Autres rongeurs

96 rongeurs Arvicanthis vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Soumis pendant 16 semaines à un régime gras et sucré, ils subissent trois séries de huit microprélèvements sanguins sur animal vigile, que le porteur reconnaît pouvoir provoquer une douleur aiguë et une inflammation, avant un prélèvement sanguin terminal. Tous sont tués pour des analyses moléculaires et biochimiques post-mortem. Le porteur retient ce rongeur diurne pour sa proximité avec le rythme humain et affirme qu'aucune méthode sans animal ne peut caractériser la prise alimentaire, la retombée en chrononutrition humaine restant hypothétique.

Objectifs

Non seulement la quantité et la nature des aliments ingérés impactent la santé, mais le moment auquel sont pris les repas influence également le bien-être des individus. C'est notamment le cas des personnes qui ont des dîners à haute teneur énergétique et des personnes qui ont des habitudes alimentaires erratiques ou nocturnes chez lesquelles on observe une incidence accrue de diabète de type 2, d'obésité et de maladies cardiovasculaires. Au sein du système nerveux central, une région du cerveau appelée l'hypothalamus est impliquée dans le contrôle de la prise alimentaire, de la satiété et dans l'équilibre énergétique. Cette région est également responsable de l'organisation temporelle de toutes les fonctions et comportements biologiques car elle héberge une horloge biologique, les noyaux suprachiasmatiques (NSC) , qui donne le tempo à l'ensemble de l'organisme. Lors d'un régime alimentaire déséquilibré, il devient donc pertinent de pouvoir discriminer si les perturbations métaboliques observées viennent d'un déséquilibre dans les quantités d'aliments ingérés ou si elles s'accompagnent également d'une désorganisation temporelle du rythme de prise alimentaire. Le projet vise donc à étudier la chrononutrition chez Arvicanthis ansorgei, un modèle de rongeur diurne qui présente une organisation temporelle de ses fonctions biologiques similaire à celle de l'homme, comme par exemple un éveil diurne, un sommeil nocturne et une rétine riche en cônes. L'objectif sera sur des animaux nourris avec un régime équilibré 1/ de caractériser le rythme journalier de la prise alimentaire (structure temporelle sur 24h des repas, leur nombre et leur durée) ainsi que de la sécrétion des principales hormones métaboliques (insuline, leptine et corticostérone) equi la contrôlent 2/ de réaliser un phénotypage métabolique complet des animaux (volumes d'oxygène consommé et de CO2 rejeté avec calcul du quotient respiratoire et dela dépense énergétique) afijn ensuite d'évaluer les conséquences chez arvicanthis d'une exposition à un régime déséquilibré (graisse ou glucide) sur tous ces paramètres et in fine d'évaluer si les conséquences métaboliques observées sont uniquement dues au régime alimentaire déséquilibré seul ou combiné à une modification spontanée du rythme circadien de la prise alimentaire.

Bénéfices attendus

Les résultats obtenus pourraient permettre d'envisager chez l'homme des traitements basés sur des protocoles de chrononutrition visant à proposer certains aliments à certains moments de la journée sans rompre l'équilibre énergétique. La mise en évidence qu'un régime déséquilibré riche en graisse ou sucre ne conduit pas au développement d'une obésité et d'un diabète de type 2 sur le modèle animal choici pourrait ouvrir de nouvelles pistes pour de futurs traitements chez l'humain.

Procédures

Lers animaux seront soumis à 3 séries de 8 microprélèvements sanguins (durée de chaque prélèvement = quelques secondes) réalisés sur animal vigile. Chaque série de prélèvements est séparée de la précédente par 8 semaines de récupération. Chaque animal sera soumis à un prélèvement sanguin terminal sous anesthésie profonde et analgésie (durée quelques minutes). Les animaux seront soumis à 16 semaines de régime alimentaire déséquilibré (gras et sucré).

Impact sur les animaux

Les tests métaboliques réalisés par microprélèvement sanguin pourront induire une douleur aigue et pourraient créer de l'inflammation. L'exposition au régime déséquilibré pendant 16 semaines pourrait induire des perturbations métaboliques pouvant conduire à la mise en place d'une obésit et / ou d'un diabète de type 2.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour prélèvements post-mortem et analyses moléculaires et biochimiques.

Remplacement

L'objectif du projet étant de caractériser la prise alimentaire (nombre de repas, durée des repas,intervalles entre les repas, quantité de nourriture ingérée), il n'est pas possible d'utiliser des méthodes alternatives. L'animal reste donc le modèle de choix pour mener à bien cette étude.

Réduction

Le nombre d'animaux nécessaires au projet (96 animaux sur 5 ans de projet) a été calculé pour permettre d'obtenir des résultats fiables et exploitables statistiquement. Nous avons privilégié une étude longitudinale pour le métabolisme où chaque animal sera son propre contrôle. Les résultats seront analysés par des tests statistiques permettant d'établir l'impact d'un régime déséquilibré sur la prise alimentaire et le métabolisme sur arvicanthis, modèle de rongeur diurne à l'instar de l'humain et établir si arvicanthis pourrait être résistant au diabète et à l'obésité.

Raffinement

Les mâles arvicanthis sont agressifs entre eux et sont donc maintenus en cage individuelle enrichie (bâton et matériel de nidification). Les animaux sont hébergés dans le même pièce ce qui permet de maintenir les contacts olfactifs, visuels et auditifs entre les congénères. Afin de limiter le stress lié à la préhension, arvicanthis étant un animal diurne particulièrement actif, les animaux sont habitués à la manipulation qui est réalisée avec une serviette ce qui permet de prendre les animaux délicatement par le corps. Les procédures invasives sont réalisées sous anesthésie et analgésie. Des points limites ont été définis permettant d'interrompre la procédure et ainsi soustraire l'animal à la souffrance.

