Rongeurs

Infectées par une bactérie injectée dans les deux cuisses, puis traitées jusqu'à 23 fois dans les études les plus longues, qui peuvent durer 84 jours, 6 810 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. L'infection peut provoquer inflammation, œdème, douleur locale et boiterie, et certaines souris reçoivent au préalable un immunosuppresseur. Le projet doit évaluer de nouveaux antibactériens, leur dose, leur fréquence et leur voie d'administration, en partie par un cathéter veineux "préalablement implanté" dont le résumé ne dit ni quand ni comment il est posé. Le porteur présente cette mise à mort systématique comme une garantie du "respect des exigences en matière de bien être animal".

Objectifs

Ce projet a pour objectif de mieux comprendre les infections bactériennes localisées des tissus mous. Ces infections peuvent entraîner une inflammation importante, une destruction des tissus musculaires et, dans certains cas, une propagation de l’infection vers des formes plus graves. Elles représentent un enjeu important de santé publique, en particulier en raison de l’augmentation des résistances aux antibiotiques. Pour cela, des études sont réalisées chez la souris afin d’observer comment l’infection se développe au niveau musculaire et d’évaluer l’efficacité de nouveaux traitements antibactériens. Ces modèles permettent notamment de mesurer la capacité des médicaments à réduire la charge bactérienne dans les tissus infectés, à limiter l’inflammation locale et à améliorer l’évolution de l’infection. Ils permettent également d’étudier le comportement des traitements dans l’organisme afin d’optimiser leur utilisation. Avant d’être testés chez l’animal, les composés font l’objet d’études préalables en laboratoire (en dehors de l’organisme) afin de sélectionner les candidats les plus prometteurs. Les expérimentations animales ne sont réalisées que lorsque les informations recherchées ne peuvent pas être obtenues par des méthodes alternatives. Ces travaux permettront de mieux identifier les traitements les plus efficaces et de mieux comprendre les relations entre l’exposition des médicaments et leur activité anti-infectieuse. À terme, ce projet vise à contribuer au développement de nouvelles approches thérapeutiques contre les infections bactériennes des tissus mous, notamment dans les situations où les traitements actuellement disponibles sont insuffisants ou moins efficaces.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à améliorer la compréhension et le traitement des infections bactériennes localisées des tissus intramusculaires de la cuisse. Ces infections peuvent entraîner une inflammation importante, une destruction des tissus musculaires et, dans certains cas, évoluer vers des formes plus graves difficiles à traiter. Elles représentent un enjeu important de santé publique, en particulier dans le contexte de l’augmentation des résistances aux antibiotiques. Les principaux bénéfices attendus concernent le développement de nouveaux traitements antibactériens plus efficaces. Les études permettront d’identifier des composés capables de réduire la charge bactérienne dans les tissus infectés et de déterminer les conditions optimales de leur utilisation (dose, fréquence et voie d’administration). Ces travaux contribueront également à mieux comprendre l’évolution des infections musculaires localisées, la réponse inflammatoire associée et les mécanismes d’action des traitements au sein d’un organisme entier. Ils permettront ainsi d’améliorer les connaissances scientifiques dans le domaine des infections bactériennes des tissus mous. À terme, les résultats de ce projet pourraient contribuer au développement de nouvelles approches thérapeutiques pour les patients, en particulier dans les situations où les traitements actuellement disponibles sont insuffisants ou moins efficaces en raison de phénomènes de résistance aux antibiotiques. Enfin, en optimisant les modèles expérimentaux et les approches utilisées, ce projet participe à une utilisation raisonnée et limitée des animaux en recherche, en évitant la répétition d’études inutiles et en permettant d’obtenir des résultats fiables avec le nombre minimal d’animaux nécessaire.

