Autres rongeurs

100 mulots sylvestres capturés dans la nature vont être utilisés, tous tués à l'issue par dislocation cervicale, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent des prélèvements de sang par voie rétro-orbitaire sous anesthésie et une injection de LPS, avant d'être tués pour prélever leurs organes. Le porteur anticipe une mortalité de 3 % dans les pièges et un stress lié à la capture et à l'hébergement. Il affirme que l'usage d'animaux sauvages est "requis", la réponse immunitaire des individus sauvages différant de celle des animaux de laboratoire.

Objectifs

Le concept de «One Health» postule que la santé humaine, animale et environnementale sont liées et promeut une approche systémique des questions environnementales, au profit des problématiques de santé publique associées. De nombreux changements environnementaux induits par les activités humaines (Fragmentation des habitats, pollution, zoonoses, ...) affectent les écosystèmes et la faune sauvage à l’échelle mondiale. Parmi ces menaces, l’exposition aux éléments traces métalliques (ETM) peut induire de nombreux effets toxiques à tous les niveaux d’organisation biologique (de la molécule aux services écosystémiques). L’exposition de Mammifères sauvages à des ETM toxiques a montré un effet immunosuppresseur aussi bien en laboratoire qu’en milieu naturel, les rendant potentiellement plus susceptibles aux pathogènes circulant dans l’environnement. Les performances du système immunitaire des animaux sont par ailleurs modulées par la qualité et la quantité des ressources alimentaires disponibles dans leur environnement. Les études abordant les effets des métaux sur le système immunitaire des Mammifères terrestres in natura sont rares et les mécanismes de l’immunomodulation par les métaux et par les ressources alimentaires mal connus. Des études comparatives portant sur le système immunitaire de rongeurs ont montré une différence significative des réponses immunitaires entre des groupes d’individus sauvages et de laboratoires, rendant nécessaire l’expérimentation sur le terrain, en complément d’approches en laboratoire. Dans ce contexte, l’objectif du présent projet vise à comprendre les mécanismes des impacts des métaux toxiques et de la qualité nutritionnelle sur l’état et le fonctionnement du système immunitaire de Rongeurs sauvages. Après une étude préliminaire visant à la mise au point, chez le Mulot sylvestre, de tests immunologiques développés chez la Souris domestique, le projet portera sur le site d’une ancienne fonderie de zinc (Zn) et de plomb (Pb) située dans les Hauts-de-France. Ce site se distingue par un gradient de concentrations en cadmium (Cd), Pb et Zn dans les sols : les concentrations décroissent des zones les plus contaminées, situées au pied de l’ancien site métallurgique, vers des zones peu affectées à plusieurs kilomètres de l’ancienne usine (et considérées comme « témoin » dans la présente étude).

Bénéfices attendus

Ce projet permettra une meilleure compréhension de l’impact des polluants métalliques sur le système immunitaire d’une espèce sauvage, le Mulot sylvestre. Ces résultats permettront de développer des marqueurs de toxicité non conventionnels (par opposition aux marqueurs classiquement utilisés en évaluation des risques écotoxicologiques (ERE) que sont la mortalité, la croissance ou la reproduction) qui pourront à terme être transposés dans les procédures réglementaires d’ERE. L’immunomodulation du système immunitaire par les métaux permettra également d’évaluer l’impact potentiel sur la susceptibilité de ces Rongeurs à héberger des pathogènes zoonotiques, c’est-à-dire transmissible à l’Homme (par exemple les bactéries Borrelia sp. responsables de la maladie de Lyme).

Procédures

Pour les procédures 1 et 2, une prise de sang sera réalisée sous anesthésie générale pour chaque animal. Pour la procédure 3, les animaux recevront deux prises de sang sous anesthésie générale espacées de 5 jours. La prise de sang est effectuée en insérant une pipette Pasteur dans le sinus rétro-orbitaire des Mulots sylvestres pour collecter un échantillon sanguin (~150-200 µL en fonction de la masse de l’animal considéré) par capillarité, méthode de prélèvement considérée comme la moins stressante chez des souris de laboratoire. Le volume de sang maximal prélevé est estimé à 1,5% de la masse corporelle, soit 300 µL de sang pour un individu de 20 g. La prise de sang sera réalisée 2h après une injection intrapéritonéale de LPS (500 µg/kg). A la suite de cette intervention les animaux seront euthanasiés par dislocation cervicale.