Choix des espèces

Le moment du repas tout comme la quantité d'aliments ingérés ou leur qualité nutritionnelle concourrent au maintien de l'équilibre énergétique et donc au bien-être des individus. Il est donc important pour notre étude d'utiliser un modèle animal dont la niche temporelle de prise des repas se rapproche de celle de l'homme. Arvicanthis Ansorgei est un rongeur diurne qui présente des caractéristiques similaires à l'homme : rythme veille/sommeil avec un éveil diurne et un sommeil nocturne et une rétine riche en cônes. Il s'avère donc être un modèle pertinent pour étudier les conséquences d'un régime déséquilibré sur les rythmes circadiens (hormones, métabolites et gènes horloges). Nous utiliserons des animaux adultes âgés de 2 à 4 mois afin de travailler sur des animaux mâtures. Pour limiter les variations entre individus il est important pour l'étude de travailler sur des groupes avec un cerveau intégrant les centres régulateurs du comportement alimenatires (hypothalamus notamment mâture).

96 souris glaneuses vont etre utilisees, toutes tuees a l'issue, dans des procedures impliquant un niveau de souffrance modere. Les jeunes sont separes de leur mere aux jours 9 et 12 pour enregistrer leurs cris de separation, puis testes en champ ouvert et face a un objet nouveau aux jours 35 et 50, avant d'etre tues au jour 55 pour peser leurs organes, dont les glandes surrenales comme marqueur de stress. Le porteur reconnait que la separation maternelle peut, dans de rares cas, conduire la mere a un infanticide et que les tests repetes imposent un stress. Il affirme qu'une etude du comportement individuel ne peut se passer d'animaux, l'objectif etant de mesurer l'effet de l'age de la mere sur la personnalite de la descendance.

Objectifs

Les effets de l'âge maternel sur le développement de la personnalité de la progéniture ont rarement été étudiés dans des modèles animaux. Dans notre étude, nous visons à examiner les différences potentielles de différences individuelles cohérentes dans le comportement (c'est-à-dire les différences de « personnalité ») entre la progéniture née de mères jeunes et âgées. Ceci sera fait par le phénotypage comportemental des jeunes. Tout d'abord, pendant la période de nidification, cela se fait par des tests répétés de vocalisation de séparation, libérant généralement des fréquences variables de cris de séparation ultrasoniques chez les petits. Plus tard, après le sevrage, nous effectuons deux tests combinés, qui sont également répétés, les tests en champ libre et directement après, un nouvel objet est introduit dans l'arèneet l'exploration de l'objet par l'animal est quantifiée. Ainsi, ces deux tests servent à quantifier des différences individuelles cohérentes (différences de personnalité) dans la tendance à l'exploration. Le premier type de test a été fréquemment utilisé pour phénotyper les différences individuelles chez les jeunes mammifères, y compris chez les souris. En outre, la tendance à l'exploration, quantifiée par des tests de champs libre et des tests du nouvel objet, est un trait de personnalité clé chez de nombreuses espèces de petits mammifères.

Bénéfices attendus

Nous pourrons mettre en évidence la contribution de l'âge de la mère dans la personnalité de la progéniture, ce qui est un aspect jusqu'à présent peu exploré des caractéristiques maternelles dans ce contexte. Deuxièmement, en associant les vocalisations ultrasoniques des petits en réponse à la séparation à leur tendance à l'exploration lors des tests effectués après le sevrage, nous serons en mesure de conclure dans quelle mesure les vocalisations au cours de la vie précoce sont prédictives des différences de personnalité au cours des étapes ultérieures de la vie.

Procédures

Seules des mesures comportementales seront effectuées. Les tests suivants sont effectués sur des animaux vigiles : (1) Une séparation maternelle est effectuée les jours postnatals 9 et 12 (5 minutes chacun), c'est-à-dire pendant la période de nidification. Au cours de ce test, on quantifie la fréquence des vocalisations non ultrasoniques des animaux lorsqu'ils sont séparés de leur mère et de leurs frères et sœurs (appel de séparation). (2) Les jours postnatals 35 et 50 (5 minutes chacun), les animaux sont introduits dans une nouvelle arène et leur exploration et leur activité locomotrice sont quantifiées. Directement après ces 5 minutes de test, un nouvel objet (une boîte métallique, par exemple) est introduit dans l'arène et les réponses de l'animal (pendant les 5 minutes suivantes) à ce nouveau stimulus sont quantifiées.--- Au total, chaque individu sera soumis à 6 tests comportementaux entre les jours postnatals 9 et 50, chaque test ayant une durée de 5 minutes. -- Une fois l'expérimentation terminée, les animaux sont euthanasiés au jour postnatal 55 et seront disséqués par la suite.

Impact sur les animaux

Les tests comportementaux que nous utilisons peuvent être considérés comme peu ou modérément invasifs. De brèves séparations des petits de leur mère, comme cela a été fait lors du test de vocalisation de séparation aux jours 9 et 12, peuvent, dans de rares cas, conduire à un infanticide par la mère. En outre, les tests répétés aux jours 35 et 50 peuvent imposer un certain stress aux jeunes. Cependant, nous considérons que les effets négatifs d'un tel stress plutôt léger ou modéré n'affecteront pas notablement le bien-être.

Devenir

A la fin de la procédure, au jour postnatal 55, les 96 animaux expérimentaux seront euthanasiés. Ensuite, les animaux seront disséqués et nous allons mesurer et peser leurs organes. Sur la base de ces données, nous comparerons, par exemple, le poids des glandes surrénales (en tant que marqueur du stress chronique) entre les petits issus de mères âgées et de mères jeunes.

Remplacement

Les conséquences de l'âge maternel sur l'émergence de différences individuelles constantes de comportement ("différences de personnalité") ne peuvent être évaluées par d’autres moyens que ceux où l’utilisation d’animaux est requise. S’agissant d’une étude sur le comportement des individus il n’est pas possible de se passer des animaux.

Réduction

Selon notre hypothèse, la cause sous-jacente des différences potentielles de personnalité entre les descendants de mères jeunes et de mères âgées sont les effets de l'âge des mères, qui trouvent donc leur origine au niveau maternel. Ainsi, il est nécessaire de tester un nombre suffisamment élevé de mères, c'est-à-dire 12 portées de mères jeunes et 12 portées de mères âgées. Cependant, il est également nécessaire de tester plusieurs jeunes par portée afin de démêler les effets de facteurs tels que le sexe et la masse corporelle des jeunes, qui peuvent également influencer l'émergence de différences de personnalité. Ainsi, nous avons décidé de tester 4 jeunes par portée, de préférence 2 mâles et 2 femelles. Cette stratégie nous permettra également de garder les 4 frères et sœurs ensemble dans un groupe après le sevrage, ce qui est favorable du point de vue du bien-être animal. La taille d'échantillon (au total: N = 96 animaux expérimentaux) nécessaire pour obtenir des résultats fiables a été calculée par un test de puissance.