Procédures

Les animaux seront soumis à différents types de gestes expérimentaux, incluant des administrations de substances, des infections expérimentales, des prélèvements sanguins et un suivi clinique régulier. Aucune procédure chirurgicale lourde n’est prévue. Les principales étapes sont les suivantes : • Acclimatation : minimum 5 jours avant toute procédure, sans intervention. • Utilisation d’un cathéter veineux préalablement implanté : Manipulation du cathéter (connexion, administration en perfusion, rinçage, vérification de la perméabilité) réalisée en conditions aseptiques par du personnel formé. • Pré-conditionnement (si nécessaire) : administration d’agent immunosuppresseur (voie sous cutanée, J 4 et J 1 avant infection) ou d’antihistaminiques. • Infection expérimentale : administration intramusculaire unique dans les 2 cuisses, réalisée sous anesthésie générale et en quelques minutes. • Traitement : administration prophylactique ou thérapeutique par voie intraveineuse, intrapéritonéale, sous cutanée ou orale jusqu’à 63 jours avant le début de l’infection en 2 ou 3 fois. Les volumes et fréquences respectent les recommandations. Le nombre maximal d’injections est généralement de 2 à 6 sur modèles courts (~25 h) et peut atteindre 20 à 23 sur modèles prolongés. • Prélèvements sanguins : o soit réalisés une fois en phase terminale o soit en cours d’étude (PK), jusqu’à 7 prélèvements sur 24 h, de faible volume, sur animal vigile ou anesthésié selon la technique o utilisation possible de cathéters pour limiter les ponctions répétées • Suivi clinique : réalisé 6 à 8 fois par jour selon le modèle (évaluation du score clinique, signes d’infection), avec une mesure du poids corporel réalisée 1 à 2 fois par jour. • Mise à mort : en fin d’étude ou dès atteinte des critères d’arrêt, avec réalisation de prélèvements terminaux. La durée des études est généralement d’environ 25 heures pour les modèles d’efficacité ou PK/PD, et peut atteindre jusqu’à 21 jours post infection. Soit un total maximal de 84 jours pour les études de survies si la thérapie est utilisée en prophylactique.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus dans ce modèle d’infection intramusculaire sont principalement liés à l’établissement d’une infection localisée dans le tissu musculaire et aux manipulations expérimentales associées. Le développement de l’infection peut entraîner une altération légère à modérée de l’état général des animaux, se traduisant par une diminution de l’activité, une posture voûtée, un pelage ébouriffé, une perte de poids modérée et une baisse de la prise alimentaire. Des signes locaux spécifiques au modèle sont également attendus au niveau du site d’injection intramusculaire, incluant une inflammation, un œdème, une douleur locale et une possible boiterie ou diminution de l’appui sur le membre affecté. Ces manifestations reflètent la réponse inflammatoire et l’évolution locale de l’infection dans le muscle. Selon l’agent infectieux et la progression du modèle, une dissémination bactérienne peut survenir et conduire dans de rares cas à des signes systémiques (hypothermie, déshydratation), bien que le modèle soit principalement localisé. Ces effets sont considérés comme de sévérité légère à modérée, mais peuvent devenir modérés en raison de leur cumul au cours du protocole expérimental. Un suivi clinique régulier basé sur une grille de score est mis en place afin de détecter précocement toute dégradation de l’état des animaux. Des mesures de soutien sont instaurées dès l’apparition des premiers signes cliniques et des critères d’arrêt prédéfinis sont appliqués de manière stricte afin de limiter toute douleur ou souffrance excessive.

Devenir

À l’issue des procédures expérimentales, les animaux sont systématiquement mis à mort. Aucune réutilisation, remise en liberté ou maintien en vie après la procédure n’est envisageable. En effet, les animaux ont été exposés à des agents infectieux potentiellement pathogènes et les procédures impliquent généralement des atteintes physiologiques incompatibles avec une récupération complète dans des conditions garantissant leur bien être. Le recours à la mise à mort permet également la réalisation de prélèvements terminales indispensables à l’atteinte des objectifs scientifiques du projet. Cette approche garantit à la fois la qualité des données générées et le respect des exigences en matière de bien être animal, en évitant toute utilisation ultérieure inappropriée des animaux.

