Primates

Tous tués à l'issue pour que leurs yeux soient prélevés et analysés, 9 ouistitis vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacun subit une injection de vecteur lentiviral sous la rétine, sur un œil ou sur les deux, puis quatre à seize séances d'anesthésie de une à quatre heures, espacées de une à deux semaines. Le porteur indique que l'injection devrait provoquer un léger traumatisme de l'œil et peut entraîner une hémorragie localisée, et que des effets plus graves, décollement rétinien ou endophtalmie, peuvent être attendus, avec douleur, photophobie, hausse de la pression intraoculaire et baisse de l'acuité visuelle. Il écrit s'entraîner à l'injection sur des ouistitis mis à mort dans d'autres projets, et affirme qu'aucun dispositif in vitro ne reproduit la fovéa et la macula, structures absentes chez les rongeurs.

Objectifs

Les dystrophies rétiniennes génétiques sont des maladies des yeux qui font perdre la vue précocement et ont un impact socio-économique important. La thérapie génique est la solution la plus prometteuse pour soigner ces maladies. Elle consiste à remplacer un gène défectueux par un nouveau gène. Pour cela, on utilise un « vecteur » qui transporte le nouveau gène jusqu'aux cellules de la rétine. L'objectif de cette étude est de tester un nouveau type de vecteur pour améliorer l’efficacité de la thérapie génique de la rétine. Actuellement, il n'y a qu'une thérapie génique pour une maladie des yeux concernant un gène unique (nommé « RPE65 »). Mais il n’est pas possible d’utiliser cette thérapie pour toutes les maladies des yeux d'origine génétique, car les méthodes actuelles ne peuvent pas manipuler des gènes de trop grande taille. La technologie utilisée ici permet de transférer des gènes de toute taille, et serait donc applicable à toutes les maladies rétiniennes. Le gène qui sera utilisé dans cette expérience est de grande taille et ses mutations sont responsables de la plus fréquente maladie génétique de la rétine : la maladie de Stargardt. Des essais cliniques sont en cours concernant cette maladie, cependant les vecteurs utilisés sont inefficaces. Notre projet vise donc à utiliser une nouvelle technologie pour augmenter significativement l’efficacité de la thérapie. Des tests sur la souris avec ce vecteur ont montré une augmentation d’efficacité de ~5 % à ~90 % dans les photorécepteurs, comparé aux thérapies géniques préexistantes. Nous voulons maintenant vérifier si le système fonctionne de la même manière chez les primates non-humain. Nous allons d'abord regarder le taux d’intégration du gène dans les cellules de la rétine, puis nous vérifierons si le fonctionnement de la rétine est modifié après l’intervention.

Bénéfices attendus

Si les résultats obtenus sur les primates non humains sont aussi concluants que ceux observés sur les souris, cela pourrait représenter une avancée majeure pour l’utilisation de ce vecteur chez l’homme, notamment pour les mutations du gène testé dans cette étude, mais aussi pour d’autres gènes responsables des maladies rétiniennes génétiques. Les vecteurs classiquement utilisés, appelés adenoassociated virus (AAV) sont couramment utilisés pour cibler la rétine en raison de leur affinité naturelle pour l'œil. Toutefois, un inconvénient majeur des AAV réside dans leur capacité de charge limitée (taille du matériel génétique), ce qui restreint leur application aux gènes de petite taille. Cette contrainte empêche le développement de traitements pour les nombreuses maladies rétiniennes génétiques causées par des gènes volumineux. Les vecteurs lentiviraux (lentivirus, LV), en raison de leur capacité de charge nettement plus grande, représentent une solution prometteuse. Un autre avantage des lentivirus réside dans la faible réaction inflammatoire qu’ils induisent. Ainsi, ils constituent une option prometteuse pour les thérapies géniques rétiniennes, surmontant les limitations des AAV et offrant de nouvelles perspectives pour traiter de nombreuses maladies rétiniennes génétiques.

Procédures

1 intervention pour des injections sous-rétiniennes de 1 à 4 heures, 4 à 16 sessions d'anesthésie de 1 à 4 heures: il s'agira donc d'anesthésies répétées à 1-2 semaines d'intervalles.

Impact sur les animaux

Le gène lié à cette étude code pour une protéine qui intervient dans le transport de dérivés de la vitamine A au travers la rétine. Une surexpression temporaire de cette protéine chez un animal sain ne causera donc aucun phénotype dommageable mais cette protéine non native pourrait créer une réponse immunitaire inflammatoire. L'injection sous-rétinienne sera effectuée par un chirurgien ophtalmologue. Elle devrait provoquer un léger traumatisme localisé de l'œil, potentiellement une hémorragie localisée. Des effets indésirables plus graves, tels qu’un décollement rétinien ou une endophtalmie, peuvent être attendus, entraînant douleur, photophobie, rougeur, augmentation de la pression intraoculaire et une baisse de l'acuité visuelle. Réponse inflammatoire au vecteur viral : ils sont connus pour déclencher une réponse immune innée et adaptative. Une inflammation locale peut être attendue, généralement transitoire entre ~24-72 heures après la dose. Les signes cliniques sont l'infiltration cellulaire dans la chambre antérieure ou postérieure, la rougeur ou le gonflement autour de l'œil, des larmoiements excessifs, une fermeture persistante des yeux, une difficulté avec les mouvements oculaires et une augmentation de la pression intraoculaire. Réponse inflammatoire au transgène : L'expression du gène d'intérêt est attendue environ 2 à 3 semaines après l'administration. Cette expression pourrait entraîner une réponse immunitaire anti-transgène. Notre vecteur codera pour le gène natif du tamarin. La production de la protéine transgénique pourrait entraîner une inflammation locale. Les signes cliniques typiques sont l'infiltration cellulaire dans la chambre antérieure ou postérieure, la rougeur ou le gonflement autour de l'œil, des larmoiements excessifs, la fermeture des yeux, des difficultés avec les mouvements oculaires (de façon similaire à la réponse immunitaire au vecteur viral). Enfin il nous faut mentionner le stress lié à la préhension et aux anesthésies répétées que subiront les animaux.

Devenir

Pour la seule procédure, tous les animaux seront euthanasiés à la fin car les yeux doivent être extraits pour l'analyse physiopathologique.

Remplacement

Les aspects de la technologie qui ne nécessitent pas de modèles de primates non-humains (PNH) in vivo ont été développés à l'aide de méthodes in vitro (organoïdes rétiniens humains) et testés par administration chez la souris. Cependant, il n'existe actuellement aucun modèle in vitro capable de simuler l'impact de l'efficacité de la transduction sur l'architecture de l'œil, les mécanismes d'élimination de cette voie d'administration, et la réponse immune innée et adaptative au vecteur. En particulier, la technologie vise à traiter des maladies rétiniennes affectant la fovéa et la macula, des structures oculaires qui ne peuvent pas être modélisées avec précision chez d'autres espèces (sans fovéa, ex : les rongeurs). C'est pourquoi les vecteurs doivent encore être évalués pour leur efficacité et leur sécurité dans des modèles animaux de grande taille avant d'être testés chez des patients humains.

Réduction

Des données préliminaires obtenues sur des organoïdes rétiniens et dans des modèles murins permettent de réduire le nombre d'animaux nécessaires pour obtenir la preuve du concept chez le ouistiti. Les doses utilisées par animal seront étalées de façon à permettre une analyse intermédiaire du tropisme du vecteur. Si la transduction du vecteur s'avère moins variable que prévu, cela pourrait permettre de réduire le nombre d'animaux nécessaires pour atteindre les objectifs de cette étude. Toutefois, ces injections n'ayant jamais été testées chez les primates non humains, un risque de perte animale et/ou de problèmes liés à l'injection est à prévoir. Pour quantifier les conséquences de l’administration du composé sur le bien-être animal, nous commencerons par injecter un œil à la plus faible dose du protocole à un premier animal. Trois doses seront ensuite testées sur les deux yeux de groupes de deux animaux (n = 6). Nous estimons les risques de sortir du protocole à 20 %, ce qui correspond à 7 animaux, soit 8,4 animaux au total, arrondi à la hausse pour tenir compte de la marge d'erreur. Pour limiter encore ce nombre, nous nous entraînerons à l’injection sur des animaux mis à mort dans le cadre d'autres projets. L’approche statistique consistera à comparer, sur des tranches histologiques, le nombre de photorécepteurs présentant le transgène, en comparant « œil sain vs œil injecté » sur le premier animal, puis à comparer ce nombre en fonction des deux constructions virales chez les animaux injectés bilatéralement, et ceci en fonction des trois doses utilisées sur des groupes de deux animaux. Dans ce contexte, une simple analyse de variance permettra d’évaluer la significativité de l’augmentation de la transduction. À noter que si les premières doses s’avèrent efficaces pour prouver l’amélioration de la transduction (> 80 %), les animaux des doses supérieures ne seront pas utilisés.

Raffinement

Les doses du vecteur ont été adaptées à partir de doses bien tolérées chez d'autres modèles mammifères (souris et rats) et ne dépasseront pas celles bien tolérées lors des essais cliniques chez l’homme. Des méthodes de dosage cliniques modifiées seront utilisées pour l'administration du vecteur. Pour l’administration, la vitrectomie sera évitée afin de minimiser le risque de traumatisme rétinien. Des médicaments pour réduire la réponse immunitaire et soulager la douleur seront donnés avant, pendant et après la chirurgie afin de minimiser les risques d'inflammation et de douleur. L'administration sous-rétinienne, réalisée par un chirurgien ophtalmologue, minimise considérablement la bio-distribution du vecteur et limite la probabilité de déclencher une forte réponse immunitaire. Cette réponse ne devrait pas causer de douleur ou de détresse et se résorbera en quelques jour. La protéine générée par le transgène administré ne sera pas secrétée par les cellules rétiniennes et restera liée à la membrane interne des cellules. Ces caractéristiques devraient minimiser le risque de réponse anti-transgène. Le dosage des animaux individuels sera étalé pour surveiller les événements indésirables liés au vecteur ou au transgène, permettant ainsi des modifications des protocoles, des procédures ou des doses si besoin et si ces changements ne modifient pas les objectifs scientifiques de l'étude. En particulier, avant de l’appliquer à tous les animaux, un premier animal sera injecté sur un seul œil pour vérifier par une observation (photophobie, œil fermé, position prostré) et/ou auscultation (œil rouge et inflammé) quotidienne que le protocole ne génère pas d’impact sur le bien-être de l’animal. En cas contraire, qui reste peu probable compte tenu des mesures déjà prises, nous ajusterons la dose pour les prochains et continueront ainsi animal par animal jusqu’à trouver la bonne dose. Cette approche minimisera la douleur ou les dommages potentiels. Tous les tests ophtalmologiques et de santé seront réalisés sous anesthésie afin d'éviter le stress que cela provoquerait si l'on les réalisait à l'état éveillé. Les procédures de surveillance réalisées sous anesthésie seront exécutées de manière séquentielle pour minimiser le nombre total d'inductions requises. Les animaux seront logés par paires dans des volières adaptées enrichies de divers éléments (hamacs, tunnels, nids suspendus, perchoirs, etc.).