Raffinement

Des enrichissements environnementaux (matériaux de nidification, rondins à ronger) seront fournis aux animaux à tout moment, aux couples reproducteurs ainsi qu'aux jeunes après le sevrage. Après le sevrage, les animaux expérimentaux (N = 96) sont toujours gardés en groupe avec leurs frères et sœurs de la même portée, ce qui leur procure un environnement social stable. En outre, la présence de frères et sœurs apporte généralement un soutien social et contribueront ainsi à amortir les conséquences négatives du stress. Tous les transferts d'animaux d'une cage à une autre ou à un dispositif de test se feront sans manipulation directe mais par l'utilisation d'une petite boîte dans laquelle l'animal sera encouragé à entrer. Les différents tests auxquels les animaux sont soumis sont brefs (5 minutes chacun) et peu invasifs. Lorsque les jeunes sont séparés de leur mère lors des tests effectués pendant les jours postnatals 9 et 12, nous empêchons le refroidissement des jeunes par un sol chauffé à 30°C dans le cadre du test. En outre, pour éviter efficacement un éventuel infanticide de la mère lors du retour au nid, nous avons pris diverses mesures, par exemple : utilisation de gants portant uniquement l'odeur de la portée particulière, séparation courte seulement, la mère n'entendra pas les cris de séparation des petits pendant la procédure. Un point limite majeur de cette expérimentation est d'éviter l'utilisation de petits pour le test de vocalisation de séparation dont la température corporelle s'est déjà refroidie trop bas avant l'expérience. Il s'agit d'un processus réversible, qui peut se produire car certains petits, au cours de leur dynamique naturelle dans le nid, perdent parfois temporairement le contact avec leurs frères et sœurs de portée avant d'être récupérés au nid par la mère. Par conséquent, lorsque nous sortons les petits pour l'expérimentation, nous mesurons leur température de surface corporelle à l'aide d'un thermomètre infrarouge sans contact. Seuls les petits dont la température de surface corporelle est supérieure à 34°C sont utilisés. Si la température de surface corporelle du petit choisi est trop basse, il est ramené au nid et peut être testé après 1-2 heure, lorsqu'il s'est remis de son épisode de basse température. Les tests comportementaux aux jours postnataux 35 et 50 donnent généralement aux animaux la possibilité d'adopter une solution comportementale qui leur convient.

Choix des espèces

La souris glaneuse a, dans des conditions naturelles, une durée de vie très courte. Seuls les juvéniles nés pendant les mois d'été survivent à l'hiver. Pour cette raison, le schéma suivant se dessine : (1) Au printemps, toutes les femelles qui se reproduisent sont primipares mais sont les vieilles femelles (environ 7-8 mois) nées au cours de l'année précédente. (2) Plus tard au cours de la saison de reproduction, les mères sont principalement nées au cours de la même année (=des mères plus jeunes). Il existe des différences distinctes dans l'âge maternel au printemps et en été chez cette espèce. Notre projet utilise ce phénomène intéressant de l'histoire de vie de cette espèce, et explorera dans une étude en laboratoire si les différences d'âge maternel conduisent à des différences de personnalité chez la progéniture. Nous quantifierons la vocalisation des jeunes pendant la période de pré-sevrage, vers les jours 9 et 12. À cet âge, les petits émettent des cris de séparation ultrasoniques lorsqu'ils sont séparés de leur mère et de leurs frères et sœurs. Plus tard, à l'âge de 35 et 50 jours (stade juvénile, avant la maturité), nous testerons la tendance à l'exploration des animaux dans une arène ouverte et lorsqu'ils sont confrontés à un nouvel objet. Des études précédentes ont montré que tester les animaux à ces jours est approprié, car ils sont généralement très motivés pour explorer l'arène de test.

Une perte de poids de plus de 5 % ou une posture anormale pourrait signaler une souffrance chez les rats des sables, surveillés aussi pour toute inflammation, infection, rougeur ou opacité de l'œil dans les jours qui suivent chaque analyse. 496 rats des sables (Psammomys obesus), des rongeurs, vont être utilisés dès l'âge de quinze jours dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue pour l'analyse de leur rétine. Chacun reçoit sous anesthésie une injection sous la rétine des deux yeux, l'un avec un ADN témoin, l'autre avec une forme mutée du gène abca4, puis sa vision est mesurée à partir de trois mois, sous anesthésie, par électrorétinogramme et tomographie d'une heure au plus chacun, à plusieurs reprises. Le but est de mettre au point une méthode d'induction de la maladie de Stargardt chez ce rongeur diurne, dont la rétine compte selon le porteur 40 % de cônes contre 1 % chez la souris, et les résultats "pourraient donner des pistes" thérapeutiques.

Objectifs

La maladie de Stargardt est une maladie qui affecte l’œil. Elle fait notamment partie de la forme de dégénérescence maculaire héréditaire la plus fréquente chez l’Homme. Elle touche des personnes jeunes et provoque un handicap visuel lourd dû à la perte de la partie centrale de la rétine, nommément la macula qui est riche en cônes. Le gène impliqué dans cette maladie héréditaire est le gène abca4. Les mécanismes pathogènes ont été largement analysés dans une souche de souris modifiée qui n‘exprime pas le gène abca4 (alias « knockout »). Néanmoins, ces souris knockout ne présentent pas les déficits observés chez les patients atteints de la maladie de Stargardt. Contrairement aux rongeurs nocturnes (rat et souris), le rongeur diurne appelé Rat des Sables (Psammomys obesus) présente des caractéristiques uniques pour modéliser cette maladie, car nous avons montré que sa macula, contrairement à ce qui est obnservé chez la souris animal nocturne, est riche en cônes et ressemble fortement à celle de l’homme. L’objectif du projet est de développer un nouveau modèle animal dans lequel le gène abca4 sera invalidé par l’injection dans l’œil de la forme mutée du gène abca4. Les conséquences de la mutation induite seront étudiées par des méthodes non-invasives permettant de mesurer finement la vision et la fonction de la rétine interne, ainsi que d’obtenir des images de l’œil en coupe. Des analyses cellulaires et moléculaires post-mortem viendront compléter l’étude. Ainsi, ce modèle mènera à une meilleure compréhension du rôle du gène abca4 et de sa protéine dans la régulation de la prolifération des cônes au cours du développement de la rétine. Par conséquent, il permettra d’éclaircir les mécanismes impliqués dans l’apparition de la maladie de Stargardt associée aux mutations du gène abca4.

