Mammifères "de rente"

17 brebis vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, puis réutilisées. Chacune subit une ovariectomie et la pose d'un implant d'estradiol sous anesthésie, la pose répétée de cathéters dans la veine jugulaire et jusqu'à 24 prélèvements de sang sur dix heures, répétés six fois, pour tester des analogues de kisspeptine destinés à maîtriser la reproduction des animaux d'élevage. Le porteur présente ce projet comme une piste pour supprimer les traitements hormonaux qu'il juge éthiquement contestables. Il affirme que la reproduction ne peut s'étudier que sur organisme entier et que le passage à l'animal reste incontournable.

Objectifs

Actuellement, la maîtrise de la reproduction des animaux d'élevage repose principalement sur la stimulation de l'ovulation par des hormones. Des systèmes considérés plus « naturels », tel l'effet mâle, sont aussi utilisés mais leur efficacité est moindre. Pour différentes raisons, ces deux approches ne répondent pas de façon satisfaisante aux attentes sociétales (absence de contaminant dans les produits consommés et de pollution de l'environnement) et à celles des producteurs (efficacité et rentabilité). Nous avons, dans un projet précédent, développé des analogues à partir d’un neurotransmetteur endogène, la kisspeptine (Kp) comme piste originale pour réduire voire éliminer l’utilisation d’hormones. Ce neurotransmetteur joue un rôle clé dans la stimulation de la reproduction, mais son instabilité métabolique, et par conséquent sa durée d'action trop courte, empêche son utilisation sur le terrain. Nous avons donc conçu et synthétisé des analogues avec une durée d'action plus importante que la molécule naturelle. Le présent projet vise à étudier l'effet de différentes formes de Kp humaine sur la fonction de reproduction des brebis, pour développer l'analogue le plus efficace possible.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus sont 1) comprendre la différence d'effet de différentes isoformes de Kp entre deux organismes, 2) mettre en place une forme de Kp optimale pour stimuler la reproduction de la brebis et 3) développer un outil permettant de maitriser la reproduction des animaux d'élevage (notamment ici, la brebis). De façon plus globale, ce projet vise à élaborer une stratégie d’élevage des animaux de rente avec une meilleur prise en compte du bien-être animal et des attentes sociétales en supprimant les traitements hormonaux et en trouvant des alternatives aux traitements actuellement mis en place et éthiquement contestables.

Procédures

- Ovariectomie et pose d’implant d’estradiol sous anesthésie générale sur 17 brebis (environ 2 heures) - Retrait d’implants d’estradiol sous anesthésie générale sur 17 brebis - Pose et dépose de cathéters dans la veine jugulaire sur animal vigile : 2 fois chez 17 brebis - Prélèvements de sang sur animaux vigiles par ponction de la veine jugulaire via un cathéter : 24 prélèvements sur 10h pour 17 brebis, répété 6 fois.

Impact sur les animaux

La kisspeptine est une molécule employée à de nombreuses reprises dans notre laboratoire dans le cadre de projets antérieurs. De plus, le peptide et ses effets sont très bien décrits chez les mammifères, et notamment chez les ovins. D'après notre expérience, suite à une injection aigüe de kisspeptine aucune nuisance ou effet indésirable n'est observé. En termes de manipulation des animaux, les chirurgies, injections et prises de sang sont des manipulations maitrisées par le laboratoire et réalisées par du personnel expérimenté. Cependant, des effets peuvent être observés, notamment suite à l'ovariectomie ou la pose des cathéters, des douleurs, perte de poids et perte de mobilité peuvent apparaître mais sont anticipés par l'injection d'analgésiques au moment des procédures.

Devenir

Les animaux auront été ovariectomisés, soumis à l'implantation d'un cathéter dans la jugulaire et injectées avec des isoformes de kisspeptine avec une durée de vie courte (de l'ordre de quelques minutes/heures), les animaux pourrons alors aisément être réutilisés ou replacés.

Remplacement

La reproduction est un mécanisme physiologique intégré extrêmement complexe qui ne peut être étudié que par une approche in vivo. Il en est de même pour toutes les études visant à la contrôler. Notre niveau de connaissances actuelle est largement insuffisant pour espérer mettre en place par exemple une approche de modélisation informatique afin de prédire comment le système répond à un stimulus donné ou pour une quelconque approche de substitution, comme des cultures cellulaires, capable de reproduire les phénomènes complexes d’intégration qui ont lieu au niveau de l’organisme entier. Cependant, l'activité des molécules à tester in vivo dans ce projet a déjà été caractérisée in vitro. Le passage à l'animal reste incontournable en l'état actuel de nos connaissances.