Impact sur les animaux

Mortalité La littérature ainsi que l’expérience des personnels impliqués dans ce programme laissent envisager un taux de mortalité de l’ordre de 3%. Les causes de décès peuvent être un stress conduisant à une rupture des cervicales ou un refroidissement en période froide (peu probable au printemps) et/ou pluvieuse dans les pièges. Des arrêts cardiaques peuvent être constatés dans les pièges ou lors des manipulations. En dehors de l’arrêt des captures en cas de conditions météorologiques défavorables, ces mortalités indésirables sont difficilement totalement évitables. Stress à la capture et durant les manipulations Les captures d’organismes sauvages entrainent nécessairement un stress, réduit au minimum par la relève des pièges dès que possible le matin (les captures ayant généralement lieu la nuit). Dès que les animaux sont sortis des pièges ou des cages, et après détermination spécifique immédiate, les animaux non-cibles (Campagnols par exemple) sont immédiatement relâchés, réduisant le stress au minimum. Les animaux-cibles (Mulots sylvestres) sont immédiatement anesthésiés pour la suite des manipulations (examen morphologique pour la détermination du sexe, mesures mophométriques pour la détermination de l’âge, prise de sang, injection de LPS). Les animaux trop jeunes sont relâchés dès les mesures morphométriques permettant d’estimer leur âge, de même que les femelles gestantes. Stress durant l’hébergement L’hébergement, sous tente et avec contrôle des conditions environnementales (Température, hygrométrie), dure de quelques heures à 5 jours maximum dans le présent projet. L’hébergement est individuel, ce qui, au printemps, correspond au comportement solitaire des Mulots sylvestres en période de reproduction et évite d’éventuels comportements antagonistes. L’observation comportementale et la pesée (permettant d’évaluer un point-limite fixé à une perte de masse de 20%) sont quotidiennes de manière à détecter un éventuel stress élevé chez les individus. L’expérience de l’équipe sur cette espèce montre que les individus tolèrent la captivité courte (5 jours) sans montrer de comportements (activité motrice, alimentaire…) dénotant un stress élevé.

Devenir

Les individus seront mis à mort pour un prélèvement d'organes. Ces organes permettront la mise au point de mesures immunologiques et la mesure de l’exposition aux métaux, grâce aux mesures des concentrations dans les tissus. Il s’agit d’une décision prise collégialement par les membres de la structure du bien-être animal de notre unité, au regard des aspects éthiques, scientifiques et logistiques.

Remplacement

L’objectif du projet est d’étudier la réponse immunitaire d’animaux exposés à une contamination environnementale en fonction de leur charge parasitaire (helminthes intestinaux) et de la qualité nutritionnelle de leur alimentation. L’utilisation d’animaux est requise car, à notre connaissance, aucune approche de modélisation ne permettrait d’obtenir de telles données. Des études comparatives sur le système immunitaire de rongeurs ayant montré que la réponse immunitaire d’individus sauvages et d’animaux de laboratoire différaient significativement, l’utilisation d’animaux sauvages est donc aussi requise.

Réduction

La variabilité inter-individuelle des réponses immunitaires est très forte en conditions naturelles. La variabilité liée à la biodisponibilité des ETM (Capacité de transfert de l’environnement vers un organisme) conduit aussi à des concentrations variables en ETM dans les organes cibles de différents individus du même site. Sur la base de ces informations, les effectifs prévus pour les procédures 1, 2 & 3 ne peuvent être inférieurs à 20 Mulots (Procédure 1), 40 Mulots (Procédure 2) et 40 Mulots (Procédure 3) pour garantir une puissance statistique suffisante et la valorisation scientifique des résultats.

Raffinement

Suite à une procédure invasive telle qu’une prise de sang dans le sinus rétro-orbitaire ou une injection de LPS, les animaux sont remis en cage et observés à différents temps après la procédure pour évaluer leur état sanitaire (blessure à l’œil, comportement dénotant une diminution de la vue, apathie, manque d’appétit…). Un point-limite (perte de 20% de la masse) est évalué quotidiennement lors des périodes d’hébergement (qui n’excédent pas 5 jours dans le présent projet). Les animaux seront hébergés sous tente avec un contrôle des conditions environnementales (Température, hygrométrie) et les anesthésies, mesures et prélèvements seront effectués dans le véhicule agréé pour expérimentation animale, donc en un lieu séparé de l’hébergement. Les animaux conservés pour les expérimentations sont hébergés entre quelques heures et 5 jours maximum en fonction de la procédure concernée. Les animaux sont hébergés dans les meilleures conditions possibles (hébergement individuel pour éviter des comportements antagonistes, cages adaptées, enrichissement). L’ensemble des procédures est effectuée par ou sous supervision directe de personnels hautement qualifiés et expérimentés dans le domaine de ce type d’expérimentation.

Choix des espèces

L’espèce choisie est le Mulot sylvestre (Apodemus sylvaticus). Il s’agit d’un Micromammifère abondant, ubiquiste, opportuniste avec un régime alimentaire varié (Majoritairement granivore). Son positionnement trophique intermédiaire le place comme une source de nourriture de premier choix pour un grand nombre de prédateurs (Rapaces et Mammifères) incluant des espèces patrimoniales (Milan royal par exemple). Leurs nombreuses utilisations dans la littérature permettent de les définir comme bio-indicateurs des impacts des activités anthropiques dans les écosystèmes, incluant la pollution environnementale. Leur facilité de capture et leur capacité à être maintenus en captivité en font un modèle biologique idéal par rapport aux objectifs scientifiques de cette étude. Les Mulots sylvestres utilisées dans la procédure 1 permettront de tester le croisement possible entre les techniques développées sur Souris et l’espèce modèle retenue dans ce projet, le Mulot sylvestre. Seuls des individus d’âge subadulte et adulte (masse supérieure à 15g) seront utilisés pour cette étude.

