Primates
- Babouins
- Macaques à longue queue
- Macaques rhésus
- Ouistitis et tamarins
- Prosimiens
- Singes écureuils
- Singes vervets
Etude de l’effet de l’exposition aux UV sur le taux sérique de vitamine D et sur le bien-être animal des ouistitis
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
Pour mesurer si une exposition à des lampes UVB relève leur taux de vitamine D, 32 ouistitis d'un centre d'élevage vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance léger. Chaque individu subit deux captures avec anesthésie à un mois d'intervalle, un prélèvement d'un millilitre de sang et une coupe de poils à la tondeuse, complétés par quatre récoltes de selles sans contention. Le porteur relève des hématomes possibles après la ponction et un stress au retour de l'animal dans son groupe, et annonce des mesures de cortisol, d'ocytocine et de comportements comme les stéréotypies ou l'hyperagitation. La carence que le projet cherche à corriger vient des conditions d'hébergement qu'il décrit lui-même, des installations intérieures où l'accès aux UVB reste limité, et tous les ouistitis sont gardés vivants au terme de l'étude.
Objectifs
L'utilisation des ouistitis en recherche biomédicale est en expansion et la nécessité d'une gestion adaptée des conditions d'hébergement requiert une attention accrue. La nutrition et les paramètres environnementaux — tels que l’éclairage, la température ou l’enrichissement du milieu — jouent un rôle clé à chaque stade de leur vie, influençant leur croissance, leur développement, et leur bien-être. La synthèse cutanée de vitamine D3, essentielle au métabolisme osseux et à la régulation immunitaire, dépend chez les ouistitis, comme chez d’autres vertébrés, d’une exposition aux rayonnements UVB. En milieu naturel, la lumière solaire directe permet de couvrir ces besoins. En captivité, les animaux sont souvent maintenus dans des installations intérieures où l’accès aux UVB est limité (vitres, éclairage artificiel, exposition indirecte) ce qui les expose à un risque de carence en vitamine D3, avec des conséquences potentielles sur leur santé et leur bien-être, ce qui est classiquement compensé par l'alimentation. Une étude pilote menée sur 6 ouistitis dans un centre a révélé un niveau sanguin de vitamine D trop bas chez les sujets testés. L’installation de lampes UVB au-dessus de leurs volières a permis non seulement d’augmenter leurs taux sanguins de vitamine D3, mais aussi de réduire significativement des comportements indicateurs de stress (périodes d’inactivité prolongée, grattage, phases d’hyperagitation locomotrice). Ces résultats préliminaires suggèrent un lien entre l’exposition aux UVB, la synthèse de vitamine D3 et l’amélioration du bien-être animal. Pour approfondir ces observations, un projet transversal a été initié dans 4 centres hébergeant des colonies de ouistitis dans des conditions d’hébergement variées. Ce projet vise à : 1. Évaluer l’impact des lampes UVB sur les taux sanguins de vitamine D3 afin de confirmer l’efficacité de cette méthode pour prévenir les carences. 2. Analyser les effets comportementaux de l’exposition aux UVB, en mesurant la fréquence des comportements associés au stress ou au bien-être. 3. Mesurer les taux de deux hormones clés dans les selles et poils des ouistitis. Le cortisol, hormone liée au stress, et l’ocytocine, associée au bien-être et à la régulation des interactions sociales, fourniront des indicateurs biologiques. Une diminution du cortisol et une augmentation de l’ocytocine seraient ainsi corrélées à une amélioration du bien-être.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à étudier les effets d’une exposition contrôlée aux rayonnements UVB sur la production endogène de vitamine D3 — une vitamine clé pour de nombreuses fonctions physiologiques — ainsi que sur des marqueurs hormonaux et comportementaux du bien-être animal. Seront notamment évalués les taux sériques de vitamine D3, les niveaux d’ocytocine (indicateur de bien-être et de lien social), les taux de cortisol (marqueur de stress), ainsi que des paramètres comportementaux tels que l’inactivité, les stéréotypies, l’hyperagitation, l’exploration et les interactions sociales. In fine, ce projet contribuera à mieux définir les conditions d’hébergement standards et leurs effets sur le bien-être des ouistitis, une espèce modèle en recherche biomédicale. Parallèlement, les méthodologies de dosage non invasives développées dans cette étude pourront être appliquées à d’autres espèces de primates non humains, voire à d’autres vertébrés partageant des mécanismes physiologiques similaires. Les résultats obtenus, qu’ils confirment ou non les hypothèses initiales, permettront d’éclairer les pratiques d’élevage et de conservation. Ils pourraient ainsi proposer des approches innovantes pour améliorer les conditions de vie des animaux en milieu confiné, tout en répondant aux exigences éthiques croissantes. Enfin, une meilleure compréhension de ces mécanismes ouvrira la voie à une standardisation des protocoles et à une amélioration de la rigueur scientifique des études utilisant des modèles animaux, en réduisant les biais liés au stress chronique.
Procédures
Deux prélèvements sous anesthésie à 1 mois d'intervalle (1mL de sang et poils coupés à la tondeuse). Les anesthésies dureront entre 5 et 10 minutes. 4 prélèvements de selles non invasifs sans contention ni anesthésie.
Impact sur les animaux
Stress lors des captures, anesthésies, hématome possible suite au prélèvement sanguin, stress potentiel au retour de l'animal dans son groupe.
Devenir
Tous animaux seront gardés en vie à la fin du projet, l’obtention de résultats dans ce projet n'étant pas invasif et ne nécessite pas la mise à mort des animaux.
Remplacement
L’objectif de l’étude est l’amélioration du bien-être des ouistitis hébergés en captivité dans nos colonies et une amélioration de leurs conditions de vie. Le ouistiti constitue ici l’objet même du projet et pas seulement le modèle utilisé pour atteindre l’objectif. Il n’est pas possible de remplacer l’espèce étudiée par des alternatives non animales dans ce contexte.
Réduction
Pour obtenir des résultats significatifs, nous avons déterminé par test statistique la nécessité d’étudier un total de 112 à 192 ouistitis pour l'ensemble de l'étude sur 4 établissements (28 à 48 individus/centre). Un minimum de 24 animaux par site (12 par groupe de traitement) est requis. Cependant, compte tenu de la forte variabilité observée, une cible de 28 à 48 animaux par EU est recommandée pour permettre des analyses statistiques robustes. Le centre hébergeant actuellement 32 animaux tous seront inclus (sauf les jeunes de moins d'un an moment de l'étude et les femelles allaitantes).
Raffinement
Les animaux sont hébergés en groupes sociaux ou en famille en volières ou en cages avec un enrichissement structurel (hamac, tunnel, branche, etc.) et alimentaire favorisant les comportements naturels (insectes vivants, gomme arabique). Les animaux impliqués dans ce projet proviennent de notre élevage et sont habitués des tous petits à la présence humaine. De plus, les animaux qui participeront au projet sont régulièrement entraînés par conditionnement opérant. Lors des phases expérimentales et l'observation, les captures et manipulation seront effectuées par les personnes assurant leur entrainement de manière à limiter le stress lié à la manipulation. Lors des phases de prise de sang les animaux seront anesthésiés et leur réveil sera surveillé, tout comme les interactions sociales seront monitorées dans les heures et jours suivants l’intervention pour s’assurer qu’aucun conflit ne survienne par les zootechniciens et l’équipe en charge du bien-être animal ; dans le cas contraire une surveillance accrue sera initiée. Les prélèvements seront réalisés sous anesthésie afin de réduire le stress. Une anesthésie gazeuse sera utilisée ce qui permet un endormissement et un réveil plus rapide par rapport aux autres techniques ou molécules.
Choix des espèces
Le projet a pour objectif l’amélioration du bien-être d'animaux d'une colonie de ouistitis hébergés en animalerie intérieure n'ayant pas d'accès extérieur et par conséquent aux rayons solaires. La pertinence de l'espèce animale est ainsi en lien avec les besoins spécifiques de l'espèce en termes de conditions d'hébergements, amélioration du bien-être et besoins vitaminiques. Des individus de plus de 1 an seront étudiés pour obtenir des résultats sur des adultes, la croissance affectant l'état physiologique de l'animal et possiblement les niveaux de vitamine D. Nous exclurons de l’étude les femelles adultes gestantes ou allaitantes puisque le niveau de vitamine D change également avec l’état physiologique de l’animal.
Etudes de toxicologie, tolérance locale, pharmacocinétique et pharmacologie chez le macaque cynomolgus
- Recherche appliquée
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
- Tests réglementaires
- Toxicologie et autres tests de sécurité
Cent-dix études réglementaires en trois ans, exigées avant tout essai clinique ou toute mise sur le marché : 2 000 macaques à longue queue vont être utilisés, 1 568 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, 432 en gravité légère. Ils reçoivent des produits par voie orale ou par injection, parfois placés jusqu'à deux heures sur une chaise de contention, isolés en cage individuelle jusqu'à 72 heures pour la collecte d'urine, équipés d'un gilet portant une pompe, d'électrodes, de cathéters permanents ou d'implants de télémétrie posés sous anesthésie. La plupart sont tués pour l'examen des organes exigé par la réglementation, 150 sont réutilisés dans d'autres études, six retournent en élevage et trois sont placés. Le porteur rappelle que la réglementation réserve les primates aux pathologies humaines invalidantes ou mortelles et aux cas sans autre espèce possible, tout en couvrant par ce seul projet médicaments et dispositifs médicaux de commanditaires variés.
Objectifs
L’objectif de ce projet est la réalisation des études réglementaires de toxicologie générale ou de pharmacologie de sécurité ou de tolérance locale ou des études préliminaires (recherche de doses, dose maximale tolérée, étude de pharmacocinétique, pharmacologie et pharmacodynamie) ou des études d’immunogénicité chez le primate non humain. Ces études consistent en l’administration unique ou répétée du produit à tester (médicament ou dispositif médical) suivie par des observations régulières des animaux, pesées corporelles, suivi de la consommation alimentaire, examen ophtalmologique, évaluation des effets sur la tolérance locale (si applicable), évaluation des effets sur les paramètres sanguins ou urinaires, évaluation des effets neurocomportementaux ou sur les fonctions respiratoires, cardiovasculaires et immunologiques, analyse macroscopique et/ou histopathologique, évaluation de la pharmacocinétique et pharmacodynamie du produit. Ces études permettront d’accéder aux essais cliniques afin de confirmer la sécurité et l’efficacité du produit chez l’Homme avant sa mise sur le marché ou d’obtenir l’autorisation de mise sur le marché (dispositif médical). Le nombre d’études pouvant être réalisées au total sur ce projet est de 110 sur 3 ans.
Bénéfices attendus
Les études de toxicologie générale ou de pharmacologie de sécurité ou de tolérance locale sont réglementairement requises par les lignes directrices Européennes et Internationales et représentent une étape essentielle avant de réaliser des essais cliniques sur un médicament humain (sur des volontaires sains à court terme et sur les patients à moyen et long terme), ou pour l’obtention d’une autorisation de mise sur le marché pour les dispositifs médicaux. Elles visent à définir le profil de toxicité ou de tolérabilité des produits à tester et donc rendre les essais cliniques plus sûrs pour les patients ou volontaires participant à l'essai. Elles permettent aussi de définir la dose qui sera testée (avec une marge de sécurité) pour la première administration à l’Homme. Ce projet permettra donc d’avancer dans le développement des solutions thérapeutiques, prophylactiques (préventives) ou diagnostiques innovantes pour le traitement de certaines maladies chez l’Homme.
Procédures
Les animaux pourront être soumis à des prélèvements sanguins, sur animal vigile, en accord avec les recommandations du comité d’éthique et de la structure du bien-être animal. Des récoltes d’urines et de fécès pourront être réalisées en plaçant les animaux dans des cages spécifiques. Les animaux recevront les produits à tester par différentes voies, orale ou injections, avec si nécessaire mise sur siège à contention pour des administrations intraveineuses lentes ou des voies orales sur animaux matures. Les animaux pourront être équipés d’un gilet contenant une pompe ou avec des capteurs pour enregistrer les paramètres ECG. Les animaux pourront être anesthésiés pour tout acte nécessitant une immobilisation de l’animal pour une durée limitée à quelques minutes, comme les examens ophtalmologiques ou les examens physiques détaillés. Pour des examens plus longs ou pour des prélèvements (tels que la moelle ossseuse, liquide céphalorachidien ou biopsies diverses) ou pour des chirurgies telles que les implantations de cathéter ou d’implant de télémétrie, l’anesthésie sera plus longue et plus profonde avec un protocole adapté. Le nombre d’anesthésies et de prélèvements sera réduit au maximum de ce qui est nécessaire pour diminuer au maximum l’inconfort des animaux. Les animaux pourront être isolés pendant 24h en post-opératoire des chirurgies de cathétérisme intrathécal pour éviter que les congénères touchent la plaie et qu'on ait des infections. - La fréquence de ces administrations varie en fonction du produit (par exemple 1 fois par jour, 1 fois par semaine) - La durée des administrations est généralement rapide quelques secondes à quelques minutes pour les voies orale et administrations, sous-cutanée, intraveineuse ou intramusculaire. Les administrations par perfusion continue peuvent durer de plusieurs heures par jour ou être en continu. - Des prélèvements seront réalisés pour évaluer les effets sur les paramètres sanguins et urinaires ; généralement 2 à 4 fois par étude. L'évaluation de la pharmacocinétique/pharmacodynamique et mesure des biomarqueurs dans le sang sont réalisés plusieurs fois par étude (généralement 2 à 6 occasions). - Le nombre et la durée des interventions sont adaptés en fonction de l'utilisation clinique, de la durée d'étude, de la cinétique d'exposition, des effets attendus et sont définis dans le plan d'étude.