Choix des espèces

L'objectif principal de l'étude est d'examiner l'efficacité de transduction d'un nouveau système vectoriel destiné à des applications cliniques en thérapie génique. L'efficacité prédite de la transduction déterminera la probabilité que

Trois macaques à longue queue vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacun reçoit un anticorps anticancéreux par perfusion intraveineuse de trente minutes, placé sur une chaise de contention pendant environ quarante minutes. Les trois subissent quatorze prélèvements sanguins totalisant 53 ml en quatre semaines, et les deux qui poursuivent la seconde phase dix-huit de plus, pour 65 ml en cinq semaines. Deux seront tués pour le prélèvement de leurs organes, le troisième gardé en vie et réutilisable après accord du vétérinaire. L'objet immédiat de l'étude est d'affiner les doses et les protocoles d'études réglementaires ultérieures, elles aussi menées sur des primates.

Objectifs

Ce projet vise à évaluer les effets biologiques ainsi que le devenir dans l’organisme d’un anticorps développé pour cibler et éliminer les cellules tumorales dans le cadre du développement d’un futur traitement anticancéreux destiné à l’homme. Cet anticorps sera administré par voie intraveineuse chez le macaque en administration unique à trois doses distinctes (phase 1) puis selon un schéma d’administrations répétées (cinq injections) à deux niveaux de dose (phase 2). La selection des deux doses pour les administrations répétées sera basée sur les résultats des adminsitrations uniques. Cette étude permettra d’identifier les doses et les modalités d’administration les plus adaptées en vue de la réalisation de futures études à plus grande echelle et réglementaires. Ce projet constitue donc une étape importante et indispensable dans le processus de développement et de sélection des doses du candidat médicament.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus du projet sont, à terme, la validation et la mise sur le marché d’un nouvel anticorps capable de créer une thérapie anticancéreuse ciblée et puissante. Cette étude génèrera des données scientifiques qui permettront d’affiner les protocoles des études à plus grandes echelles puis des études règlementaires sur le primate. Ainsi les connaissances acquises permettront de sélectionner la meilleure dose et le meilleur schéma d’administration mais aussi d’adapter les méthodes de suivi et de raffinement spécifiques aux primates.

Procédures

Trois animaux réaliseront la phase 1 et à l’issue de cette phase, deux animaux continueront vers la phase 2 Les animaux vigiles recevront un candidat médicament par voie intra-veineuse de façon unique à différentes dose (faible, moyenne, haute) lors de la première phase puis deux doses seront selectionnées pour poursuivre les administrations répétées (x5) pour la seconde phase. L’injection durera 30 minutes et la contention sur chaise durera environ 40 minutes. Pour la seconde phase, es animaux bénéficieront d’une période de repos d’une semaine entre les administrations. Les animaux auront également 14 prélèvements de 1 à 5 ml, pour une volume total prélevé de 53 ml sur 4 semaines en phase 1 et 18 prélèvements de 1 à 8,5ml, pour une volume total prélevé de 65 ml sur 5 semaines en phase 2. Les animaux seront vigiles mais une sédation sera envisagée en cas de besoin. Chaque prélèvement dure entre 3 à 15 minutes (contention et prélèvement compris) Le suivi des paramètres physiologiques (poids et température corporelle) tout au long du projet nécessitera une contention d’environ 5 minutes. Pour le confort des animaux, certains prélèvements et suivis pourront être réalisés simultanément (ce qui diminuera le nombre de manipulations et de contentions). Des points limites précoces ont été déterminés afin de prendre en charge toute forme de douleur ou de souffrance. En cas d’atteinte d’un de ces points, l’animal concerné sera pris en charge selon les recommandations du vétérinaire.

Impact sur les animaux

Sur la base du mode d’action des anticorps et de leur potentielle cible sur les cellules de l'immunité, une réaction de type fièvre peut apparaître les jours suivant les administrations liées à un relargage de cytokines. La réalisation de prélèvements sanguins et les administrations par voie intraveineuse pourront également provoquer un stress, une douleur légère et/ou l’apparition de réactions locales (du type hématome ou œdème léger par exemple) au niveau de la zone de ponction ou d’injection. Durant les administrations, les animaux seront placés sur des chaises à contention ce qui a pour conséquence de réduire leurs mouvements.

Devenir

Deux doses seront sélectionnées en fin de procédure 1 pour être évaluée dans la procédure 2 (sur 2 animaux). L’animal non utilisé pour la procédure 2 sera gardé en vie et pourra être réutilisé (après accord du vétérinaire). En fin de procédure 2, tous les animaux seront mis à mort à la fin du projet dans le but de récolter les organes et d’évaluer la toxicité du candidat médicament.

Remplacement

Les études de pharmacocinétique et de toxicité chez l’animal sont indispensables au développement de nouvelles molécules pharmaceutiques. En effet, celles-ci permettent de déterminer la biodisponibilité des candidats médicaments et permettent d’affiner la connaissance de l’effet principal et des effets indésirables éventuels. Les modèles animaux permettent dans ce cas d'objectiver l'apparition des signes cliniques et donc de mettre en évidence une éventuelle toxicité de la molécule en test. Actuellement, aucune méthode alternative à l'utilisation des animaux n'est susceptible d'apporter le même niveau d'information qu'un organisme vivant entier et complexe dans ce projet.

Réduction

Le nombre estimé d'animaux utilisés dans ce projet a été défini à 3 primates répartis en 3 lots de 1. Il a été réduit au minimum. La période de washout (periode d'elimination de l'organisme du candidat médicament) entre les deux phases permet de réutiliser 2 animaux pour l’évaluation des doses répétées ce qui permet de réduire le nombre d’animaux.

Raffinement

Afin d'optimiser leur bien-être et de leur permettre d'exprimer leurs besoins comportementaux, les animaux sont hébergés en groupes sociaux de même sexe. De l'eau fraîche ad libitum est mise à leur disposition et un aliment adapté à l'espèce et au poids de chaque individu est distribué quotidiennement. Les paramètres environnementaux de l'animalerie sont également suivis et contrôlés afin de répondre aux exigences physiologiques de l’espèce. En parallèle, un programme d'enrichissement complet est mis en place au sein de l'animalerie. Ce dernier comprend : - Des enrichissements structuraux permettant aux PNH d'évoluer dans un environnement tridimensionnel ; - De la litière pour leur permettre de fourrager ; - Des jouets variés faisant l'objet d'une rotation une fois par semaine pour éviter que les animaux ne se lassent ; - Des friandises et des fruits et légumes frais distribués quotidiennement ; - De la musique d'ambiance est diffusée pendant la journée à un volume raisonnable dans le but de réduire le stress en couvrant le bruit causé par les activités du personnel dans les salles adjacentes et en habituant les animaux à la voix humaine. Une période d'acclimatation sera mise en place avant le début de l’étude. Un programme d'habituation à l'Homme et de conditionnement aux actes techniques associés à du renforcement positif permettra de réduire le stress des animaux lié aux manipulations (prise de sang, de température rectale, chaise à contention). Les animaux seront suivis individuellement et bi-quotidiennement tout au long de l'étude pour détecter tout signe de stress ou de douleur. De même, le personnel veillera à garder une interaction quotidienne avec chaque animal afin de diminuer le stress qui pourrait être engendré par les manipulations. Les temps de repos accordés aux animaux entre les prélèvements et les volumes prélevés respecteront les recommandations éthiques en vigueur. Des mesures préventives et correctives de diminution de la douleur et du stress ont été déterminées au préalable sans compromettre les objectifs scientifiques de l’étude. Durant les administrations, les animaux seront assis sur des chaises à contention. Pour limiter leur stress et l’ennui, un personnel formé veillera à interagir avec les animaux, leur distribuer des friandises ou encore leur projeter un documentaire/dessin animé sur une tablette électronique. Des points limites précoces et spécifiques ont été définis et seront utilisés en cas de besoin.

Choix des espèces

La molécule d’intérêt étudiée dans ce projet étant à visée humaine, il est important d'avoir recours à un modèle animal pertinent et prédictif. En raison de sa proximité phylogénétique et physiologique avec l'Homme, notamment en ce qui concerne les populations de lymphocytes T γδ et l'expression des cibles impliquées dans le mécanisme d'action du candidat médicament, le macaque a été retenu dans le cadre de ce projet. L’anticorps cible des récepteurs présents chez le macaque mais absents ou très différentes chez les rongeurs. En effet les rongeurs ne possèdent pas de système γδ comparable à celui de l'Homme. Des jeunes adultes seront utilisés dans ce projet car certaines études montrent que les animaux matures (>4,5ans) sont statistiquement plus sujet aux anomalies liées au vieillissement pouvant affecter la qualité des échantillons prélevés et notamment les analyses histologiques.

Treize écouvillonnages du nez et de la trachée, cinq lavages des bronches, deux ponctions de moelle osseuse et jusqu'à six prises de sang par semaine : 246 macaques à longue queue vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. 216 d'entre eux sont infectés par la grippe puis par un pneumocoque et seront tués pour analyse des tissus, les 30 autres pouvant être réutilisés dans d'autres études après récupération et avis vétérinaire. Le porteur décrit une ponction lombaire par macaque, pouvant provoquer un hématome sous-cutané et aller jusqu'à l'hémorragie intrarachidienne ou intramédullaire, et un hébergement individuel pendant la phase d'infection. Le choix de cette espèce tient, selon lui, à la proximité génétique et physiologique avec l'être humain, à un appareil respiratoire de structure et de dimensions voisines et à un système immunitaire qui réagit de façon similaire.

Objectifs

La grippe constitue un enjeu majeur de santé publique. Des complications sévères peuvent survenir notamment lorsque l’infection par le virus de la grippe est suivie d’une infection bactérienne, appelée « surinfection ». Dans ce cas, les défenses naturelles des poumons sont affaiblies par le virus, ce qui permet à certaines bactéries opportunistes de s’installer plus facilement et d’aggraver la maladie. L’une des bactéries les plus souvent impliquées est Streptococcus pneumoniae, responsable notamment de pneumonies. Les surinfections bactériennes surviennent le plus souvent chez les personnes les plus fragiles, comme celles hospitalisées pour une grippe sévère, les patients en réanimation ou ceux ayant déjà d’autres problèmes de santé. Dans ces situations, la combinaison du virus et des bactéries peut entraîner des formes graves de maladie, avec un risque accru de complications voire de décès. Ce projet cherche à réduire ces complications. L’objectif est d’évaluer la sécurité et l’efficacité de nouveaux traitements limitant la gravité de la maladie lorsque virus et bactéries sont présents en même temps.