Bénéfices attendus

La suppression du gène abca4 dans l’oeil de Psammomys obesus, dont la rétine est riche en cônes comme chez l’homme, va permettre d’étudier les effets, spécifiquement in vivo, de l’altération de abca4 dans les processus du développement de la rétine, et surtout de déterminer l’importance du gène abca4 dans la survie des photorécepteurs. Les résultats pourraient donner des pistes pour de nouvelles stratégies thérapeutiques de la maladie de Stargardt où les cônes dégénèrent.

Procédures

496 nouveau nés de Psammomys obesus sont inclus dans une procédure comprenant une injection sous-rétinienne, et une analyse fonctionnelle de la vision à l'aide de deux méthodes, nommément électrorétinogramme (ERG) et tomographie à cohérence oculaire (OCT). L'injection sous-rétinienne s’effectue sous anesthésie gazeuse suivie d’une anesthésie locale et de l’application d’un gel limitant le dessèchement de l’oeil (ocrygel), environ 10minutes pour chaque animal. L'étude fonctionnelle de la vision par ERG et OCT sont des méthodes non invasives, ne provoquant pas de souffrance particulière. Ces deux méthodes d'une durée de 60 minutes maximum chacune sont réalisées sous anesthésie. Les yeux sont traités avec une application de gel hydratant avant et après la réalisation des mesures. Seulement un des yeux injectés développera la maladie étudiée.

Impact sur les animaux

Les animaux sont systématiquement surveillés dans les jours suivant les analyses pour détecter toute anomalie oculaire (inflammation, infection, rougeur, opacité...). L’injection sous-rétinienne chez les nouveau nés de Psammomys obesus, n’engendre, en général, aucune lésion ni altération de la fonction visuelle. Toutefois nous ne pouvons exclure l’apparition d’une infection, d’une inflammation ou de dommages à l’œil injecté lors de son développement ou d’une douleur transitoire. L’ERG et l’OCT sont des méthodes non invasives, ne provoquant pas de souffrance particulière mais une inflammation de l’œil n’est pas à exclure. Une perte de poids (sup à 5%)- ou une anomalie posturale pourrait indiquer un mal-être et une souffrance chez l'animal.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort pour analyses ultérieures moléculaires et cellulaires de la rétine.

Remplacement

A ce jour aucun modèle in vitro ne permet de recréer la complexité du système visuel dans son intégrité, c’est-à-dire depuis la détection de la lumière jusqu’aux réponses fonctionnelles (en ce qui nous concerne ici). Toutefois, la technique permettant d'introduire la forme mutée du gène abca4 dans les cellules nerveuses photosensibles (ou photorécepteurs) a été validé par analyse de l'ADN et sera également validée sur des cellules de peau en culture.

Réduction

Chaque animal est son propre contrôle. A savoir un oeil est injecté avec un ADN contrôle et l’autre avec la forme mutée du gène abca4 .Le nombre d'animaux a été évalué au maximum en prenant en compte le risque potentiellement engendré par l’injection d'ADN (maximum 10%), ainsi que la variabilité interindividuelle pour aboutir à des résultats significatifs lors de la comparaison entre l’oeil contrôle et l’œil qui n'exprime plus la protéine ABCA4 d’un même animal. Il s'agit également d'une étude ou le même animal est suivi à plusiuers temps après injection ce qui contribue à réduire le nombre d'animaux utilisés.

Raffinement

Les animaux âgés de 15 jours sont hébergés avec leur mère et leur fratrie, afin de respecter les interactions sociales; et dans un environnement enrichi (matériel de nidification et bâton à ronger), afin de stimuler leur activité motrice. Après le sevrage, les animaux sont hébergés en groupes sociaux comprenant 2 à 3 individus de même sexe, afin de respecter les interactions sociales et dans un environnement enrichi (bâton à ronger, tunnel), afin de stimuler leur activité motrice. Les animaux reçoivent de l'eau et de la nourriture ad libitum, qui est adaptée selon l’état physiologique des animaux (mère allaitante, animaux sevrés, adultes). Lors de l’injection sous-rétinienne les animaux âgés de 15 jours sont placés sur tapis chauffant et sous anesthésie générale , à laquelle est rajoutée une anesthésie locale de l’oeil. Après l’intervention, le dessèchement de l’oeil est limité par l’application d’un gel hydratant (ocrygel). Lors des analyses non invasives de la fonction visuelle, les animaux alors âgés d’au moins 3 mois sont placés sous anesthésie générale et analgésie. De plus, le dessèchement de l’oeil est limité par l’application d’un gel hydratant. Un suivi quotidien est assuré par du personnel spécialisé afin de mettre en évidence d'éventuels signes précoces de mal être : deux fois par jour le jour de l’intervention, puis une fois par jour jusqu’à la fin de la procédure. Pendant ces surveillances, l’aspect des yeux sera minutieusement inspecté.

Choix des espèces

Pour cette étude nous utiliserons un modèle rongeur diurne Psammomys obesus. Par comparaison avec la souris, la rétine de Psammomys obesus est de plus grande taille et est enrichie en cellules nerveuses photosensibles (ou photorécepteurs) de type cônes (40% versus souris 1%). Ce modèle est donc parfaitement adapté pour l’injection sous rétinienne et l’étude des cônes, qui sont impliqués dans la maladie de Stargardt. Nous utiliserons des animaux au stade postnatal P15 (15 jours après la mise bas), car c’est à ce stade que la maladie de Stargardt se déclare chez l’homme (entre 7 et 12 ans) et que la protéine Abca4 est déjà bien exprimée dans les photorécepteurs.