3 150 rongeurs, soit 1 050 souris, 1 050 rats et 1 050 rongeurs d'autres espèces, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent par gavage des appâts rodenticides, une entreprise cherchant à développer et homologuer ces produits destinés à les tuer. Le porteur reconnaît qu'il est "certain que les rongeurs vont subir des nuisances qui devraient les conduire à la mort", les survivants étant ensuite tués. Il présente ces essais comme une "obligation réglementaire européenne" imposant de tester chaque espèce cible et un nombre minimal d'animaux.

Objectifs

Il existe un vrai besoin de développement de nouveaux appâts rodonticides à mettre sur le marché de la lutte contre les rongeurs nuisibles. Cette lutte est justifiée par la nécessité absolue de préserver les personnes et les biens (alimentation, bâtiments et matériels) des risques et méfaits induits par ces rongeurs cibles nuisibles. En effet, ces derniers sont porteurs de zoonoses (maladies transmissibles à l’homme) et sont responsables de plusieurs milliers de morts chaque année, via des contaminations directes ou indirectes. Les maladies véhiculées par les rongeurs ont tué plus de personnes au cours des 10 derniers siècles que toutes les guerres. Ce projet a pour objectif d'évaluer l'efficacité de divers appâts rodenticides, depuis leur développement jusqu'à leurs autorisations de mise en marché (AMM), aux renouvellements périodiques des homologations, ainsi qu'à leur benchmark par rapport aux produits du marché. Il permettra également de faire progresser la connaissance scientifique. La société développe et commercialise des produits de lutte contre les rongeurs nuisibles, sous forme d’appâts. Ces appâts doivent répondre à de nombreux critères pour être efficaces et homologués. Ils doivent être appétents pour les cibles visées afin qu’ils soient consommés et que les rongeurs ingèrent la substance active qu’ils contiennent. Ils doivent être adaptés aux conditions d’utilisation variables selon les cas : lieu sec, humide, chaud, froid … et assurer la stabilité de la substance active et de l’appétence au cours du temps. Le besoin de régulation des populations de rongeurs nuisibles et les exigences réglementaires contraignantes imposent le développement et l'optimisation des formulations d'appâts. Pour procéder à leur développement et à leurs homologations, la société a besoin de conduire des essais sur des produits nouveaux. Elle doit également conduire des essais sur des produits connus en vue du renouvellement périodique de leurs homologations. Enfin, elle se doit de benchmarquer les produits concurrents qui arrivent sur le marché. L’objectif de ce protocole doit permettre de développer puis de valider l’appétence et l’efficacité de formulations d’appâts contenant des substances rodonticides en vue de leur homologation sur les 3 espèces cibles. Les animaux seront utilisés au stade adulte et répartis entre mâles et femelles, le plus équitablement possible. Pour être validé, un essai devra afficher une efficacité d’au moins 90%.

Bénéfices attendus

La conduite de ces essais d'efficacité et d'appétence permettra à l'entreprise de progresser dans ses connaissances au niveau de la formulation d'appâts et de finaliser le développement des nouveaux produits, avant d'engager les demandes d'homologation. Dans les dossiers de demande d'homologation, la réglementation européenne impose la présentation de résultats d'essais conduits en laboratoire avec des animaux de chacune des espèces cibles revendiquées dans les demandes d'AMM. La guidance de l'ECHA impose également le nombre minimum d'animaux par essai, afin d'avoir une représentativité suffisante.

Procédures

Lors de la procédure expérimentale n°2, les animaux seront soumis à des opérations de gavage. Ces gavages pourront être uniques : 1dose gavée une seule fois, ou répétés, une fois par jour sur 2 à 5 jours consécutifs. Les opérations de gavages auront une durée limitée d'une minute par gavage. Pour les procédures expérimentales 1 et 2, les animaux pourront être soumis à un prélèvement sanguin (procédure n°3), sous anesthésie terminale, juste avant euthanasie.

Impact sur les animaux

Dans la mesure où les produits à tester sont des rodonticides, il est certain que les rongeurs vont subir des nuisances qui devraient les conduire à la mort. Afin de réduire au maximum ces nuisances, la règle des 3R et le respect de l'atteinte des points limites seront appliqués.

Devenir

Tous les animaux survivants à l'issue des procédures 1 et 2 seront euthanasiés. En effet, l'exposition aux substances actives et la durée des essais ne permettront pas de les réutiliser dans d'autres essais.