Réduction

Notre protocole expérimental a été mis en place de sorte à réduire au maximum le nombre d'animaux utilisés. A la lumière des études publiées dans le domaine et de notre expérience, il nous sera nécessaire de constituer des groupes de 7 animaux par traitement. Dans le souci de réduire au maximum le nombre d'animaux utilisés ainsi que le nombre d'injections et de prise de sang réalisées sur chaque animal, nous prévoyons de tester plusieures molécules par animal à minimum 3 jours d'intervalle. Cet intervalle de temps permettra de laisser le temps aux molécules injectées de ne plus être détectable dans le sang et de pouvoir tester la molécule suivante sans crainte d'avoir une interaction avec la molécule précédente. Chaque groupe test d'une forme de Kp (composé de 7 animaux) sera comparé avec un groupe contrôle (composé de 17 animaux répartis sur chaque série de tests) pour assurer la validité scientifique et la puissance statistique nécessaire.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en groupe et seront également en groupe lors des procédures afin de minimiser au maximum le stress lié à la contention dans des cages individuelles qui sont souvent employées pour ce genre de procédures. Les méthodologies utilisées dans le cadre de ce projet ne dépasseront pas une douleur de classe modérée et nous mettrons en œuvre tout notre possible afin de garantir le bien-être de l’animal en lui apportant les soins adéquats en fonction des besoins. Dans cet optique, les animaux seront visités au moins une fois par jour avec contact direct ou non (sans réalisation de procédure), permettant l'habituation de l'animal à l'expérimentateur et un suivi du bien-être des animaux. Un suivi journalier sera mis en place tout au long de la période d'expérimentation pour évaluer l'état de bien-être des animaux en s'assurant que les points limites ne soient pas atteints. Le comportement (notamment isolement) et l'apparence des brebis (notamment au niveau des plaies chirurgicales et implantation du cathéter) sera suivi avec attention et les animaux seront pesés (en prêtant attention au pourcentage de perte et qu'il ne dépasse pas le seuil critique de 20%) pendant 3 jours après l'ovariectomie. Ce suivi permettra d'évaluer le bien-être des animaux et de décider de l'euthanasie ou le soulagement de la douleur des animaux suivant le stade d'atteinte des points limites (soulagement de la douleur en cas de dégradation d’un critère de comportement et d’apparence, euthanasie en cas d’atteinte du seuil critique des 20% de perte de poids et/ou dégradation de plus de deux critères de comportement et d’apparence). En cas de douleur les animaux seront traités comme suit : Anti inflammatoire non stéroïdien en intramusculaire éventuellement renouvelé 48H après si signes douloureux (baisse d'appétit, prostration, décubitus prolongé). Dans le cas où ces traitements ne résulteraient pas en une amélioration significative de l’état des animaux, ou dans le cas où certains comportements témoignant une douleur seraient détectés (par exemple prostration, décubitus prolongé, anorexie...) les animaux seraient alors euthanasiés par surdosage de barbituriques intraveineux. En cas d’hémorragie post-opératoire (muqueuses pâles), l’animal serait réanesthésié et nous rechercherions le site hémorragique pour procéder à la suture vasculaire.

Choix des espèces

La brebis est un modèle largement utilisé pour l’étude de la reproduction chez les animaux d’élevage et nous pouvons nous baser sur une littérature très riche sur ce modèle. Nous avons choisi d’utiliser la race Ile de France pour les brebis parce que c’est le modèle sur lequel nous avons obtenu nos résultats précédents et parce que c’est une race d’élevage d’intérêt économique important. Adulte pour étudier un animal sexuellement développé avec un axe gonadotrope actif.

9 moutons et 9 bovins vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, le porteur indiquant qu'ils peuvent ensuite retourner dans le troupeau expérimental. De jeunes agneaux et veaux non faunés sont inoculés avec un protozoaire puis subissent, sur quatre mois, des prélèvements répétés de contenu ruminal par sonde œsophagienne, de sang et de fèces. Il décrit un léger inconfort lié surtout à la contention et une douleur légère lors des prises de sang. Il affirme que la culture in vitro de ces protozoaires reste trop limitée, l'objectif étant d'étudier leur rôle dans la digestion et la production de méthane.

Objectifs

Ce projet propose d'utiliser des jeunes ruminants (ovin, bovin) naturellement dépourvus de protozoaires (non-faunés) qui seront ensuite inoculés par une seule espèce de protozoaire provenant de la cryobanque ERCULE (projet EU) avec l’objectif d’effectuer des études génomiques et fonctionnelles car les protozoaires du rumen ne peuvent pas être cultivés de manière axénique et en quantité suffisante in vitro.

Bénéfices attendus

A l’issue du projet, nous aurons des données génomiques et fonctionnelles pour appréhender le rôle des protozoaires dans l’écosystème digestif du ruminant qui reste mal connu. Les données alimenteront la base de données publique du projet HoloRuminant. Les informations obtenues dans ce projet serviront à évaluer le rôle des certains protozoaires dans la digestion des aliments et leur effet sur la production de méthane dans le rumen.

Procédures

Les animaux feront l'objet de 3 types de prélèvements : Contenu ruminal : Le volume prélevé sera adapté à la taille et au développement de l'animal : jusqu’à 100 ml pour un agneau de 20 kg ou 200 ml pour un veau, 6 fois au cours de toute la période de 4 mois et sera réalisé en moins de 3 minutes (entre le début de la contention et la fin du prélèvement). Sang : Les animaux seront prélevés 2-3 fois pendant la période de "mono-faunation". Les quantités prélevées sont de 10-15 ml et largement inférieures à 10% du volume sanguin total afin d’éviter tout risque d'hypovolémie, anémie ou stress physiologiques et durera moins d'une minute. Fèces : Les agneaux et les veaux seront prélevés 6 fois au cours de toute la période de 4 mois. Le volume prélevé sera d'environ 5-10 g et durera moins d'une minute.

Impact sur les animaux

Les techniques des prélèvements sont des pratiques couramment appliquées. Le contenu ruminal sera prélevé par sonde oesophagienne. La procédure génère un léger inconfort, surtout du à la contention de l’animal mais aucune douleur ni souffrance n’est attendue. Si nécessaire, des prises de sang seront réalisées à la veine jugulaire. La prise de sang génère une douleur légère.

Devenir

Les procédures appliquées aux animaux sont peu invasives et la fréquence des prélèvements est faible. Les veaux et agneaux peuvent à l'issu de cette procédure retourner dans le troupeau expérimental.

Remplacement

A l’heure actuelle, la culture des protozoaires in vitro est très fastidieuse. La croissance in vitro est très limité et les cultures sont souvent perdus sans raison apparente après quelques jours. En plus, le nombre réduit des protozoaires que puissent être obtenues in vitro ne permet pas d’effectuer certaines études et il n’y pas asses d’information indiquant que les caractéristiques fonctionnelles des protozoaires cultivés in vitro sont similaires à celles des protozoaires dans son milieu naturel, le rumen.

