vaches pourront réintégrer de nouveaux projets expérimentaux.

Remplacement

Une difficulté pour prédire la valeur nutritionnelle des rations chez les ruminants résulte du fait que les bactéries du rumen transforment largement les aliments, dont certains nutriments peuvent être dégradés par le métabolisme microbien et d’autres synthétisés de novo. Cependant, du fait du faible nombre de données engrangées actuellement, il est difficile d’estimer la proportion de phytates dégradés dans le rumen par des modèles mathématiques et/ou des tests in vitro. L’acquisition de mesure de référence est une nécessité. De même, très peu de données ont été produites à ce jour pour connaitre les dégradations et les synthèses des vitamines dans le rumen et d’acides aminés intestinaux. Cette expérimentation sera doublée de tests in vitro pour valider leur pertinence pour estimer la digestion des protéines.

Réduction

Le schéma expérimental utilisé dans ce projet (4X4) fait qu’on peut obtenir une puissance statistique satisfaisante avec un faible nombre d’animaux. Ce type de schéma est possible ici car les traitements qui sont à comparer n'ont pas d’effet induit sur la période suivante (pas d’effet rémanent). En effet, les rations alimentaires ne varieront que par le type de tourteau utilisé, et les teneurs des régimes en protéines restent dans une gamme de variation qui n'induit pas de régulation physiologique interne très marquée. De plus, une autre condition à ce type de schéma est une certaine stabilité du stade physiologique des vaches sur la durée de l’essai, ce qui est le cas ici avec des vaches suivies en milieu de lactation.

Raffinement

La conduite des animaux dans ce projet sera aussi respectueuse que possible du bien-être des animaux. Un suivi régulier du comportement et des paramètres indicateurs de la souffrance des animaux sera mis en place pour détecter le plus rapidement possible tout signe de perturbations et de traiter si besoin les animaux malades. Les pratiques dans ce projet les plus susceptibles d’entraîner un mal-être chez les animaux seront le fait de les maintenir attachés et la pose de harnais de collecte des urines. Pour limiter les risques de mal-être, voire de stress lié à l’attache, les vaches seront logées dans une même salle pour se sentir et s’entendre, et les périodes d’attaches seront ponctuées de périodes de remises en liberté. La durée des périodes à l’attache est limitée au maximum pour permettre aux animaux d’être complétement habitués au fait d’être attachés avant les mesures. Les périodes en liberté auront aussi pour objectif de permettre de limiter les risques articulaires et de mieux les détecter et les traiter le cas échéant. Pour limiter les risques d’irritation chronique de la peau pendant les collectes d’urine, ces dernières seront les plus courtes possibles si on intègre le fait que l’on a toujours une variabilité journalière du volume et de la composition de l’urine. Des crèmes cicatrisantes/apaisantes seront appliquées dès la fin des collectes, qui seront par ailleurs suffisamment espacées pour permettre des périodes de récupération importante entre les périodes de pause des harnais.

Choix des espèces

La problématique de l’étude est assez spécifique aux vaches laitières, puisqu'elle concerne des apports protéiques sous forme de tourteaux dans les rations hivernales. Les vaches seront de race Prim’Holstein. Il s’agit de la race de vache laitière la plus répandue dans le monde. Les résultats de ce projet ont vocation à être diffusés au niveau international. Les vaches seront en milieu de lactation qui est le stade physiologique le plus courant des vaches laitières en production en fermes.

48 cochons vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Pendant 56 jours ils reçoivent des additifs alimentaires à base de plantes, subissent des pesées et deux prélèvements sanguins à la jugulaire par immobilisation au lasso, avant d'être tués pour prélever leur contenu intestinal, leurs muscles et leur graisse. L'objet du projet est de valider des additifs commerciaux réduisant les émissions d'ammoniac de l'élevage porcin intensif, en vue de leur mise sur le marché. Le porteur affirme que l'inconfort se limite au stress de la contention et présente l'expérimentation in vivo comme la suite de tests in vitro déjà probants.