Remplacement

La conduite des essais sur les rongeurs cibles : rats (Rattus norvegicus et Rattus rattus) et souris (Mus musculus) répond à une obligation réglementaire européenne et ne peut être remplacée. Pour pouvoir accéder au marché, ces appâts doivent être homologués. Une des conditions requises pour l'obtention de l'homologation consiste à fournir des résultats d'essais d'efficacité, conduits en laboratoire, selon la guidance de l'ECHA (Guidance on the Biocidal Products Regulation. Volume II Efficacy - Assessment and Evaluation (Parts B+C), Version 3.0, April 2018) qui impose que les essais soient conduits sur les espèces cibles. Par ailleurs, il n'existe pas de méthode de substitution pour valider l'efficacité et l'appétence des appâts. Le recours aux animaux est donc obligatoire.

Réduction

Les trois espèces cibles (Rattus norvegicus, Rattus rattus et Mus musculus) ont des comportements alimentaires différents. Elles ne sont donc pas substituables. Selon la réglementation européenne, les essais doivent être conduits en laboratoire sur chaque espèce cible pour l'obtention des AMM. Les guidances mentionnent qu'il est nécessaire d'utiliser au moins 10 animaux par essai afin d'atteindre une représentativité suffisante des résultats. Imposé par la réglementation, ce nombre d'animaux par essai ne pourra être réduit. Il est prévu, pour la première année du projet : Procédure 1 : 10 essais par espèce, puis 15 essais par an les 4 années suivantes, soit(10x12x1+15x12x4=) 840 animaux par espèce, soit 3x840= 2520 animaux au total, pour la procédure 1 sur la durée du projet. Procédure 2 : 5 essais, dont 2 avec groupe témoin, par espèce et par an soit (5x6x5 + 2x6x5=) 210 animaux par espèce cible sur la durée du projet, soit au total 630 animaux pour la procédure 2 sur la durée du projet. Pour la procédure 3, il n'est pas prévu d'animaux supplémentaires. Les animaux intégrant cette procédure seront tous issus des procédures 1 ou 2. Le total d'animaux prévu sur l'ensemble du projet est donc de 2520 + 630 = 3150 animaux sur les 5 ans du projet. Ce nombre est justifié par le besoin d'appâts de formulations variées afin de répondre aux besoins des différents sites à traiter selon leurs caractéristiques.

Raffinement

Les essais seront conduits dans un environnement enrichi - objets susceptibles d’être rongés ou déchiquetés et pouvant servir à la construction de nids (papiers, cartons, etc)-, par des personnels qualifiés formés au respect des conditions du bien-être des animaux, afin de minimiser au maximum le stress et la souffrance imputables à ces essais. Afin de respecter le caractère grégaire des animaux, les rats seront hébergés à 3 par cage et les souris par groupe de 5 ou 6, en veillant à séparer les mâles des femelles. Pour éviter toute souffrance inutile, le concept de Raffinement et de points limites sera mis en œuvre. Un suivi clinique des animaux sera effectué, au moins quotidiennement, afin de relever la présence d’éventuels symptômes de mal-être. Les animaux moribonds ayant atteint des points limites seront euthanasiés, en accord avec la structure en charge du bien-être animal de l’EU. Pour les essais par gavage et pour les prélèvements sanguins, les gestes techniques seront réalisés par des personnels formés et expérimentés.

Choix des espèces

Les 3 espèces (Rattus norvegicus, Rattus rattus et Mus musculus) répondent à une exigence réglementaire européenne (Règlement BIOCIDE au niveau européen, selon guidance ECHA : Guidance on the Biocidal Products Regulation. Volume II Efficacy - Assessment and Evaluation (Parts B+C), Version 3.0, April 2018). En effet, ces trois espèces représentent les 3 cibles majoritaires des produits développés pour la protection des personnes et des biens, contre les rongeurs nuisibles. La réglementation impose que des essais d'efficacité et d'appétence soient conduits en laboratoire sur chacune des espèces cibles. Les animaux des 3 espèces seront utilisés au stade adulte afin de respecter les guidances de l'ECHA (European CHemical Agency) pour ce type d'essai.

80 souris pygmées (Mus minutoides) vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures classées en souffrance modérée. Le porteur décrit une étude qu'il présente comme "non invasive et indolore", mesure de l'activité locomotrice par caméra et de l'activité métabolique par calorimétrie sur trois jours, tout en isolant chaque animal en cage individuelle, ce qui peut provoquer un mal-être qu'il reconnaît. À l'issue, les souris sont mises à mort et prélevées de nombreux organes, cœur, rein, tête, muscle, pour des mesures complémentaires, le porteur indiquant qu'elles ne peuvent rejoindre l'élevage sous peine d'être rejetées ou tuées par leurs congénères. Sur le remplacement, il affirme que l'étude "nécessite des organismes vivants dans leur intégralité" propres à cette espèce.