Réduction

Le nombre des animaux tient compte surtout des aspects éthiques (compagnie des animaux grégaires). L’animal n’est pas l’unité expérimentale mais le moyen pour obtenir des protozoaires en quantité suffisante pour des études de séquençage du matériel génomique.

Raffinement

Tout signe de souffrance, se manifestant par de l’abattement, un refus de s’alimenter, ou un comportement anormal (considérés comme points limites) sera signalé, consigné dans le cahier d’expérimentation et pourra entrainer l’arrêt des prélèvements et la fin de l’expérimentation pour un individu donné voire l’euthanasie si nécessaire. Néanmoins, les prélèvements ne devraient pas induire de douleur car ils sont réalisés rapidement par du personnel expérimenté.

Choix des espèces

L'objectif est de comprendre les déterminants microbiens déclancheurs des diarrhées chez le jeune ruminant, un travail sur les ovins et les bovins s'avère donc, par définition en tant qu’espèce-cible et espèce-modèle, plus pertinent qu'un autre modèle pour les ruminants d’élevage. L'étude de la modulation du microbiote gastrointestinal après le sevrage nécessite d'utiliser des agneaux ou veaux qui ont eu un contact limité avec des adultes pour éviter la comtamination en protozoaire.

15 910 souris et 972 mini-porcs vont être utilisés, tous tués à l'issue pour analyse des organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur décrit un modèle de souris à phénotype dommageable dont environ 30 % meurent dans les premières 48 heures et 10 % développent des complications sévères comme une hydrocéphalie ou des troubles respiratoires. Les souris subissent des prélèvements sanguins jusqu'à sept fois par semaine, une biopsie d'oreille et des injections, les mini-porcs des prélèvements de sperme, de sang et des injections. Il affirme que le projet ne peut se faire sans modèle animal, le bénéfice pour les patients d'une maladie osseuse rare étant présenté comme "éventuel" et à long terme.

Objectifs

Le but de ce projet est de développer un traitement pour une pathologie osseuse rare. Il s'agit d'une maladie osseuse génétique qui cause une forme rare de nanisme chez l'être humain (1 naissance sur 100 000). Elle est caractérisée par une petite taille avec un raccourcissement du tronc et du cou, induisant un risque important d'instabilité au niveau des vertèbres cervicales pouvant provoquer une paralysie. Les patients souffrent également d'anomalies au niveau de l'oeil et d’une perte d'audition. Ce projet a pour but de continuer le développement d’un potentiel traitement pour cette pathologie. Ce projet nécessite l'utilisation de souris atteintes de la maladie mimant la pathologie humaine ce qui permettra de tester l’approche thérapeutique validée et l’améliorer.

Bénéfices attendus

Ce projet va nous permettre de faire la preuve de concept chez l’animal d’une approche thérapeutique pour cette maladie rare. Il s’agit d’une maladie rare sévère pour laquelle à l’heure actuelle il n’existe aucune approche thérapeutique. Dans le cas où cette approche fonctionnerait cela nous permettrait de continuer le développement dans le but d’apporter un jour un traitement efficace pour les patients. Il s’agit donc d’un bénéfice éventuel à long terme pour ces patients.

Procédures

Souris: prélèvements de sangs (30s), maximum 7 fois par semaine pour les microprélèvements et 1 fois par semaine pour les prélèvements de 7,5% du volume sanguin circulant. biopsie d'oreille (quelques secondes), une fois dans la vie de l'animal. Injection 1 à 3 fois dans la vie de l'animal (30sec à 10min) Miniporc: prélèvements de sperme (10-20min), maximum 1 fois par semaine. injections (1-60min), maximum 1 fois par semaine dans la vie de l'animal sauf pour les injections terminales 2 dans la même journée. prélèvements de sang (3-10min), maximum 2 fois par semaine.

Impact sur les animaux

Le modèles de souris utilisé dans ce projet est à phénotype dommageable. En effet, les animaux malades présentent des complications qui surviennent de façon chronologique et si les souris survivent les premières semaines, elles restent modérément atteintes. Environ 30% des animaux malades meurent dans les 48 premières heures et environ 10% développent des complications sévères (hydrocéphalie, pectus excavatum, troubles respiratoires) dans les 3 premières semaines de vie. Une attention toute particulière est apportée à ces animaux qui sont surveillés quotidiennement dès leur naissance. En ce qui concerne les souris et miniporc non malades, il n'y a pas d'effets indésirables prévues suite aux procédures. Il s’agit d’injection et de prélèvements réalisés par des personnes compétentes et formées. Les tampons qui sont prévus d’être utilisés sont à pH physiologique et peu visqueux.

Devenir

Tous les animaux inclus dans les procédures seront euthanasiès à la fin des procédures afin de pouvoir analyser les organes.

Remplacement

Ce projet ne peut pas se faire sans modèle animal car avant de pouvoir envisager un traitement, et de commencer une étude clinique sur les patients souffrant de cette pathologie osseuse, il est nécessaire de démontrer que les molécules choisies ont l'effet attendu au niveau du modèle animal de la maladie et qu'elles ne présentent pas d'effets toxiques majeurs.

Réduction

Le nombre d’animaux a été calculé de manière à produire les animaux nécessaires pour la partie expérimentation. Nous avons inclus dans les procédures des contrôles communs dès que possible.

Raffinement

Le suivi quotidien (weekends et jours fériés inclus) des animaux par le personnel de l’établissement utilisateur et les visites régulières des expérimentateurs (à minima trois fois par semaine) nous permettront de déceler précocement tout signe de souffrance ou d’angoisse et nous appliquerons strictement les points limites définis. En cas d'altération de l'état de l'animal, la surveillance sera rapprochée et les animaux seront soignés en fonction de la sévérité de la douleur observée. En cas d'apparition d'une souffrance ou toxicité inattendue, les animaux seront exclus de l'étude et mis à mort dans les 24 heures avec l’accord du directeur d’étude.