Remplacement

Avant de recourir à l’utilisation d’animaux, des méthodes alternatives sont systématiquement mises en œuvre afin de limiter leur utilisation. Les molécules testées sont d’abord étudiées en laboratoire, en dehors de l’organisme, grâce à des tests réalisés sur des micro organismes (bactéries) et des cellules. Ces approches permettent de vérifier si les candidats traitements sont susceptibles d’être efficaces et d’éliminer ceux qui ne présentent pas d’intérêt. Des modèles informatiques et des analyses de données existantes sont également utilisés pour mieux comprendre le comportement des médicaments et sélectionner les doses appropriées avant toute expérimentation animale. Ces méthodes permettent de réduire le nombre d’animaux utilisés en ne testant que les molécules les plus prometteuses. Elles sont systématiquement privilégiées dès que cela est possible. Cependant, certaines questions scientifiques ne peuvent pas être étudiées sans recourir à un organisme entier. Les infections étudiées impliquent des interactions complexes entre l’agent infectieux et l’ensemble de l’organisme, notamment la circulation du pathogène dans différents organes et la réponse globale de l’organisme. À ce jour, ces phénomènes ne peuvent pas être reproduits de manière fiable par des méthodes alternatives. Le recours à l’animal reste donc nécessaire dans certaines situations, mais il est limité au strict nécessaire, et uniquement lorsque les informations recherchées ne peuvent pas être obtenues autrement.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés dans ce projet est limité au strict nécessaire grâce à plusieurs mesures mises en place dès la conception des études. Avant toute expérimentation, les chercheurs s’appuient sur les données déjà disponibles (littérature scientifique, résultats internes) afin d’éviter de répéter des études déjà réalisées. Des tests préalables en laboratoire permettent également d’identifier les conditions les plus adaptées avant d’utiliser des animaux. Les modèles sont d’abord optimisés avec un nombre réduit d’animaux afin de définir précisément les paramètres expérimentaux (dose d’infection, durée de l’étude). Ces informations permettent ensuite de concevoir les études de manière plus efficace et d’éviter d’avoir à les répéter. Le nombre d’animaux par groupe est déterminé à l’aide de méthodes statistiques permettant d’obtenir des résultats fiables tout en utilisant le minimum d’animaux nécessaire. Par ailleurs, les études sont organisées de manière à limiter le nombre de manipulations réalisées sur chaque animal. Lorsque les besoins expérimentaux sont importants, des groupes distincts d’animaux (appelés cohortes) sont utilisés afin d’éviter d’imposer un trop grand nombre de prélèvements ou d’injections à un même animal. Enfin, plusieurs types de données (par exemple observations cliniques et mesures biologiques) sont recueillis chez un même animal lorsque cela est possible, ce qui permet de réduire le nombre total d’animaux nécessaires. L’ensemble de ces approches permet de concilier la qualité scientifique des résultats avec une utilisation raisonnée et limitée des animaux.

Raffinement

Le projet met en œuvre différentes mesures afin de réduire au maximum la douleur, la souffrance et le stress des animaux tout au long des études. Les animaux sont hébergés dans des conditions adaptées et contrôlées, avec un enrichissement du milieu (matériel de nidification, abris, tunnels) qui favorise leur bien être et leur permet d’exprimer des comportements naturels. Ils sont acclimatés avant toute expérimentation afin de réduire le stress lié au changement d’environnement. Les manipulations sont réalisées par du personnel formé, en utilisant des techniques adaptées pour limiter l’inconfort et la durée de contention. Lorsque cela est nécessaire, une anesthésie est utilisée pour certaines procédures. Des traitements contre la douleur peuvent également être administrés si des signes de gêne apparaissent. Les animaux font l’objet d’une surveillance régulière (plusieurs fois par jour si nécessaire) afin de détecter rapidement toute dégradation de leur état de santé. Une grille de suivi permet d’évaluer leur état de manière objective. Des mesures de soutien sont mises en place en cas de besoin, comme l’apport d’eau ou de nourriture facile d’accès, ou un environnement chauffé si les animaux présentent des signes de fragilité. Des critères d’arrêt précoces sont définis : dès qu’un animal présente des signes importants de souffrance, il est pris en charge ou euthanasié afin d’éviter toute dégradation de son état. Enfin, l’organisation des études permet de limiter le nombre de manipulations par animal, notamment grâce à l’utilisation de groupes distincts lorsque nécessaire. L’ensemble de ces mesures permet de réduire autant que possible l’impact des procédures sur les animaux tout en garantissant la qualité des résultats scientifiques.