Bénéfices attendus

Aujourd’hui, certaines bactéries, comme Streptococcus pneumoniae, deviennent de plus en plus difficiles à traiter, car elles résistent aux antibiotiques habituellement utilisés, ce qui rend les infections plus difficiles à traiter. Ce projet vise à évaluer de nouveaux traitements innovants pour lutter contre les infections à Streptococcus pneumoniae. Les résultats, obtenus dans un modèle animal proche de l’humain, fourniront des connaissances essentielles pour mieux comprendre ces infections et développer de nouveaux traitements. Ils permettront également de proposer des solutions plus efficaces aux patients et d’améliorer globalement leur prise en charge. Ce projet pourrait contribuer à mieux protéger la santé humaine face à un problème de plus en plus préoccupant à l’échelle mondiale : la résistance aux antibiotiques.

Procédures

Les interventions prévues dans ce projet seront réalisées sous anesthésie générale et seront regroupés pour limiter les anesthésies (1 à 7x par semaine, 246 animaux, 30-45 minutes) : Prélèvements : - Prélèvements sanguins (1 à 6 10 fois par semaine, 246 animaux, 5 minutes). - Ecouvillonnages nasaux et trachéaux (13 fois, 246 animaux, 2 minutes) - Retrait de ganglions lymphatiques, (2 fois maximum, 216 animaux, 20 minutes) - Lavage broncho-alvéolaire (5 fois, 246 animaux, 10 minutes) - Ponction lombaire (1 fois, 216 animaux, 20min) - Moëlle osseuse (2 fois, 246 animaux, 10 minutes) Interventions - Implantation d’une puce de suivi de température (1 fois, 246 animaux, 30 minutes) - Infection par voie respiratoire, (2 fois, 216 animaux, 30 min) - Imagerie in vivo (5 fois, 246 animaux, 45 minutes) - Traitements avec des molécules thérapeutiques (jusqu’à 6 fois, 120 animaux, 5 minutes)

Impact sur les animaux

Les prélèvements et anesthésies répétés peuvent engendrer une perte d’appétit avec plus ou moins de perte de poids mineure, un hématome au niveau du site du prélèvement ou uneinfection au niveau du site de prélèvement dans les jours qui suivent le prélèvement. Après traitement, une réaction locale, des démangeaisons/douleurs dans les heures/jours suivant peuvent apparaitre. L’infection grippale peut causer de la fièvre, de la toux et un encombrement bronchique. Ces symptômes peuvent être augmentés par la surinfection par pneumocoque. L’état des animaux sera observé tous les jours et des points limites sont prévus dans le projet en cas de progression de la maladie ou d’éventuels effets inattendus du traitement. L’implantation de puces de télémétrie peut créer une réaction locale au site d’incision : gonflement, suintement de la plaie (rare), démangeaisons Les lavages bronchoalvéolaires, peuvent provoquer une toux, ou des difficultés respiratoires légères juste après le geste Les écouvillonnages nasotrachéaux peuvent provoquer un saignement nasal (léger à modéré) Le retrait de ganglions peut engendrer une réaction locale au site d’incision : gonflement, suintement de la plaie rare, durée de 1 à 5 jours l’hébergement individuel peut entrainer un stress ou de l’ennui. La ponction lombaire peut amener à un hématome sous-cutané, pouvant aller jusqu’à l’hémorragie intrarachidienne ou intramédullaire.

Devenir

Tous les animaux infectés seront euthanasiés afin de réaliser des dosages et une analyse des tissus. Les autres animaux pourront être inclus dans d’autres études après récupération complète des animaux et sur avis favorable du vétérinaire.

Remplacement

Ce projet a pour objectif d’évaluer la sécurité et l’efficacité de nouvelles stratégies de traitements contre des infections respiratoires complexes associant le virus de la grippe et Streptococcus pneumoniae. À ce jour, les méthodes alternatives telles que les études menées sur des cellules en laboratoire (approches in vitro), sur des modèles informatiques (in silico), ou encore sur des tissus isolés (ex vivo) ne permettent pas de reproduire toute la complexité anatomique du poumon humain, notamment les interactions entre les différents types de cellules et tissus, et le fonctionnement du système immunitaire dans son ensemble. C’est pourquoi, malgré les efforts pour privilégier ces alternatives, l’utilisation de modèles animaux reste nécessaire pour atteindre les objectifs du projet. Ce modèle animal permet de reproduire la complexité de l’ensemble des mécanismes biologiques impliqués dans cette double infection et d’évaluer de façon fiable la sécurité et l’efficacité de nouveaux traitements avant toute application chez l’humain.

Réduction

Dans ce projet, plusieurs mesures sont mises en place pour utiliser le moins d’animaux possible tout en garantissant des résultats fiables. Les premières étapes du projet serviront à ajuster les conditions d’infection les plus pertinentes (par exemple la quantité de bactérie utilisée) afin de reproduire de façon la plus fiable les symptômes observés chez l’humain sans multiplier les essais et selon un procédé, étape par étape, déjà publié dans la littérature scientifique. Pour affiner les paramètres importants comme la sécurité, la dose ou la manière d’administrer les traitements, seuls de petits groupes d’animaux seront utilisés. Cela permettra de sélectionner les meilleures conditions avant de passer à des études d’efficacité. Enfin, pour les études d’efficacité, le nombre d’animaux par groupe est strictement limité au minimum nécessaire pour obtenir des résultats solides et interprétables. Ce nombre a été déterminé de façon à pouvoir détecter de réelles différences entre les groupes tout en évitant d’utiliser plus d’animaux que nécessaire.

Raffinement

Les prélèvements et interventions sur les animaux sont réduits au minimum nécessaire pour répondre aux objectifs du projet. Ils seront effectués sous anesthésie générale pour éviter le stress et d’éventuelles douleurs et seront regroupés au maximum lors d’une même anesthésie afin de réduire le nombre d’anesthésies. Les anesthésies pouvant entrainer une diminution de l’appétit, une diversification et complémentation de l’alimentation sera instaurée au besoin. L’état général des animaux sera observé quotidiennement. À chaque intervention, l’état de santé des animaux sera évalué à l’aide d’une grille d’observation. Si des signes de maladie apparaissent, le vétérinaire sera immédiatement prévenu afin d’adapter le suivi et les soins. Le recours à des médicaments anti-douleur pourra être envisagé si nécessaire. Les points limites seront raffinés en fonction des résultats obtenus au cours de la mise en place du modèle. Les prélèvements de sang et les biopsies pouvant entrainer l’apparition d’une réaction locale, un traitement symptomatique pourra être mis en place (désinfection, analgésie locale). Pour limiter l’irritation de la trachée liée à l’intubation lors du lavage pulmonaire, un spray anesthésique sera appliqué localement en amont de la manipulation. L’implantation de puces électroniques, permettant un suivi régulier de la température corporelle, peut induire une réaction au site d’incision. Un signalement au vétérinaire sera effectué qui pourra appliquer un traitement symptomatique (désinfection, analgésie locale). Un traitement analgésique sera appliqué avant la chirurgie. Les animaux seront hébergés en groupes avant infection et en hébergements individuels proches permettant des interactions sociales pendant la phase d’infection (conservation du contact sensoriel, et hébergements face à face séparés par 2 m). Le programme d’enrichissement sera étendu par ajout de dispositifs alimentaires, jouets, renforcement du contact positif. Cet hébergement individuel est nécessaire pour éviter les biais lors de l’évaluation de la température mesurée par puce électronique, pour éviter une contamination croisée et limiter le stress lié à la cohabitation d’animaux développant la maladie

Choix des espèces

Dans ce projet, le modèle primate non-humain est choisi pour sa proximité génétique, et physiologique avec l'être humain, ce qui en fait le modèle le plus pertinent pour l’évaluation de traitements. Son appareil respiratoire ressemble beaucoup à celui de l’être humain, aussi bien par sa structure que par ses dimensions. Son système immunitaire réagit de manière similaire, avec une sensibilité aux mêmes types d’infections. De plus, les techniques et outils d’exploration de la réponse immunitaire sont disponibles et maitrisés chez cette espèce. Ces études seront réalisées sur des animaux adultes. Le traitement à tester étant destiné principalement à la population adulte et le système immunitaire évoluant en fonction du stade de développement et de l’âge des individus, des animaux au système immunitaire mature seront donc utilisés dans ce projet.

Chacune des 96 femelles macaques à longue queue utilisées est anesthésiée une quarantaine de fois, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. S'y ajoutent, par macaque, une infection vaginale par Chlamydia trachomatis, une à six injections de vaccin ou de placebo, l'implantation d'une puce de télémétrie, une quarantaine de prélèvements de sang, une trentaine d'écouvillonnages vaginaux, quinze biopsies vaginales et sept biopsies ganglionnaires. Le porteur attend des diarrhées, un amaigrissement, une cervicite avec écoulement purulent, une anémie transitoire et des infections cutanées aux sites de prélèvement, et prévoit des phases d'hébergement individuel dont il reconnaît qu'elles peuvent provoquer stress et ennui. Cinquante-deux macaques seront tuées pour analyse des organes cibles de l'infection, les quarante-quatre autres gardées en vie et réutilisées après vérification de leur état sanitaire par le vétérinaire.

Objectifs

Ce projet vise à mieux comprendre une infection sexuellement transmissible fréquente causée par la bactérie Chlamydia trachomatis, et à tester de nouvelles stratégies de vaccination pour essayer de la prévenir. Cette infection est très répandue dans le monde. Elle passe souvent inaperçue, en particulier chez les femmes, car elle ne provoque pas toujours de symptômes. Pourtant, elle peut avoir des conséquences graves, notamment sur la fertilité, en augmentant le risque de douleurs chroniques, de grossesse extra-utérine ou d’infertilité. Les traitements antibiotiques permettent de soigner l’infection, mais ils ne suffisent pas toujours à empêcher la propagation de l’infection dans la population ni à éviter certaines complications. Le développement d’un vaccin pourrait donc représenter un progrès important pour la santé publique. Le projet a pour objectif de mieux comprendre la manière dont cette infection se développe dans l’organisme et d’évaluer de nouveaux vaccins potentiels. Les nouveaux modèles d’infection développés dans ce projet permettront d’étudier une situation plus proche de celle observée chez l’être humain. Les candidats vaccins ayant montré des résultats satisfaisants chez le primate non humain pourront ensuite faire l’objet d’évaluations complémentaires en vue d’un possible développement clinique chez l’être humain. À plus long terme, ces travaux pourraient contribuer au développement de nouvelles approches de prévention pour réduire les conséquences de cette infection dans la population.