Objectifs

Le projet présenté ici a pour objectif d’évaluer une solution pour atténuer les émissions gazeuses, spécialement d’ammoniac, enregistrées en élevage intensif des porcs. Les émissions atmosphériques de composés polluants sont au centre des préoccupations environnementales et concernent notamment le secteur de l’agronomie avec l’élevage porcin qui constitue un gros émetteur de gaz. Les émissions proviennent des déjections des animaux qui dépendent de la composition des régimes alimentaires et des performances des animaux. Les aliments à teneur élevée en protéines non valorisée par les animaux conduit à une excrétion d’azote importante sous formes d’azote fécal et d’azote urinaire composé d’urée, pour éliminer l’ammoniaque issu du catabolisme des protéines, rapidement converti en azote ammoniacal. Cet azote ammoniacal conduit à des émissions d’ammoniac (NH3) et de protoxyde d’azote (N2O), en bâtiment, au stockage et à l’épandage. Les mesures de réduction des apports azotés et donc de l’excrétion d’azote pourraient être utilisées à la fois pour réduire les émissions de gaz à effets de serre (GES) mais aussi et en priorité pour réduire les émissions d’ammoniac, compte tenu de ses effets sur la santé humaine, la santé animale, l’acidification et l’eutrophisation. Depuis plusieurs années, des stratégies ont été développées pour réduire les émissions d’azote, dont l’ammoniac. Une des stratégies vise notamment à optimiser l’alimentation animale (volailles et porcins), avec l’ajustement des apports protéiques dans les rations. En effet, une alimentation à basse teneur en protéines permet de réduire les quantités de protéines ingérées par les porcs, et donc les excrétions azotées des animaux ainsi que les pertes gazeuses associées, sous forme d’ammoniac. Une autre stratégie consiste aussi ces derniers temps à utiliser des extraits de plantes (extrait du thé vert, d'olive, de réglisse) comme additifs naturelles pouvant être ajoutées à la ration alimentaire pour empêcher efficacement la libération d’ammoniac dans l’air à différents niveaux.

Bénéfices attendus

Les émissions d'ammoniac provenant des élevage d'animaux font fréquemment l'objet de plaintes pour odeurs et de préoccupation en raison de la possibilité de leurs effets négatifs sur la santé des humains et des animaux. Les animaux peuvent développer une variété de troubles lorsqu'elles sont exposées à des niveaux élevés d'ammoniac pendant des périodes prolongées. Il est donc très important de développer des stratégies efficaces pour réduire les émissions de NH3 provenant des lisiers. Les résultats de ce projet permettront donc de valider l’utilisation d’inhibiteur d’uréase comme stratégie de réduction des émissions gazeuses en élevage porcins et comprendre leur mode d’action, et d’identifier de nouvelles substances qui contribueront à la rétention de l’azote.

Procédures

Les animaux seront soumis à la procédure pour une durée de 56 jours. Les animaux seront soumis au cours de la procédure à deux prélèvements sanguins au niveau de la veine jugulaire. Les deux prélèvements sanguins seront réalisés avec une période de récupération de 4 semaines entre les deux. Pour chaque prise de sang le temps de prélèvement ne dépassera pas 1 minute.

Impact sur les animaux

Perte de poids, ralentissement de la croissance en cas de réduction de l'ingestion alimentaire (palatabilité), refus d'alimentation. Stress dû à la conduite des animaux en vue de leur pesée individuelle. Inconfort et stress dus à l’immobilisation des animaux à l'aide d'un lasso pour la prise de sang.

Devenir

Tous les animaux entrant dans la procédure expérimentale seront mis à mort à l'issu de la procédure afin de réaliser des prélèvements d'échantillons biologiques (contenus intestinal, muscle, mesure d'épaisseur de graisse)

Remplacement

Le projet envisagé fait suite aux tests in vitro réalisés au préalable afin d'évaluer l'efficacité des substances testées. Les résultats ayant montré des résultats probants, la finalité de la démarche consiste ensuite à démontrer l’effet bénéfique de l’ajout des substances d’origine végétale sur la réduction de l’émission gazeuse tout en maintenant l’efficacité de croissance des animaux.