40 rats et 80 rats roussards du Soudan (Arvicanthis) vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Tous subissent l'implantation chirurgicale d'une électrode dans le cerveau et un protocole de décalage horaire, une partie une restriction d'accès à l'eau et l'administration de fluoxétine, puis des stimulations électriques répétées, l'euthanasie servant à vérifier le site d'implantation. Le porteur étudie le fonctionnement de l'horloge biologique chez une espèce diurne. Il affirme que ces bases neurales ne peuvent être reproduites in vitro ni in silico et nécessitent l'animal vivant.

Objectifs

L'horloge principale est responsable de la régulation de tous les rythmes du corps et permet à l'organisme de s'adapter et d'anticiper les changements environnementaux. La perturbation des cycles externes peut nuire à notre santé. Des études récentes chez l'homme indiquent que la perturbation de l’horloge, tels que ceux causés par l'exposition à la lumière artificielle de nuit, par le jet lag ou par le travail posté, augmente le risque de développer des maladies cardiovasculaires, des troubles du sommeil, de la dépression et maladies métabolique. L'activité électrique de l'horloge biologique est la première étape de la formation de son signal de sortie qui détermine la libération de signaux capable de synchroniser toutes les fonctions rythmiques du corps, y compris l’activité comportementale. Il n’est pas clair quel est l’effet de l’activité électrique de l’horloge sur l’activité comportamentale, et si en stimulant l'activité électrique de l'horloge centrale on peut renforcer l'amplitude du rythme de l'activité comportementale, qui au contraire diminue avec l'âge. Ainsi, le premier objective est de définir l’effet de l’activité électrique de l'horloge sur l’activité comportementale chez une espèce diurne (Arvicanthis) et chez une espèce nocturne (rat) ; et de tester chez des Arvicanthis âgée si la stimulation de l’activité électrique de l’horloge peut augmenter l'amplitude du rythme d'activité comportementale. Un des signaux qui influence l'horloge biologique est la sérotonine qui peut modifier l'activité de l'horloge. Ainsi, le second objective de ce projet est de tester si une augmentation de sérotonine, peut accélérer la resynchronisation de l’activité comportementale de l’animale a un nouveau cycle de lumière /obscurité décalé de 6h.

Bénéfices attendus

Dans la société moderne, les rythmes sont perturbés et de plus en plus de preuves montrent que cela est nocif pour la santé. Les mécanismes de fonctionnement de l’horloge ne sont pas clairs chez les espèces diurnes, interdisant le développement de thérapies pour l'amélioration des fonctions diurnes, y compris humaines. Ce projet améliorera notre compréhension du fonctionnement de l’horloge centrale chez une espèce diurne. Cela fournira des informations utiles pour développer des stratégies efficaces pour améliorer les fonctions de l'horloge chez l'homme jeune et âgé. Plus précisément ce projet : 1. Fournira des informations sur la relation entre l'activité électrique et l'activité locomotrice chez les animaux diurnes, et les éventuelles différences avec les animaux nocturnes. Ces informations peuvent aussi être utilisées pour améliorer les conditions des patients qui présentent des pathologies associées à des troubles circadiens (troubles journaliers comme dans différents troubles de l'humeur, y compris la dépression). 2. Fournira des informations sur comment la signalisation sérotoninergique interagit avec la lumière pour déphaser l'horloge biologique chez une espèce diurne. Ces résultats pourraient permettre le développement de stratégies pour aider à combattre la désynchronisation circadienne chez les travailleurs postés et lors de décalage horaire.

Procédures

16 animaux seront soumis à un protocole de décalage horaire, dont 10 seront soumis à une restriction temporelle d'eau (accès à l'eau 6h par jour), pour un total de 16 jours (4 jours de restriction temporelle d'eau suivis de 5 jours d'accès à l'eau ad libitum). Cette restriction temporelle d’eau est nécessaire pour l'administration de fluoxétine-qui entraîne une augmentation des niveaux de sérotonine-(6 jours au total) à des moments précis de la journée. 6 animaux seront soumis au même protocole (décalage horaire) mais auront toujours accès à l'eau. Ces Arvicanthis seront soumis à une chirurgie de 1 heure 1 mois après la fin du protocole de décalage horaire (durée totale 47 jours). Tous les animaux (120) seront soumis à une chirurgie de 1h qui est nécessaire pour l'implantation de l'électrode de stimulation de la zone de la zone d'intérêt. 40 jeunes (2-5 mois) Arvicanthis (dont 16 issues du protocole de décalage horaire) et 40 jeunes (2-5 mois) rats, recevront 4 stimulations électriques par jour (durée 2h), pendant 6 jours dans 3 conditions de lumière (2 jours en 12h lumière : 12h d'obscurité, 2 jours en obscurité constante, 2 jours en lumière constante). 40 Arvicanthis âgées (>12 mois) recevront une stimulation électrique par jour (durée 2h-4h), pendant 3 jours (1 jour en 12h de lumière : 12h d'obscurité, 1 jour en obscurité constante, 1 jour en lumière constante).