Objectifs

Chez les mammifères, le déterminisme sexuel XX/XY reste très conservé, à quelques exceptions près, car toute déviation mène généralement à la stérilité des organismes hybrides. Certaines espèces comme Mus minutoides échappent à cette règle. Chez cette espèce, il existe une inversion sexuelle due à un chromosome X mutant, le chromosome X*, qui féminise les individus. Par conséquent, il existe des femelles XX, XX* et X*Y et des mâles XY chez cette espèce. Outre l’inversion sexuelle, ce troisième chromosome X* entraine de nombreuses différences phénotypiques. Les femelles X*Y ont un meilleur succès reproducteur que les autres femelles, i.e. une première portée plus précoce, une taille de portée plus grande et plus de descendants au cours de leur vie. De plus, elles présentent un comportement très masculinisé, sont plus agressives et moins anxieuses que les femelles XX et XX*. Ainsi, les études jusqu’alors menées chez Mus minutoides se sont surtout intéressées aux différences génotypiques et comportementales observées entre les différents génotypes sexuels. Peu d’études ont investigué la physiologie et encore moins l’influence du génotype sexuel sur celle-ci, chez cette espèce. Ce présent projet a donc pour objectif de poursuivre le phénotypage chez Mus minutoides en réalisant de nouvelles mesures comportementales et physiologiques (de l’animal entier jusqu’à la cellule). Pour cela, 16 femelles XX, 16 femelles XX*, 16 femelles X*Y et 16 mâles XY seront utilisés. Après deux semaines d’acclimatation, les paramètres listés ci-après seront mesurés durant 3 jours consécutifs (mesures répétées) : - L’activité locomotrice par caméra infrarouge. Pour cette analyse comportementale, la durée, la fréquence et le type de déplacement seront considérés. - L’activité métabolique grâce à un système de calorimétrie indirecte. Cette mesure permettant alors d’obtenir des mesures complémentaires à celle de l’activité locomotrice en quantifiant, par exemple, l’énergie utilisée dans les fonctions vitales pour l’animal et celle impliquée dans d’autres fonctions (comme la locomotion) sur 24h. De même, il sera possible de calculer le quotient respiratoire, la prise alimentaire et la prise hydrique des individus étudiés. Cette étude, non invasive et indolore, constitue une opportunité unique de répondre à des questions fondamentales sur les bases génétiques des différences physiologiques et comportementales entre sexes.

Bénéfices attendus

Ce projet est une opportunité unique de répondre à des questions fondamentales sur les bases génétiques des différences cérébrales et comportementales entre sexes et sur le rôle de l’antagonisme sexuel dans l’évolution des chromosomes sexuels. Nous sommes également dans une excellente configuration pour comprendre les bases génétiques encore largement méconnues du déterminisme sexuel chez les mammifères, qui pourrait apporter des éléments utiles à la recherche clinique. Les animaux ne pourront pas être réintroduits dans leur élevage initial sous peine d’être rejetés voire tués par leurs congénères. Ils seront mis à mort et conservés comme échantillons biologiques pour diverses mesures complémentaires (mesures de bioénergétique mitochondriale, western blot, activités enzymatiques, analyse morphométrique, etc) afin de mieux comprendre l’influence du déterminisme sexuel sur le phénotype des individus Mus minutoides et d’apporter de nouvelles connaissances sur cette espèce encore peu méconnue d’un point de vue physiologique.

Procédures

Après deux semaines d’acclimatation, les souris seront placées en cage expérimentales dans les mêmes conditions de stabulation (enrichissement précédent conservé). Pour chaque individu, les paramètres listés ci-après seront mesurés durant 3 jours consécutifs : - L’activité locomotrice par caméra infrarouge. Pour cette analyse comportementale, la durée, la fréquence et le type de déplacement seront considérés. - L’activité métabolique grâce à un système de calorimétrie indirecte. Cette mesure permettant alors d’obtenir des mesures complémentaires à celle de l’activité locomotrice en quantifiant, par exemple, l’énergie utilisée dans les fonctions vitales pour l’animal et celle impliquée dans d’autres fonctions (comme la locomotion) sur 24h. De même, il sera possible de calculer le quotient respiratoire, la prise alimentaire et la prise hydrique des individus étudiés. Cette étude est non invasive et indolore. Elle constitue une opportunité unique de répondre à des questions fondamentales sur les bases génétiques des différences cérébrales et comportementales entre sexes et sur le rôle de l’antagonisme sexuel dans l’évolution des chromosomes sexuels. Nous sommes également dans une excellente configuration pour comprendre les bases génétiques encore largement méconnues du déterminisme sexuel chez les mammifères, qui pourrait apporter des éléments utiles à la recherche clinique. Les animaux ne pourront pas être réintroduits dans les élevages initiaux sous peine d’être rejetés voire tués par leurs congénères, il seront mis à mort et conservés comme échantillons biologiques pour diverses mesures complémentaires (mesures de bioénergétique mitochondriale, western blot, etc) qui permettront de mieux comprendre l’influence du déterminisme sexuel sur le phénotype des individus Mus minutoides.

Impact sur les animaux

Le projet est conçu de sorte à ne pas entrainer de nuisances ou d’effets indésirables sur les animaux. Néanmoins, les souris seront seules dans leur cage, pour un souci d’agressivité et de conditions expérimentales, ce qui peut mener à un mal-être de l’animal. Par conséquent, nous porterons une attention particulière au comportement et à l’état physique des souris pour éviter qu’un animal ne se retrouve en souffrance. De même, les cages seront placées les unes à côté des autres pour que les souris puissent au moins se voir et ne pas se sentir isolées. Les observations faites lors du dernier projet réalisé sur cette espèce ont permis de mettre en évidence que les souris ne montrent pas de signes de stress lorsque leur cage se situe à côté de celles de leurs congénères.