Réduction

Sur la base des résultats rapportés dans la littérature, l'addition de substance d'origine végétale a des effets positifs sur différents paramètres liés à l'accrétion protéique, la rétention d'azote par l'animal, paramètres cibles de décision dans ce projet pour montrer les effets bénéfiques de la supplémentation des additifs testés. Une approche statistique a permis d'évaluer la taille de l'échantillon nécessaire afin de montrer un effet attendu de 5 % .L'analyse statistique a montré que 12 animaux par lot étaient necessaires pour montrer une difference significative.

Raffinement

Le stress dû à la conduite des animaux en vue de leur pesée individuelle est réduit en réalisant les opérations de conduite jusqu’à la balance en évitant de claquer les portes des cages métalliques, en déplaçant les porcs en groupe (cage par cage) dans le calme en prenant en compte le point de balance de l’animal qui avance si l’opérateur est placé en arrière du point de balance et qui recule si l’opérateur est placé en avant du point de balance. L’opérateur doit porter une tenue de couleur sombre, et stimuler les animaux par la voix et la main afin de guider leur déplacement. Des panneaux de conduites, des tapettes en plastiques sont autorisés pour la conduite des animaux. La mesure du gras dorsal est réalisée au moment de la pesée au niveau de la balance afin d'éviter une manipulation supplémentaire des animaux ou directemnt dans la cage pour éviter de manipuler l'animal. Lors des prises de sang, chaque animal est présenté à l'aide d'un lasso en acier souple en bon état, maintenu à la main et tiré vers l’avant afin que la tête soit alors présentée légèrement relevée pour des porcs de plus de 30 kg. L’inconfort et le stress dus à l’immobilisation des animaux sont réduits par une manipulation compétente et rapide des animaux par les applicateurs de la procédure, par un prélèvement de faibles volumes de sang en fonction de la volémie et par l’application d’un point de pression sur le site de prélèvement comme décrit dans le procédure interne « Geste technique sur animaux vivants : prises de sang » qui définit le volume limite de prélèvement sanguin et les périodes de récupération nécessaires. A la fin de la prise de sang, l’animal peut être caresser au niveau du groin ou sous le cou. Les conditions d’hébergement des animaux sont définies de telle sorte que l’enrichissement des cages (ballons, croix, chaine), la densité des animaux par cage, ou encore les paramètres environnementaux (température et hygrométrie…) procurent le maximum de confort aux animaux, et restent supérieurs ou égaux à la législation en vigueur (Arrêté du 01/02/2013). Aucun animal ne reste isolé, en cage individuelle sans contact olfactif, auditif et visuel avec ses congénères, ceci afin de réduire au minimum l’angoisse et le stress des animaux..

Choix des espèces

Les additifs alimentaires développés sont destinés à être incorporés dans les aliments destinés aux porcins (porcs en croissance) qui représentent de ce fait la cible privilégiée des produits que nous voulons mettre sur le marché. Porcs : études avec des animaux sevrés à 28 jours d’âge au niveau de l’élevage et réceptionnés avec un poids vif de 28-32 kg en moyenne Les animaux sont utilisés au stade de l'engraissement qui constitue le stade de développement qui génère le plus d'émissions gazeuses, permettant ainsi d'évaluer les solutions proposées par ce projet.

10 porcs vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent la pose chirurgicale d'un cathéter dans la veine jugulaire, des gavages sous contention ferme et des prélèvements de sang répétés, pour établir la cinétique d'une association d'antibiotiques utilisée dans la filière porcine. Le porteur souligne une pose "moins invasive" et des prélèvements "totalement indolores" une fois le cathéter en place, et réutilise chaque animal pour deux voies d'administration. Il justifie la mise à mort par le prélèvement des muscles, du foie et des reins pour y doser les antibiotiques.