Impact sur les animaux

La restriction temporelle d’accès à l’eau (6h) est nécessaire pour administrer la fluoxétine à un moment donné du temps journalier. Cependant, cela pourrait entraîner une déshydratation (dont l’importance sera évaluée dans une manipe pilote). Si une diminution de la prise d’eau est constatée, cela pourrait entrainer une diminution de la prise alimentaire et une conséquente perte de poids, entrainant un stress de l’animal. Dans une expérience précédente dans notre groupe de recherche, les Arvicanthis ont été traités pendant 5 jours avec la fluoxétine. Aucun effet délétère n'a été observé sur le bien être des animaux pendant et après le traitement à la fluoxétine. La chirurgie stéréotaxique, qui est nécessaire pour l'implantation de l'électrode de stimulation, peut entraîner une perte modérée de poids. Compte tenu que la chirurgie comporte une incision cutanée au niveau du crâne, une infection ou une inflammation des plaies cutanées ne peut pas être exclu. La restriction temporelle d’accès à l’eau (6h) est nécessaire pour administrer la fluoxétine à un moment donné du temps journalier. Cependant, cela pourrait entraîner une déshydratation (dont l’importance sera évaluée dans une manipe pilote). Si une diminution de la prise d’eau est constatée, cela pourrait entrainer une diminution de la prise alimentaire et une conséquente perte de poids, entrainant un stress de l’animal. Dans une expérience précédente dans notre groupe de recherche, les Arvicanthis ont été traités pendant 5 jours avec la fluoxétine. Aucun effet délétère n'a été observé sur le bien être des animaux pendant et après le traitement à la fluoxétine. La chirurgie stéréotaxique, qui est nécessaire pour l'implantation de l'électrode de stimulation, peut entraîner une perte modérée de poids. Compte tenu que la chirurgie comporte une incision cutanée au niveau du crâne, une infection ou une inflammation des plaies cutanées ne peut pas être exclu.

Devenir

Tous les animaux (80 Arvicanthis, 40 rats) seront mis à mort à la fin du projet. L'euthanasie est nécessaire à la vérification du site d'implantation de l'électrode de stimulation.

Remplacement

La compréhension des bases neurales de la diurnalité, qui implique au vu des connaissances actuelles un circuit de plusieurs structures cérébrales interconnectées, dont le schéma ne peut actuellement être reproduit avec une approche in vitro ou in silico, nécessite une approche in vivo chez l'animal vivant pour atteindre l'objectif.

Réduction

Notre approche longitudinale (enregistrement en continu d’un même animal dans différentes conditions expérimentales, animal utilisé comme son propre controle) permet de réduire considérablement le nombre d’animaux utilisés et de réduire la variabilité inter- individuelle. Le nombre d’animaux utilisés nous permettra d’obtenir des résultats statistiquement fiables. Les résultats seront exploités avec des tests statistiques adaptés.

Raffinement

Les Arvicanthis seront gardés en cages ouvertes individuelles pour enregistrement rythmes journaliers, car les animaux adultes sont agressifs entre eux. Les animaux gardent des contacts olfactifs et auditifs avec les congénères dans la même pièce. Les cages sont enrichies avec un bâton à ronger. Les cages d'enregistrement in vivo sont équipées d'un joint tournant permettant à l'animal de rester libre de ses mouvements. La procédure invasive sera réalisée sous anesthésie générale et analgésie. L'état de santé des animaux sera évalué au cours de l'étude et des points limites spécifiques ont été établis permettant d'interrompre les procédures et soustraire l'animal à la souffrance.

Choix des espèces

Rats: Pour comprendre la physiologie de l'horloge chez les animaux diurnes, nous devons aussi étudier les différences avec ll'horloge chez les nocturnes. La comparaison entre nocturne et diurne apporte des informations supplémentaires sur ce qui est différent entre les deux espèces. Cela permet d'améliorer les stratégies biomédicales actuellement en place, qui sont basées sur des informations provenant d'animaux nocturnes. Le choix de cette espèce nocturne est principalement basé sur le fait que le rythme de l'activité électrique de l'horloge biologique chez le rat a déjà été caractérisé. Ceci est nécessaire pour appliquer correctement notre protocole de stimulation Arvicanthis: Comprendre les bases neuronales de la diurnalité nécessite l'étude des animaux diurnes. La disponibilité du Rat roussard du Soudan (Arvicanthis ansorgei), un rongeur diurne élevé au Chronobiotron, est une opportunité unique d'atteindre cet objectif. Rats et Arvicanthis jeunes adulte (2-5 mois), pour étudier un système circadien mature et non-sénescent. Arvicanthis âgés (> 12 mois), pour tester l'effet de la stimulation électrique sur des animaux présentant un rythme faible d'activité comportementale.

3 000 micromammifères sauvages vont être capturés, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, puis relâchés sur leur lieu de capture. Sur chaque animal vigile le porteur prélève du sang dans le sinus rétro-orbitaire, une biopsie d'oreille et des tiques, en moins de cinq minutes. Il indique un taux de mortalité de 1 à 2 % lors des captures, par hypothermie, choc cardiaque ou prédation dans les pièges. Le projet suit sur quinze à vingt ans l'exposition de ces rongeurs aux agents transmis par les tiques, dont la bactérie de la maladie de Lyme, et le porteur affirme que le remplacement ne peut être envisagé.

Objectifs

Les micrommamifères sauvages sont réservoirs de nombreux agents pathogènes transmis par les tiques qui peuvent entraîner des maladies chez l'homme, dont la borréliose de Lyme, l'encéphalite à tique (appelée aussi TBE), l’anaplasmose granulocytaire, la rickettsiose ou la neoerhlichiose. La densité de tiques infectées par ces différents agents pathogènes présente dans l’environnement est généralement utilisée comme une approximation du risque d’expositition de l’homme vis-à-vis de ces agents pathogènes. Elle varie en fonction de la saison et des années, en lien avec les variations des conditions météorologiques et des populations des hôtes. Très peu d’études de terrain ont été réalisées sur du long terme pour étudier les variations temporelles de la densité de tiques infectées par les différents agents infectieux et comprendre l’influence respective des conditions météorologiques et de la dynamique intra- et inter-annuelle des populations de micromammifères sur les densités de tiques infectées et donc sur le risque d’exposition à l’homme vis-à-vis de ces agents infectieux. L’objectif du projet est de réaliser un suivi long terme des populations de rongeurs (par espèce), de leur infestation par les tiques, de leur exposition aux agents infectieux étudiés et de la densité de tiques infectées par ces agents infectieux afin (i) d’étudier l’influence des conditions météorologiques et des densités de rongeurs sur les variations inter-annuelles de densités de tiques infectées et (ii) de modéliser le risque de contact et de transmission de l’Homme vis-à-vis de ces agents infectieux.