Devenir

L’élevage initial ne reprendra pas les individus utilisés dans cette procédure expérimentale pour des raisons sanitaires et également de réinsertion. La souris pygmée Africaine Mus minutoides est une espèce sociale qui vit en petit groupe. A l’issu de l’expérimentation, il sera difficile de reconstituer des groupes d’individus qui auront été isolés plusieurs jours (même si le contact visuel est maintenu entre les individus), plus particulièrement avec les mâles XY et les femelles X*Y qui peuvent se montrer très agressifs. Enfin, il existe peu d’informations sur la physiologie de cette espèce et sur les différents génotypes existants chez celle-ci : femelles XX, X*X et X*Y et mâles XY. A l’issu de ce projet, les animaux seront mis à mort et conservés comme échantillons biologiques pour diverses mesures complémentaires : mesures de bioénergétique mitochondriale, western blot, activité enzymatique, analyse morphologique, etc. Des mesure qui permettraient de mieux comprendre l’influence du déterminisme sexuel sur le phénotype des individus Mus minutoides, sans mettre à mort d’autres individus. Les échantillons biologiques prélevés seront nombreux (i.e cœur, rein, tête, queue, muscle squelettique, foie, muscle, tissu adipeux brun, etc) pour répondre à diverses questions soulevées au sein de notre laboratoire et dans d’autres laboratoire (Montpellier notamment). En guise d’exemple, le muscle squelettique sera utilisé par notre laboratoire pour des analyses de bioénergétique mitochondriale et les têtes des souris seront, quant à elles, envoyées à Montpellier pour des analyses de la morphologie des cavités nasales de cette espèce.

Remplacement

Ces expérimentations nécessitent des organismes vivants dans leur intégralité, en particulier une espèce, Mus minutoides, qui ne peut pas être remplacée par une approche substitutive.

Réduction

Les manipulations sont optimisées statistiquement pour réduire le nombre d’individus utilisés : 16 individus par génotype sexuel, soit 64 individus au total. En effet, un test de puissance, à partir de données préliminaires, indique que 16 individus par condition sont nécessaires pour détecter une différence : power.anova.test (groups = 4, between.var = 1, within.var = 4, power = 0.80). Chaque individu sera utilisé à la fois pour les mesures d’activité physique, de taux métabolique et d’autres mesures complémentaires (prises alimentaire et hydrique, bioénergétique mitochondriale, etc). 4 individus supplémentaires de chaque génotype seront aussi maintenus en réserve et ne seront utilisés que dans le cas où des individus seraient écartés de la procédure expérimentale ou morts. Ainsi, dans le cas où les individus supplémentaires venaient à être étudiés, 80 animaux seraient utilisés pour ce projet. Les données obtenues à l’issu de ce projet seront alors analysées statistiquement à l’aide d’une ANOVA sur mesures répétées puisque plusieurs mesures auront été réalisées sur un même individu.

Raffinement

Les mesures nécessitent ni injection, ni manipulation des individus, excepté lors du changement de cage. Les cages d’hébergement seront enrichies de nids et de jeux, et la nourriture ainsi que l’eau seront disponibles ad libitum pour limiter la solitude des individus dans la cage. Ce même enrichissement sera conservé dans les cages expérimentales et aucun changement de cage ne sera effectué lors des mesures pour limiter le stress des animaux. Une attention particulière sera portée sur diverses manifestations : les prises hydrique et alimentaire, la présence ou non de toilettage, la modification de comportement ou de posture, l’apparition d’une hypothermie et la consistance des selles. Un individu en souffrance sera écarté de la procédure et placé dans sa cage d’hébergement initiale, plus enrichie. Si son état venait à s’aggraver, l’animal serait mis à mort par dislocation cervicale précédée d’une sédation.

Choix des espèces

L’étude de l’activité physique et du taux métabolique nécessite des organismes vivants dans leur intégralité, et en particulier des femelles et des mâles Mus minutoides. En effet, ce projet cherche à comparer quatre génotypes sexuels différents : trois génotypes féminins existant chez cette espèce (XX, XX* et X*Y) et un génotype mâle (XY). Ainsi, aucune méthode alternative n’existe pour réaliser ce projet. Les animaux utilisés seront de jeunes adultes reproducteurs. Les mesures de taux métabolique (consommation d’oxygène) et d’activité nécessitent de choisir des individus d’âge relatif similaire afin d’éviter les variations en lien avec le stade de développement. Prendre des adultes, par exemple, évite de mesurer le taux métabolique (consommation d’oxygène) alloué à la croissance des individus en développement et de mesurer par conséquent le taux métabolique basal de l’individu.