Objectifs

L'association d'antibiotiques sulfamides/triméthoprime est classiquement utilisée en médecine vétérinaire, notamment dans la filière porcine, pour traiter certaines infections. Le ratio de doses sulfamides/triméthoprime dans la quasi-totalité des spécialités vétérinaires mises sur le marché est de 5:1. Or, ce ratio n’a pas été établi à partir de données animales, mais est une transposition directe du ratio correspondant à l’association sulfaméthoxazole/triméthoprime (SMX/TMP) utilisée chez l’Homme. Un biais majeur de cette transposition réside dans le fait que les vitesses d’élimination des sulfamides (illustrées par leurs temps de demi-vie plasmatiques, t1/2 vie) peuvent être très variables selon l’espèce animale. Chez l’Homme, le SMX et le triméthoprime ont des t1/2 vie assez proches, permettant de maintenir un rapport de concentrations entre les deux antibiotiques constants au cours du temps et de conserver ainsi l’effet synergique entre eux. A l’inverse, chez les animaux de rente par exemple, certains sulfamides ont des t1/2 vie beaucoup plus longs que celui du triméthoprime. Les sulfamides seront alors présents beaucoup plus longtemps chez l’animal, d’où une perte probable de l’effet synergique recherché et par voie de conséquence de l’efficacité de l’association. L’ensemble de ces facteurs questionne la pertinence du ratio 5:1 des formulations vétérinaires, mais aussi les posologies recommandées (doses et/ou intervalles d’administration). Cette procédure expérimentale s’ajoute à une autre demande déjà validée par le comité d’éthique dans laquelle deux associations de sulfamide/TMP (sulfadiazine(SDZ)/TMP et sulfadiméthoxine(SDMX)/TMP), ayant des propriétés pharmacocinétiques distinctes, ont été étudiées chez le porc. L’objectif de cette nouvelle demande est d’ajouter une étude cinétique avec une 3e association (sulfaméthoxazole(SMX)/TMP) pour compléter les données pharmacologiques in vivo déjà obtenues avec les deux précédentes associations, permettant par la suite de consolider l’approche de modélisation pharmacocinétique/pharmacodynamique (PKPD) afin d’optimiser les posologies et schéma d’administration de ces molécules chez le porc.

Bénéfices attendus

La promotion de solutions thérapeutiques à base d’associations – entre antibiotiques ou entre antibiotiques et nonantibiotiques – tient une place importante dans les stratégies de lutte contre l’antibiorésistance. Lorsqu’elles associent 2 antibiotiques, ces solutions doivent viser à limiter l’émergence de résistances et non à élargir le spectre d’activité. Les formulations associant le TMP avec un sulfamide peuvent entrer dans la première catégorie, ce qui en fait une exception « vertueuse » parmi les associations disponibles en médecine vétérinaire dont la plupart ont été développées avec un objectif d’élargissement du spectre. Malheureusement, les formulations TMP/sulfamides destinées aux animaux ont été développées par transfert « aveugle » des données de la médecine humaine relatives à l’établissement d’une synergie, sans tenir compte des spécificités des espèces animales ou de leurs bactéries pathogènes. Les études pharmacocinétiques in vivo couplées au études pharmacodynamiques sur des bactéries pathogènes les plus fréquemment rencontrées vont à terme, permettre d’optimiser l’administration de l’association triméthoprime/sulfamide (doses, posologies) chez le porc.

Procédures

Pour réaliser la cinétique plasmatique, un cathéter central sera posé au niveau de la veine jugulaire externe grâce à un acte chirurgical réalisé sous anesthésie générale et échoguidé. Cette technique utilisant un échographe permet de réduire la durée de l’intervention par rapport à une chirurgie « classique » (de 1h30-2h à 30-45 minutes par animaux) tout en minimisant le risque infectieux (acte moins invasif). Cet acte chirurgical peut être source de stress et de douleur mais une contention maitrisée suivi d’une anesthésie/analgésie adaptée permettra de réduire au maximum ces désagréments. Une fois le catéther posé (avec une rallonge du connecteur), les prélèvements de sang seront totalement indolores, sans contention particulière et réalisé en moins d'une minute. Durant l'expérimentation une source de stress viendra des gavages qui nécessitent une contention ferme quisera effectuée par des opérateurs formés, assurant ainsi la sécurité des animaux et des opérateurs et minimisant les sources d’inconfort pour les animaux. Chaque manipulation de contention+gavage ne dure pas plus de quelques minutes (entre 3 et 4 minutes).