Bénéfices attendus

L’objectif long terme de ce projet est de déterminer l’influence respective des facteurs météorologiques et de densités de micrommamifères sur les variations inter-annuelles des densités de tiques infectées par différents agents infectieux d’intérêts afin de mieux prédire le risque d’exposition de l’Homme, en particulier pour Borrelia burgdorferi sl. (bactéries responsables de la maladie de Lyme). A moyen terme, il est prévu que les données collectées soit utilisées pour paramétrer un modèle mathématique de la transmission de Borrelia burgdorferi sl. à l’Homme. De plus, les données collectées permettront également d’apporter plus d’informations sur l’épidémiologie d’agents infectieux pour lesquelles les données existantes sont faibles (Anaplasma phagocytophilum, Rickettsia spp., Neoerhlichia mikurensis, TBEV), si ceux-ci sont présents dans la zone étudiée.

Procédures

Chaque animal, une fois par session, est immobilisé entre deux doigts au niveau de la nuque. Les prélèvements suivants sont réalisés sur animaux vigiles : prise de sang effectuée dans le sinus rétro-orbitaire, une biopsie de peaux d’oreille, prélèvements de tiques et identification par une puce. Le temps de manipulation n’excède pas 5 minutes, et l’animal est relaché au plus vite dans le milieu naturel sur son lieu de capture.

Impact sur les animaux

Les animaux sont soumis à un certain stress lors de la capture et de la manipulation (pesée, marquage, prise de sang rétro-orbital, biopsie, collecte de tiques). Pour limiter ce stress, la durée maximale de manipulation n’excèdera pas 5 minutes et les manipulateurs sont attentifs à la détection de points limites. Les animaux sont manipulés dans la matinée et sont relachés le plus rapidement possible sur leur domaine vitale grace à un quadrillage précis de la zone d’étude. Dans nos expériences précédentes de piégeage par méthode de capture-marquage-recapture, il est fréquent que des animaux soient recapturés trois nuits consécutives lors d’une même session de capture et durant plusieurs sessions, ce qui peut indiquer que la manipulation et les prélèvements réalisés n’ont pas induit d’effets négatifs à long terme sur certains individus. Un faible taux de mortalité (1-2%) lors des captures est généralement observé. La mortalité peut être liée à de l’hypothermie, un choc cardiaque lors de la manipulation et très ponctuellement à de la prédation dans les pièges par des martres ou fouines.

Devenir

Les animaux sont relachés sur leurs lieux de capture, dans le milieu naturel

Remplacement

Le but étant d’étudier la circulation des agents pathogènes au sein des populations de micromammifères dans leur milieu naturel pour mieux comprendre leur épidémiologie et le risque d’exposition pour l’Homme, le remplacement ne peut-être envisagé pour ce type de projet.

Réduction

Nous avons choisi de piéger sur trois sites différents distants de 1.5-2.5 km afin d’avoir trois réplicats au même moment. L’objectif est de réaliser ce suivi sur du très long terme (15-20 ans) sur ces trois sites afin d’avoir suffisamment de données pour l’analyse et mettre en évidence certains effets. Le nombre de pièges par site (100 par site), correspondant à un nombre attendu d’individu capturés variant de 30 à 300 individus pour une session selon les années de pullulations de micromammifères, a été défini afin d’avoir suffisamment de rongeurs capturés pour estimer leur exposition aux agents infectieux et leur infestation par les tiques au regard des contraintes matérielles et avec suffisammement de précision au moins pendant les phases de pullulation de rongeurs. Le nombre d’animaux maximum pour lesquels des prélèvements seront réalisés par session de capture est fixé à 300, nombre suffisant pour répondre aux objectifs de l’étude. Il permettra d’estimer des niveaux d’infestation par les tiques et des prévalences d’infection avec des précisions de 2 à 5% pour des prévalence d’infection attendues variant entre 5 et 30%.

Raffinement

Les animaux sont capturés la nuit par des pièges qui permettent de les maintenir à l’abri des intempéries et nous mettons à disposition des carottes et des graines de tournesol permettant un apport d’énergie (graines de tournesol) et d’eau (carottes) aux animaux capturés. Quand les animaux sont sortis des pièges, ils sont mis dans des gants de fouille (un individu par gant). Du papier est ajouté dans ces gants pour que les animaux puissent se blotir dedans et pour permettre d’absorber l’humidité (urines, …), de maintenir la température des animaux et de réduire leurs stress. Les animaux sont manipulés et relachés le plus rapidement possible sur leur domaine vitale grace à un quadrillage précis de la zone d’étude. Si les animaux sont capturés plusieurs fois au sein d’une même session, ils ne sont prélevés qu’une fois au sein d’une même session.

Choix des espèces

Cette demande porte sur l’étude dans le milieu naturel de la circulation des agents pathogènes vectorisés par les tiques au sein des populations de micromammifères. Le stade de développement influence le niveau d’infestation des tiques et le statut d’infection, et pour en tenir compte dans l’analyse à l’échelle individuelle et populationnelle, les animaux de tous les stades de développement seront étudiés.

639 rats bruns et rats noirs vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent une infection intranasale par le SARS-CoV-2 sous anesthésie, jusqu'à sept lavages nasaux, des prises de sang répétées et un gavage oral, pour évaluer si ces rongeurs peuvent constituer un réservoir sauvage du virus. Le porteur indique que l'infection respiratoire peut provoquer une baisse d'appétit et une perte de poids, les difficultés respiratoires ou une perte de poids au-delà de 20 % déclenchant la mise à mort. Il affirme que l'étude du potentiel de réservoir ne peut être menée que par des expériences in vivo.