Impact sur les animaux
Les nuisances pour les animaux peuvent être les suivantes : - Stress, inconfort ou douleur brève, n’excédant pas quelques minutes, lors des procédures d’administration et de prélèvement de sang. Dans le cas d’administration intraveineuse lente la procédure d’administration peut être plus longue (maximum 2h) avec placement de l’animal en chaise à contention. Pour des prélèvements sanguins, l’animal peut être isolé (maximum 1h) dans un compartiment individuel. - Hébergement dans une cage individuelle pour collecte d’urines pendant 72h maximum - Anesthésie de quelques minutes et réveil d’anesthésie avec éventuellement désorientation/perte d’équilibre ou hypothermie lors des examens physiques détaillés ou des examens ophtalmologiques ou tout autre acte nécessitant une sédation légère. - Anesthésie et douleur légère à modérée en post-opératoire (quelques jours) pour la pose des cathéters ou d’implants de capteurs collectant des données physiologiques. - Stress, inconfort lié au port d’un gilet avec une pompe pour les animaux implantés avec un cathéter en permanence depuis la chirurgie jusqu’à la fin de période de traitement. - Stress, inconfort lors de la mise en place d’électrodes ou d’un brassard avec mise en siège à contention pour une évaluation des fonctions vitales telles que ECG ou pression artérielle, pour une durée maximale telle que décrite pour les administrations. - Pour des cas exceptionnels, stress, inconfort lié à la mise à jeun avec isolement dans un compartiment individuel pour une durée maximum de 16h pour recueil d’urines/feces. - Modification ponctuelle et de courte durée du cycle nycthémèral lorsque des actes d’études (prise de sang pour de la bioanalyse, par exemple) devant se faire pendant la période nocturne. - Effets toxicologiques ou pharmacologiques ou effets locaux (sites d’administration) légers à modérés dus à l’administration des médicaments à tester (perte de poids, léthargie, excitation, baisse de la consommation de nourriture, tremblements, irritation ou inflammation locale au site d’administration…).
Devenir
En accord avec le plan d’étude utilisé les animaux pourrons être 1) euthanasiés en fin d’expérimentation en vue d’examens et de prélèvements d’organes ou tissus (examens macroscopiques et/ou microscopiques) tels que requis par la réglementation pour la détermination des organes cibles ; 2) gardés en vie et retourner en zone d’hébergement hors étude suite à l’avis du vétérinaire avec l’évaluation de la gravité réelle des procédures subies ; 3) replacés en accord avec la structure en charge du bien-être animal et les vétérinaires ; 4) hébergés en attente d’inclusion en étude, conditionnée par un examen vétérinaire favorable.
Remplacement
Actuellement, il n’existe pas encore d’alternatives à l’utilisation d’animaux pour évaluer la toxicité de substances dans leur globalité sur un corps entier avec une connectitivé de tous les organes et tissus. Pour le moment, les approches alternatives (NAMs) ne permettent pas elles seules de déterminer la toxicité de substances suite à une expoxition systémique. Dans ces études, un relevé des signes cliniques et des paramètres sanguins des animaux est requis, ainsi qu’une évaluation macroscopique et microscopique des organes nécessitant d’avoir accès à l’animal dans son entièreté, pour évaluer l’ensemble des paramètres demandés par les lignes directrices.
Réduction
Le nombre d’animaux pour les études réglementaires est défini dans les lignes directrices internationales applicables (notamment ICH) et adapté en fonction du nombre de doses testées, du nombre de produits testés et de la présence ou non d’une période de réversibilité. Pour les études préliminaires, le nombre d’animaux par lot est établi au plus juste afin d’obtenir des résultats exploitables et en tenant compte des objectifs de l’étude, du nombre de doses testées et du nombre de produits ; il est précisé dans le plan d’étude. Le plan d’étude est évalué par le comité d’éthique avant le démarrage de l’étude. Dans la mesure du possible, notamment pour les études préliminaires, il n’est pas nécessaire d’avoir un lot contrôle puisque l’on dispose de données prétest ou de données historiques relevantes pour les interprétations. Le développement d’études avec un Virtual Control Groupe (basé sur une banque de données des paramètres principaux de toxicologie obtenue à partir d’études avec le même design et sur le même modèle animal) permettra de limiter également l’utilisation d’animaux contrôles, y compris dans les études réglementaires. Dans les études de télémétrie, le design est en carré latin, l'animal est son propre contrôle et recoit chaque dose produit à tester tour à tour. Ce type de design permet de réduire le nombre d'animaux utilisés. Dès que cela est possible, les paramètres de pharmacologie de sécurité sont évalués dans les études de toxicologie ce qui évite la réalisation d'études de pharmacologie de sécurité standalone et réduit le nombre d’animaux utilisés. Lors que cela est possible, les animaux contrôles réverses peuvent retourner en stock au sein de l’établissement utilisateur, après accord vétérinaire. Lorsqu’aucun effet du genre de l’animal n’est attendu, un seul sexe pourra être utilisé dans l’étude.
Raffinement
Pour améliorer leur bien-être, les animaux seront hébergés en groupes sociaux dans la mesure du possible et auront au moins 15 jours d’acclimatation dans la salle d’étude avant la première administration. Pour limiter le stress des animaux, des séances d'habituation au transfert en compartiment de procédure seront réalisées avec la distribution de récompenses. Les animaux bénéficient également de divers enrichissements tels que des jouets (en rotation sur la semaine), des bâtonnets de bois à ronger, des graines de tournesol/raisins secs, des tunnels en carton et de fruits et légumes en plus de l’alimentation classique. L’hébergement en volière sera privilégié (au moins pour les primates juvéniles) car il comporte des tubes en PVC, des perchoirs, des barrières visuelles et des balançoires. La musique sera présente dans l’ensemble des hébergements. Des récompenses alimentaires seront distribuées après les actes contraignants. Les animaux seront progressivement habitués aux administrations orales, au placement sur siège lors d'administration IV longue, ... Les techniques engendrant le moins de stress ou d’inconfort sur une durée la plus courte possible pour l’animal seront privilégiées. Les actes pouvant engendrer du stress ou de l’inconfort seront réduits au minimum nécessaire (nombre et durée) et seront réalisés sous anesthésie avec un protocole analgésique adapté le cas échéant. Les animaux sont observés au moins 1 fois par jour (incluant le week-end) afin de permettre la détection rapide de signes cliniques et d’agir au plus vite pour limiter toute souffrance ou douleur inutile. En cas de signes cliniques ayant des répercussions sur le bien-être animal, des mesures rapides et appropriées seront prises par le vétérinaire (mise en place d’un traitement médical, interruption des administrations, réduction de la dose testée par exemple). Pour les études préliminaires de recherche de doses, le choix de la dose ultérieure est raffiné et adapté en fonction des effets cliniques observés à la dose précédente, sous supervision éthique. Les procédures chirurgicales seront réalisées sous anesthésie avec un protocole d’analgésie adapté (cf section anesthésie/analgésie de chaque procédure). Pour les candidats médicaments biologiques, un prétraitement pourra être réalisé avec des anti-histaminiques ou corticoïdes pour limiter le risque de réaction immunogène.
Choix des espèces
L’utilisation du primate non humain se justifie d’un point de vue réglementaire car c’est une des espèces non-rongeurs acceptée pour la réalisation d’études précliniques. Le choix du primate non humain est basé sur la réglementation qui réserve l’utilisation de primates non humains aux études précliniques sur des candidats médicaments destinés à traiter des pathologies humaines invalidantes ou mortelles et sous réserve qu’il existe des éléments scientifiques indiquant que la finalité de la procédure ne peut pas être atteinte en utilisant d’autres espèces. Ces données scientifiques peuvent être des données pharmacocinétiques, de métabolisme et de pharmacodynamie et/ou des analogies entre l'Homme et l'animal. L’âge des animaux sera déterminé en fonction du type d’étude et de la population ou des animaux cibles du produit, cela peut varier de l’âge juvénile jusqu’à l’âge adulte, correspondant à la maturité sexuelle. Ce choix est fait en prenant en considération l’ensemble des études réglementaires précliniques qui pourraient être nécessaires pour les essais cliniques chez l’Homme et l’autorisation de mise sur le marché d’un nouveau médicament.
Corticogénèse cérébrale du primate
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système nerveux
Réutilisées d'une gestation à l'autre, 42 femelles macaques de cette colonie enchaînent jusqu'à six césariennes chacune, à raison d'une tous les onze à quinze mois. 59 macaques à longue queue sont comptabilisés au total, quinze opérés sous anesthésie et tués avant tout réveil, 44 soumis à des procédures d'un niveau de souffrance modéré, deux rendus à l'élevage. Les fœtus, 75 en tout, sont tués pour prélever leur cerveau et étudier la formation du cortex. Ceux de moins de 105 jours de gestation ne sont pas comptés dans les effectifs du projet, ce que le porteur justifie par leur utilisation avant le dernier tiers du développement.
Objectifs
Nous avons pour but de caractériser les mécanismes biologiques qui contrôlent la mise en place les caractéristiques structurelles uniques du cerveau humain. La compréhension de ces processus biologiques fondamentaux est un pré-requis pour progresser dans l'étiologie des pathologies neuro-développementales qui sont à l'origine de troubles invalidants (épilepsie, autisme, schizophrénie, etc). Le matériel histologique humain prénatal est rare et la préservation des tissus souvent non optimale, rendant l'interprétation des résultats difficile. Le singe représente un maillon préclinique incontournable. Des travaux récents ont en effet montré que certains mécanismes gouvernant le développement du cerveau sont communs au singe et à l’homme.
Bénéfices attendus
Le bénéfice est de permettre d’avancer dans la compréhension du développement du cortex cérébral de l’homme. Notre projet constitue une étape incontournable pour faire avancer la recherche clinique sur les pathologies neurodéveloppementales chez l’homme.
Procédures
Les femelles auront plusieurs anesthésies générales pour les échographies et les césariennes. Les femelles participeront à un maximum de 6 césariennes selon l’avis de notre vétérinaire référente. En moyenne une femelle subit une césarienne tous les 11 à 15 mois
Impact sur les animaux
L'anesthésie générale provoquera en elle-même un inconfort au réveil avec d'éventuelles nausées. La césarienne pourra susciter des douleurs post-opératoires pendant le temps de la cicatrisation, normalement maitrisé par l'administration d'analgésique et un suivi rapproché par les expérimentateurs et les zootechniciens.
Devenir
Nous avons une colonie de reproduction de Macaques cynomolgus composée d’environ 44 femelles pubères âgées de 4 à 8 ans et 4 mâles qui nous permettront d'obtenir 75 embryons (mis à mort pour recuperer leur cerveau), 45 (9/an) utilisés pour l'étude des précurseurs de la corticogénèse à différents stades embryonnaires (de E35 à E120) et 30 (6/an) utilisés pour des analyses génétiques (sc RNA-Seq, miRNA-Seq). A la fin de la procédure, les animaux pourront être réutilisés pour d’autres procédures ou placés dans des structures d’accueil appropriées.
Remplacement
Le macaque cynomolgus possède un cortex cérébral gyrencéphalique dont l’organisation anatomique et l’ontogénèse présentent des similitudes importantes avec le cortex humain, contrairement à d’autres espèces de primates (marmoset, microcèbe). Le génome du macaque est bien décrit et des atlas neuroanatomiques et d’expression de gènes sont disponibles pour cette espèce. La corticogénèse du macaque est bien caractérisée et a des caractéristiques communes avec le développement du cortex cérébral humain, notamment en ce qui concerne l’organisation des zones germinales. Le macaque constitue donc un modèle de prédilection pour étudier les mécanismes de spécification des aires corticales et les mécanismes développementaux responsables de la mise en place de la connectivité des aires corticales.
Réduction
Les femelles pourront être utilisées pour des gestations successives sauf avis contraire du vétérinaire. En moyenne une femelle subit une césarienne tous les 11 à 15 mois (estimations statistiques réalisées sur une vingtaine d'années). Nous utilisons des tranches organotypiques de cerveaux embryonnaires que nous maintenons en culture pendant 8 à 15 jours pour des observations de la prolifération et de la migration en cinétique videomicroscopique. Afin de minimiser le nombre d’embryons nous avons fait réaliser sur mesure une platine d'observation du microscope biphotonique nous permettant de doubler le nombre de tranches organotypiques observées (48 tranches) ce qui permet de réduire le nombre d’embryons utilisés d'un tiers. Nous menons en parallèle des recherches sur les capacités de différenciation neuronale des cellules souches pluripotentes (cellules souches embryonnaires et cellules souches pluripotentes induites) de primate ce qui permet d'étudier certains aspects de la différentiation des neurones du cortex de primate, ce qui permet de ne pas avoir recours à des tranches organotypiques issues de fœtus.
Raffinement
Nous entrainons les animaux à coopérer (conditionnement par renforcement positif) pour certaines procédures de manière à diminuer le stress de l’animal (déplacement en cage de transfert pour mise au mâle ou changement de volière) et pour des actes non invasifs et non douloureux comme les échographies de contrôle de manière à éviter le recours à l’anesthésie. Actuellement un tiers des femelles sont suffisamment conditionnées pour réaliser cet acte en vigile. Les femelles subissent une anesthesie générale pour la réalisation des césariennes et une fiche de suivi après la chirurgie nous permet d’évaluer en fonction de critères spécifiques les signes indicateurs de gêne ou de souffrance et d'adapter le traitement antalgique si nécessaire.
Choix des espèces
Nos travaux sur la corticogénèse chez le primate non-humains nécessite un accès à des embryons d'âge précis. Les techniques de substitution (organoïdes cérébraux) ne peuvent remplacer le tissu vivant pour l’analyse des mécanismes cellulaires et moléculaires qui opèrent in vivo. En effet, les organoïdes obtenus in vitro permettent d’obtenir un échantillon de tissu cérébral sans identité régionale particulière, déconnecté de son environnement physiologique (par ex structures sous corticales, tronc cérébral) et maintenu dans des conditions artificielles qui induisent un stress cellulaire important. Ceci conduit à des anomalies de l’identité des progéniteurs corticaux et de leur différenciation dans les organoïdes. De plus, l’expression des gènes dans les organoïdes cérébraux varie en fonction de la composition du milieu et des conditions de culture, conduisant à des résultats qui ne reflètent pas la situation in vivo. Animaux matures: Femelles de plus de 4 ans et mâles de plus de 5 ans. Les mâles sont utilisés uniquement comme reproducteurs lors des reproductions naturelles et ils ne sont pas comptabilisés dans les animaux utilisés. Fœtus âgés de 35 à 130 jours embryonnaires (durée gestation 165 jours). Comme indiqué en 3.4.10, les fœtus âgés de 105 jours et moins (dans les deux premiers tiers de gestation) ne sont pas comptabilisés dans le nombre d'animaux car ils sont utilisés avant le dernier tiers de leur développement. Nous projetons d’étudier 15 fœtus âgés de plus de 105 jours (dans le dernier tiers de gestation) pour les analyses moléculaires in situ.