Choix des espèces

Ce projet développe un traitement pour une pathologie rare de la croissance. Nous allons avoir besoin de souris pour faire du criblage de thérapie. Cela permet de cribler un grand nombre de molécules rapidement (gestation courte de 3 semaines et 5 à 8 petits en moyenne par portée). Le mini porc est utilisé pour démontrer la pénétration de l'approche thérapeutique dans la plaque de croissance d’une espèce non-rongeur. La plaque de croissance du mini porc est proche de celle de l’homme, donc cette espèce est un bon modèle dans le cadre de cette étude. Nous travaillons sur les porcelets, ce modèle permet d’avoir entre 6 et 10 petits par mise-bas et donc raffiner le nombre de femelles nécessaires. Nous allons utiliser des souris qui sont un mutant spontané caractérisé à l'état homozygote. Ces animaux ont un phénotype de nanisme similaire à la pathologie humaine. Chez la souris, les études de bio distribution seront réalisées sur des animaux âgés de 5 à 8 semaines et pour les études d’efficacité nous utiliserons les animaux de la naissance jusqu’à 18 mois d’âge. Dans le cas des mini porcs, les porcelets seront utilisés de la naissance jusqu’à l’âge de 12 mois maximum et les génitrices jusqu’à ce que les porcelets soient euthanasiés. Il n’est pas possible de remettre les génitrices en croisement après la mise bas. Cela nous permet de couvrir tous les âges potentiels d’utilisation du traitement chez l’homme.

2 chèvres vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, réutilisées pour d'autres expérimentations ou confiées à une association d'adoption à l'issue. Chaque animal reçoit jusqu'à cinq injections intramusculaires et sept prélèvements sanguins à la jugulaire pour produire des anticorps dirigés contre des vésicules bactériennes. Le porteur indique que le protocole peut provoquer fatigue, douleur, hyperthermie et, dans un cas extrême, un choc anaphylactique. Il affirme que le recours à l'animal vivant est "indispensable" et qu'il n'existe "aucune alternative" non animale, seul un "organisme intégré et vivant" pouvant synthétiser ces anticorps.

Objectifs

Les vésicules de membranes externes (OMV) sont des vésicules formées à partir de la membrane externe des bactéries Escherichia coli. Ces vésicules font l’objet de nombreux projets de recherche dans des domaines variés (traitement anti-cancéreux, vaccinologie, ...). Le but de ce projet est de produire des anticorps dirigés contre ces vésicules (anticorps non disponibles à ce jour). Les anticorps fixés sur les vésicules pourront être marqués par fluorescence (immunomarquage) afin de pouvoir suivre le trajet des vésicules au niveau cellulaire et ainsi de comprendre le mécanisme d’action des OMV au niveau des cellules.

Bénéfices attendus

Le sérum des chèvres prélevées permettra de récupérer des anticorps dirigés contre les vésicules extra-cellulaires (OMV) de bactéries et de créer un stock d’anticorps pour les expérimentations en laboratoire ultérieurement (exemple : suivi des OMV par marquage fluorescent des anticorps dirigés contre les OMVs (immunomarquage)). Cela permettra de mieux étudier le mécanisme d’action encore méconnu de ces vésicules.

Procédures

5 injections intramusculaires maximum (durée de 5 secondes environ) à 2 semaines d’intervalle entre chaque injection, sur 2 chèvres vigiles. Et 7 prélèvements sanguins à la veine jugulaire (environ 10 secondes par prise de sang) sur 2 chèvres vigiles avec 2 semaines d’intervalle entre chaque prise de sang.

Impact sur les animaux

Le protocole est susceptible de générer un stress chez l'animal au moment des manipulations (injections et prises de sang) et une réaction inflammatoire et immunitaire attendue liée à la production d'anticorps en réponse à l'injection des OMV, qui pourrait entrainer un état de fatigue, de la douleur et de l'hyperthermie de manière transitoire, voire un choc anaphylactique (dans un cas extrême, non attendu). Ce protocole ne doit pas entrainer d'effet délétère à long terme, ni de souffrance et ne nécessite pas la mise à mort des animaux. De nombreuses validations in vitro et in cellulo ont déjà été réalisées de manière à garantir la qualité des vésicules utilisées à des fins vaccinales. De plus, l’innocuité chez l’animal a déjà été établie dans un modèle poussin.

Devenir

Les chèvres seront réformées pour d’autres expérimentations ou alors adoptées par une association spécialisée dans le placement d’animaux anciennement utilisés à des fins scientifiques.

Remplacement

L'absence d'anticorps disponibles nécessite de recourir à une production d'anticorps par immunisation contre les vésicules extracellulaires d'intérêt. Ce projet ne peut pas être réalisé in vitro. En effet, il n'existe aucune alternative non animale disponible permettant de produire des anticorps. A l'heure actuelle, tous les anticorps sont produits dans des organismes modèles (souris, rat, lapin, chèvre, âne ou singe le plus souvent). Le recours a l'animal vivant est ici indispensable car la production d'anticorps étant secondaire à une immunisation (ici consécutive à l'injection d'OMV) et mettant en jeu des mécanismes complexes et séquentiels, seul un organisme intégré et vivant est capable de synthétiser ces anticorps.

Réduction

Le nombre d’animaux minimal nécessaire pour afin de garantir la production d’anticorps est de 2 individus. En effet, une seule chèvre ne serait pas suffisante dans le cas où le système immunitaire de la chèvre ne répondrait pas à l’immunisation (pas de production d’anticorps) car il existe une variabilité de réponse immunitaire entre les animaux d’une même espèce. 2 chèvres est donc le nombre minimal nécessaire afin d’augmenter les chances de récupérer des anticorps par prélèvement sanguin sur les chèvres.