Ovariectomie avec implant d'œstradiol, pose d'un capteur de glycémie ou d'un cathéter permanent lors de chirurgies de deux heures, frottis vaginaux quotidiens et prélèvements de sang par incision de la queue : 312 femelles d'un rongeur diurne, Arvicanthis ansorgei, subissent ces actes dans un projet sur les effets de la lumière nocturne sur le métabolisme et la fertilité. Elles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, et tuées à l'issue pour l'étude de leurs gènes, hormones et organes. Pour 16 d'entre elles, 150 microlitres de sang sont prélevés toutes les trois heures pendant vingt-quatre heures par le cathéter. Le porteur reconnaît que ces rongeurs sont sociaux et prévoit d'en garder une partie en cage individuelle pendant toute l'expérimentation.

Objectifs

Ce projet de recherche vise à déterminer les mécanismes biologiques, à ce jour très mal connus, impliqués dans les effets néfastes de la pollution lumineuse et de la désynchronisation circadienne (= désynchronisation des rythmes biologiques proche de 24 heures). Les résultats permettront de répondre aux enjeux de santé publique visant à améliorer la santé du personnel exposé aux conditions de travail posté et des populations exposées à la lumière nocturne (professionnels navigants sur plusieurs fuseaux-horaires, travaillant très tôt ou très tard, enfants et adolescents s’exposant à la lumière d’écrans la nuit). Les mécanismes impliqués dans les effets sanitaires néfastes de la pollution lumineuse et des horaires décalés sont difficiles à établir chez les sujets humains, et nécessitent l'utilisation d’un modèle animal proche de l’homme. Les modèles classiques (rats, souris) ont un phénotype nocturne (vivent la nuit) qui est inadapté aux applications biomédicales. Nombre de leurs rythmes journaliers (cycles veille-sommeil, prise alimentaire-jeune) sont inversés par rapport à l’Homme (phénotype diurne, de jour). La majorité des études expérimentales sont réalisées chez des individus mâles, ignorant l’effet sexe de ces analyses. Les études ne distinguent pas l’impact direct de la pollution lumineuse nocturne de l’effet indirect de la désynchronisation circadienne sur la physiologie. Nous proposons une approche originale pour mieux comprendre les effets de la pollution lumineuse et des décalages horaires sur le métabolisme et la fertilité féminine. L’objectif de ce projet est de fournir de nouvelles connaissances pour mieux comprendre les effets délétères de la pollution lumineuse sur l'homéostasie métabolique et la fertilité. Le choix d’un modèle diurne, le rongeur Arvicanthis Ansorgei, permettra la production de résultats rapidement exploitables dans le domaine de la santé humaine. La majorité des études dans cette thématique étant menées chez les individus masculins, notre choix de sujets féminins permettra d’évaluer les points critiques et, de gérer les risques sanitaires de la pollution lumineuse sur l'ensemble de la population générale. La réalisation de ce projet aidera à développer des approches préventives.

Bénéfices attendus

Ce projet va aider à mieux comprendre les mécanismes néfastes de la pollution lumineuse nocturne sur la santé métabolique et la fertilité. Les résultats obtenus chez un modèle animal diurne ( = vivant de jour) féminin permettront de mieux appréhender les risques sanitaires de la pollution lumineuse pour le personnel exposé aux conditions de travail en horaires décalés ainsi que pour toutes les autres catégories populationnelles exposées à de la lumière nocturne (par exemple, personnel navigant sur plusieurs fuseaux-horaires, personnes de toutes classes d’âge s’exposant à la lumière d’écrans pendant la nuit). La réalisation de ce projet conduira ensuite à développer des approches préventives sous forme de mesures interventionnelles ou de recommandations de bonnes pratiques et de gestion des risques professionnels.

Procédures

108 animaux vigiles seront soumis à une injection d’une solution sucrée ((2 g de D-glucose / kg masse corporelle) à l’aide d’une seringue d'un mL afin de réaliser un test de tolérance au glucose (durée 3H). Ce test sera effectué avant le début de l'expérience, puis à la fin de chaque mois, l’expérimentation durant entre 1 et 3 mois selon les résultats obtenus. Des micro-volumes de sang (5 μl) seront prélevés à 5 reprises sur une durée totale de 3 h à l’aide d’une micro-incision de la queue. Un anti-douleur sera administré sur la queue à la fin du protocole. 16 animaux seront soumis à une chirurgie permettant la pause d’un capteur donnant la glycémie 24/24h (durée 2H). Cette opération s’effectuera sous anesthésie générale et un traitement post opératoire sera fourni à l’animal ainsi qu’un suivi quotidien de rétablissement. 32 animaux seront soumis à une cathétérisation permanente (durée de la chirurgie 2H). Cette chirurgie s’effectuera sous anesthésie générale et un traitement post opératoire sera fourni à l’animal ainsi qu’un suivi quotidien de rétablissement. Pour 16 des animaux, un volume de 150 μl sera prélevé toutes les 3 heures avec réinjection des éléments sanguins (durée 24H). Pour les 16 animaux restants ce volume sera de 50 μl (prélèvement répété sur plusieurs jours) avec réinjection des éléments sanguins. 48 animaux seront soumis à une ovariectomie et à un implant estradiol sous anesthésie générale puis un traitement post opératoire sera fourni à l’animal ainsi qu’un suivi quotidien de rétablissement. Ces animaux seront soumis à un unique frottis vaginal. Les frottis seront réalisés sur animaux éveillés maintenu à l’aide d’un tissu englobant le corps (pour réduire le stress) pendant une durée d’environ une minute. Les cellules sont recueillies avec 10 microL de sérum physiologique inséré dans le vagin à l’aide d’une micropipette. 108 individus seront soumis à des frottis vaginaux quotidiens (décrit précédemment) et des micro-prélèvements sanguins réguliers (jour déterminé par frottis). Les micro-volumes de sang (4 μL) seront prélevés à 4 reprises sur une durée totale de 8h par une micro-incision de la queue. Un anti-douleur sera administré sur la queue à la fin du protocole.