Bénéfices attendus

Le modèle d’infection développé dans ce projet aidera à mieux comprendre comment la bactérie Chlamydia trachomatis infecte l’organisme et s’y développe. Il permettra de disposer d’un outil proche de ce qui se passe chez l’être humain pour tester de futurs vaccins. Les candidats vaccins les plus prometteurs, après des résultats encourageants chez l’animal évalué au cours de ce projet, pourraient ensuite être utilisés chez l’être humain. À plus long terme, ces recherches pourraient contribuer à développer de nouvelles méthodes de prévention contre cette infection, avec pour objectif de réduire ses effets sur la santé publique

Procédures

Les interventions seront réalisées sous anesthésie générale (40 fois environ , entre 5 et 30 minutes sur tous les animaux) Les différentes interventions dans ce projet sont : - Injection des vaccins ou placebo (1 à 6 fois, tous les groupes vaccinés et contrôles, 5 min) - Infection vaginale avec la bactérie Chlamydia trachomatis (1 fois, tous les animaux, 15 min) - Prélèvement de sang (40 fois environ, tous les animaux, 5min) - Ecouvillonnage vaginal (30 fois environ, tous les animaux, 5 min) - Implantation d’une puce de télémétrie (1 fois, tous les animaux, 20 min) - Biopsies ganglionnaires (7 fois environ, 20 minutes, tous les animaux) - Biopsies vaginales (15 fois environ, 20 minutes, tous les animaux)

Impact sur les animaux

Dans ce projet, des nuisances ou effets indésirables pourront être observés selon les interventions : Nuisances liées aux vaccinations et aux biopsies (peu attendues) : Réaction locale, démangeaisons/douleur dans les heures/jours suivant l’administration ou les prélèvements. Nuisances liées à l’infection : diarrhée, amaigrissement, cervicite avec écoulement purulent (peu attendus). Nuisances liées aux anesthésies et prélèvements de sang : troubles de l’appétit avec plus ou moins de pertes de poids mineures, anémie transitoire (légère à modérée), hématome au niveau du site du prélèvement, infection cutanée dans les jours qui suivent le prélèvement. Nuisances liées à l’implantation de puces de télémétrie : réaction locale au site d’incision : gonflement, suintement de la plaie (rare), démangeaisons, durée de 1 à 5 jours. Nuisances liées à l’hébergement individuel : l’hébergement individuel peut entrainer un stress ou de l’ennui.

Devenir

En fonction des résultats obtenus, certains animaux pourront être euthanasiés à la fin de la procédure pour des analyses plus approfondies des organes cibles de l’infection. Les autres animaux seront gardés en vie à la fin de l’étude et réutilisés une fois que l’état sanitaire des animaux aura été vérifié par le vétérinaire compétent.

Remplacement

Dans le cadre de ce projet, l’utilisation de l’animal de laboratoire est nécessaire pour mimer la pathologie observée chez l’être humain suite à l’infection par Chlamydia trachomatis. En effet, ce modèle animal permet de reproduire la réponse immunitaire induite par la vaccination et par l’infection dans un organisme entier, ce qui n’est pas réalisable avec les modèles ne recourant pas à l’animal de laboratoire (in vitro, in silico et ex vivo). Le primate non humain étant proche physiologiquement de l’être humain, son utilisation permet une meilleure extrapolation des résultats chez celui-ci.

Réduction

Le nombre d’animaux est réduit au minimum nécessaire à une analyse statistique fiable des résultats. Il a été ajusté au strict minimum nécessaire pour permettre une interprétation robuste des effets des conditions expérimentales, tout en prenant en compte la variabilité entre individus.

Raffinement

Les animaux seront suivis tous les jours, par une équipe dédiée. En cas d’atteinte d’un point limite, des mesures seront prises (arrêt des interventions, traitement, sortie d’étude), selon avis du vétérinaire et de la structure chargée du bien-être animal. En cas d’apparition de douleurs ou de signes cliniques liés aux prélèvements ou à l’infection, un traitement symptomatique pourra être mis en place. L’ensemble des interventions et les prélèvements seront regroupés au maximum et réalisés sous anesthésie générale des animaux. Les prélèvements sanguins, l’implantation de puces de télémétrie ou l’administration de vaccins peuvent entraîner des réactions locales (douleur, gonflement ou irritation). Si nécessaire, des soins appropriés, tels qu’une désinfection et un traitement contre la douleur, seront mis en place sur avis vétérinaire. Des phases d’hébergements en individuel seront nécessaires au cours du projet. Cet hébergement individuel pourrait entrainer un stress qui sera compensé par un programme défini par la cellule « bien-être animal » de l’établissement pour l’enrichissement de leur milieu de vie (distribution 2 fois/semaine d’enrichissements destructibles ou sachet surprise au lieu d’1 pour les hébergements en groupe). Cet hébergement individuel est nécessaire pour l’évaluation de certains paramètres biologiques notamment la température corporelle et pour limiter la surexposition bactérienne.

Choix des espèces

Seuls les primates non humains présentent des caractéristiques anatomiques et biologiques en termes de réponse immunitaire et vaccinale suffisamment proches de l’être humain pour permettre une étude pertinente de l’infection par Chlamydia trachomatis et de l’immunité. Nous avons choisi le macaque cynomolgus, modèle d’infection pour la bactérie d’intérêt déjà utilisé dans des études scientifiques précédentes et chez qui les techniques et outils d’exploration du système immunitaire sont disponibles et maitrisés. Notre étude, qui s’intéresse à l’infection vaginale par Chlamydia trachomatis nécessite d’avoir accès à des femelles adultes et matures.

Deux applications quotidiennes d'une crème inflammatoire sur le dos pendant quatorze jours, chacune avec dix à quinze minutes de contention, puis au quinzième jour une injection intraveineuse de trente minutes sur chaise de contention pendant une quarantaine de minutes : 20 macaques à longue queue vont être utilisés, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. S'y ajoutent quatre prélèvements de sang de 2,5 ml, dix millilitres au total sur trois semaines, et quatre biopsies de peau par macaque sous anesthésie générale, précédées d'un jeûne pouvant aller jusqu'à seize heures. Le porteur attend des lésions cutanées, une fièvre par relargage de cytokines et des hématomes, signale qu'une déhiscence de plaie ou une infection du site de biopsie restent possibles, et projette un documentaire ou un dessin animé sur tablette pendant les contentions pour limiter l'ennui. Tous sont tués à la fin du projet pour que leurs organes soient récoltés.

Objectifs

L’objectif de ce projet est de reproduire une réaction inflammatoire de la peau chez le macaque, similaire à celle observée chez l’Homme dans certaines maladies auto-immunes comme le psoriasis. Pour cela, une crème contenant un principe actif est appliquée sur la peau. Cette substance stimule le système immunitaire local et provoque une inflammation visible, avec des rougeurs, un épaississement de la peau et une infiltration de cellules immunitaires. Ce modèle permettra de tester l’efficacité d’un nouveau traitement. Ce traitement est un anticorps qui cible un type particulier de cellules immunitaires impliquées dans plusieurs maladies auto-immunes tel que le psoriasis. Au cours de l’étude, des échantillons de peau et de sang seront prélevés afin d’analyser les réactions de l’organisme, notamment au niveau de l’expression des gènes. Cela permettra de vérifier si le traitement agit comme attendu sur l’inflammation. Ce modèle a été développé en collaboration avec un partenaire scientifique afin de garantir sa pertinence. Les résultats obtenus pourraient contribuer, à terme, au développement de nouveaux traitements pour des maladies auto-immunes telles que le psoriasis, la polyarthrite rhumatoïde, les maladies inflammatoires chroniques de l’intestin ou la sclérose en plaques.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour objectif d’évaluer l’efficacité d’un nouveau traitement basé sur un anticorps ciblant un type spécifique de cellules du système immunitaire, connues pour jouer un rôle important dans plusieurs maladies auto-immunes. L’étude permettra de vérifier si ce traitement est capable de réduire l’inflammation dans un modèle expérimental reproduisant certaines caractéristiques des maladies humaines. Les résultats obtenus permettront de mieux comprendre l’action de cet anticorps et de confirmer son intérêt comme approche thérapeutique. À plus long terme, ce projet pourrait contribuer au développement de nouveaux traitements pour des maladies auto-immunes, comme le psoriasis, la polyarthrite rhumatoïde, les maladies inflammatoires chroniques de l’intestin ou la sclérose en plaques, avec l’objectif d’améliorer la prise en charge des patients grâce à des thérapies plus ciblées et adaptées.

Procédures

Au cours de ce projet, les animaux vigiles auront une application de crème sur une petite surface du dos identifiée, deux fois par jour pendant 14 jour. L’application de la crème et la contention durera environ 10 à 15 minutes. Cette contention pour l’application de la crème permettra également de faire une observation dermatologique rapprochée quotidienne du site d’application. Au 15ème jour, le modèle inflammatoire sera effectif, nous n’appliquerons plus de crème, et les animaux vigiles recevront un candidat médicament ou un contrôle par voie intra-veineuse de façon unique à différentes dose (contrôle, faible, moyenne, haute). L’injection durera 30 minutes et la contention sur chaise durera environ 40 minutes. Les animaux auront également 4 prélèvements de sang de 2,5ml, pour un volume total prélevé de 10 ml sur 3 semaines avant et après administration de l’élément d’essais. Les animaux seront vigiles lors des prélèvements de sang uniquement les jours sans biopsie de peau. Les jours de biopsie, les animaux seront anesthésiés, les prélèvements de sang se feront donc à ce moment-là. Chaque prélèvement dure entre 3 à 15 minutes (contention et prélèvement compris). Quatre prélèvements de peau par animal seront réalisés avant et après administration de l’élément d’essais, chez tous les animaux et sous anesthésie générale et analgésie (après une mise à jeun inférieur à 16h). Pendant cette anesthésie, des mesures spécifiques dermatologiques : plie de peau et taux de perte d’eau transépithéliale seront mesurés de manière non invasive avec des appareils de mesure spécifiques par un vétérinaire spécialisé. Le prélèvement durera environ 30 minutes (anesthésie et mesures comprises). Le suivi des paramètres physiologique (température et poids) tout au long du projet nécessitera une contention d’environ 5 minutes. Pour le confort des animaux, certains prélèvements et suivis pourront être réalisés simultanément (ce qui diminuera le nombre de manipulations et de contentions). Des points limites précoces ont été déterminés afin de prendre en charge toute forme de douleur ou de souffrance. En cas d’atteinte d’un de ces points, l’animal concerné sera pris en charge selon les recommandations du vétérinaire.