Objectifs

Dès le début de la pandémie de COVID-19, la question de la contamination des animaux proches de l'homme a été posée. Plusieurs études expérimentales ont été menées pour déterminer le spectre d'hôtes du SRAS-CoV-2 apparu à Wuhan, en Chine. Il a été démontré que la sous-famille des Murinae, qui comprend les rats et les souris, n'était pas réceptive (la réceptivité étant la capacité de réplication virale) à l'infection par le SRAS-CoV-2, probablement en raison de différences essentielles au niveau du récepteur utilisé par le virus pour infecter son hôte. L'émergence de nouveaux variants du SARS-CoV-2, en particulier les variants préoccupants B.1.351 et P.1, qui peuvent infecter expérimentalement de jeunes souris, a modifié cette situation, d'où la nécessité de surveiller le risque que les rongeurs sauvages deviennent des réservoirs du virus, à partir desquels il pourrait évoluer et se propager à l'homme. Les rats, en particulier Rattus norvegicus sont devenus des habitants importants de nos villes, tandis que Rattus rattus est plus fréquent dans les zones agricoles et portuaires. Dans les villes où les égouts ne sont pas bétonnés, les estimations sont de 1,5 à 1,7 rats par habitant avec des pullulations reconnues dans les grandes villes comme Paris et Marseille, ou lors de conditions particulières comme les grèves des éboueurs. La proximité de ces espèces sauvages avec les humains ainsi que la possibilité de détecter du matériel génétique du SRAS-CoV-2 dans les effluents incitent à poursuivre les recherches sur le rôle que ces espèces pourraient jouer en tant que réservoir secondaire des variants du SARS-CoV-2, avec des implications dramatiques pour les risques de propagation et les efforts d'éradication putatifs et une mauvaise interprétation des concentrations virales dans les eaux usées si le virus est également excrété par les rongeurs vivant dans les égouts. L'objectif de ce projet est d'étudier le risque d'émergence de réservoirs de rongeurs par une approche d’essai de réceptivité et de transmission.

Bénéfices attendus

L’approche expérimentale couplée à une recherche du virus chez les rats piégés dans de grandes métropoles françaises permettra de répondre à la question de la possibilité de constitution d’un réservoir sauvage d’un des variants du SARS-CoV-2. L’approche expérimentale pemet de savoir si les animaux sont récéptifs et capables de se transmettre l’infection soit de façon directe (par projection d'aérosol entre individus), soit de façon indirecte par voie orale (par le biais des matières fécales). Les études sur le terrain permettront de voir si les rongeurs sont effectivement exposés car il reste toujours une incertitude sur le caractère infectieux du virus retrouvé dans les effluents.

Procédures

1/Lavage nasal sous anesthésie gazeuze (entre 1 à 7 fois selon les procédures et les groups de rats, à raison d'une durée de 30 secondes). 2/Infection intranasale sous anesthésie gazeuse (environ 15 secondes) .3/ Prise de sang à la veine caudale (durée 1 à 2 minutes) sous anesthésie gazeuse (5 répétitions à 3/4 jours d'intervalle sur un seul groupe de 6 rats) 4/ Prise de sang intracardiaque terminale (durée d'une minute environ) sous anesthésie (induction à l’isoflurane et injection intrapéritonéale de kétamine et de Xylazine) + analgésique. 5/ gavage oral sous anesthésie gazeuse (quelques secondes).

Impact sur les animaux

L’infection chez les rongeurs peut provoquer une baisse d’appétit et une perte de poids. Le contrôle visuel sera quotidien et le contrôle du poids effectué tous les 2 jours pour ne pas perturber les rats (Rattus rattus particulièrement). Tout signe inhabituel (tel qu'une baisse d’activité) entrainerait une observation 2 fois par jour. L’infection étant respiratoire, un point limite est fixé : l'observation de difficultés respiratoires, d'une toux très importante ou d'une perte de poids au delà des 20%, entraîne la mise à mort humaine de l'animal. Toute pathologie intercurrente qui ne peut être soignée ou entraînant une douleur qui ne peut être contrôlée entraînera une mise à mort compassionnelle. Les lavages nasaux seront effectués sous anesthésie gazeuse (isoflurane)

Devenir

mise à mort de tous les rats afin d'effectuer des prélèvements (organes et sang)

Remplacement

L'étude du potentiel de constitution d’un réservoir de SARS-CoV-2 sur une espèce sauvage ne peut être réalisée que par des expériences in-vivo. Des études in silico et in vitro d’inoculation de cellules de rats ont déjà montré une possible réplication du virus en fonction du variant.

Réduction

La construction du projet en procédures successives dont la mise en œuvre ne se fait que si la précédente est efficace permet de limiter le nombre d’animaux. L’utilisation de lot de 5 à 6 animaux permet en minimisant leur nombre d’appliquer des tests statistiques non paramétriques.

Raffinement

Les animaux seront observés et approvisionnés en nourriture fraîche quotidiennement. Ces rongeurs seront hébergés en cage de 2 à 3 individus avec un enrichissement composé de nombreux tunnels, abris (afin de satisfaire leur besoin de cachette particulièrement les rats noirs et les rats bruns), et de bâtonnets de bois à ronger. Tout signe inhabituel (telle qu'une baisse d’activité) entrainerait une observation 2 fois par jour. Un point limite est fixé : l'observation de difficultés respiratoires (dyspnée, tirage costal, toux très importante, perte de poids au delà des 20%) entraîne la mise à mort humaine de l'animal. Toute pathologie intercurrente qui ne peut être soignée ou entraînant une douleur qui ne peut être contrôlée entraînera une mise à mort compassionnelle. Les seuls prélèvements sont des lavages nasaux qui seront effectués sous anaesthésie gazeuses à l’isoflurane. La mise à mort des rongeurs sera effectuée suite à une anesthésie (induction à l’isoflurane puis injection intrapéritonéale de kétamine à 150mg/kg et de Xylazine à 10 mg/kg associée à une prise de sang terminale intra-cardiaque et une dislocation cervicale.

Choix des espèces

Rattus norvegicus et rattus rattus sont les 2 espèces de rats vivant dans les égouts ou espaces anthropisés suceptibles d’être exposés par les effluents contaminés ou proximité d’avec l’homme. Les rattus norvegicus de laboratoire seront issus d'un éleveur agréé. Les rats bruns et les rats noirs, bien que de type sauvage seront issus d'un élevage également. Seul le rat noir, dont aucun animal de laboratoire ne dérive, nécessite un certificat de capacité puisqu'il est considéré par les autorités comme un animal sauvage. Les essais de réceptivité/sensibilité chez les murinés ayant été menés chez des rongeurs adultes, les rats choisis ici sont des adultes d'un poids compris entre 200 et 300 grammes.