Impact sur les animaux

L’intervention chirurgicale est jugée douloureuse (douleur modérée) et inflammatoire. Toute intervention chirurgicale sera donc effectuée sous anesthésie générale, anti-douleur locale et avec apport d’anti-inflammatoires pour réduire toute souffrance et éviter toute inflammation post-opératoire. Les procédures chirurgicales peuvent entraîner une perte de poids de 15%. Au-delà de ce seuil,l'expérience sera interrompu. Le poids sera surveillé à J+1, J+3 et J+5 après tout prélèvement sanguin ou toute intervention chirurgicale. Bien que les rongeurs soient des espèces « dit » social, il faudra garder certains individus en cage individuelle après intervention chirurgicale pour éviter que ses congénères ouvrent la plaie et empêchent la cicatrisation. De plus, certaines analyses s’effectueront dans des cages particulières n’étant pas prévu pour l’analyse de 2 individus simultanément. Une partie des animaux sera donc placés en cages individuelles pendant toute l’expérimentation. Les cages seront enrichies au mieux (bâton à ronger). Dans une telle étude, l’animal devra être habitué à être manipulé. Pour l’habituation de la présence humaine tout sera fait de façon la plus neutre possible (même blouse, absence de parfum).

Devenir

L’euthanasie des animaux est nécessaire puisqu'elle permettra d’étudier les gènes, hormones et organes afin de comprendre le mécansime biologique d’action de la lumière sur le métabolisme et la reproduction.

Remplacement

En termes de remplacement, la régulation du métabolisme et des cycles reproducteurs impliquant plusieurs organes (notamment, cerveau, foie, pancréas, muscles, hypophyse, ovaires), l’investigation des interactions nécessite l’utilisation d’organismes entiers, et non pas d’organes ou de cellules isolées.

Réduction

En termes de Réduction, le nombre d’animaux propose est basé sur un nombre minimal qui prend en compte les moyennes des données comportementales recueillies dans des études précédentes. Ici nous privilégions l’utilisation des mêmes animaux pour les expérimentations calorimétrie, tolérance au glucose, actimétrie.

Raffinement

En termes de Raffinement, les cages seront systématiquement enrichies d’un morceau de bois à ronger. L’ajout de matériel de nidification n’est pas utile chez les Arvicanthis en stabulation car ni les mâles, ni les femelles hors reproduction ne construisent de nid avec ce matériau. Par ailleurs, bien que ce projet nécessite des procédures invasives, le maximum sera fait pour réduire la douleur et le stress des animaux tout au long de l’expérience (environnement enrichi, anesthésie et analgésie profondes, suivi du score de douleur). De plus, l’état de santé des animaux sera suivi quotidiennement. Des points limites prédictifs ont été établis permettant d’interrompre les procédures et soustraire ainsi l’animal à la souffrance.

Choix des espèces

Le rongeur diurne Arvicanthis ansorgei a été choisi car son système circadien fonctionne d’une manière similaire à celui des Hommes, contrairement aux rongeurs classiques de laboratoire (rats et souris qui ont une activité nocturne). Le modèle Arvicanthis présente donc des atouts novateurs indéniables pour les applications biomédicales visant à étudier les effets de la pollution lumineuse sur la santé humaine. Nous avons choisi d’étudier l’effet de la pollution lumineuse sur un modèle de rongeur de sexe féminin pour trois raisons majeures : 1) le genre féminin est rarement étudié dans les investigations scientifiques à ce jour, 2) il existe des différences spécifiques liées a la reproduction féminine qui implique les rythmes biologique de 24 h dans la création des cycles reproducteurs ; 3) un nombre croissant de femmes travaille en horaires décalés alors que leurs systèmes reproducteur et métabolique sont particulièrement sensibles à la pollution lumineuse. La tranche d'âge choisi est jeunes adultes entre 3 et 6 mois pour étudier des fonctions matures dont la fonction de reproduction étudiable qu'en période mature. La tranche d'âge choisi est jeunes adultes entre 3 et 6 mois pour étudier les fonctions physiologiques matures dont la fonction de reproduction étudiable qu'en période mature et non-sénescentes.