Impact sur les animaux

Sur la base du mode d’action du principe actif contenu dans la crème et de sa cible cutanée, des lésions au niveau de la peau pourront être observées. Sur la base du mode d’action des anticorps et de leur potentielle cible sur le système immunitaire, une réaction systémique de type fièvre peut apparaître les jours suivant les administrations liées à un relargage de cytokines. La réalisation de prélèvements sanguins et les administrations par voie intraveineuse pourront également provoquer un stress, une douleur légère et/ou l’apparition de réactions locales (du type hématome ou œdème léger par exemple) au niveau de la zone de ponction ou d’injection. Les prélèvements de peau sous anesthésie pourront provoquer des douleurs au niveau de la zone de prélèvement ainsi qu’un hématome et dans de très rare cas une déhiscence de plaie ou infection de la zone de prélèvement. L'anesthésie des animaux pourra également engendrer un stress ou une sensation d'inconfort lié à la mise à jeun (maximum 16h), à la procédure d'induction (contention, administration, perte de conscience...) ou lié au réveil de l'animal (risque de vomissements, perte d'équilibre...). Durant les administrations, les animaux seront placés sur des chaises à contention ce qui a pour conséquence de réduire leurs mouvements. Les animaux auront accès à de l’eau et des friandises durant la manipulation.

Devenir

À la fin du projet, tous les animaux seront mis à mort dans le but de récolter les organes pour évaluer l’efficacité de l’élément d’essais.

Remplacement

Le modèle d’inflammation cutanée vise à reproduire une réponse inflammatoire cutanée complexe, impliquant des interactions immunitaires proches de celles observées chez l’homme. Ces caractéristiques sont essentielles pour garantir la pertinence des résultats et la prédictivité des réponses thérapeutiques. Bien que des modèles de peau in vitro permettent d’étudier certains mécanismes cellulaires, ils restent limités dans la reproduction de la complexité immunologique, vasculaire et systémique observée in vivo. À ce jour, aucune méthode alternative in vitro ou in silico ne permet de capturer de manière fiable cette dynamique intégrée. La cible de l’anticorps est conservée chez le macaque et présente des caractéristiques fonctionnelles et phénotypiques proches de celles observées chez l’Homme, justifiant le choix de cette espèce. L’utilisation des animaux demeure donc indispensable pour valider le modèle et assurer la transposabilité des données vers la clinique dans le cadre du développement de nouvelles thérapies.

Réduction

Le nombre d’animaux a été strictement limité au minimum nécessaire pour obtenir des résultats scientifiquement exploitables. Un effectif de 5 animaux par groupe a été retenu afin de permettre la réalisation d’analyses robustes, tout en évitant une utilisation excessive d’animaux. Le design expérimental comprend 4 groupes (un groupe contrôle et trois groupes recevant des doses croissantes), permettant d’évaluer la relation dose-effet ainsi que de recueillir des données de pharmacocinétique au sein d’une même étude, limitant ainsi le recours à des expériences supplémentaires. Par ailleurs, le choix de cet effectif prend en compte la variabilité interindividuelle et génétique observée chez le macaque. Des études préliminaires menées sur un nombre restreint d’animaux ont mis en évidence plusieurs profils de réponse distincts à l’induction inflammatoire. L’augmentation du nombre d’animaux par groupe est donc nécessaire pour garantir la représentativité et l’homogénéité des groupes, tout en assurant la fiabilité de l’interprétation des résultats. Ainsi, le nombre total de 20 animaux constitue un compromis raisonné entre la réduction du nombre d’animaux utilisés et les exigences scientifiques nécessaires à la validation de l’étude.

Raffinement

Afin d'optimiser leur bien-être et de leur permettre d'exprimer leurs besoins comportementaux, les animaux sont hébergés en groupes sociaux de même sexe. De l'eau fraîche ad libitum est mise à leur disposition et un aliment adapté à l'espèce et au poids de chaque individu est distribué quotidiennement. Les paramètres environnementaux de l'animalerie sont également suivis et contrôlés afin de répondre aux exigences physiologiques de l’espèce. En parallèle, un programme d'enrichissement complet est mis en place au sein de l'animalerie. Ce dernier comprend : - Des enrichissements structuraux permettant aux macaques d'évoluer dans un environnement tridimensionnel ; - De la litière pour leur permettre de fourrager ; - Des jouets variés faisant l'objet d'une rotation une fois par semaine pour éviter que les animaux ne se lassent ; - Des friandises et des fruits et légumes frais distribués quotidiennement (cachés dans la litière ou dans des jouets distributeurs) ; - De la musique d'ambiance est diffusée pendant la journée à un volume raisonnable dans le but de réduire le stress en couvrant le bruit causé par les activités du personnel dans les salles adjacentes et en habituant les animaux à la voix humaine. Une période d'acclimatation sera mise en place avant le début de l’étude. Un programme d'habituation à l'Homme et de conditionnement aux actes techniques associés à du renforcement positif permettra de réduire le stress des animaux lié aux manipulations (prise de sang, application de la crème). Les animaux seront suivis individuellement et bi-quotidiennement tout au long de l'étude pour détecter tout signe de stress ou de douleur. De même, le personnel veillera à garder une interaction quotidienne avec chaque animal afin de diminuer le stress qui pourrait être engendré par les manipulations. Les temps de repos accordés aux animaux entre les prélèvements et les volumes prélevés respecteront les recommandations éthiques en vigueur. Des mesures préventives et correctives de diminution de la douleur et du stress ont été déterminées au préalable sans compromettre les objectifs scientifiques de l’étude. Durant les administrations, les animaux seront assis sur des chaises à contention. Pour limiter leur stress et l’ennui, un personnel formé veillera à interagir avec les animaux, leur distribuer des friandises ou encore leur projeter un documentaire/dessin animé sur une tablette électronique par exemple.

Choix des espèces

L’utilisation du macaque pour le modèle d’inflammation cutané induit par l’application d'une crème contenant un principe actif sur la peau est justifiée par sa similarité immunologique avec l’humain. Les macaques ont un système immunitaire proche de celui de l’humain, notamment au niveau des voies de signalisation impliquées dans la réponse inflammatoire. Ce modèle induit une inflammation cutanée et une activation immunitaire locale. Chez le macaque, ces récepteurs sont exprimés de manière comparable à l’humain, ce qui garantit une réponse pharmacologique et immunologique pertinente pour l’évaluation des thérapies. La cible de l’anticorp est conservée chez le macaque et présente des caractéristiques fonctionnelles et phénotypiques proches de celles observées chez l’Homme, justifiant le choix de cette espèce. Des animaux juvéniles seront utilisés dans ce projet (jeunes adultes). Dans la littérature, certaines études montrent que les animaux matures (>4ans) sont statistiquement plus sujet aux anomalies liées au vieillissement pouvant affecter la qualité des échantillons prélevés et notamment les analyses histologiques. Sachant que des prélèvements de peau seront réalisés dans ce projet, il est préférable d’écarter au maximum ce biais lié à l’âge des animaux.

Sept macaques, quatre crabiers et trois rhésus, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue pour l'analyse post-mortem de leur cerveau. Ils subissent une restriction hydrique pendant douze à vingt-quatre mois, une chirurgie de pose d'implant crânien de quatre à six heures, parfois répétée sur l'autre hémisphère en cas d'infection, puis des séances quotidiennes d'enregistrement neuronal d'une à deux heures pendant six à huit mois. Le porteur liste les risques encourus : œdème cérébral, accident vasculaire lors de la descente des électrodes dans le cerveau, infection au site d'implantation. Le projet vise à créer chez le primate non humain un modèle de troubles compulsifs par inactivation de neurones du striatum, démarche que le porteur juge "indispensable" pour extrapoler aux aptitudes humaines.

Objectifs

Nous nous intéressons aux mécanismes neuronaux qui contrôlent l’adaptation du comportement de l'organisme aux contraintes changeantes de l’environnement (flexibilité comportementale). Plus précisément, nous étudions la contribution d'une région du cerveau appelée striatum, située sous le cortex cérébral, qui est censée intervenir dans la flexibilité comportementale. L’innervation cholinergique de cette région est altérée dans des pathologies neuropsychiatriques où prédominent des signes compulsifs (tics, stéréotypies, persévérations). La libération d’acétylcholine dans le striatum est assurée par un groupe spécifique d'interneurones cholinergiques (INChs) dont le dysfonctionnement est associé à un manque de flexibilité comportementale et à la manifestation de compulsions. Ainsi, une diminution de densité en INChs est décrite dans le striatum de patients atteints du syndrome de Gilles de la Tourette et des études chez le rongeur indiquent que l'inactivation des INChs perturbe l'adaptation des animaux à des changements de contexte. Les informations traitées par le striatum sont transmises aux circuits de commande du comportement par les neurones de projection qui influencent les commandes comportementales. L'adaptation comportementale résulterait de la mise en jeu coordonnée de ces neurones, sous contrôle des INChs. Les connaissances acquises chez le rongeur ne permettent pas de déterminer comment les INChs exercent ce contrôle. Notre projet vise à (1) déterminer la connectivité entre des populations distinctes de neurones du striatum; (2) examiner les interactions fonctionnelles entre ces populations; (3) établir si l'inactivation sélective des INChs induit des signes compulsifs assimilables à ceux observés chez l'humain. Pour cela, nous utilisons des approches expérimentales innovantes de marquage de populations neuronales distinctes dans le striatum, d’enregistrements simultanés de ces populations neuronales et d’inactivation des INChs par un procédé de ciblage sélectif de ces interneurones par utilisation d'outils génétiques.

Bénéfices attendus

Les troubles compulsifs sont une cause majeure de handicap dans bon nombre de maladies neuropsychiatriques. A n’en pas douter, les progrès à venir dans la compréhension et le traitement de ces anomalies passeront par une meilleure connaissance des mécanismes neuronaux sous-jacents. Dans cette perspective, la piste d'une anomalie de la neuromodulation cholinergique au niveau du striatum, une région profonde du cerveau, est actuellement privilégiée. On suppose qu'un défaut du signal cholinergique perturbe les informations transmises par le striatum aux circuits de commande comportementale qui aboutirait à l'expression de conduites inadaptées. Notre projet vise à préciser les bases anatomiques et physiologiques de cette régulation. Un aspect innovant de notre projet est le développement d'une méthode d'inactivation sélective des interneurones du striatum à la source du signal cholinergique à l'aide d'outils génétiques. Cet aspect du projet offre la possibilité de créer un modèle de troubles compulsifs chez le primate non humain permettant d'appréhender précisément la signification fonctionnelle de ce signal. Cette recherche fondamentale ouvre des perspectives prometteuses pour de nouvelles thérapies chez l'humain destinées à compenser un contrôle cholinergique défaillant dans les troubles compulsifs.

Procédures

(1) Contrôle hydrique pendant toute la durée des expériences (12 à 24 mois). (2) Examen IRM d'environ 2 h. (3) chirurgie pour la pose d'un implant crânien sur un hémisphère cérébral, suivi éventuellement d'une seconde implantation sur l'autre hémisphère dans le cas d'un incident (infection et/ou inflammation) obligeant à retirer le premier implant). Ce type de chirurgie dure de 4 à 6 heures. (4) enregistrements de l'activité neuronale chez le singe effectuant une tâche instrumentale au cours de séances quotidiennes de 1 à 2 h pendant 6 à 8 mois (5) injections de vecteurs viraux sous anesthésie générale conformément à un plan d'injection défini sur la base de l'examen IRM et du repérage électrophysiologique. Selon le nombre de sites d'injection (striatum et/ou globus pallidus), les injections durent entre 2 et 3 heures.