Prélèvement de fluides biologiques pour la recherche et développement in vitro, la sélection d’animaux ou la fourniture de produits biologiques
- Production de routine
- Tests réglementaires
Macaques à longue queue : 50
50 macaques à longue queue et 30 ouistitis vont être utilisés dans des procédures classées en souffrance légère, prélèvements de sang répétés et prélèvements de sperme par stimulation de la prostate sous anesthésie, d'une durée de trente minutes, renouvelables après trois jours de repos. Le porteur reconnaît que cette stimulation peut provoquer une douleur du pénis, une douleur ou un saignement recto-anal et une infection urinaire. Après trois échecs consécutifs, un mois de repos précède de nouvelles tentatives. Aucun n'est tué au titre de ce projet, tous étant transférés vers d'autres établissements ou d'autres expériences, l'établissement présentant ces prélèvements comme une manière de "limiter l'utilisation directe" des primates et de suivre les principes de "réduction et de raffinement".
Objectifs
La proximité des primates non humains avec l’espèce humaine en fait des modèles animaux particulièrement valables pour reproduire des pathologies humaines. Ce projet vise à limiter l’utilisation directe des primates non-humains aux seules applications scientifiquement pertinentes et à promouvoir autant que possible la recherche sur leurs produits dérivés. Ce projet décrit donc deux types de prélèvements : prélèvement sanguin et prélèvement de sperme. Ce projet a deux objectifs principaux : 1- Prélever des échantillons biologiques (sang, sperme) afin de valider la pertinence scientifique des primates non-humains ou de sélectionner des individus particuliers sur la base d’analyses sanguines ou de spermogrammes pour confirmer la maturité sexuelle. Ces étapes peuvent être prérequises avant de réaliser des études sur les animaux, en particulier les études réglementaires d’efficacité et de sécurité de médicaments. Cela permet de limiter l’utilisation directe d’animaux en expérimentation, avec des procédures légères et peu douloureuses, et ainsi de suivre les principes de réduction et de raffinement en expérimentation animale. 2- Prélever des échantillons biologiques (sang, sperme) pour fournir ces produits à la communauté scientifique, pour des tests in vitro, des cultures cellulaires, etc. à partir des composants du sang, pour de la recherche fondamentale ou appliquée.
Bénéfices attendus
Ce projet contribuera au développement et à la validation de méthodes analytiques, à l’identification de biomarqueurs et aux tests in vitro préalables aux études précliniques permettant le développement de nouveau médicament, avec l’objectif de réduire l'utilisation de primates non humains. Ce projet contribue également à l'évaluation de l'impact d'un candidat-médicament sur les principales fonctions biologiques, notamment sur la fertilité masculine. Pour cela, il est important de s’assurer que les animaux inclus dans ces études ont bien atteints la maturité sexuelle afin que les résultats obtenus soient fiables et transposables chez l’homme.
Procédures
Les animaux seront soumis à des prélèvements sanguins, sous sédation ou vigile. Le prélèvement sanguin prend habituellement 2 minutes et ne doit pas excéder 5 minutes. Tant que l'état clinique et l'état de bien-être de l'animal le permettent, celui-ci peut être prélevé en respectant les recommandations éthiques de fréquence et de volume. Les animaux seront soumis à un prélèvement de sperme par stimulation de la prostate sous anesthésie. Cette procédure dure environ 30 minutes et pourra être répétée après au moins 3 jours de repos. Si après 3 essais successifs, aucun échantillon de sperme n’a été obtenu, un repos d'un mois est respecté avant de réaliser de nouveaux prélèvements de sperme.
Impact sur les animaux
La manipulation et la contention des animaux peut induire un stress. Pour les procédures réalisées sous anesthésie, les nuisances possibles sont une douleur liée à l’introduction d’une aiguille pour l’injection d’anesthésiant, une hypothermie et un trouble cardiorespiratoire lors du réveil. Les prélèvements sanguins peuvent induire une douleur lors de l’introduction de l’aiguille pour la ponction sanguine, un saignement persistant, l’apparition d’un hématome ou d’une fistule artérioveineuse. Les prélèvements de sperme peuvent induire une douleur du pénis due à la stimulation externe, une douleur ou un saignement recto-anal ou une infection urinaire liés à la stimulation de la prostate.
Devenir
Les prélèvements biologiques ne compromettent pas la réutilisation ou l'utilisation continue dans un autre établissement utilisateur. Chaque animal fait l'objet d'une évaluation clinique et de son état de bien-être avant d'être transféré vers un autre établissement.
Remplacement
Afin de répondre aux objectifs de ce projet, le recours à l’expérimentation animale est nécessaire car il s’agit de vérifier que les animaux vivants ont bien les caractéristiques physiologiques permettant leur inclusion dans une étude pré-clinique. D’autre part, il n’existe pas à l’heure actuelle de méthode alternative permettant de modéliser les produits sanguins de primates non humains.
Réduction
Pour une demande d'un volume défini, nous faisons en sorte de prélever le minimum d'animaux possible tout en respectant les bonnes pratiques de volumes/fréquences de prélèvements sanguins en fonction du poids des animaux. Pour les prélèvements de sperme, seuls les macaques mâles d’âge suffisant et dont les testicules sont suffisamment développés sont inclus dans le projet.
Raffinement
Pour limiter le stress et la légère douleur de la ponction, les animaux peuvent être prélevés sous sédation. Des systèmes de contention adaptés sont développés pour limiter les manipulations directes et la contention manuelle des animaux vigiles. En cas de prélèvement vigile, l'animal reçoit des friandises en récompense pendant et après le prélèvement. Les volumes prélevés/administrés respectent les bonnes pratiques éthiques. Le prélèvement de sperme par électrostimulation rectale est réalisé sous anesthésie légère, pour réduire l’inconfort et le stress. Si animal voit son état de santé se dégrader, indépendamment ou non des procédures, il est immédiatement exclu des procédures de prélèvements et un traitement adéquat est mis en place sous la responsabilité d’un vétérinaire.
Choix des espèces
La proximité des primates non humains avec l’espèce humaine fait de ces espèces des modèles animaux pertinents en recherche biomédicale. Le macaque cynomolgus et le ouistiti commun sont deux espèces particulièrement utilisées dans le développement de nouveaux candidat-médicaments (études précliniques réglementaires) ou dans la recherche fondamentale. La recherche et développement sur leurs produits dérivés sont étroitement liés à ces besoins. Nous répondons à la demande des expérimentateurs demandeurs qui évaluent et justifient la pertinence de l’espèce animale sur laquelle ils travaillent in vitro, ou les expérimentateurs demandeurs qui souhaitent évaluer la pertinence des primates non humains par rapport à d’autres espèces animales, ou sélectionner spécifiquement certains individus avant toute étude in vivo. Prélèvement sanguin : animaux juvéniles (macaques : minimum 20 mois, ouistitis : minimum 10 mois) ou adultes, correspondant à l’âge d’inclusion en étude préclinique. Prélèvement de sperme : macaques subadultes de minimum 36 mois ou adultes, pour évaluer l’état de maturité sexuelle.
Etude de la tolérance et de l’efficacité d’un gel lubrifiant en prophylaxie contre l’infection par le VIH chez le macaque cynomolgus
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Tests réglementaires
- Toxicologie et autres tests de sécurité
Pour tester un gel lubrifiant censé prévenir la transmission sexuelle du VIH, 25 macaques à longue queue femelles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune peut subir jusqu'à huit applications du gel, 25 anesthésies, 25 prélèvements sanguins, trois biopsies de tissus et trois colposcopies vaginales. Seize d'entre elles au maximum sont exposées au virus une fois par semaine pendant huit semaines, avec fièvre, diarrhées persistantes et perte de poids attendues en phase aiguë. Celles du test de tolérance sont réintégrées dans l'étude d'exposition, les animales infectées étant tuées pour mesurer la charge virale dans leurs tissus.
Objectifs
Les infections sexuellement transmissibles (IST) constituent un problème majeur de santé publique, avec plus de 1 million de nouveaux cas recensés chaque jour dans le monde, particulièrement chez les femmes. Malgré les efforts déployés à l’échelle mondiale, le virus de l'immunodéficience humaine (VIH) reste un pathogène majeur à l’échelle mondiale. Il est donc nécessaire de développer des stratégies permettant de réduire et de prévenir ces infections. Le préservatif reste aujourd’hui le moyen de protection le plus efficace contre ces infections. Toutefois, son usage reste insuffisant dans certaines populations, pour des raisons sociales, culturelles ou liées à l’impossibilité de négociation au sein du couple. Dans plusieurs régions à forte incidence, notamment en Afrique subsaharienne, les jeunes femmes représentent 80 % des nouveaux cas de VIH. Le développement de moyens de protection autonomes, en particulier pour les femmes, ne nécessitant pas de négociation préalable avec le partenaire, représente ainsi un enjeu important de santé publique. Dans ce contexte, le projet vise au développement et à l’évaluation préclinique de gels lubrifiants microbicides pour prévenir de l’infection au VIH, conçus pour reproduire les propriétés protectrices du mucus naturel au niveau des muqueuses génitales. Dans un premier temps, la compatibilité du gel avec les tissus muqueux et les paramètres biologiques généraux de l’organisme au gel seront évalués après administration dans le vagin . Dans un second temps, la protection du gel contre l’infection sera évaluée par l’analyse des paramètres virologiques et immunologiques. Le modèle retenu est le macaque cynomolgus femelle, référence pour l’étude de la transmission muqueuse du VIH, en raison de la proximité de son système immunitaire avec celui de l’être humain, de la proximité anatomique et physiologique de son appareil reproducteur, de son cycle menstruel et de sa sensibilité à l’infection par un virus simien reproduisant les caractéristiques de l’infection HIV.
Bénéfices attendus
Le projet permettra le développement de nouvelles approches pour la confection de gel lubrifiant microbicide contre les infections sexuellement transmissibles (IST). Tout d’abord contre l’infection VIH chez la femme, et à long terme dans le développement d’un produit à plus large spectre contre les IST pour les femmes et les hommes.
Procédures
Les interventions prévues dans ce projet sont : • Administration du gel lubrifiant candidat ou contrôle (jusqu’à 8 administrations, sur 25 animaux, 1x par semaine, 2min) • Anesthésie des animaux (jusqu’à 25x, sur 25 animaux, 30min) • Prélèvements sanguins (jusqu’à 25x, sur 25 animaux, 5 min) • Biopsie de tissus (maximum 3, sur 25 animaux, 30min). • Suivi de l’environnement vaginal (récolte de fluides vaginaux, jusqu’à 25x, sur 25 animaux 2min) • Infection de 16 animaux maximum, (jusqu’à 8 infections à une fréquence d’une exposition par semaine, 2min) • Colposcopie vaginale, (3x maximum sur 25 animaux, 10min)
Impact sur les animaux
Nuisance liée au traitement Suite au traitement, une réaction locale d’inflammation peut apparaitre : démangeaison, douleur de façon transitoire. Nuisances liées aux prélèvements sanguins et biopsies tissulaires -Une réaction locale après prélèvement sanguin -Une réaction locale, suppuration, démangeaisons/douleur peuvent apparaitre après une biopsie tissulaire de façon transitoire. Nuisance liée à l’anesthésie Les anesthésies répétées peuvent entrainer une baisse de l’alimentation et par conséquent une perte de poids. Nuisance liée à l’infection sexuellement transmissible Les animaux infectés peuvent développer de la fièvre, des diarrhées persistantes, une perte de poids et une baisse du niveau de lymphocytes T de façon transitoire en phase aigüe (durée : quelques semaines). Nuisances liées aux colposcopies La colposcopie n'est pas un examen douloureux mais des crampes peuvent être ressenties après l’examen.
Devenir
Les animaux issus du test de tolérance seront gardés en vie et ils pourront être inclus dans l’ étude de protection afin de réduire le nombre d’animaux utilisés après avis du vétérinaire. Les animaux exposés au virus seront euthanasiés pour l’évaluation de la charge virale tissulaire et des réponses immunitaires dans les tissus.
Remplacement
L es études de tolérance et de l’efficacité d’un produit prophylactique contre des virus aussi critiques que VIH, ne peuvent pas être testées directement chez l’ être humain mais doivent montrer une efficacité dans des conditions proches de ce qui ce qui passe chez l’être humain. L’étude de tolérance et d’efficacité d’un produit au niveau vaginal implique un modèle proche de l’humain au niveau anatomique, du système immunitaire et de sa capacité à être infecté par le VIH. Aucune méthode alternative ne permet actuellement d’évaluer simultanément : • La tolérance locale sur une muqueuse génitale fonctionnelle ; • La protection induite dans un modèle d’exposition répétée au virus reproduisant les conditions de la transmission sexuelle.
Réduction
La taille des groupes a été réduite au minimum nécessaire à une analyse statistique fiable des résultats par des tests adaptés pour pouvoir conclure de la tolérance et de l’efficacité de traitements prophylactiques candidats tout en prenant en compte une certaine variabilité individuelle.