Choix des espèces

La souris est l’espèce choisie pour ce projet car il s’agit d’un modèle largement utilisé en recherche médicale. Elle permet d’étudier de manière fiable le développement des infections et d’évaluer l’efficacité de nouveaux traitements dans un organisme entier. De nombreuses connaissances scientifiques existent déjà sur ce modèle, ce qui facilite l’interprétation des résultats et permet de limiter la répétition d’expériences. L’organisme de la souris présente des similitudes importantes avec celui de l’Homme pour l’étude des infections, notamment en ce qui concerne la manière dont les agents infectieux se propagent dans le corps et la façon dont l’organisme réagit. Cela en fait un outil pertinent pour améliorer les connaissances et développer de nouveaux traitements. Les animaux utilisés sont des adultes. Ce choix permet de travailler sur un organisme dont les fonctions sont totalement développées et stables, ce qui garantit des résultats plus fiables et reproductibles. Chez les adultes, le système immunitaire et les caractéristiques physiologiques sont mieux établis, ce qui est essentiel pour étudier correctement les infections. Selon les besoins de l’étude, des animaux avec un système immunitaire normal ou temporairement affaibli peuvent être utilisés. Cela permet d’explorer différentes situations, notamment celles où les défenses de l’organisme sont diminuées, comme cela peut être le cas chez certains patients. Ce choix d’espèce et de stade de développement permet de répondre aux objectifs scientifiques du projet tout en utilisant le modèle le plus adapté et le mieux caractérisé.

3 612 souris vont être utilisées, chacune recevant deux ou trois injections de vaccin, par voie intrapéritonéale, sous-cutanée, intradermique, intranasale, intramusculaire ou intravaginale, et jusqu'à sept prises de sang. Selon les procédures, une injection d'acétate de médroxyprogestérone, une hormone, précède la vaccination de cinq jours. Ces souris, dont des lignées génétiquement modifiées pour exprimer des protéines humaines, sont utilisées pour tester 18 vaccins, leurs adjuvants et leurs voies d'administration dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, et toutes sont mises à mort à la fin de chaque procédure pour prélever moelle osseuse, rate et ganglions. Face à ces atteintes, le porteur résume les bénéfices attendus au "développement de nouveaux vaccins", contre six agents infectieux allant du SARS-CoV-2 à la tuberculose.

Objectifs

Les objectifs du projet sont de tester la capacité de vaccins à activer des réponses immunitaires dans les infections comme l’infection à SARS-CoV-2 (nouveaux variants), à Nipah virus (un virus léthal qui émerge contre lequel il n'existe pas de vaccin), HBV (le virus de l'hépatite B contre lequel il n'existe pas de vaccin), Chlamydiae trachomatis (CT, une bactérie sexuellement transmissible contre laquelle il n'existe pas de vaccin), Bordetella pertussis (responsable de la coqueluche dont les cas sont en nette augmentation du fait d'une diminution de la protection induite par le vaccin acellulaire) ou encore Tuberculosis mycobacterium (afin de traiter les formes latentes de la tuberculose) et d’identifier pour chaque vaccin la meilleure voie d’administration et le meilleur adjuvant afin d’obtenir des réponses immunitaires optimales et adaptées à chaque pathogène. Les vaccins que nous évaluons dans ce projet ont démontré leur innocuité dans une précédente étude. Ce qui change ici ce sont les antigènes (petits morceaux de microbes qui ne donnent pas la maladie) véhiculés par ces vaccins. Nous devons nous assurer que ces antigènes sont bien capables d'activer des réponses immunitaires dans un organisme vivant. Cette évaluation préclinique est primordiale avant de pouvoir tester ces vaccins chez l'homme dans des essais cliniques. Certains de nos vaccins sont des anticorps associés à des petits fragments de microbes. Ces anticorps reconnaissent des protéines humaines à la surface des cellules clefs pour activer le système immunitaire. Pour tester ces vaccins, nous devons utiliser des souris génétiquement modifiées qui expriment ces protéines humaines. Le projet vise également à déterminer la persistance de la réponse immunitaire induite par les vaccins après avoir choisi les plus efficaces et l’adjuvant le plus efficace pour chaque vaccin.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus sont le développement de nouveaux vaccins dans des maladies infectieuses avec un impact sur la santé humaine.

Procédures

Les interventions effectuées seront : une injection sous-cutanée d'acétate de médroxyprogestérone 5 jours avant la vaccination selon les procédures, des injections de vaccins (durée: 30 secondes) par voie intrapéritonéale, sous-cutanée, intradermique, intranasale, intramusculaire ou intravaginale selon les procédures ( à semaine 0, 3 et 5) et un prélèvement périodique de sang (durée 30 secondes) pratiqué sur les souris (Semaine (S)-1, S0+1 jour, S2, S3+1jour, S4, S5+1 jour, et le jour de la mise à mort) après la vaccination.