Impact sur les animaux

1) la restriction hydrique; (2) la capture des animaux depuis leur site d’hébergement, leur transfert au laboratoire et la contention de la tête sont source de stress dans les premiers temps de ces manipulations; (3) l'anesthésie générale présente des risques d'incident cardiaque ou respiratoire; (4) la chirurgie crânienne présente des risques d'infection au site d'implantation ou d'oedème cérébral; (5) la descente d'électrodes ou de canules d'injection dans le cerveau présente des risques d'infection ou d'accident vasculaire cérébral; (6) le maintien à long terme d'un implant crânien présente des risques liés au développement d'une infection ou de réactions inflammatoires au site d'implantation.

Devenir

Notre projet implique une analyse post-mortem de la connectivité entre différents types de neurones striataux et une évaluation de l'expression d'un transgène (DREADD) dans les INChs. Chaque animal sera mis à mort à l'issue de la procédure expérimentale.

Remplacement

Nos recherches portent sur la contribution de l’innervation cholinergique du striatum dans la flexibilité comportementale. L’approche expérimentale consiste à décrire le schéma des connexions anatomiques au sein du striatum, à corréler des indices de la flexibilité comportementale à l’activité électrophysiologique et à examiner les conséquences d’une inactivation cholinergique sur le comportement. Une telle approche exclut toute alternative basée sur des modèles in vitro (tranches de tissu, cultures de cellules ou cellules dissociées) ou sur l’animal anesthésié. Les neurosciences computationnelles permettent d’élaborer des modèles utiles pour la compréhension des processus sensorimoteurs ou cognitifs. Ces modèles tirent parti des données neurophysiologiques, acquises chez l'animal comme chez l'humain, et fournissent des hypothèses de travail ou des cadres d'interprétation utiles pour guider la recherche, mais en aucun cas ils ne peuvent remplacer l'expérimentation. De plus, un modèle computationnel, aussi sophistiqué soit-il, est une approximation de la complexité neurobiologique susceptible d'être améliorée sur la base des nouvelles données acquises.

Réduction

Nous avons restreint autant que possible le nombre d'animaux impliqués dans le projet tout en restant compatible avec l'exigence d'analyses statistiques fiables. Pour cela, l'analyse électrophysiologique des populations neuronales du striatum sera faite chez les mêmes singes qui seront ensuite utilisés pour les injections de vecteurs viraux. Pour l’électrophysiologie, l'analyse porte sur des échantillons de neurones enregistrés lors de séances quotidiennes, pendant plusieurs mois. L'analyse est d'abord faite pour chaque animal et les données sont ensuite groupées. Ce "pooling" permet d'augmenter la puissance statistique, en particulier si les échantillons de neurones disponibles pour chaque animal sont trop faibles. Nous complétons cette analyse globale par une analyse cas par cas si les performances et les données neuronales divergent trop entre les sujets. Afin de réduire le nombre d’animaux pour étudier la connectivité entre neurones striataux, nous réaliserons les injections de vecteurs viraux dans les 2 hémisphères cérébraux de chaque singe. Comme les projections des neurones de sortie striataux vers le globus pallidus sont strictement ipsilatérales, on ne risque pas d'induire de chevauchement des marquages en intervenant sur chacun des hémisphères.

Raffinement

Tout est mis en oeuvre pour favoriser la coopérativité de l'animal dans les expériences de conditionnement, d'enregistrement et d'inactivation pharmacogénétique. Pour diminuer le stress des animaux au début de certaines phases de la procédure expérimentale (capture, contention de la tête), on les habitue progressivement aux contraintes imposées. A l'animalerie, les animaux sont hébergés en duo ou trio, selon les affinités, dans un environnement enrichi qui inclut l'accès à une volière munie d'objets à manipuler, de perchoirs et de cordages. Les interventions sources de douleur (implantation crânienne, injections intracérébrales, perfusion intracardiaque) sont effectuées sous anesthésie générale. Les chirurgies crâniennes sont suivies d'un traitement analgésique morphinique en période post-opératoire immédiate. Tout constat d'anomalie affectant l'état général de l'animal en cours d'expérience donnera lieu, sous anesthésie ou sédation profonde, à un examen complémentaire par le vétérinaire pour auscultation et/ou prélévements sanguins. Les éventuels épisodes inflammatoires ou infectieux au site d'implantation donneront lieu à des traitements locaux adaptés. Les points limites définis dans le cadre des différentes étapes de notre procédure expérimentale seront pris en considération pour décider de l'interruption de l'expérimentation afin de mettre en oeuvre une prise en charge thérapeutique adaptée, impliquant notamment le retrait du dispositif implanté, ou l'euthanasie de l'animal si son état s'est trop dégradé en dépit des soins.

Choix des espèces

L'analyse des anomalies comportementales après inactivation expérimentale chez le rongeur n'est jamais aussi détaillée que celle faite chez le singe. Les spécificités du répertoire comportemental des primates font du macaque rhésus un bon modèle pour l'expression de compulsions semblables à celles qui se manifestent chez l'humain. Une abondante littérature atteste de la similitude d’organisation des circuits qui relient le cortex préfrontal au striatum chez le macaque rhésus et l'humain. Il est donc indispensable d’étudier les supports neuronaux des fonctions de planification et de sélection de l'action chez le singe pour extrapoler aux aptitudes humaines et à leur dérèglement en pathologie. De plus, les tests comportementaux sont proches de ceux employés chez l'humain (mouvements d'atteinte de cibles avec la main) et les données électrophysiologiques recueillies à l’échelle neuronale chez le singe sont un complément précieux aux mesures plus globales, non invasives, de l'activité cérébrale chez l'humain. Nous utilisons des animaux dans une gamme de poids 6 à 12 kg dont la morphologie crânienne est compatible avec la mise en place chirurgicale de la chambre d'enregistrement et du dispositif de fixation de la tête.

Réattribués à une nouvelle procédure après validation vétérinaire, dix macaques à longue queue vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque séance commence par une mise à jeun depuis la veille, se poursuit sous anesthésie continue avec trois cathéters posés, et comporte jusqu'à trente prélèvements sanguins, dans la limite de 15 % du volume circulant de l'animal. Le porteur reconnaît que des prélèvements trop répétés peuvent provoquer une anémie, et que l'hébergement individuel imposé le temps de la décroissance du radioisotope, jusqu'à 72 heures, constitue un stress. Il justifie le recours au macaque par la taille de ses veines, par la ressemblance de son cerveau avec celui de l'humain, et par le fait que ces études pharmacologiques ne sont "souvent pas autorisées chez l'homme".

Objectifs

Ce projet de recherche a pour objectif de vérifier si certaines molécules d’intérêt médical peuvent se fixer de manière fiable à une cible biologique précise, susceptible d’être utilisée en diagnostic ou en thérapie. Pour cela, nous utilisons une technique d’imagerie non invasive appelée tomographie par émission de positons (TEP), qui permet de suivre le comportement de ces molécules dans l’organisme vivant. La première question posée est de savoir si le radiotraceur utilisé se lie réellement à la cible visée, et si cette liaison est suffisamment spécifique et sélective. Autrement dit, il s’agit de vérifier que le signal observé correspond bien à la cible d’intérêt et non à d’autres structures biologiques. Cette étape est étudiée en administrant une molécule compétitrice connue, capable de prendre la place du radiotraceur. La deuxième question porte sur la reproductibilité des mesures, c’est-à-dire les différences de distribution du radiotraceur entre différents individus et également chez un même individu (test-retest). La troisième question concerne le devenir des molécules d’intérêt dans le sang et les tissus : sa répartition entre le sang total et le plasma, sa liaison aux protéines sanguines, sa stabilité dans le temps et sa distribution dans les organes. Enfin, la quatrième question vise à évaluer l’exposition globale de l’organisme au radiotraceur, un paramètre clé pour anticiper une utilisation future chez l’homme.

Bénéfices attendus

Les résultats de ce projet apporteront des résultats significatifs dans la compréhension des mécanismes biologiques impliqués dans certaines maladies, en particulier en ce qui concerne l’interaction entre des molécules d’intérêt médical et leurs cibles dans l’organisme. Ces connaissances contribueront à accélérer le développement de nouveaux outils diagnostiques et thérapeutiques. En définissant des critères clairs de sélection des molécules dès les premières étapes de la recherche, les résultats permettront de mieux orienter les efforts scientifiques vers les solutions les plus efficaces, tout en limitant le recours ultérieur à des études plus complexes et plus lourdes. Le projet produira également des données fiables sur la distribution des molécules dans le cerveau et dans l’ensemble du corps, informations essentielles pour comprendre leur mode d’action et leur devenir dans l’organisme. Ces résultats renforceront la qualité des évaluations pharmacologiques et faciliteront la comparaison entre différentes molécules candidates. À plus long terme, les données générées constitueront une base scientifique solide et réutilisable, pouvant servir à l’identification de biomarqueurs diagnostiques ou à la préparation d’évaluations thérapeutiques ciblant des pathologies spécifiques. Grâce à la forte proximité biologique du primate non humain avec l’être humain, les résultats obtenus permettront une meilleure transposition vers la clinique, augmentant les chances que les avancées issues de ce projet se traduisent en bénéfices concrets pour la santé humaine. L’optimisation des stratégies de recherche contribue aussi à une utilisation plus raisonnée des ressources expérimentales, au bénéfice d’autres espèces et de l’environnement.

Procédures

Avant l’imagerie les animaux sont mis à jeun depuis la veille au soir pour un examen d’imagerie réalisé le matin. Après l’induction de l’anesthésie, trois cathéters sont posés, l’un sert à administrer l’anesthésie de manière continue pendant l’imagerie, l’autre à administrer les ligands, et le troisième pour effectuer des prélèvements sanguins. Le volume sanguin total prélevé et le nombre de prélèvements (maximum 30) correspondra à moins de 15% du volume circulant de l’animal. L’hébergement individuel est limité à la durée de décroissance du radioisotope (min 4h, max 72h.

Impact sur les animaux

Chaque séance d’imagerie sur le PNH est un acte qui peut générer plusieurs nuisances ou effets indésirables : - L’anesthésie peut induire une hypothermie et perte de poids transitoire de l’animal : les animaux sont thermorégulés avec un suivi de la température corporelle. Au réveil, les animaux sont nourris avec quelques fruits ou légumes en plus de leur ratio de croquettes. - L’anesthésie peut induire une déshydratation de l’animal. - Des prélèvements sanguins trop répétés peuvent induire une anémie chez le PNH: le taux d’hémoglobuline est mesuré régulièrement et une période de repos est accordée aux animaux entre les examens. - L’hébergement temporaire en zone TEP lors de la décroissance est un stress pour l’animal : cette période est réduite à la période de décroissance réglementaire. - L’introduction des cathéters peuvent induire des hématomes et douleurs associées.