Raffinement
Hébergement Les animaux seront hébergés en groupes avant le début des expérimentations et pendant le test de tolérance. Pendant la phase d’infection, les animaux seront en hébergements individuels proches afin d’éviter la surexposition virale tout en permettant des interactions sociales entre eux. L’enrichissement sera renforcé pour les animaux hébergés individuellement (distribution 2 fois/semaine d’enrichissements destructibles ou de sachet surprise au lieu d’1). En plus, du raffinement (nourriture plus variée, compléments alimentaires) sera mis en place quotidiennement. Anesthésie Les interventions (administrations, prélèvements de tissus, colposcopies) et les prélèvements de fluides seront regroupés autant que possible et réalisés sous anesthésie générale afin d’éviter le stress et d’éventuelles douleurs. Les anesthésies répétées pouvant entrainer une baisse de l’alimentation, une diversification et complémentation de celle-ci pourront être instaurées. Le recours à des techniques d’analgésie et d’antalgie pourra être mis en place lors d’apparitions de signes particuliers. Prélèvements sanguins et tissulaires En cas de signes cliniques liés aux biopsies tissulaires => signalement au vétérinaire, afin de mettre en place un traitement symptomatique en local. Traitement intravaginal Le vétérinaire de l’installation sera alerté en cas d’apparition de signes cliniques (rougeurs, démangeaisons) afin d’adapter le suivi et les soins aux animaux. Infection lors du test d’efficacité Les animaux seront observés quotidiennement. Les expositions virales seront interrompues dès confirmation de l’infection. En cas de modifications majeures des paramètres biologiques après analyses des prélèvement sanguins (, associées à l’apparition de signes cliniques, un avis vétérinaire sera demandé. Examens colposcopiques Des colposcopies permettront de déterminer l’intégrité de la muqueuse vaginale et des signes d’inflammation avant et après traitements. Les colposcopies seront effectuées sous anesthésie pour éviter le stress, aucune douleur n’est attendue lors de cet examen.
Choix des espèces
Le macaque cynomolgus femelle de plus de 3 ans a été choisi en raison de la pertinence scientifique de ce modèle pour l’étude de la transmission muqueuse du VIH retrouvé chez la femme. L’environnement vaginal et le système immunitaire varie au cours de développement et de l’âge de l’animal et ont donc un impact sur la susceptibilité à l’infection virale et sur les effets d’un traitement prophylactique. Ces études seront donc réalisées chez des macaques cynomolgus femelles de plus de 3 ans possédant un système immunitaire « mature ». Le macaque Cynomolgus partage à la fois une grande similarité avec l’être humain au niveau anatomique et morphologique du système reproducteur féminin, mais aussi au niveau de son système hormonal, et de son cycle menstruel. De plus le macaque cynomolgus possède un système et une réponse immunitaire proche de l’ être humain. Ce modèle est susceptible à l’infection par le virus simien, et développe une physiopathologie proche de celle observée chez l’humain atteint du VIH. Aucun autre modèle animal ne permet d’évaluer simultanément la tolérance au niveau de la muqueuse, l’impact hormonal et l’efficacité prophylactique dans un contexte d’exposition virale répétée.
MicroTRF: Effets d’une alimentation diurne chez un primate omnivore nocturne
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système nerveux
24 des 80 microcèbes seront tués pour prélever leur cerveau et y chercher des traces de formation de nouvelles cellules nerveuses, les 56 autres retournant dans la population captive où ils pourront être réaffectés à d'autres projets, dans des procédures d'un niveau de souffrance léger. Pendant cinq mois ils reçoivent des régimes alimentaires différents, dont un régime enrichi en graisses servi pendant leur phase de repos diurne, avec prélèvements sanguins toutes les deux semaines, mesures du métabolisme, de la composition corporelle et tests cognitifs. Cinq jours de calorimétrie en cage individuelle interrompent l'hébergement en groupe, les seuls contacts restants étant vocaux et visuels. Le porteur retient cette espèce pour sa proximité phylogénétique avec l'être humain et pour sa flexibilité métabolique, un microcèbe pouvant varier de 10 % de son poids en une semaine sans que cela soit considéré comme pathologique.
Objectifs
Les mammifères présentent un rythme circadien de 24 heures, permettant de synchroniser les fonctions biologiques aux variations environnementales, notamment l’alternance jour/nuit. Cette synchronisation repose sur l’interaction entre l’horloge centrale et les horloges périphériques, et est principalement régulée par la lumière. La régulation du métabolisme est fortement dépendante de cette coordination pour maintenir l’homéostasie énergétique. Cependant, la pollution lumineuse et/ou des rythmes alimentaires irréguliers peuvent perturber cette synchronisation, induisant un désalignement entre horloges centrale et périphériques. La lumière artificielle nocturne inhibe la sécrétion de mélatonine, perturbant le rythme veille/sommeil et les horloges métaboliques (foie, muscles). Ces désynchronisations augmentent le risque de troubles métaboliques, surtout lorsqu’elles sont combinées à une prise alimentaire durant la phase de repos. La flexibilité métabolique dépend des horloges circadiennes, qui optimisent les processus métaboliques selon le cycle jour/nuit, et apparaît comme un facteur clé de prévention des déséquilibres métaboliques. Elle pourrait prévenir l'apparition de troubles associés à la consommation d'un régime riche en graisses, ou à des heures non conformes au rythme endogène. Cette hypothèse sera testée chez un primate omnivore nocturne qui présente une grande flexibilité métabolique associée à un jeûne comportemental diurne strict. En désynchronisant l'accès à la nourriture du rythme endogène de cet animal (nourrissage de jour pendant la période de repos diurne), nous allons vérifier si sa flexibilité métabolique naturelle prévient l'apparition de troubles métaboliques et cognitifs, même avec un régime enrichi en graisses, contrairement à ce qui est observé chez les rongeurs.
Bénéfices attendus
Nos résultats permettront d’évaluer la flexibilité énergétique d’un primate omnivore face aux variations de son régime alimentaire et d'une perturbation du rythme d'alimentation. Ce projet nous permettra de mieux formaliser les relations entre rythmes biologiques, alimentation, métabolisme et fonction cérébrale chez un modèle connu pour sa très grande flexibilité métabolique, chez qui une exposition à un régime enrichi en graisse n'induit pas de troubles métaboliques ou cognitifs, comme observé chez le rongeur.
Procédures
Tous les animaux de ce projet (N=80) seront exposés à différents régimes alimentaires pendant 5 mois et seront exposés à des prélèvements sanguins réguliers (toutes les 2 semaines), des mesures de leur taux métaboliques, de leur composition corporelle et de leurs capacités cognitives.
Impact sur les animaux
Les possibles effets indésirables attendus résident surtout dans les troubles métaboliques qui pourraient apparaître avec la combinaison d'un régime enrichi en graisses avec un décalage des horaires de prise alimentaire par rapport au rythme circadien naturel de l’animal. Néanmoins, le régime enrichi en graisses a déjà été testé dans un précédent projet et n'a pas induit de troubles physiologiques et cognitifs, même après 5 mois. Le suivi des paramètres sanguins (glycémie et acides gras circulants) ainsi que des indices comportementaux au quotidien (signes de prostration, absence d’alimentation, symptômes apparents de gêne ou de douleur, agressivité, surléchage, etc) permettront de s'assurer du maintien du bien-être des animaux. A cet égard, le microcèbe se caractérise par une très grande flexibilité métabolique; nous faisons l'hypothèse que les changements de régime alimentaire ne devraient pas affecter sur le long-terme l'état de santé des animaux. Nous précisons toutefois que les volumes et fréquences prévues sont très en deçà des volumes maximaux recommandés.
Devenir
A l'issue de l'unique procédure de ce projet qui sera appliquée sur une durée de 5 mois, 56 animaux seront maintenus en vie et retourneront dans la population captive et pourront éventuellement être réutilisés pour d'autres projets en fonction de la compatibilité des procédures. Les 24 autres animaux seront seront euthanasiés dans le but de réaliser des prélèvements de tissus fixés, en particulier pour évaluer par marquage immunohistochimique les effets des régimes alimentaires sur certains processus cérébraux (formation de nouvelles cellules nerveuses par exemple.
Remplacement
Le recours aux animaux se justifie pleinement et ne peut être remplacé car les études physiologiques portant sur des influences métaboliques ne peuvent être réalisées que chez des animaux vivants, dans un système intégré. Par conséquent, l’impact du régime enrichi en graisses et de la synchronisation/désynchronisation de la prise alimentaire avec le cycle circadien de l’animal sur ses capacités cognitives ne sera observable qu’en réalisant des tests de mémoire sur animaux vivants. De même, nous ne pouvons pas mimer la flexibilité métabolique in vitro ou ex vivo, il est donc nécessaire d’utiliser l’animal dans son entier.
Réduction
Pour la majorité des tests effectués dans l’étude (mesure des paramètres sanguins, urinaires, métaboliques, comportementaux et cognitifs), et afin de répondre à l’exigence de réduction du nombre d’animaux, un nombre de 10 animaux adultes par sexe et par groupe expérimental a été déterminé pour assurer un pouvoir statistique suffisant, prenant notamment en compte la variabilité interindividuelle. Pour les mesures immunohistochimiques, nécessitant le recours au sacrifice des animaux, le nombre d'animaux nécessaires a été réduit à 3 par condition expérimentale (N=24 au total), ce qui est classiquement réalisé dans ce type d’étude et permet d’atteindre des seuils statistiques satisfaisants afin de déceler des effets entre les groupes expérimentaux, notamment pour les processus comme la neurogenèse.
Raffinement
Le but de cette étude étant de caractériser l'impact du régime alimentaire sur la physiologie et les capacités cognitives, une grande attention sera portée au maintien des conditions optimales pour le bien-être des animaux en essayant d’être le moins intrusif possible et donc d'observer les animaux dans les conditions les plus physiologiques possibles. Dans cette optique, les animaux seront maintenus en groupe durant la majeure partie de l’étude (et non isolés comme il est souvent le cas dans les protocoles de suivi du régime alimentaire) et dans leurs pièces d'animalerie respectives pour réduire le stress. Cela ne sera pas le cas lors des périodes de calorimétrie indirecte pendant lesquelles les animaux seront hébergés dans des cages individuelles pendant 5 jours, permettant néanmoins des interactions vocales et visuelles. Les animaux bénéficieront donc d'un environnement familier et enrichi selon les pratiques habituelles de l'animalerie. L'ensemble des procédures expérimentales appliquées a été raffiné au cours des dernières années afin de limiter le stress et le mal-être des animaux, en étant notamment pratiquées par des opérateurs expérimentés. Tous les animaux seront surveillés quotidiennement afin de s’assurer du bien-être des animaux utilisés. Pour cela, des indicateurs comme le poids de l’animal, la prostration, l’absence d’alimentation, des symptômes apparents de gêne ou de douleur (irritations, etc) ou enfin des troubles du comportement (agressivité, sur-léchage, etc) sont particulièrement suivis. En particulier, chez cette espèce saisonnière, les variations de poids peuvent aller jusqu’à 10% en une semaine. Une perte de poids sera considérée comme pathologique à partir du moment où ce seuil sera dépassé. Dans ce cas, en accord avec la SBEA, l'animal est retiré de l'expérience et on s'assure qu'il récupère correctement (reprise de poids); si tel n'est pas le cas, on procède à l'euthanasie après concertation avec le vétérinaire référent.
Choix des espèces
Outre sa proximité phylogénétique avec l’Homme, l'espèce utilisée dans ce projet est particulièrement adaptée à l’étude des mécanismes impliqués dans la flexibilité métabolique. En effet, cette espèce hétérotherme (capable d'exprimer des phases d'hypométabolisme - torpeurs journalières - pour économiser pour économiser de l'énergie) est capable d'ajuster son métabolisme en fonction de la disponibilité alimentaire, comme c'est le cas dans son milieu naturel (variation en qualité et quantité du régime alimentaire au cours de l'année). Par ailleurs, cette espèce exprime une rythmicité circadienne et circannuelle très robuste avec des phases d'activité et de repos très marqués. C'est donc un excellent modèle pour explorer les liens entre horloges biologiques, métabolisme et fonction cérébrale. Toutes les procédures du projet se feront sur des animaux ayant atteint l’âge adulte (entre 2 et 5 ans) pour ne pas perturber la courbe de croissance des animaux et ne dépassant pas la demi-vie de l’espèce afin de ne pas introduire de variabilité à nos mesures qui pourrait être causée par le processus de vieillissement.
Validation d’un modèle d’inflammation cutanée chez le PNH. MODIFICATION.
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
Gardés en vie et réutilisés à la fin, 7 macaques à longue queue vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Une crème inflammatoire est appliquée sur leur dos une à deux fois par jour pendant quinze jours, avec quatre biopsies de peau sous anesthésie et cinq prises de sang, pour valider un modèle de psoriasis. Le modèle avait été testé sur quatre animaux, aux réponses inconstantes. Trois macaques sont ajoutés pour tenter d'obtenir l'effet recherché.
Objectifs
L’objectif du projet est de valider un modème d’inflammation cutanée chez le primate non humain afin de reproduire une réponse inflammatoire cutanée comparable à celle observée chez l’homme dans le cadre d’un psoriasis. Le psoriasis touche 2 à 3 % de la population, ce qui en fait une maladie chronique fréquente et un véritable enjeu de santé publique. Son caractère inflammatoire systémique justifient une recherche active pour mieux comprendre ses mécanismes. Enfin, son fort impact sur la qualité de vie rend indispensable le développement de traitements plus efficaces et mieux tolérés. De plus, le psoriasis partage des mécanismes inflammatoires avec d’autres maladies auto-immunes extrêmement invalidante, comme l’arthrite rhumatoïde. Les modèles expérimentaux de psoriasis sont donc aussi utilisés comme des portes d’entrées sur d’autres maladies inflammatoires pour lesquelles il n’y a pas de modèles satisfaisants. Mieux caractériser ce modèle au niveau des mécanismes inflammatoires impliqués permettra de l’utiliser pour tester des candidats médicaments dédiés à d’autres indications thérapeutique et accélérera leur développement. Dans le cadre de cette validation, des prélèvements cutanés et sanguins seront réalisés, cette approche permettra de caractériser les profils d’expression génique associés à la réponse inflammatoire et de confirmer la pertinence biologique du modèle. Un modèle similaire a été décrit chez la souris puis chez le primate non humain mais une revalidation est nécessaire : • les données existantes concernent une autre espèce de primate non humain, susceptible de présenter des différences immunologiques. De plus, les données méthodologiques sont lacunaires et ne permettent de pleinement juger de la pertinence du modèle ou de le reproduire. • il faut spécifiquement vérifier l’activation de certaines voies de signalisation inflammatoires dans les lésions induites, étape indispensable pour le développement de candidats thérapeutiques ciblant certaines populations immunitaires. La validation du modèle dans cette espèce vise ainsi à confirmer sa pertinence biologique, sa reproductibilité et son adéquation aux besoins du programme de recherche, en vue de son utilisation ultérieure pour l’évaluation de nouvelles approches thérapeutiques destinées aux maladies inflammatoires cutanées.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus de ces projets sont à terme, la validation d’un modèle préclinique qui induit une réponse inflammatoire cutanée similaire au psoriasis humain, tant sur le plan clinique qu’immunologique, d’étudier les mécanismes immunitaires induits par cette crème chez le primate, plus proche de l’homme que les rongeurs, pour mieux caractériser les voies impliquées et enfin d’avoir un modèle validé pour évaluer l’efficacité et la tolérance de nouvelles approches thérapeutiques.