Raffinement

Les chèvres seront logées à côté d’un troupeau de chèvre (afin de répondre aux besoins sociaux intra-espèce des chèvres, car il n’existe pas de risque infectieux), en boxe intérieur sur aire paillée. Les animaux auront des abreuvoirs, du foin à volonté et une distribution de granulés quotidienne. Les densités par animal sont respectées conformément à la réglementation (directive 2010/63/UE du Parlement européen et du Conseil du 22 septembre 2010 relative à la protection des animaux utilisés à des fins scientifiques). Des brosses sont mises à disposition sur les murs du logement afin que les chèvres puissent se frotter contre celles-ci afin d’enrichir leur environnement. Elles auront la possibilité d’exprimer un comportement propre à leur espèce. Avant le début du protocole expérimental, les chèvres auront une longue période d’acclimatation dans leur nouvel environnement (supérieure à 1 mois).

Choix des espèces

Nous avons choisi le modèle chèvre car il permet de purifier une quantité importante de sérum, ce qui évitera de devoir reproduire la même expérimentation régulièrement. Par ailleurs, le modèle chèvre étant couramment utilisé pour produire des anticorps, de nombreux réactifs dirigés contre cette espèce sont disponibles dans le commerce, ce qui permettra d'utiliser les anticorps produits dans de nombreuses applications. Chèvre adulte (afin de limiter le risque d'apparition de choc anaphylactique).

40 jeunes moutons mâles vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent des injections répétées d'antigènes avec adjuvant, une dizaine de rappels au cours de leur vie productive, pour produire un sérum servant à fabriquer des réactifs de diagnostic vendus. Le porteur indique que l'adjuvant peut provoquer des inflammations locales, et précise que les animaux sont euthanasiés à la fin "afin de ne pas être reconduit dans la filière alimentaire". Il justifie le choix de l'espèce par l'absence de modèle in vitro performant et par les volumes de sérum obtenus.

Objectifs

Les anticorps polyclonaux de mouton anti-immunoglobuline de lapin et de souris sont utilisés dans la production de différents réactifs de diagnostic in vitro pour le test : - de maladies métaboliques liées aux hormones stéroïdiennes (estradiol et cortisol) ; - mesure de la concentration des hormones thyroïdiennes T4 et T3. Le dosage de ces hormones est réalisé dans le cadre d’un bilan de la fonction thyroidienne. L’anticorps de mouton est utilisé pour assurer la sensibilité et spécificité des tests en assurant la capture des anticorps spécifiques de lapin ou de souris dirigés contre chacune des molécules à doser (estradiol, cortisol, T3, T4).

Bénéfices attendus

En l'absence de modèle in-vitro performant, c'est l’espèce ovine qui a été choisie. Les résultats de développement des tests de diagnostic concernés ont montré l’efficacité de l’immunisation chez cette espèce. La qualité des anticorps ainsi obtenus s’est révélée satisfaisante (sensibilité et spécificité) permettant de garantir la fiabilité du résultat rendu par les tests : un faux résultat (faux positif, faux négatif ou erreur de dosage) rendu par le test dans un laboratoire clinique peut avoir un impact grave sur la santé, le suivi médical et la prise en charge des patients testés avec ces méthodes. Cette espèce donne la possibilité d’effectuer des prélèvements de sang à différentes reprises, ce qui permet de produire des quantités importantes de sérum hyper-immun et ainsi de limiter le nombre d’animaux impliqués dans le projet pour couvrir les besoins pour les 5 prochaines années de production.

Procédures

Pour un animal lors de la primo injection (1seule fois dans la vie de l’animal) : 4 injections par voie intra-dermique à 28 jours d’intervalle (3 minutes pour la totalité d’une injection). Et lors d’un rappel (une dizaine de fois dans sa vie productive) : 1 seule injection par voie intra-dermique (3 minutes pour la totalité de l’injection).

Impact sur les animaux

Par expérience, ces protocoles ne sont pas susceptibles d'occasionner douleur, souffrance ou angoisse. Les antigènes sont administrés avec adjuvant qui peut entrainer des inflammations locales au point d’injection. Ces inflammations, seront suivies quotidiennement et traitées si besoin par un protocole de traitement adapté. Toutefois, la surveillance particulière et quotidienne de ces animaux en protocole assure, en cas de signes cliniques, le déclenchement de soins spécifiques sur les conseils d'un vétérinaire. L'observation quotidienne de la troupe permet de détecter les premiers signes d’alerte : apathie, arrêt de l’alimentation, dégradation de l’état général.

Devenir

A l’issue de la procédure, tous les animaux seront euthanasiés afin de ne pas être reconduit dans la filière alimentaire.

Remplacement

Indisponibilité de modèle in vitro performant pour la production d’anticorps contre les antigènes considérés ayant les caractéristiques nécessaires (spécificité, avidité, sensibilité) pour un dosage ELISA automatisé. Les anticorps polyclonaux obtenus sont très spécifiques de l'antigène injecté et très sensibles en raison du nombre d’épitopes différents qu'ils reconnaissent.

Réduction

Le nombre d'animaux utilisés est calculé au plus juste en fonction des besoins de production. Le calcul du nombre d'animaux dépend du volume de produit commandé. Ce nombre d’animaux a été optimisé au fil des années d’expérience et permet d’être ajusté au plus près des besoins. Les quantités de sérum obtenues avec les moutons sont importantes, présentent des taux élevés d’anticorps ayant une forte affinité vis à vis de l'antigène injecté et correspondent aux volumes souhaités.