Devenir

A l’issue de la procédure, après validation par le vétérinaire, les primates non humains peuvent être attribués à une nouvelle procédure.

Remplacement

Avant toute utilisation d’animaux, les radiotraceurs font l’objet d’une stratégie de développement progressive visant à privilégier les méthodes de remplacement. Des approches in silico (modélisation numérique) sont d’abord mises en œuvre afin de sélectionner les candidats les plus pertinents. Ces candidats sont ensuite évalués par des méthodes in vitro (tests de liaison, de spécificité, de stabilité et de métabolisme sur systèmes cellulaires ou biochimiques) et, lorsque cela est possible, par des approches ex vivo. Ces étapes permettent un remplacement partiel de l’expérimentation animale et conduisent à l’élimination précoce des radiotraceurs ne répondant pas aux critères requis. La validation in vivo chez le rongeur constitue une étape intermédiaire indispensable pour étudier la biodistribution, la pharmacocinétique et le signal d’imagerie dans un organisme vivant. Toutefois, pour certains ligands à visée clinique, les données obtenues chez le rongeur ne permettent pas d’obtenir des résultats suffisants, notamment en raison de différences physiologiques, anatomiques et métaboliques limitant la transposabilité à l’homme. Dans ces situations spécifiques, l’évaluation chez le primate non humain devient nécessaire afin de se rapprocher au plus près des conditions cliniques humaines. À ce stade du développement, il n’existe pas d’alternative complète permettant de reproduire de manière intégrée l’ensemble des paramètres requis (biodistribution, métabolisme, cinétique du radiotraceur, passage de barrières biologiques et signal d’imagerie). Ces phénomènes ne peuvent pas être modélisés de façon fiable par des méthodes in silico, in vitro ou ex vivo seules. Seuls les radiotraceurs pour lesquels l’ensemble des approches alternatives et des modèles de rongeurs s’est révélé insuffisant sont testés chez le primate non humain, ce qui permet de limiter strictement le nombre d’animaux utilisés. L’imagerie TEP, méthode non invasive, autorise par ailleurs des études longitudinales chez un même animal, contribuant au raffinement des procédures et à la réduction globale de l’utilisation d’animaux.

Réduction

L’imagerie TEP est une technique d’imagerie peu invasive, ce qui permet de répéter l’examen chez le même animal, réduisant ainsi le nombre d’animaux. Les examens d’imagerie étant très bien tolérés par les animaux, nous faisons le choix de réduire le nombre d’animaux dans cette demande d’autorisation de projet et d’augmenter les répétitions. Si certaines informations sont déjà connues dans la littérature, ces expériences ne seront pas répétées.

Raffinement

L’examen se déroule sous anesthésie générale. Une assistance respiratoire est appliquée en cas d’arrêt respiratoire. Pendant l’examen, les paramètres physiologiques, tels que le rythme cardiaque, la pression artérielle et la fréquence respiratoire sont utilisés comme indicateurs pour adapter la profondeur de l’anesthésie. Avant chaque protocole, le taux d’hémoglobine est mesuré pour chaque primate non humain au début, et pendant toute la durée de la procédure. Pendant les examens, les animaux sont hydratés. Des points limites ont été identifié conduisant à l’arrêt de l’imagerie, suivi par le réveil, et une phase de récupération puis reprise normale du protocole ou prolongement période de repos.

Choix des espèces

Le primate non humain permet par sa taille d’effectuer des prélèvements sanguins simultanément à l’acquisition des images TEP, contrairement au rongeur. Ce projet utilise des jeune adulte d’au moins 5 ans pour assurer que : - le volume sanguin permette les prélèvements nécessaires, - la taille des veines/artères permette facilement la pose de cathéters. Chez l’homme, le prélèvement sanguin artériel demande une logistique hospitalière importante, et est difficile voire impossible à mettre en œuvre chez certains patients. L’utilisation du primate non humain se justifie par la ressemblance anatomique et fonctionnelle du cerveau par rapport à celui de l’homme. La taille et la structure du cerveau permettent des analyses anatomiques et fonctionnelles strictement comparables à celles réalisées dans les mêmes conditions chez les patients. L’utilisation du primate non humain se justifie par le fait que les études pharmacologiques ne sont souvent pas autorisées chez l’homme, car les pharmaceutiques utilisés dans ces études ne disposent pas toujours d’une autorisation de mise sur marché (AMM). Jeune adulte d’au moins 5 ans pour assurer que: - le volume sanguin permette les prélèvements nécessaires pour la mesure temporelle de la concentration sanguine du radioligand, - la taille des veines/artères permette facilement la pose de cathéters.

Une injection dans le cerveau sous anesthésie, une heure d'intervention, puis vingt-neuf jours avant la mise à mort, neuf macaques à longue queue vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Trois vecteurs de thérapie génique contre la maladie de Huntington sont testés, à raison de trois animaux par vecteur, l'enjeu déclaré étant de déterminer lequel atteint le mieux sa cible dans le cerveau. Le porteur indique que l'administration intracérébrale peut provoquer un saignement dans le cerveau et des troubles de la locomotion, et les neuf animaux sont tués à l'issue pour prélever leurs organes. Il justifie l'emploi de jeunes adultes par la volonté d'écarter les anomalies liées au vieillissement, et écrit que les similitudes entre cerveaux de macaques et cerveaux humains rendent cet emploi "indispensable".

Objectifs

L’objectif de ce projet est de caractériser le suivi dans le corps de candidats médicaments innovants développés pour le traitement de la maladie d’Huntington après administration dans le cerveau. Huntington est une maladie qui affecte les fonctions motrices et entraine une détérioration physique et mentale chez l'Homme. Il n'existe actuellement aucun traitement sur le marché permettant de la soigner, de retarder son apparition ou de ralentir sa progression. Les candidats médicaments testés visent à corriger la cause sous-jacente de la maladie et non traiter ses symptômes. Cette étude permettra de sélectionner le médicament qui atteignera le mieux sa cible après administration.

Bénéfices attendus

En cas de succès, l’administration unique de ce médicament, au plus proche de sa cible (directement dans le cerveau) permettra d’induire un ralentissement significatif de la progression de la maladie.

Procédures

Après plus de trois semaines d’acclimatation et d’habitation, les 9 animaux inclus dans le projet recevront une injection du candidat médicament dans le cerveau sous anesthésie et analgésie (après mise à jeun inférieure à 16h). L’intervention durera environ 1h. Des prélèvements de sang seront réalisés avant et après administration sur animal vigile (3 prélèvements sanguins par animal seront réalisés sur une période de 29 jours). Le temps de contention nécessaire à la réalisation de ces prélèvements est compris entre 3 et 5 minutes. Le suivi des paramètres physiologiques (poids, température corporelle) tout au long du projet nécessitera une contention d’environ 5 minutes. Une pesée par semaine par animal sera réalisée. La température corporelle sera mesurée 1x/jour 3 jours avant administration, 2x/jour le jour de l’administration et 1x/jour durant 3 jours après l’administration. Le projet prendra fin 29 jours après l’administration du candidat médicament et les 9 animaux impliqués seront mis à mort sous anesthésie afin de récolter leurs organes.

Impact sur les animaux

L’administration dans le cerveau pourra provoquer une douleur modérée avec des risques neurologiques (saignement dans le cerveau, trouble de la locomotion…) et/ou l'apparition de réactions locales au niveau de la plaie chirurgicale (du type hématome, gonflement, saignement léger, infection par exemple). Durant les administrations, les animaux seront anesthésiés, ce qui pourra engendrer un stress ou une sensation d’inconfort lié à la mise à jeun (inférieure à 16h), à la procédure d’induction (contention, administration, perte de conscience…) ou lié au réveil de l’animal (risque de vomissement, perte d’équilibre…). Les prélèvements de sang pourront provoquer un stress léger, une douleur légère et/ou l’apparition de réactions locales (du type hématome léger). Les pesées et les mesures de température rectale peuvent également engendrer un stress léger chez les animaux.

Devenir

Les 9 animaux utilisés dans le cadre de ce projet seront mis à mort à la fin de la procédure afin de récolter leurs organes pour déterminer la biodistribution des candidats médicaments testés.

Remplacement

Les études permettant de déterminer le suivi des candidats médicaments dans le corps sont indispensables au développement de nouvelles thérapies. En effet, celles-ci permettent de déterminer sa localisation dans les différents tissus après administration. Cette étude dépend d’un grand nombre de facteurs qui interagissent en temps réel dans un organisme vivant et complexe (ex : échanges entre les tissus, barrières biologiques…). Seul un organisme complet, où tous les organes sont en interaction constante permet de répondre aux objectifs scientifiques du projet. Ceci ne pourrait être obtenu en culture cellulaire et justifie le recours à des animaux.

Réduction

9 primates répartis en 3 groupes seront utilisés dans ce projet. 3 médicaments seront testées, chacun sur 3 animaux. 3 animaux seront utilisés par groupes car, en plus de pouvoir détecter une tendance dans le groupe, ce nombre permet de déceler toute valeur extrême, ce qui est un paramètre critique pour l’interprétation des résultats scientifiques du projet. Cette étude n’étant pas règlementaire, elle ne nécessite pas de réaliser des tests statistiques sur de grandes cohortes d’animaux.

Raffinement

Un programme d'enrichissement complet sera mis en place au sein de l'animalerie comprenant des enrichissements structuraux permettant aux primates d'évoluer dans un environnement tridimensionnel, de la litière pour leur permettre de fourrager, des jouets variés faisant l'objet d'une rotation une fois par semaine pour éviter que les animaux ne se lassent, des friandises et des fruits et légumes frais distribués quotidiennement (cachés dans la litière ou dans des jouets distributeurs). De la musique d'ambiance/des documentaires/dessins animés seront diffusés pendant la journée à un volume raisonnable dans le but de réduire le stress en couvrant le bruit causé par les activités du personnel dans les salles adjacentes et en habituant les animaux à la voix humaine. Une période d'acclimatation de plus de 3 semaines sera mise en place avant le début de l’étude incluant un programme d'habituation à l'Homme et de conditionnement aux actes techniques associés à du renforcement positif. Elle permettra de réduire le stress des animaux lié aux manipulations (prise de température rectale, pesée, prises de sang). Les animaux seront suivis individuellement et bi-quotidiennement tout au long de l’étude pour détecter tout signe de stress ou de douleur. Un suivi spécifique neurologique sera également mis en place. Pour limiter le stress et l’ennui lié aux actes techniques, le personnel veillera à interagir avec les animaux en gardant une interaction quotidienne avec chaque animal. L'administration des médicaments dans le cerveau sera réalisée sous anesthésie et anti-douleurs. Des antibiotiques et des anti-inflammatoires seront également utilisés pour le confort des animaux. Les prélèvements sanguins seront réalisés sur animal vigile afin d’éviter les modifications physiologiques de l’animal et le stress, engendrés par une anesthésie, ainsi qu’un risque plus important pour l’animal que la procédure elle-même. Des points limites seront mis en place afin de détecter précocement tout signe de stress ou de douleur. En cas d’atteinte d’un de ces points, l’animal concerné sera pris en charge selon les recommandations du vétérinaire. L’arrêt du protocole sera envisagé si l’état de l’animal se dégrade (sous la responsabilité du vétérinaire).