Procédures
Au cours de ce projet, les animaux vigiles auront une application de crème sur le dos quotidiennement pendant 15 jours pour 4 animaux et bi quotidiennement pour 3 animaux. L’application de la crème et la contention durera environ 10 à 15 minutes. Cette contention pour l’application de la crème permettra également de faire une observation dermatologique rapprochée quotidienne du site d’application. Les animaux auront également 5 prélèvements de sang de 2,5ml, pour un volume total prélevé de 12,5 ml sur 2 semaines. Les animaux seront vigiles lors des prélèvements de sang uniquement les jours sans biopsie de peau. Les jours de biopsie, les animaux seront anesthésiés, les prélèvements de sang se feront donc à ce moment-là. Chaque prélèvement dure entre 3 à 15 minutes (contention et prélèvement compris). Quatre prélèvements de peau par animal seront réalisés chez tous les animaux et sous anesthésie générale et analgésie (après une mise à jeun inférieur à 16h). Pendant cette anesthésie, des mesures spécifiques dermatologiques tel que l'hydratation ou le pH de la peau seront prisent de manière non invasive avec des appareils de mesure spécialisé pour 4 animaux uniquement. Le prélèvement durera environ 30 minutes (anesthésie et mesures comprises) et environ 20 min sans les mesures pour les 3 autres animaux. Le suivi des poids tout au long du projet nécessitera une contention d’environ 5 minutes. Pour le confort des animaux, certains prélèvements et suivis pourront être réalisés simultanément (ce qui diminuera le nombre de manipulations et de contentions). Des points limites précoces ont été déterminés afin de prendre en charge toute forme de douleur ou de souffrance. En cas d’atteinte d’un de ces points, l’animal concerné sera pris en charge selon les recommandations du vétérinaire.
Impact sur les animaux
Sur la base du mode d’action de la crème utilisé et de sa cible cutanée des lésions au niveau de la peau pourront être observées. La réalisation de prélèvements sanguins peut également provoquer un stress, une douleur légère et/ou l’apparition de réactions locales (du type hématome ou oedème léger par exemple) au niveau de la zone de ponction. Les prélèvements de peau sous anesthésie pourront provoquer des douleurs au niveau de la zone de prélèvement ainsi qu’un hématome et dans de très rare cas une déhiscence de plaie ou infection de la zone de prélèvement. L'anesthésie des animaux pourra également engendrer un stress ou une sensation d'inconfort lié à la mise à jeun (maximum 16h), à la procédure d'induction (contention, administration, perte de conscience...) ou lié au réveil de l'animal (risque de vomissements, perte d'équilibre...).
Devenir
À la fin du projet, tous les animaux seront gardés en vie après examen et avis du vétérinaire de l’établissement utilisateur.
Remplacement
Le modèle d’inflammation cutanée présenté vise à reproduire une réponse inflammatoire cutanée complexe, impliquant des interactions immunitaires proches de celles observées chez l’homme. Ces caractéristiques sont essentielles pour garantir la pertinence des résultats et la prédictivité des réponses thérapeutiques. Bien que des modèles de peau in vitro permettent d’étudier certains mécanismes cellulaires, ils restent limités dans la reproduction de la complexité immunologique, vasculaire et systémique observée in vivo. À ce jour, aucune méthode alternative in vitro ou in silico ne permet de capturer de manière fiable cette dynamique intégrée. L’utilisation des animaux demeure donc indispensable pour valider le modèle et assurer la transposabilité des données vers la clinique dans le cadre du développement de nouvelles thérapies.
Réduction
Le nombre estimé d'animaux utilisés dans ce projet a été défini à 4 primates. Il a été réduit au minimum afin de tout de même obtenir des résultats fiables interprétables. Le but étant aussi de faire des analyses génétiques, il était important d'avoit au moins 4 animaux pour avoir une diversité de profils et de variations potentielles. AJOUT : Lors de la première procédure, quatre animaux ont été utilisés et ont montré des réponses différentes : certains ont bien réagi, d’autres moins. Ces résultats indiquent que le modèle fonctionne, mais que l’effet recherché n’a pas été obtenu de manière constante. L’ajout de trois animaux supplémentaires est donc proposé afin de mieux comprendre cette variabilité et d’augmenter les chances d’observer l’effet attendu.
Raffinement
Afin d'optimiser leur bien-être et de leur permettre d'exprimer leurs besoins comportementaux, les animaux sont hébergés en groupes sociaux de même sexe. De l'eau fraîche ad libitum est mise à leur disposition et un aliment adapté à l'espèce et au poids de chaque individu est distribué quotidiennement. Les paramètres environnementaux de l'animalerie sont également suivis et contrôlés afin de répondre aux exigences physiologiques de l’espèce. En parallèle, un programme d'enrichissement complet est mis en place au sein de l'animalerie. Ce dernier comprend : - Des enrichissements structuraux permettant aux primates d'évoluer dans un environnement tridimensionnel ; - De la litière pour leur permettre de fourrager ; - Des jouets variés faisant l'objet d'une rotation une fois par semaine pour éviter que les animaux ne se lassent ; - Des friandises et des fruits et légumes frais distribués quotidiennement (cachés dans la litière ou dans des jouets distributeurs) ; - De la musique d'ambiance est diffusée pendant la journée à un volume raisonnable dans le but de réduire le stress en couvrant le bruit causé par les activités du personnel dans les salles adjacentes et en habituant les animaux à la voix humaine. Une période d'acclimatation sera mise en place avant le début de l’étude. Un programme d'habituation à l'Homme et de conditionnement aux actes techniques associés à du renforcement positif permettra de réduire le stress des animaux lié aux manipulations (prise de sang, application de la crème). Les animaux seront suivis individuellement et bi-quotidiennement tout au long de l'étude pour détecter tout signe de stress ou de douleur. De même, le personnel veillera à garder une interaction quotidienne avec chaque animal afin de diminuer le stress qui pourrait être engendré par les manipulations. Les temps de repos accordés aux animaux entre les prélèvements et les volumes prélevés respecteront les recommandations éthiques en vigueur. Des mesures préventives et correctives de diminution de la douleur et du stress ont été déterminées au préalable sans compromettre les objectifs scientifiques de l’étude. Enfin, des points limites précoces ont été déterminés afin de prendre en charge toute forme de douleur ou de souffrance. En cas d’atteinte d’un de ces points, l’animal concerné sera pris en charge selon les recommandations du vétérinaire.
Choix des espèces
L’utilisation du primate non humain pour le modèle d’inflammation cutané induit par l’application d'une crème sur la peau est justifiée par sa similarité immunologique avec l’humain. Les primates ont un système immunitaire proche de celui de l’humain. Ce modèle induit une inflammation de la peau et une activation immunitaire locale. Chez le primate, l'activation immunitaire est exprimé de manière comparable à l’humain, ce qui garantit une réponse pertinente pour l’évaluation des thérapies. Le développement de ce model permettra d’avoir des résultats transposables et prédictifs pour l’homme. Des animaux juvéniles seront utilisés dans ce projet (jeunes adultes). Dans la littérature, certaines études montrent que les animaux matures (>4ans) sont statistiquement plus sujet aux anomalies liées au vieillissement pouvant affecter la qualité des échantillons prélevés et notamment les analyses histologiques. Sachant que des prélèvements de peau pendant l’étude seront réalisés en fin d’étude dans ce projet, il est préférable d’écarter au maximum ce biais lié à l’âge des animaux.
Etude des principales protéinopathies chez le primate non-humain par comportement et imagerie
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
Jusqu'à deux chirurgies cérébrales de quatre heures et des séances répétées d'IRM et de TEP sous anesthésie générale sur un an: 60 macaques à longue queue vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue. Des protéines pathologiques humaines sont injectées dans leur cerveau pour y reproduire une maladie de Parkinson ou d'Alzheimer et suivre l'apparition de troubles moteurs et cognitifs. Le porteur juge le primate "indispensable" au motif que les rongeurs ne reproduisent pas les symptômes cognitifs. Tous les cerveaux sont prélevés après la mise à mort pour analyse.
Objectifs
Les maladies neurodégénératives comme la maladie de Parkinson, la maladie d’Alzheimer ou la paralysie supranucléaire progressive se caractérisent par l’accumulation progressive d’agrégats protéiques spécifiques dans le cerveau. Avec l’évolution de la maladie et le vieillissement cellulaire, ces agrégats deviennent toxiques, entraînant la mort des neurones et l’apparition de symptômes moteurs et cognitifs. Il est donc essentiel de comprendre le rôle de ces agrégats dans le développement des déficits, d’évaluer leur impact fonctionnel et d’explorer des stratégies thérapeutiques visant à favoriser leur élimination, telles que les immunothérapies. Les modèles animaux classiques, notamment les rongeurs, permettent de reproduire certaines lésions mais ne reflètent pas pleinement les symptômes, en particulier cognitifs. Cette limite pourrait s’expliquer par les différences anatomiques entre le cerveau humain et celui des rongeurs. Ainsi, l’utilisation d’un modèle animal phylogénétiquement proche de l’Homme apparaît indispensable pour étudier les conséquences fonctionnelles de l’accumulation de protéines pathologiques. Des travaux récents montrant le caractère « infectieux » de certaines protéines ont ouvert la voie au développement de modèles chez le primate non humain. Ces modèles animaux permettent de reproduire les mécanismes d’agrégation protéique et d’induire des troubles moteurs et cognitifs similaires à ceux observés chez les patients même à des stades précoces de la maladie. Ils offrent également la possibilité d’un suivi longitudinal (au cours du temps) des lésions et du comportement grâce à des techniques d’imagerie non invasives directement applicables à l’Homme telles que l’IRM, les examens ophtalmologiques et la tomographie par émission de positons (TEP). L’objectif du projet est double: développer des modèles de maladies neurodégénératives chez le primate non humain par différentes approches (surexpression de protéines pathologiques humaines ou de protéines de synthèse), et suivre in vivo l’évolution des agrégats protéiques en lien avec l’apparition et la progression des déficits moteurs et cognitifs.
Bénéfices attendus
Ce projet va permettre de développer de nouveaux modèles animaux plus robustes et pertinents d’un point de vue biologique des principales maladies neurodégénératives, telles que la maladie de Parkinson, la maladie d’Alzheimer ou la Paralysie Supranucléaire Progressive. L’utilisation de méthodes non-invasives similaires à celles utilisées dans les hôpitaux va permettre une meilleure application à l’Homme. Sur le long terme, ces nouveaux modèles animaux permettront de valider des thérapies innovantes ou des biomarqueurs diagnostiques ciblant ces maladies neurodégénératives.
Procédures
Les animaux seront anesthésiés pour inoculer des protéines mutées synthétisées in silico ou isolées et amplifiées à partir de cerveaux de patient. . Un maximum de deux chirurgies de 4h maximum espacées de 6 mois sont prévues. Les animaux seront ensuite réévalués à 6 mois et 12 mois post injection. Les animaux seront évalues de la façon suivante à 3 temps espacés de 6 mois : - Comportement moteur spontané sans restriction alimentaire ou hydrique (1h/j/4j à 4 temps différents maximum). - Comportement cognitif sur écran tactile avec renforcement positif et sans restriction alimentaire ou hydrique (1h/j/4j à 4 temps différents maximum). - Imagerie IRM sous anesthésie générale pendant 1 à 3 heures maximum par session avec un minimum de 1 session et un maximum de 3 sessions espacées d’au moins une semaine par temps et un maximum de 4 temps. - Imagerie TEP sous anesthésie générale durant 2 à 4 heures maximum par session avec un maximum de 3 sessions espacées d’une ou deux semaines (voir renouvelée une fois à 6 mois) en fonction de la nécessité de réaliser des prélèvements sanguins (tous les traceurs TEP ne demande pas des prélèvements de sang pour l’interprétation des résultats). Un maximum de 3 temps 12 mois. - Imagerie ophtalmique sous anesthésie générale durant 1 à 3 heures maximum par session avec un maximum de 3 sessions espacées d’au moins une semaine et un maximum de 3 temps sur 12 mois. - Un prélèvement sanguin et de LCR sous anesthésie (15min).. Ces prélèvements sont couplés à l’un des examens d’imagerie pour réduire le nombre total d’anesthésies.
Impact sur les animaux
L’administration de vecteurs viraux ou des protéines entraine une douleur locale, de courte durée et légère. La délivrance de ces composés dans le cerveau entraine une douleur locale due à l’ouverture de la peau et la rétraction du muscle. Les anesthésies, qu’elles soient de courte durée ou plus longues, génèrent un risque d’hypothermie (stress thermique) si la température n’est pas contrôlée. De plus, la mise à jeun la nuit qui précède l’anesthésie et la manipulation des primates avant anesthésie pourraient induire un stress jusqu’à leur réveil, nourrissage et remise en groupe social. Les anesthésies de longue durée nécessitent la pose d’un cathéter veineux pour maintenir une anesthésie en continue et une intubation ce qui entraine une douleur locale, légère, et de courte durée. Pour les chirurgies et les examens d’imagerie, la nécessité d’immobilisation peut entrainer une nuisance locale transitoire au niveau du canal auditif jusqu’au retrait du cadre. Le maintien de l’œil ouvert lors des examens ophtalmologiques peut entrainer une douleur locale transitoire. Les anesthésies répétées peuvent induire une perte de poids, raison pour laquelle un suivi du poids sera réalisé tous les mois pendant toute la durée de l’expérience.