Raffinement

Les moutons, animaux grégaires, sont stabulés en petits groupes dans des conditions conformes à la réglementation et adaptées à l'espèce. Les animaux ont accès à la nourriture via une distribution de concentrés, au foin et à l’eau à volonté. Ils sont soignés quotidiennement, avec une surveillance intensifiée assurant leur bien-être. L'observation de signes cliniques de souffrance déclenche des soins spécifiques sur les conseils d'un vétérinaire.

Choix des espèces

Le mouton est une espèce documentée et classiquement utilisée pour la production d'anticorps polyclonaux. Bien que présentant une grande hétérogénéité, les anticorps polyclonaux sont très spécifiques de l'antigène injecté et très sensibles en raison du nombre d’épitopes différents qu'ils reconnaissent. Les quantités de sérum obtenues avec les moutons sont importantes, présentent des taux élevés d’anticorps ayant une forte affinité vis à vis de l'antigène injecté et correspondent aux volumes souhaités. Les animaux utilisés sont des jeunes mâles adultes afin de permettre le prélèvement de volumes sanguins (donc de sérums hyper-immuns) suffisamment importants pour la réalisation des diagnostics visés par l’étude.

6 brebis vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, puis rendues à l'élevage. Chacune subit une ovariectomie d'environ une heure sous anesthésie, l'ablation des ovaires les empêchant d'être gestantes tout en conservant un comportement d'oestrus. Le porteur décrit ces brebis comme des femelles "boute-en-train" destinées à stimuler les béliers pour la collecte de semence, une fois toutes les trois semaines. Il affirme qu'il n'est pas possible de collecter les béliers sans recourir à des femelles.

Objectifs

L'objectif est de réaliser une ovariectomie chez la brebis pour permettre la collecte de semence de bélier. Les brebis ovariectomisées ne présentent plus de risque de gestation non désirée et peuvent exprimer un comportement d'oestrus lorsque la collecte de semence est souhaitée.

Bénéfices attendus

Le projet permettra de disposer de brebis ovariectomisées permettant la collecte de la semence de béliers, sans risques de gestation indésirable, et sans utilisation de traitements hormonaux pour synchroniser les brebis.

Procédures

Les animaux seront soumis une fois à une procédure chirurgicale : ovariectomie. La durée totale de l'intervention, anesthésie comprise, est d'environ une heure. Si des injections post opératoires s'avèrent nécessaires, les animaux seraient contentionnés à peine 2 ou 3 minutes, injection comprise.

Impact sur les animaux

Le statut ovariectomisé n'entraine pas d'effet indésirable au cours de la vie de l'animal. Les animaux peuvent ressentir du stress lors des manipulations, de la phase pré opératoire, de l'induction de l'anesthésie, et de la phase de réveil. L'apparition de douleurs suite à la chirurgie est également possible, ainsi qu'une éventuelle infection qui entraînerait abattement, fièvre et anorexie. Lors de l'anesthésie, une irritation de l’appareil respiratoire supérieur (liée à l’intubation) peut apparaître, mais c'est rare.

Devenir

Les animaux retournent en élevage.

Remplacement

La collecte de la semence de bélier requiert l'utilisation de femelle boute en train. Il n'est pas possible chez les ovins de collecter les mâles sans une autre méthode.

Réduction

Le nombre d'animaux a été choisi pour réduire au maximum l'utilisation des femelles pour les collectes , soit une fois toutes les 3 semaines pour chaque brebis.

Raffinement

Afin de prévenir tout stress, les animaux sont gardés en groupes sociaux stables, dans des conditions d’élevage optimales avec fourrages et concentrés de qualité et des locaux calmes. La douleur est traitée préventivement avant l’acte chirurgical dès l’anesthésie, et le traitement est maintenu jusqu’à un état physiologiquement stable des animaux. Le retour à l’état normal est estimé à 3 jours postopératoires. Les animaux sont surveillés quotidiennement et plusieurs fois par jour en post-opératoire immédiat. Un animal anorexique, prostré, recevra l’administration de morphinique. Sans réponse physiologique satisfaisante, il sera procédé à l’euthanasie suivi du prélèvement du site lésionnel pour analyse. Tout animal qui ne se nourrit pas pendant 4 jours ou avec perte de poids par rapport au poids initial malgré le traitement sera mis à mort. Une fiche de suivi individuel est mise en place, renseignée tous les jours. Les animaux seront surveillés quotidiennement sur 6 paramètres. Les point limites attendus sont : - Une prostration avec abattement et anorexie en cas de douleur importante : en ce cas ces animaux recevront des injections sous cutanées de morphine - Fièvre, abattement, en cas d’infection post opératoire : en ce cas, les animaux recevront des antibiotiques et des anti inflammatoires non stéroïdien en fonction de la gravité des symptomes.

Choix des espèces

La collecte de béliers est possible uniquement par l'utilisation de brebis pour stimuler le comportement reproducteur. Brebis adultes et matures sexuellement, de façon à pouvoir répondre au traitement hormonal appliqué après l'ovariectomie.

12 chèvres laitières vont être utilisées, gardées vivantes à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont placées dans des enceintes de mesure du méthane qui les isolent et les exposent au bruit de turbines, pour mettre au point un dispositif de quantification des émissions. Le porteur indique que ce séjour peut provoquer angoisse, état dépressif, vocalisations et perte de poids transitoire, et retire de l'expérience tout animal en détresse au-delà de vingt-quatre heures. Il affirme que l'utilisation des chèvres est "essentielle et irremplaçable".