Choix des espèces

Les primates constituent un modèle animal de référence pour déterminer le suivi de candidats médicaments dans le système nerveux avant les essais cliniques chez l’Homme. En effet, il est admis que les primates présentent de nombreuses similitudes avec l’Homme que l'on ne retrouve pas dans d'autres modèles animaux, par exemple une grande homologie d'ADN, de grandes similitudes entre les cerveaux de primates et les cerveaux humains contrairement aux cerveaux de rongeurs. Cette espèce apporte donc les meilleures données transposables à l’Homme. L’ensemble de ces similitudes avec l’Homme rend son emploi indispensable pour répondre aux objectifs scientifiques de ce projet. De jeunes animaux seront utilisés dans ce projet. Dans la littérature, certaines études montrent que les animaux matures (>4ans) sont statistiquement plus sujet aux anomalies liées au vieillissement pouvant affecter le système nerveux, ce qui pourrait interférer avec les résultats scientifiques de l’étude et la qualité des échantillons prélevés. Leur organisme a atteint la maturité mais ne subit pas encore les variations liées au vieillissement. Il est donc préférable d’écarter au maximum ce biais lié à l’âge.

Une trentaine d'anesthésies par animal, dix-sept séances d'imagerie, douze lavages broncho-alvéolaires et jusqu'à huit semaines d'hébergement individuel : 60 babouins juvéniles vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Tous reçoivent des candidats vaccins puis sont infectés par la bactérie de la coqueluche, avec une toux qui peut durer de trois à six semaines et des saignements après les écouvillonnages. Le porteur décrit le babouin comme la seule espèce reproduisant les symptômes coquelucheux humains, et retient des juvéniles sevrés pour représenter les réponses immunitaires des enfants. 40 babouins sont tués pour prélever leurs organes, les 20 autres restent vivants et pourront être réutilisés dans de nouveaux projets compatibles avec leur historique.

Objectifs

La coqueluche est une infection bactérienne des voies respiratoires responsable de 40 millions de cas et 300 000 décès par an dans le monde. Chez les patients les plus jeunes, les symptômes caractéristiques (fièvre, toux) peuvent évoluer vers une détresse respiratoire grave, voire entraîner le décès. Cette maladie affecte principalement les nourrissons et les jeunes enfants, dont le système immunitaire n’est pas encore pleinement développé. Depuis les années 1940-1950, des vaccins dits « ancienne génération » ont été développés afin d’immuniser les populations. Néanmoins, à partir des années 1990 et en raison de préoccupations liées aux effets indésirables (comme la fièvre et/ou des réactions inflammatoires au point d’injection), des vaccins « nouvelle génération » sont utilisés. Depuis quelques années, une recrudescence des cas de coqueluche a été observée. Des études épidémiologiques, cliniques et précliniques ont démontré que l’immunité conférée par la vaccination avec les vaccins de nouvelle génération diminue rapidement. Ils protègent contre la maladie, mais pas contre la colonisation bactérienne ni la transmission. Ceci a pour conséquence de permettre la transmission de la bactérie aux jeunes populations encore non protégées. Il apparaît donc nécessaire de développer de nouveaux vaccins capables d’induire une immunité durable, protégeant à la fois contre les symptômes, la colonisation bactérienne et la transmission. Dans ce projet, nous évaluerons l’efficacité de nouveaux candidats vaccins pour prévenir la maladie et la colonisation bactérienne chez des primates non-humains juvéniles, comme modèle des populations humaines pédiatriques à risque.

Bénéfices attendus

Les candidats vaccins qui auront montré des résultats satisfaisants chez le modèle primate non-humain pourront à court terme être utilisés lors d’essais cliniques chez l’être humain adulte. Ils pourront, à moyen-long terme, recevoir une autorisation de mise sur le marché pour être utilisés dans les populations humaines adultes et pédiatriques.

Procédures

Les différentes interventions prévues dans ce projet sont réalisées sous anesthésie générale : - Anesthésie des animaux (31 fois environ, 30 minutes, 60 animaux) - Administration de solutions pour l’immunisation (3 fois environ, 5 minutes, 60 animaux) - Infection par la bactérie (1 fois, 15 minutes, 60 animaux) - Prélèvement de sang (31 fois environ, 5 minutes, 60 animaux) - Ecouvillonnage mucosal (27 fois environ, 1 minute, 60 animaux) - Lavage broncho-alvéolaire (12 fois environ, 10 minutes, 60 animaux) - Implantation d’une puce de suivi (1 fois, 30 minutes, 60 animaux) - Imagerie in vivo (17 fois environ, 45 minutes, 60 animaux) - Examen de mesure des variations de volume pulmonaire (11 fois, 10 minutes, 60 animaux) - Euthanasie (1 fois, au maximum 60 animaux) Hébergement individuel (jusqu’à 8 semaines maximum après exposition bactérienne, 60 animaux)

Impact sur les animaux

Dans ce projet, des nuisances ou effets indésirables pourront être observés selon les interventions : Nuisances liées à la vaccination (peu attendues) : Réaction locale, démangeaisons/douleur dans les heures /jours suivant l’administration. Nuisances liées à l’infection par la bactérie : Fièvre légère transitoire pouvant aller jusqu’à 1 semaine. Ecoulement nasal, toux, toux intense pouvant aller de 3 à 6 semaines. Nuisances liées aux anesthésies et prélèvements de sang : Trouble de l’appétit avec plus ou moins de perte de poids mineure ou absence de prise de poids, anémie transitoire (légère), hématome au niveau du site du prélèvement, jusqu’à une semaine. Nuisances suite aux écouvillonnages : Saignement pouvant aller de quelques secondes à minutes. Nuisances liées aux lavages broncho-alvéolaires : Irritation trachéale liée à l’intubation dans les heures suivant la manipulation. Nuisances liées à l’implantation de puces de télémétrie : Réaction locale au site d’incision : gonflement, suintement de la plaie (rare), démangeaisons, durée de 1 à 5 jours. Nuisances liées à l’hébergement individuel : L’hébergement individuel peut entrainer un stress ou de l’ennui. Il sera limité au strict minimum (jusqu’à 8 semaines après l’exposition).

Devenir

40 animaux seront euthanasiés afin de prélever les organes d’intérêt dans le but de réaliser des analyses des tissus. L’accès à ces prélèvements permet d’analyser l’impact de la vaccination ou de l’exposition sur les organes, ce qui ne serait pas possible chez l’être humain. 20 animaux seront gardés en vie et pourront être réutilisés, sur avis vétérinaire, dans de nouveaux projets compatibles avec leur historique afin de réduire le nombre d’animaux naïfs utilisés en recherche.

Remplacement

Dans le cadre de ce projet, l’utilisation de l’animal de laboratoire est nécessaire pour reproduire ce qui est observé chez l’être humain développant une coqueluche, ainsi que l’immunité induite suite à la vaccination. La caractérisation de la maladie, y compris les impacts sur les organes, et la mise en évidence des vaccins à protéger de la maladie n’est pas réalisable avec les modèles actuels non animaux (cellules, organes, ou modélisation informatique). Bien que ces modèles puissent être utilisés pour répondre à des questions spécifiques, ils ne reproduisent pas encore la complexité du corps humain, comme le fonctionnement des organes ou du système de défense contre les infections, ni les interactions entre ces différents éléments à l’échelle du corps entier. En revanche, le primate non humain est très proche de l’être humain sur le plan biologique. Son utilisation permet donc une transposition rapide des résultats précliniques à la clinique humaine.

Réduction

Le nombre d’animaux dans chaque groupe est réduit au minimum nécessaire. Afin de tester l’efficacité des candidats vaccins, le nombre d’animaux a été établi à 6 animaux par groupe expérimental permettant une analyse statistique valable des résultats obtenus.

Raffinement

Les interventions et prélèvements seront réalisés sous anesthésie générale. Un maximum de prélèvements et interventions seront regroupés lors d’une même anesthésie afin de réduire le nombre d’anesthésies. Les anesthésies pouvant entrainer une diminution de l’appétit, une diversification et complémentation de l’alimentation sera instaurée au besoin. Les animaux seront observés quotidiennement. En cas d’apparition de signes cliniques, le vétérinaire de l’installation sera alerté afin d’adapter le suivi et les soins aux animaux. Si les points limites définis sont atteints, les animaux seront sortis de l’étude et l’euthanasie pourra être envisagée. Les prélèvements de sang pouvant entrainer l’apparition d’une réaction locale, un traitement symptomatique pourra être mis en place (désinfection, analgésie locale). Pour limiter l’irritation de la trachée liée à l’intubation lors du lavage pulmonaire, un spray anesthésique sera appliqué localement en amont de la manipulation. L’implantation de puces, permettant un suivi régulier de paramètres biologiques, peut induire une réaction au site d’incision. Un signalement au vétérinaire sera effectué qui pourra décider du retrait de la puce et éventuellement de la sortie de l’animal de l’étude et appliquer un traitement symptomatique (désinfection, analgésie locale). Un traitement analgésique est appliqué avant la chirurgie. Les animaux seront hébergés en cages individuelles suite à l’exposition par la bactérie pour empêcher toute surinfection liée à une contamination croisée et le stress lié à la cohabitation d’animaux développant la maladie. Le programme d’enrichissement sera étendu par ajout de dispositifs alimentaires, jouets, renforcement du contact positif. La durée de l’hébergement en cage individuelle sera limitée à 8 semaines au maximum après l’infection.

Choix des espèces

Le babouin a été sélectionné pour ce projet car il est le seul modèle réunissant les éléments nécessaires à l’évaluation de l’infection par l’agent responsable de la coqueluche : c’est la seule espèce animale connue à reproduire les symptômes coquelucheux retrouvés chez l’être humain. Le système immunitaire de cette espèce est proche de celui des humains et les réponses vaccinales induites chez cette espèce sont semblables à celles observées chez l’être humain. C’est donc le seul modèle permettant d’évaluer à la fois l’immunogénicité et l’efficacité de vaccins. Ce projet a pour objectif d’étudier l’efficacité de nouveaux vaccins contre la coqueluche qui seront administrés à terme à des enfants. Ce projet repose donc sur l’utilisation de babouins juvéniles sevrés (>8 mois) comme modèle des réponses immunitaires des populations pédiatriques humaines.