Devenir
Tous les animaux du projet seront euthanasiés à la fin du projet afin de pouvoir prélever leurs cerveaux. Des analyses histopathologiques et biochimiques seront réalisées afin de caractériser l'expression des protéines aberrantes dans les différentes régions du cerveau, ainsi que l’inflammation, afin de valider les résultats obtenus in vivo.
Remplacement
Pour ce projet, le recours à l’animal est nécessaire, car aucun milieu de culture, organoïdes ou système synthétique, ne permet aujourd’hui de reproduire la complexité architecturale et fonctionnelle du système nerveux au point de prédire la cinétique d'accumulation des protéines anormales et leur impact fonctionnel. Par ailleurs, la réaction du système immunitaire suite à la surexpression d’une protéine doit aussi être évaluée dans un modèle animal proche de l’Homme pour augmenter sa valeur prédictive en termes de sureté et absence d’effets adverses.
Réduction
Une veille de la littérature est faite pour éviter de refaire des expériences déjà publiées. Le nombre d’animaux prévu dans ce projet a été réduit au minimum afin de pouvoir exploiter correctement les résultats. Un calcul statistique de puissance a été réalisé afin de dimensionner les groupes expérimentaux. De plus, le suivi longitudinal chez le même individu par des méthodes d’évaluation fonctionnelle non-invasives (imagerie et comportement) permet de réduire le nombre d’animaux en évitant l’euthanasie pour une confirmation histologique à différents temps, et sans compromettre la possibilité d’observer un effet pathologique significatif.
Raffinement
Afin de minimiser le stress et l’angoisse des animaux d’élevage importés pour des utilisations scientifiques, les primates seront acclimatés pendant au moins un mois en dehors de la quarantaine et avant la date de début du protocole. Le protocole d’anesthésie pour la réalisation des études comporte des analgésiques pour minimiser l’inconfort. La surveillance rapprochée suite aux anesthésies et plus particulièrement après les chirurgies à l’aide d’une grille d’évaluation péri-opératoire, l’évaluation du comportement moteur tous les 6 mois à l’aide d’une grille adaptée au modèle , le suivi régulier du poids, l’interaction avec la Structure chargée du Bien Être des Animaux (SBEA) et la mise en place de points limites clairs permettent de limiter les nuisances liées aux interventions. De plus, le nombre d’interventions ainsi que leur durée sont réduits au maximum. L’interaction positive au quotidien avec les personnels impliqués dans l’étude constitue aussi une forme d’enrichissement.
Choix des espèces
Le macaque adulte est retenu comme modèle d'étude sur les critères suivants : - il n'est pas possible de reproduire tous les signes pathologiques des maladies neurodégénératives dans les modèles cellulaires/organoïdes ou les modèles rongeurs, et par conséquent, il est difficile de prédire l'effet d'une thérapie chez l'Homme. - il permet d'intégrer des méthodes d'évaluation fonctionnelle, telles que l'imagerie, le comportement et les signes cliniques, qui peuvent être directement extrapolés à l'Homme dans une démarche translationnelle et utilisant des équipements d’imagerie et de tests comportementaux identiques ou similaires à ceux utilisés en clinique. - sa ressemblance anatomique et fonctionnelle du cerveau par rapport à l’Homme. La taille et la structure du cerveau permettent des analyses anatomiques et fonctionnelles strictement comparables à celles réalisées dans les mêmes conditions que chez les patients. Les animaux seront adultes (6 ans ou plus) pour mieux mimer le stade auquel les maladies neurodégénératives donnent lieu à des signes cliniques et pour éviter toute plasticité cérébrale présente chez les jeunes individus.
Impact du microbiote sur la réponse immunitaire du nouveau-né face à une infection respiratoire virale dans un modèle de primate non-humain.
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Troubles respiratoires
322 macaques à longue queue vont être utilisés pour étudier la réponse immunitaire du nouveau-né à une infection respiratoire, dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré. Les adultes subissent jusqu'à dix-sept anesthésies, vingt-trois prélèvements sanguins et des lavages broncho-alvéolaires, tandis que tous les nouveau-nés sont tués, parfois jusqu'à l'âge de trois ans, pour prélever leurs organes. Une partie des adultes, 214 individus, est gardée en vie et réutilisée après contrôle de leur état de santé. Le porteur qualifie le recours au primate d'"indispensable", aucun modèle in vitro ne reproduisant selon lui les interactions étudiées.
Objectifs
L’objectif du projet est d’explorer le rôle du microbiote dans l’immunité à la naissance, et d’anticiper les effets délétères causés par son altération (dysbiose) précoce, notamment face à des infections respiratoires virales chez l’enfant. Le système immunitaire est immature à la naissance et se développe au cours des premières années par interaction avec l’environnement. Le microbiote intestinal, soit l’ensemble des micro-organismes peuplant nos intestins, est acquis principalement lors de l’accouchement par voie basse puis via l’allaitement. Il interagit avec le système immunitaire via la production de métabolites et module les composés produits par les cellules immunitaires hôte. Le microbiote, indispensable au rôle de barrière des muqueuses et à l’apprentissage de l’immunité locale, régule la reconnaissance des pathogènes et assure le bon fonctionnement du tissu. La littérature montre qu’une dysbiose altère la capacité du système immunitaire à répondre à une infection. Or, le microbiote peut être fragilisé par l’utilisation d’antibiotiques, pratique fréquente en pédiatrie. Malgré sa reconstitution, les conséquences à court et long terme de cette perturbation passagère restent mal comprises. Notre hypothèse est qu’une telle altération chez le nouveau-né contribue à la sévérité de certaines maladies respiratoires de la petite enfance. La compréhension du rôle du microbiote est donc déterminante pour envisager des stratégies thérapeutiques adaptées. Ce projet vise le virus respiratoire syncytial (VRS), principal agent responsable des bronchiolites aiguës chez l’enfant, dont les symptômes peuvent être très sévères. L’objectif de ce projet est d’évaluer l’impact du microbiote sur la réponse immunitaire à une infection virale chez le primate non-humain nouveau-né. Une procédure préliminaire sera menée chez des macaques juvéniles et adultes afin d’évaluer la quantité et la présence dans l’organisme des différents antibiotiques utilisés en pédiatrie. Une phase pilote sera ensuite réalisée chez des macaques juvéniles et adultes pour mettre au point le modèle d’infection par le VRS afin de limiter les études préliminaires chez les nouveau-nés. Puis nous comparerons des microbiotes altérés ou non par une antibiothérapie dans les premiers jours de vie. Enfin, des stratégies thérapeutiques fondées sur la vaccination maternelle ou sur une intervention néonatale (vaccinale ou probiotique) seront évaluées.
Bénéfices attendus
Ces travaux sur le primate non-humain permettront d’approfondir les connaissances en immunité pédiatrique actuellement limitées chez le nouveau-né humain pour des raisons évidentes d’éthique, mais également de difficulté d’accès aux différents compartiments (sang, muqueuses, moelle, poumons) et de volume disponible pour les échantillons. Le bénéfice attendu dans un premier temps est une meilleure compréhension des interactions et des mécanismes régulateurs entre système immunitaire et microbiote au cours des premiers temps de vie d’un nouveau-né. C’est au cours de cette période que se façonne la capacité du système immunitaire à réagir à une infection virale ainsi que sa mémoire immunitaire. En analysant ensuite l’impact d’un microbiote intacte ou altéré sur la réponse immunitaire à une infection, nous espérons pouvoir anticiper les effets délétères causés par un déséquilibre du microbiote (dysbiose) précoce. Enfin, l’exploration de stratégies préventives (vaccination maternelle ou administration néonatale de vaccin ou de probiotiques), permettra d’envisager l’ajustement de la prévention et le traitement des nouveau-nés. Au-delà des connaissances fondamentales attendues, ce projet vise également des applications pour la santé humaine. La collaboration avec les pédiatres a pour objectif de transposer ces résultats à l’amélioration des stratégies thérapeutiques lors des dysbioses précoces et à la prévention et la maitrise des infections respiratoires chez les enfants en clinique.
Procédures
Adultes pour pharmacocinétique : - Anesthésie : 17/animal (entre 30 min et1h) - Traitement antibiotique : 1 administration/jour (10min) jusqu’à 7 jours max/animal. - Prélèvements sanguins : 23/animal (5 min). - Écouvillonnages mucosaux : 9/animal (5 min). - Urines : 10/animal (récupération dans la cage sans intervention sur l’animal) - Imagerie in vivo : jusqu’à 6 sessions/animal (durée < 1 h). - Lavage broncho-alvéolaire (LBA) : 3 prélèvements (20 min). Juvéniles et adultes : - Anesthésie : 11/animal (30min à 1h) - Prélèvement de sang : 10/animal (5 min) - Ecouvillonnage des muqueuses : jusqu’à 10 fois par animal (5 min). - LBA : 5 max (20 min) - Exposition virale : 1 exposition, 30 min - Implantation d’une puce de suivi de la température : 1 fois, 30 min - Imagerie in vivo : 4 sessions max (< 1 h). - Suivi de la respiration : 3/animal (10 min) - Hébergement individuel : 1 fois, 4 semaines max Mères : - Anesthésie : jusqu’à 40/ animal (30 min-1h) - Echographies : 2-3 fois (intervalle 1 mois entre, 30 min) - Prélèvement de sang : Jusqu’à 25 fois en moyenne/animal (durée 5 min) - Ecouvillonnage des muqueuses : Jusqu’à 25 fois en moyenne (5min) - Lait maternel : 25 collectes (10 min) - LBA : Jusqu’à 7 lavages (20min) - Ponction de moelle osseuse : 5 ponctions (20 min) - Vaccination : 1 injection au cours de la gestation (5min) Nouveau-nés : - Anesthésie : jusqu’à 45/animal (15 et 30min) - Prélèvement de sang : jusqu’à 45/animal (5min par prélèvement) - Ecouvillonnage des muqueuses : jusqu’à 45/animal (5min) - LBA : jusqu’à 17 lavages (20min) - Ponction de moelle osseuse : jusqu’à 10 (20min) - Exposition virale : 1 exposition (30min) - Traitement antibiotique ou probiotique : 1 administration/jour pendant 1 à 4 semaines (20min) - Imagerie in vivo : 3 sessions (< 1 h)Euthanasie en fin d’étude
Impact sur les animaux
Nous distinguons les effets de l’expérimentation des effets liés aux infections et traitements. Chez les nouveau-nés, les juvéniles et les adultes, l’infection par le VRS entraîne, d’après la littérature, des formes le plus souvent asymptomatiques, légères ou modérées. Des symptômes pourront être relevés (fièvre, baisse d’activité, lésions pulmonaires) mais sont transitoires et résolus en moyenne après deux semaines. La vaccination maternelle et néonatale pourrait être associée à une réaction locale au site d’injection qui serait transitoire, avec rougeur et gonflement, résolue en quelques jours. Enfin l’administration de probiotiques par voie orale se fera autant que possible par succion et non par gavage, en respectant les volumes préconisés. Nous devons maîtriser la fréquence et la durée des interventions lors des premiers jours de vie afin de ne pas interférer avec la croissance du nouveau-né ni impacter la relation mère/nouveau-né. La fréquence et la durée des interventions lors des premiers jours de vie, sous anesthésie ou vigiles, peuvent engendrer une hypothermie transitoire, un stress, interférer avec la croissance du nouveau-né ou impacter la relation mère/nouveau-né voire un risque de rejet. De même, le sevrage peut entraîner un stress lié à la séparation avec la mère. Les prélèvements de sang répétés peuvent engendrer des perturbations transitoires du profil hématologique. Ce projet repose sur notre expérience passée qui a démontré que nous pouvons suivre un schéma expérimental tel que celui décrit, sans impacter la croissance des nouveau-nés ni la relation avec les mères.
Devenir
Les juvéniles et les adultes seront gardés en vie à la fin de l’étude pilote et réutilisés une fois que l’état sanitaire des animaux aura été vérifié. Tous les nouveau-nés primates non-humains seront euthanasiés, jusqu’à l’âge de 3 ans, pour accéder aux organes et ainsi à l’analyse fine des différents compartiments d’intérêt (charge virale, populations immunitaires, microbiote, métabolites, histologie…). Les femelles primates non-humains seront sorties du projet un mois après le sevrage et pourront être réutilisées sur avis vétérinaire. Elles servent de contrôle des différents systèmes matures et adultes, mais il n’est pas nécessaire d’accéder aux tissus, nos données de laboratoire seront utilisées si nécessaire.
Remplacement
Ce projet nécessite l’étude du système immunitaire et du microbiote en fonctionnement, et ces systèmes intégrés et leurs interactions ne peuvent pas être reproduits in vitro. De même, reproduire in vitro des symptômes dans le cadre d’une pathologie respiratoire n’est pas possible. Le recours à l’animal reste donc indispensable. Nous utiliserons un modèle de primate non humain, le macaque cynomolgus, pour sa proximité phylogénétique avec l’humain : il présente une forte homologie au niveau des acteurs et de l’organisation de la réponse immunitaire et vaccinale mais aussi de la composition microbiotique, contrairement à ce que l’on peut retrouver chez d’autres modèles animaux. Ce modèle, sensible à l’infection par le virus étudié, fera l’objet d’une phase pilote préalable destinée à optimiser les conditions expérimentales et à valider leur pertinence biologique dans ce contexte.
Réduction
Le nombre d’animaux a été ajusté au strict minimum nécessaire pour permettre l’interprétation des effets des conditions expérimentales, tout en tenant compte de la variabilité interindividuelle. Pour les études de pharmacocinétique et de mise au point du modèle juvénile/adulte d’infection, la réduction est obtenue par une évaluation séquentielle des conditions, avec des groupes de 2 animaux pour chaque combinaison testée. Cette approche permet d’écarter rapidement les conditions non pertinentes sans multiplier les groupes. Deux animaux supplémentaires ne seront ajoutés que pour la combinaison ayant montré les résultats les plus concluants, afin de confirmer les observations. Pour l’étude sur le modèle d’infection néonatale, l’effectif est limité à six animaux par groupe, correspondant au minimum requis pour l’analyse prévue. Les paramètres expérimentaux appliqués aux nouveau-nés sont ceux ajustés au cours de la phase préliminaire incluse dans ce projet, évitant ainsi toute répétition d’essais exploratoires à ce stade.