Objectifs

Chez les ruminants, les principales réponses à des pratiques d'alimentation sont liées à l’action d’une population microbienne au niveau du rumen. Ce microbiote est responsable de la fermentation des aliments dont les produits principaux sont les acides gras volatils (AGV), le gaz carbonique et le méthane. La durabilité de la production des filières de ruminants est fortement dépendante de la fermentation ruminale des aliments ingérés et de la réduction des émissions de méthane entérique. La fermentation ruminale et la production de méthane sont des processus dynamiques médiés par des interactions entre l'animal, son microbiote ruminal et l'alimentation. Ces interactions contribuent à faire varier des caractères comme la longévité, l’efficience alimentaire et la résilience, sur lesquels les animaux peuvent être phénotypés, comme c’est le cas actuellement Ce projet a comme objectif de mettre au point un dispositif expérimental pour la quantification de la dynamique de l’émission de méthane chez la chèvre. Cette phase est cruciale pour les futurs projets autour de développement des modèles mathématiques pour représenter l’interaction entre production de méthane, efficience et capacité adaptative.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de rendre opérationnel un dispositif pour la quantification de la production de méthane chez la chèvre. Le projet permettra d’identifier les paramètres environementaux au delà desquels les points limites pour les animaux seront atteints et les conditions expérimentales optimales à prendre en compte pour les futurs projets de l'installation expérimentale autour de l’émission de méthane et son lien avec des phénotypes d’intérêt.

Procédures

Les animaux ne seront soumis à aucune intervention, hormis celles classiques d’un élevage laitier (traite)

Impact sur les animaux

Le séjour dans les enceintes pourraient entraîner des états d’angoisse et de détresse en raison de l’isolement des animaux et des valeurs limites des paramètres environementaux (température, humidité). Ce stress est réduit par l’enrichissement du milieu (brosse, chaînes) à l’intérieur des enceintes, la présence de parois transparentes (qui permettent la visibilité avec leur congénères) et par la présence humaine pendant la phase d’habituation. Néanmoins, le séjour dans les enceintes pourrait conduire certains animaux à un état dépressif, à vocaliser et à diminuer leur ingestion, ceci conduisant à une perte de poids transitoire. L’expérimentation pourrait avoir un impact sur l’activité de l’animal (excrétions excessives, agitation ou immobilisation). Un animal qui manifeste des signes de détresse au-delà de 24 heures sera sorti de l’expérimentation.

Devenir

La procédure de mesure de méthane est une procédure modérée qui n’implique aucune mesure invasive sur les animaux. Les animaux sont gardés en vie à l'issue de l'expérimentation.

Remplacement

Le projet a comme objectif la mise au point d’un dispositif pour quantifier la production de méthane par le système digestif de la chèvre. L’utilisation des animaux est donc essentielle et irremplaçable.

Réduction

Nous allons utiliser 12 animaux maximum. Le nombre des enceintes est 4. Le test se fera en 2 temps . Nous considérons 2 animaux de plus par essai en prévoyant le remplacement des animaux stressés.

Raffinement

Le dispositif comprend des éléments aversifs pour les animaux comme l’isolement et l’exposition au bruit produit par des turbines d’extraction. Pour réduire les nuisances sur le bien-être animal de ces éléments aversifs, une phase d’habituation sera mise en place pour minimiser le stress dans les enceintes. Dans cette phase d’habituation, les animaux seront exposés aux éléments aversifs de manière graduelle l’un après l’autre. En premier, les animaux seront exposés graduellement à l’isolement. Le bruit des turbines sera intégré dans l’environnement ultérieurement. Du matériel isolant sera utilisé dans l’armoire du système d’extraction pour réduire le bruit produit par les turbines. Les enceintes sont équipées d’un matelas qui laisse passer l’urine pour améliorer le confort de l’animal. Des brosses et des petites chaines seront installées comme enrichissement. La présence de parois transparentes (qui permettent la visibilité avec leurs congénères) et la présence humaine pendant la phase d’habituation réduiront le stress. Les signes d’inconfort des animaux (vocalisations, agitation, tremblement, abattement, excrétions excessives) seront observés pendant toute la durée du protocole d’habituation de la façon suivante : Phase d'habituation J1 permanente, J2 toutes les 15 mn pendant 4 h, J3 et 4 toutes les 30 mn avec des temps de présence de 15 mn, J5 toutes les 2 heures sur 5 heures. Phase de mesures: temps de présence 1h matin et soir avec surveillance régulière en journée des animaux et du dispositif. Comme points limites, nous considérons excrétions excessives, agitation ou immobilisation au-delà de 24 heures. Un animal qui manifeste des signes de détresse au-delà de ces 24 heures sera sorti de l’expérimentation.

Choix des espèces

Ce projet s’intègre dans le programme de recherche de l’equipe. Il utilisera l’animal modèle de l’unité : la chèvre laitière Chèvres en lactation

12 porcs Landrace d'environ 28 kg vont être utilisés, et chacun subit en quatorze jours trois anesthésies générales, une laparotomie avec création de stomies sur l'intestin, sept prises de sang, trois IRM, trois biopsies et la pose d'un dispositif médical changé toutes les 72 heures sous sédation. Ces procédures impliquent un niveau de souffrance modéré, et tous les porcs sont tués à J14, après la dernière IRM. Le porteur écrit que chaque porc "sera nutritionnellement affaibli par la mise en stomie puis bénéficiera de notre dispositif", ce qui fait de lui son propre témoin. Le but est de lever "les derniers risques" d'un appareil de réinstillation du chyme destiné aux patients porteurs d'une double entérostomie, avant une demande d'essai clinique puis la mise sur le marché.

Objectifs

L’objectif du projet est d’évaluer la sécurité et l’efficacité d’un nouveau dispositif médical intestinal. Cette étude sur le gros animal permettra de lever les derniers risques liés au dispositif et de confirmer son fonctionnement en conditions physiologiques. Les performances de l’appareil seront objectivées par l’évaluation des bénéfices nutritionnels et l’étude de la morphologie intestinale. Les conclusions de cet essai permettront également d’optimiser l’appareil afin de proposer aux patients un produit fini, sécurisé et adapté à leurs besoins.