Impact sur les animaux

Pour réaliser la cinétique plasmatique, un cathéter central sera posé au niveau de la veine jugulaire externe sous anesthésie générale, de façon écho-guidée et en respectant une asepsie rigoureuse. Cette technique permet de minimiser le risque infectieux (acte moins invasif qu’une chirurgie « classique ») ainsi que le temps d’anesthésie de l’animal. Une fois le cathéter posé (avec une rallonge du connecteur), les prélèvements de sang seront totalement indolores et sans contention particulière. Durant l'expérimentation une source de stress viendra des gavages qui nécessitent une contention qui sera effectuée par des opérateurs formés, assurant la sécurité des animaux et des opérateurs et minimisant les sources d’inconfort pour les animaux. Chaque manipulation de contention+gavage ne dure pas plus de quelques minutes (2 à 3 minutes).

Devenir

Chaque porc sera mis à mort à l’issu de l’expérimentation dans des conditions éthiques et les tissus d’intérêts (muscles, foie, reins) seront récoltés pour le dosage des antibiotiques.

Remplacement

Il n’existe actuellement pas de méthodes non-animales de remplacement pour suivre la cinétique plasmatique (tout en incluant les variabilités inter-individuelles) des molécules qui est une étape préliminaire à l’approche PK/PD envisagée.

Réduction

L’utilisation de 5 animaux par voie d’administration (IV ou voie orale VO) soit un total de 10 animaux est un minimum pour pouvoir correctement estimer la variabilité inter-individuelle des paramètres pharmacocinétiques (clairance, etc) par une approche de population (modèle non-linéaire à effet mixte). De plus, l’approche en « cross-over » permet de limiter le nombre nécessaire d’animaux en les ré-utilisant pour tester les deux voies d’administration (IV et VO) pour l’association sulfaméthoxazole (SMX)/TMP en incluant une période de wash-out adaptée pour garantir la fiabilité des résultats. Une fois le modèle PK développé et fiable, il permettra d’étendre l’exploration à d’autres posologies sans la nécessité d’utiliser d’autres animaux.

Raffinement

Les porcs seront hébergés par 2 lors de la phase d’acclimatation (7 jours) puis seront seuls par case (sur caillebotis) après la pose du cathéter afin de limiter les risques d’arrachement. Néanmoins, des barrières entre cases permettent un contact visuel, olfactif et tactile (groin à groin) entre porc voisin. Des jouets seront mis à disposition : balle, ainsi que jouets à macher suspendus. Les prises de sang répétées seront effectuées après la pose chirurgicale de cathéters (avec anesthésie et analgésie suffisante pour les animaux) pour limiter la douleur lors des prélèvements sanguins ainsi que le stress généré. Les cathéters seront protégés avec un bandage adéquat vérifié régulièrement et changé s’il devient trop souillé. Un suivi-post opératoire individuel des animaux sera effectué et une analgésie sera mise en place si nécessaire (paracétamol +/- analgésique de type morphinique) même s’il est peu probable d’avoir un tel recours en raison de la méthode très peu invasive de pose du cathéter. Le début de la cinétique ne se fera qu’au minimum 24h après la pose du cathéter. La contention lors du gavage sera effectuée par des opérateurs formés pour assurer la sécurité des animaux et des opérateurs tout en minimisant les sources d’inconfort pour les animaux. Cependant, des points limites et critères d’arrêt ont été définis afin de permettre une intervention rapide sur les animaux.

Choix des espèces

Il s’agit de l’espèce cible pour l’étude pharmacocinétique de l’association sulfamethoxazole(SMX)/TMP. Au début de l’expérimentation, les porcs seront sevrés, et auront un poids d’environ 25-30 kg. Cet intervalle de poids permet une manipulation aisée des animaux (sécurité des opérateurs, diminution du stress des animaux).