Raffinement
Les animaux seront suivis tous les jours avec une attention particulière pendant les deux premières semaines de vie. Des grilles d’évaluation permettront de suivre et détecter tout écart au bien-être animal. En cas d’atteinte d’un point limite, des mesures seront prises (arrêt des interventions, traitement, sortie d’étude), selon avis du vétérinaire et de la structure du bien-être animal. Également, en cas d’apparition de douleurs ou de signes cliniques liés aux prélèvements ou à l’infection, un traitement symptomatique pourra être mis en place. L’unité minimale d’hébergement des animaux sera le couple mère/enfant qui ne sera séparé qu’au-delà de l’âge minimal réglementaire (8 mois) de sevrage pour cette espèce afin de reformer de nouveaux groupes. Dans l’ensemble, le groupe social multifemelles et multi-nouveau-nés sera favorisé au maximum. Toute intervention sera faite sous anesthésie générale réversible pour permettre un réveil rapide des animaux, avec une anesthésie non systématique du nouveau-né lors des premières semaines de vie, lorsque la balance bénéfice/risque n’est pas favorable (risques d’hypothermie ou de rejet maternel trop importants) par rapport au temps nécessaire pour l’intervention. Enfin, toutes les techniques et analyses ont été miniaturisées pour la procédure chez les nouveau-nés, afin de réduire les volumes de sang nécessaires à prélever.
Choix des espèces
Ce projet a pour objectif final d’évaluer l’impact d’une perturbation du microbiote d’un nouveau-né sur sa réponse immunitaire à une infection respiratoire, et ainsi évaluer le bénéfice de certains traitements ou vaccins sur les effets délétères liés à cette perturbation. Seuls les primates non-humains présentent des caractéristiques anatomiques, physiologiques et immunologiques, en termes de réponse immunitaire et vaccinale, suffisamment proches de l’humain pour permettre une étude pertinente de ces phénomènes. Nous avons choisi le macaque cynomolgus, qui a déjà été modèle d’infection pour nos virus d’intérêt dans des études scientifiques, et chez qui les techniques et outils d’exploration du système immunitaire et du microbiote sont disponibles et maitrisés. L’étude pharmacocinétique de molécules telles que les antibiotiques, ne nécessite pas d’être faite chez le juvénile ou le nouveau-né et se fera sur l’adulte car leur maturité physiologique permet une caractérisation stable et reproductible des profils d’exposition, ce qui facilite l’optimisation des doses et des modalités d’administration avant leur transposition aux animaux plus jeunes. Des animaux juvéniles et adultes sont également mobilisés pour la mise au point et la validation du modèle d’infection par le RSV, les juvéniles présentant un système immunitaire encore en développement, plus proche de celui des nouveau-nés que celui des adultes, tout en permettant des investigations expérimentales plus robustes et moins contraignantes. Cette étape est nécessaire pour établir les conditions d’infection, évaluer la pertinence immunologique du modèle et sécuriser son transfert ultérieur aux stades néonataux. Enfin, notre étude, qui s’intéresse à des développements in utero et néonataux, nécessite d’avoir accès à des femelles gestantes et aux nouveau-nés issus de ces gestations.
MODIFICATION – Etude préliminaire de criblage de vecteurs adéno viraux associés (AAV) après injection intravitréenne, intracochléaire et intraveineuse successivement chez le macaque fascicularis
- Recherche appliquée
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
- Tests réglementaires
- Toxicologie et autres tests de sécurité
Dix macaques à longue queue subissent une même opération de quatre heures combinant une injection dans l'œil, une dans l'oreille interne et une par voie intraveineuse, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Tous seront tués pour analyser où se distribuent les vecteurs viraux testés. Le porteur reconnaît des risques d'hémorragie du vitré, de décollement de rétine et de troubles de l'audition et de l'équilibre. Il justifie le recours au primate par l'échec fréquent, chez le singe, des vecteurs sélectionnés sur la souris.
Objectifs
Le projet est une étude préliminaire visant sélectionner des vecteurs viraux AAV permettant d’apporter à un type de cellule une molécule thérapeutique sensible à la lumière. Cette sélection sera faite d’après l’affinité de ces vecteurs pour les organes cibles (oreille interne, rétine, estomac, cerveau), ainsi que leur distribution dans l’organisme. L’étude sera effectuée comme une étude de toxicologie pour évaluer tout effet potentiellement toxique. La sélection sera faite après leur administration intraoculaire, dans l'oreille interne et intraveineuse au cours d’une même anesthésie chez le macaque fascicularis. Les vecteurs viraux AAV sont dérivés d'un virus non pathogène et sont couramment utilisés dans la recherche biomédicale afin de développer des thérapies chez l’humain. Ils permettent une transduction efficace de nombreux types de cellules de mammifères et une expression génétique stable après un seul traitement d’un ou plusieurs gènes, ce qui permet de compenser un déficit génétique. Les protéines sensibles à la lumière sont utilisées pour développer la thérapie optogénétique, une méthode prometteuse pour compenser la perte des cellules de la rétine ou de restaurer l’audition via des implants intra-auriculaire chez des patients atteints de surdité. Les résultats obtenus permettront de sélectionner les vecteurs viraux les plus prometteurs dans le développement de thérapies optogénétiques chez l’humain.
Bénéfices attendus
Il permet de sélectionner les vecteurs viraux capbles de transduire efficacement dans les différents cellules et tissus cibles pour la réalisation d’études de toxicologie règlementaire prérequis aux essais cliniques de phase I, II et III chez l’humain
Procédures
Les animaux seront soumis à une intervention chirurgicale d'environ 4h et pendant laquelle une injection dans l'oeil, une injection dans l'oreille interne et une injection intraveineuse du produit testé seront effectués successivements. Les animaux seront soumis à des prélèvements de sang effectués vigiles, dans un système de contention adapté, à raison d'un par jour au maximum sur 7 jours. Le prélèvement de sang dure quelques minutes. Un prétraitement sous forme d'une perfusion pourra être effectué selon des résutlats préliminaires, d'une durée maximal de 2h. Un isolement physique pendant la durée d'observation (7 à 15 jours) après les administrations est possible, si aucun animal compatible socialement et scientifiquement n'est disponible.
Impact sur les animaux
Quatre catégories de nuisances peuvent être provoquées chez les animaux utilisés dans ce projet. Elles sont toutes prises en compte de manière préventives pour réduire leur impact. 1)Liées aux manipulations vigiles : en cours d’étude, les observations cliniques, peuvent nécessiter d’une manipulation et une contention manuelle des primates. Elles sont faites selon les bonnes pratiques vétérinaire mais cela peut néanmoins engendrer un stress chez ces espèces non domestiques 2) Liées à la chirurgie : un risque de nuisance modérée pour les animaux (inflammations, douleurs opératoires et post opératoire, etc) est possible 3) Liées aux prélèvements/administration : la réalisation de prélèvements de sang, peut provoquer des lésions locales (hématomes) et un stress modéré des animaux en cas de réalisation incorrectes, d’individus plus fragiles ou bien de l’immobilisation nécessaire. De plus, même si ces effets délétères sont rares lorsque le geste est réalisé par un opérateur expérimenté, il existe un risque d’infection lors d’administration dans la cochlée ou l’œil. Enfin, dans de rares cas, l’injection intravitréenne peut entrainer une augmentation de la pression intraoculaire, hémorragie du vitré, déchirures et décollement de la rétine, inflammation intraoculaire et endophtalmie et l’administration intra cochléaire peut provoquer des troubles auditifs et de l’équilibre se traduisant par exemple par des maux de tête ou des nausées. 4) Liées à une toxicité du mélange de vecteurs testés : ce type de nuisances est difficilement estimable, mais semblent faibles selon les données scientifiques des études chez d’autres espèces. Si des effets toxiques apparaissent, ils seront liés à la biodistribution des vecteurs dont l’évaluation est le but de cette étude.
Devenir
Les animaux utilisés seront euthansiés pour procéder à une analyse de la distribution des vecteurs dans l'organisme.
Remplacement
Actuellement, il n'existe pas de méthodes alternatives permettant d'obtenir toutes les informations collectées grâce à ce type étude, qui visent à sélectionner des variants de vecteurs viraux les plus efficaces pour poursuivre le développement de thérapies optogénétiques. Il faudra pour cela pouvoir modéliser un organisme entier, ce qui n'est pas réalisable pour le moment avec les méthodes alternatives existantes.
Réduction
L’utilisation d’un male et d’une femelle par lot est considéré comme le minimum acceptable permettant une interprétation pertinente des données. L’administration successive des variants AAV chez les mêmes animaux a pour but de réduire le nombre d’animaux d’un facteur 3 à 4 (par rapport à un criblage séparé pour chaque voie d’administration), sans introduire de charge supplémentaire pour l’animal individuel. Les 3 voies d'administrations n'interfèrent pas ensemble car chaque vecteur est identifié par un code spécifique. Les principaux organes cibles sont les cellules cilliées auditives, la rétine, le cerveau et l'estomac, d’où les 3 vois d'administration.
Raffinement
Une période d’acclimatation de 15-21 jours est respectée à réception des animaux, suivie de 1- 2 semaines de training. Les animaux bénéficient d’un programme de training par renforcement positif pour réduire le stress/favoriser la coopération (habituation aux systèmes de contention -boîtes taxi, chaises, gilets- et manipulations progressives reproduisant les gestes techniques de l’étude). Un programme d’enrichissements validé par la structure en charge du bien-être animal est appliqué quotidiennement pour garantir des conditions de vie optimales/minimiser les impacts des expérimentations. Les animaux sont hébergés collectivement, sauf exceptions (bagarre, blessure), avec des enrichissements adaptés à leurs besoins. L’isolement est validé par un vétérinaire et fait l’objet d’un suivi SBEA. Les animaux sont hébergés en groupes sociaux compatibles pour réduire le stress/le risque de blessures liés à un réallotement. Les animaux sont observés quotidiennement pour détecter tout signe clinique anormal et prendre rapidement les mesures nécessaires (réhydratation, isolement pour soin). Toute anomalie est rapportée au vétérinaire, qui prescrit un traitement si nécessaire. Un suivi clinique et pondéral est en place, un fois par semaine pendant la phase de suivi après l’administration. Un vétérinaire est présent aux heures ouvrées, et une astreinte vétérinaire est disponible 24h/24 et 7j/7. À leur inclusion dans le projet, tous les animaux font l’objet d’un examen clinique par un vétérinaire pour s’assurer de leur bon état de santé et exclure ceux jugés inaptes. Une traçabilité des animaux/des actes est assurée pour permettre leur suivi et analyse lors des bilans rétrospectifs. Des systèmes de contention adaptés sont développés pour limiter les manipulations directes et la contention manuelle des primates vigiles (boîte taxi, chaise à contention). Les volumes prélevés/administrés respectent les guidelines vétérinaires. Concernant les administrations : ce sont des voies standard en médecine humaine. Elles seront effectuées sous anesthésie et analgésie par des chirurgiens expérimentés ayant pratiqués ces chirurgies chez l’humain et différents modèles animaux. La réalisation de l’ensemble des administration en une seule anesthésie limite l’accumulation des anesthésies et permet d’évaluer à modérée le degré de sévérité. Pour l'isolement des animaux, celui ci ne serait que physique, et l'ajout d'enrichissements spécifique sera mis en place dès la phase de réveil.
Choix des espèces
Le macaque fascicularis est une espèce reconnue pour son aptitude à prédire les effets pharmacologiques, indésirables et/ou toxiques de produits à visée thérapeutiques humains pour des produits thérapeutiques dont la cible est la plus proche de l’humain, ce qui est le cas pour les structures oculaires et auditives. De plus, les variants AAV sélectionnés sur des modèles murins pour ce type de thérapies se révèlent souvent peu efficace chez le primate humain et non humain, ce qui explique la nécessité de passer par un primate non humain pour les sélectionner plus finement. Il convient d’utiliser de jeunes animaux sains ; les macaques sont utilisés à partir de 2 ans, et jusqu'à 5 ans.
Approches thérapeutiques de l’Adrénomyéloneuropathie (AMN) dans un modèle de souris génétiquement modifiées et chez le primate non-humain.
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
Macaques à longue queue : 6
Cinquante minutes de natation forcée trois fois par semaine pendant quatre mois : 343 animaux, 337 souris et 6 macaques à longue queue, sont utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère, tous tués à l'issue. 120 souris relèvent du niveau le plus élevé. Le projet teste contre une maladie neurologique rare, l'adrénomyéloneuropathie, trois pistes : une thérapie génique injectée dans le cerveau, un régime enrichi et l'effet de l'exercice, avec des tests de coordination et d'équilibre. Les macaques servent à étudier la distribution du vecteur, mis à jeun et isolés avant l'anesthésie.