Bénéfices attendus

Cet essai nous permettra de confirmer les bénéfices nutritionnels de la réinstillation sur un gros animal. Des données microscopiques (Biopsies intestinales) et macroscopiques (poids, selles, prise de sang) seront collectées afin d'observer le changement morphologique de la muqueuse intestinale et l'évolution d'état nutritionnel de l'animal. Nous confirmerons que l'hypothèse de la réinstillation est efficace pour corriger l'insuffisance intestinale en augmentant la capacité d'absorption intestinale. Cet essai sera également une opportunité de confirmer la tenue du dispositif médical en conditions physiologiques ainsi que ses performances.

Procédures

Tous les animaux subiront : - 3 anesthésies générales (J0, J7, J14) - La pose d’un cathéter lors du premier bloc opératoire (J0) - Prélèvements sanguins (7 prélèvements : J0, J2, J4, J7, J10, J12, J14) - 1 laparotomie avec mise en stomie et création d’une jéjunostomie d’alimentation (J0) qui resteront en place pendant tout l’essai -1 radiographie d’opacification (J7) -Pose du DM sous anesthésie générale (J7) et changement sous sédation -3 IRM (J0, J7, J14) -3 biopsies, pendant l'opération sous Anasthésie Genérale (J0, J7, J14)

Impact sur les animaux

Les effets indésirables correspondent aux points limites nécessitant l’euthanasie de l’animal, c’est-à-dire : L’observation simultanée de 3 points limites, qui persisteraient au-delà des 2 jours suivant l’intervention du vétérinaire ou du chirurgien. La présence d’une blessure OU d’une stomie bouchée, enflammée, gonflée OU un saignement au niveau de la muqueuse OU une température corporelle élevée qui persisterait au-delà des 2 jours suivant l’intervention du vétérinaire ou du chirurgien. Une respiration pénible nécessitant l’euthanasie immédiate de l’animal.

Devenir

Les procédures 1 et 3 seront réalisées dans le même temps opératoire. A l’issu de l’intervention, l’animal sera gardé en vie. La simulation du grêle court d’amont impose de maintenir l’animal en vie tout au long de l’expérience. Les procédures 4 et 5 regroupent la pose du DM et le changement toutes les 72h. L’animal doit rester en vie tout au long de la pose du DM afin d’observer l’évolution des différents paramètres nutritionnels, physiologiques et morphologiques. L’animal sera euthanasié à l’issu de la dernière IRM de masse graisseuse réalisée à J14 avant sacrifice (procédure 2).

Remplacement

Ce nouveau dispositif propose une nouvelle prise en charge thérapeutique qui doit être scrupuleusement validée. La mise à disposition d’une nouvelle technologie impose de rassembler des données pré-cliniques solides en termes de sécurité et de performances, notamment en vue d’une demande d’autorisation d’essai clinique sur l’Homme puis la mise sur marché. Ainsi, il est essentiel de réaliser des essais sur l’animal afin de valider le fonctionnement du dispositif en conditions physiopathologiques.

Réduction

Depuis le début du projet, aucun animal n’a été utilisé. Pour réduire le nombre d’animaux, nous avons réalisé un ensemble de tests sur banc d’essai (mannequin en plastique avec fabrication artisanale d’un système digestif). Aussi l’animal sera son propre témoin. Il sera nutritionnellement affaibli par la mise en stomie puis bénéficiera de notre dispositif. Les résultats obtenus dans les deux situations seront comparés. Cette stratégie nous évitera de construire un groupe témoin et un groupe de test. Enfin, nous reproduirons scrupuleusement les conditions d’un intestin interrompu avec carences nutritionnelles partielles selon un modèle déjà validé et publié par une équipe de chercheurs allemands. La mise en œuvre de ce protocole nous évitera une étape de validation préalable sur un modèle animal.

Raffinement

Une période d’acclimatation de 11 jours est prévue à l’arrivée du porc afin de réduire le stress de l’animal. En postopératoire, le porc sera extubé dès lors qu’il aura commencé à respirer spontanément. Les étapes chirurgicales seront réalisées sous lampe chauffante. Le porc sera ramené dans la cage lorsque la température corporelle physiologique sera atteinte (39–39.5°C). Les animaux auront un accès immédiat à l’eau et à la nourriture dès le premier jour postopératoire. Une voie veineuse centrale sera conservée en postopératoire à des fins de prélèvements sanguins. Pour éviter d'endommager le cathéter central, les animaux seront gardés dans des cages séparées, dans la même pièce. La voie centrale sera protégée par un pansement pour éviter toute blessure de l’animal. L'ensemble des procédures sera fait par du personnel formé, les animaux traités avec soin (traitement de la douleur lors du suivi, anesthésie) et dans un hébergement répondant à leurs besoins physiologiques (température, cycle de lumière 12h-12h, ...) et éthologiques (enrichissements, dimension des boxes...).

Choix des espèces

Pour une approche de recherche ciblée et spécifique d'un syndrôme de grêle court d'amont, un modèle animal approprié est nécessaire. Nous considérons les avantages et les inconvénients de chaque modèle afin de sélectionner le modèle le plus adapté. A cet effet, à la fois un petit modèle animal, tel que le rat, ou un grand modèle animal, tel que le porc, conviendraient. Nous considérons également la taille de notre dispositif. Les porcs ont de nombreuses similitudes anatomiques et physiologiques avec les humains. Le modèle porcin constitue le modèle expérimental le plus approprié pour la recherche sur le syndrôme du grêle court d'amont et utile pour tester l’efficacité et la sécurité de ce dispositif destiné à l’utilisation humaine. Ainsi, des porcs Landrace pédiatriques pesant environ 28-29 kg seront utilisés pour la réalisation de ce projet.