Objectifs
L’adrénomyloneuropathie (AMN) est une maladie orpheline redoutable, causée par des mutations d’un gène (le gène ABCD1) porté par le chromosome X. Elle endommage progressivement la gaine protectrice entourant les fibres nerveuses du cerveau et de la moelle épinière. Cette maladie altère la motricité des membres inférieurs et prive des milliers de personnes adultes de marcher normalement. Les déficits apparaissent entre 35 et 50 ans et s’aggravent en 10-20 ans. Aux Etats-Unis, l’AMN est dépistée à la naissance à partir d’un prélèvement de sang déposé sur buvard Il n’existe aucun traitement contre cette maladie. On pourra donc envisager dans le futur de la prévenir en agissant tôt dans la vie. Le projet développe 3 stratégies thérapeutiques : 1. Une thérapie génique faisant exprimer le gène ABCD1 normal dans s des cellules de la moelle épinière. Nous avons conçu agents thérapeutiques portant le gène sainet nous avons comme objectifs i) de tester l’effet thérapeutique de ces agents dans le modèle murin de l’AMN ii) d’étudier la biodistribution de ces agents chez le modèle primate non humain. 2. Un régime alimentaire capable de fournir un supplément de nutriments énergétiques (NE) aux axones, cellules permettant de transporter les messages nerveux . Ces suppléments, bien tolérés, testés dans d’autres maladies neurologiques, mais pas dans l’AMN, pourraient pallier le déficit métabolique des axones et prévenir/ralentir l’évolution de la maladie. Nous étudierons leurs capacités à produire des effets positifs chez le modèle souris AMN. 3. Des tests de modification du mode de vie. Notre hypothèse est que l’activité musculaire peut aggraver l’évolution de la maladie, en augmentant la dépense énergétique des axones à l’inverse d’autres maladies neurologiques. Les axones dans l’AMN étant métaboliquement vulnérables, leur imposer une dépense accrue liée à l’exercice pourrait aggraver leur déficit et peut-être accélérer leur dégénérescence.. Dans notre expérience clinique, nous avons observé quelques cas où au tout début des signes, la pratique d’un sport (jogging, marche prolongée, vélo) avait semblé aggraver les déficits. Cette hypothèse peut être testée dans le modèle souris d’AMN, en étudiant les résultats de séances répétées d’exercice.
Bénéfices attendus
Environ 30.000 adultes en Europe et en Amérique du Nord ont une AMN et ne reçoivent aucun traitement. Il y a donc un grand besoin de progrès thérapeutiques. Notre projet expérimental testera trois stratégies spécifiques et possiblement complémentaires. Notre première approche thérapeutique est la thérapie génique. Cette étude permettra d‘évaluer la capacité de cette approche à ralentir ou inverser l’apparition des signes cliniques dans notre modèle murin d’AMN. La thérapie génique est en plein développement pour traiter plusieurs maladies humaines, notamment certaines affections neurologiques. Elle s’appuie sur une dizaine d’années d’essais chez l’Homme. La mise en évidence d’un effet bénéfique de la thérapie génique dans notre modèle ouvrirait une possibilité nouvelle de traitement applicable à l’Homme. La seconde approche est une thérapie fondée sur un régime alimentaire riche en nutriments énergétiques (« nutraceutique »). Ces régimes déjà testés dans d’autres maladies neurologiques trouveraient une place dans la prévention en ralentissant l’évolution de l’AMN. Si notre projet démontre expérimentalement le rôle bénéfique de ce type de régimes sur notre modèle murin d’AMN, il ouvrirait la voie à des essais cliniques de» pour le traitement de l’AMN humaine. La troisième approche est de réduire les exercices musculaires vigoureux chez les personnes atteintes d’AMN. Notre étude permettra de démontrer leur effet néfaste chez ces personnes. En effet, si l’exercice musculaire est recommandé dans certaines maladies neurologiques cérébrales, il n’en est probablement pas de même pour les maladies touchant les très longs axones de la moëlle épinière, qui contrôlent la motricité et l’équilibre des membres inférieurs et où la conduction de l’influx exige une énorme dépense énergétique. La répétition d’exercices vigoureux soumet à long terme ces longs axones à une forte pression métabolique. Pour les axones fragilisés par l’AMN, cette forte pression pourrait favoriser la dégénérescence axonale. Contrairement à une idée répandue chez certains patients « proactifs », un haut niveau d’exercice devrait alors être évité dès les premiers signes de l’AMN. . Les résultats de cette approche permettront de conseiller aux patients d’éviter une activité physique.
Procédures
Chez les modèles primates non humains et souris : - Injection de l’agent thérapeutique : 1 injection sous anesthésie en moins de 15 secondes. - Chirurgie sous anesthésie profonde pour administration de l’agent thérapeutique : 1 intervention, durée 1h30. - Imagerie sous anesthésie : 1 intervention, durée max 1h30. - Habituation à l’expérimentateur : 3 minutes par jour par souris, 5 jours consécutifs. Selon le groupe expérimental 1 à 3 par animal. - Tests comportementaux : Deux types de tests comportementaux seront réalisés afin d’évaluer la coordination et l’équilibre . 3 fois par animal. Test de coordination : Durée : 20 minutes/jour c’est-à-dire 4 passages d’environ 5 minutes max avec 1 heure de repos entre chaque passage. Répétition : 3 jours consécutifs; Test d’équilibre: 4 passages/jour sur la barre, 3 jours consécutifs, durée max 10-15 min - Exercice : 50 minutes de natation 3 fois/semaine pendant 4 mois. - Souris : prélèvement sanguin : 1x/mois entre 12 et 24 mois - NHP : 1 prélèvement sanguin, nécessitant au préalable une mise à jeun (durée 14-15hr max) avec isolement individuel
Impact sur les animaux
Chez le modèle souris : - Injection: possible complication = gonflement autour du site d’injection qui disparait dans les 24-48 h qui suivent l’injection. Cette injection se fera -sous anesthésie
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à la fin des procédures pour prélèvement d’organe afin d’obtenir des mesures concrètes et reproductibles.
Remplacement
Pour ce projet, le recours à l’animal est nécessaire car aucun milieu de culture, organoïde ou système synthétique, ne permet de reproduire la complexité architecturale et fonctionnelle spécifique des structures du système nerveux central au point de prédire les propriétés d’une thérapeutique nutritionnelle.
Réduction
Le nombre d’animaux par groupe a été déterminé par retour d’expérience de plusieurs projets portant sur ce même type d’étude. . Le suivi longitudinal/répété chez le même individu pour monitorer la réponse des tests moteurs permet de réduire le nombre d’animaux nécessaire pour observer un effet significatif des traitements testés.
Raffinement
Chez le modèle souris : Injection au 7ème jour de vie: sous anesthésie générale Injection à 16/18 mois : Anesthésie générale et utilisation systématique d’analgésiques - Souris placées sur des tapis chauffants - Soutien nutritionnel en postopératoire pendant 2 jours Tests comportementaux : précédés d’une phase d’habituation à l’expérimentateur, but : minimiser stress et assurer une reproductibilité optimale de ces expériences. Exercice : familiarisation progressive avec la natation en 2 semaines Régime : Introduction progressive des régimes Imagerie : douleur liée à l’utilisation de barres d’oreilles pour stabiliser l’animal minimisée par application locale anesthésiant 5 minutes avant. Points limites établis pour réduire la souffrance et le stress des animaux Une observation hebdomadaire des animaux, des pesées hebdomadaires seront réalisées. Les primates seront acclimatés pendant au moins un mois en dehors de la quarantaine et avant la date de début du protocole. Le protocole d’anesthésie pour la réalisation des études comporte des analgésiques pour minimiser l’inconfort. La surveillance rapprochée suite à l’administration des produits ou à l’anesthésie, l’évaluation du comportement à l’aide d’une grille tout le long de l’expérience, un suivi du poids hebdomadaire, et la mise en place de points limites permettent de limiter les nuisances liées aux interventions. De plus, le nombre et le volume des prélèvements ainsi que la durée de l’anesthésie sont réduits au maximum. Les primates non-humains seront hébergés en groupes sociaux dans des cages équipées spécifiques de l’espèce. On limitera la durée de l’hébergement individuel lors des mises à jeun pour l’administration des vecteurs, tout en gardant un contact visuel, sonore et olfactif avec les autres primates hébergés dans la même pièce. Des enrichissements adaptés seront mis en place : structurel (balançoire et visuelle, miroir), alimentaire (fruits, graines dans le fourrage); manipulable (jouets), auditif (musique). L’interaction positive au quotidien avec les personnels impliqués dans l’étude constitue aussi une forme d’enrichissement.
Choix des espèces
Le choix de la souris comme espèce se justifie pour les raisons suivantes : il existe une lignée de souris génétiquement modifiées comme modèle d’AMN. Ces modèles présentent des manifestations cliniques et histologiques fiables et représentatives. L’injection des vecteurs se fera à deux stades de vie différents : - à l’âge de 7 jours de vie dans le but de stopper ou ralentir l’apparition des signes cliniques - à l’âge de 16/18mois, à un moment où les signes cliniques commencent à apparaitre. Le développement clinique des approches thérapeutiques demande d’étudier la biodistribution et la sureté des vecteurs AAV dans un modèle bien connu. Le primate non-humain est proche de l’Homme en termes d’organisation anatomo-fonctionnel cérébrale et d’immunologie.Nous utiliserons des jeunes adultes car ils représentent le mieux la physiologie d’un adulte humain, avec un système immunitaire et des organes matures.
Développement de la spectroscopie et de l’imagerie métabolique par résonance magnétique nucléaire chez le primate non humain : Application à l’étude de la compartimentation et de la pharmacologie du lithium
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Macaques rhésus : 6
Jusqu'à cinquante examens IRM de deux heures et cent prélèvements sanguins par animal sur cinq ans, sous anesthésie répétée : 12 macaques, six à longue queue et six rhésus, sont utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Contrairement à la plupart des projets, ils ne sont pas tués à l'issue mais réutilisés dans de nouveaux projets après avis vétérinaire. Le porteur reconnaît que la contention et les suites de l'anesthésie peuvent nuire aux animaux et entraîner une perte de poids, et que le lithium administré peut endommager la fonction rénale. L'étude vise à développer des méthodes d'imagerie métabolique du cerveau.
Objectifs
De nombreuses pathologies cérébrales, neurodégenératives ou psychiatriques, présentent des altérations précoces du métabolisme énergétique, de la neurotransmission ou de la physiologie cellulaire notamment des gradients ioniques transmembranaires. De nouvelles approches d’imagerie par résonance magnétique à haut champ offrent des perspectives prometteuses pour l’étude non-invasive de ces processus physiologiques et biochimiques. Cette multitude d’informations pourraient aider dans la compréhension des processus physiopathologiques en cours dans de nombreuses maladies cérébrales et pour l’évaluation de nouvelles thérapies. Notre projet vise à repousser les limites de l’imagerie métabolique par RMN à travers le développement et la validation d’outils dédiés à l’IRM à haut champ, notamment les schémas d’acquisition optimisés pour les différents noyaux d’intéret en recherche biomédicale et observables in vivo. Nous mènerons des expériences chez le primate non-humain anesthésié pour développer et valider de nouveaux outils d’imagerie cérébrale. En particulier, ces outils serviront à détecter et cartographier la distribution cérébrale en lithium, un élément possédant des propriétés neuroprotectrices et régulateur de l’humeur, chez des animaux auxquels auraient été administrées un traitement aigüe ou chronique aux sels de lithium à des doses thérapeutiques. D’autre part, ces méthodes seront mises en œuvre pour étudier l’activation cérébrale chez l’animal.
Bénéfices attendus
Les méthodes validées et données de référence acquises à l’occasion de ce projet seront utiles pour aider dans la compréhension des processus physiologiques et biochimiques en condition normales et préfigurer les études de recherche biomédicale chez l’Homme par IRM à ultra-haut champ magnétique qui pourraient à terme participer à l’évaluation de nouvelles thérapies.
Procédures
Dans certains cas, des prélèvements sanguins (de quelques secondes) pourront être réalisés chez l’animal anesthésié (juste avant ou juste après l’examen IRM). Le projet prévoit des examens IRM chez l’animal anesthésié à une fréquence maximale bimensuelle et une durée typique de 120 minutes. En pratique, nous envisageons moins de 50 examens IRM et moins de 100 prélèvements sur 5 ans pour chaque animal.
Impact sur les animaux
Les examens IRM sont en eux-mêmes non-invasifs. Par contre, le stress de la contention et les contrecoups de l’anesthésie peuvent être délétères entrainant une possible perte de poids. A long terme ou en cas de surdosage, les sels de lithium peuvent etre délèteres à la fonction rénale.
Devenir
Après avis favorable du vétérinaire, les animaux pourront être réutilisés dans de nouveaux projets.
Remplacement
Nos tests préliminaires seront systématiquement menés sur des objet-tests aux dimensions et caractéristiques électromagnétiques comparables à celles d’un cerveau de macaque adulte. Toutefois, aucun objet-test ne reproduit la complexité anatomique, fonctionnelle et métabolique du cerveau. Le passage par l’expérimentation animale demeure donc une nécessité.
Réduction
Nous comptons utiliser une douzaine de macaques (mâles et femelles), nombre suffisant à la mise au point de nos méthodes et à l’acquisition de données de référence. Les analyses statistiques nécessaires à la validation de nos méthodes, notamment pour l’évaluation de leur reproductibilité et l’établissement de valeurs/images de référence seront déployées. Dans la mesure du possible, nous comptons utiliser des macaques ayant déjà participé à d’autres projets de recherche afin de limiter globalement le nombre de PNH nécessaires en recherche biomédicale.
Raffinement
Les animaux seront hébergés en groupe sociaux stables. Les animaux seront anesthésiés lors des examens RMN et leurs paramètres physiologiques (température corporelle, nombre de respirations par minute) seront suivis en continu afin d’éviter tout effet négatif ou inconfort pour les animaux. Le réveil après les anesthésies est également surveillé de près pour s’assurer que l’animal récupère bien et se nourrit. Les animaux sont suivis régulièrement afin de détecter tout indicateur de souffrance et déterminer si besoin l’arrêt de l’expérimentation en accord avec les points-limites et la structure chargée du bien-être animal et les conseils vétérinaires.
Choix des espèces
Phylogénétiquement très proche de l'homme (développement cortical et sous-cortical), le macaque permet de poursuivre le développement des méthodes préalablement mises au point chez les rongeurs dans des conditions plus proches de l'examen chez l'humain notamment en matière de résolution et d'équipement. Il s'agit d'une étape nécessaire à la validation de nos approches avant l'application chez l’Homme. Pour des raisons pratiques (équipements IRM et autres appareillages) de mise en œuvre, des animaux adultes seront examinés. Pour le macaque, dans le souci de réduire le nombre global d’animaux utilisés dans des protocoles de recherche, nous souhaitons réutiliser dans la mesure du possible des macaques adultes sains âgés de moins de 15 ans au début du projet.