Impact sur les animaux

Les animaux recevront 2 à 3 injections de vaccin et seront soumis à des prélèvements sanguins réguliers. La réponse immunitaire générée est sans conséquence sur l’animal tout le long de la cinétique expérimentale. Les effets indésirables pourraient être une infection après l'utilisation d'aiguilles au moment de l'injection des vaccins ou des prélèvements de sang. Les aiguilles sont changées entre chaque animal pour limiter cet effet indésirable.

Devenir

Les animaux sont mis à mort à la fin de chaque procédure afin d'évaluer les réponses immunitaires induites par les vaccins dans les organes lymphoïdes primaires (moelle osseuse) et secondaires (rate et ganglions lymphatiques) et dans les tissus périphériques portent d'entrée des pathogènes.

Remplacement

Les vaccins utilisés dans ce projet ont déjà été évalués dans un précédent projet. Ce qui change ici se sont les antigènes (petits fragments de microbes qui ne provoquent pas la maladie) véhiculés par nos vaccins. Nous devons nous assurer que ces antigènes sont bien capables d'activer des réponses immunitaires dans un organisme vivant. Cette évaluation préclinique est primordiale avant de pouvoir tester ces vaccins chez l'homme dans des essais cliniques. Les nouvelles versions de vaccins que nous allons tester dans ces modèles animaux ont été présélectionnés sur la base de plusieurs tests in vitro sur des cellules en culture. Ainsi seuls les vaccins candidats qui auront donné les meilleurs résultats seront ensuite utilisés chez l’animal. Nous nous proposons ici de tester l’efficacité de ces vaccins pré-sélectionnés dans des modèles de souris (induction de réponses immunitaires systémiques, muqueuses et de longue durée). Les réponses immunitaires sont des processus complexes dont la mise en place est conditionnée par des interactions dynamiques impliquant de nombreux partenaires cellulaires présents dans différents compartiments de l’organismes (site d’entrée du pathogène/antigène, ganglion drainant, site effecteur). A l’heure actuelle, aucune approche in vitro ne permet de reproduire de façon satisfaisante l’ensemble des phénomènes impliqués dans l’initiation des réponses immunitaires dans le cadre d’une infection naturelle ou après une vaccination. C’est pourquoi nous avons besoin de travailler avec ces modèles animaux.

Réduction

Dans le cadre de la « Réduction », nous avons calculé le nombre minimal de souris (n=7 par groupe) nécessaires pour que les résultats soient significatifs et selon nos précédents travaux. Il s'agit ici de tester 18 vaccins avec et sans adjuvant et injectés selon différentes voies afin de trouver les meilleures conditions d'utilisation de ces vaccins c'est-à-dire l'adjuvant et la voie d'administration qui induiront les réponses immunitaires optimales. Ce nombre est estimé à 3612 souris et est calculé sur la base d’une formule statistique couramment utilisée dans l'expérimentation animale afin de calculer au plus juste le nombre d'animaux par procédure.

Raffinement

Les souris sont élevées avec soin et respect, en présence d’éléments d’enrichissement (bandelette de coton et neslets pour faire un nid et un tunnel en carton pour se réfugier et jouer) afin de réduire au maximum la souffrance animale, qu’elle soit physique ou psychique. Nous avons ainsi établi une grille de bien-être des animaux qui comprend l'évaluation de 10 signes cliniques et prend en compte des points limites. Les animaux sont toujours manipulés par une personne expérimentée.

Choix des espèces

Nous avons choisi de travailler chez la souris car notre projet nécessite d’étudier les réponses immunitaires chez des animaux génétiquement modifiés afin de d'exprimer un gène humain dans un type cellulaire donné. En effet, certains de nos vaccins sont des anticorps associés à des petits fragments de microbes. Ces anticorps reconnaissent des protéines humaines à la surface des cellules clefs pour activer le système immunitaire. Pour tester ces vaccins, nous devons utiliser des animaux génétiquement modifiées qui expriment ces protéines humaines. Ces modifications génétiques sont possibles chez la souris. D’autre part, les modèles murins de vaccination ont déjà été mis au point et sont largement décrits dans la littérature. Les souris seront utilisées à l’âge adulte (après 8 semaines afin de minimiser l’impact des perturbations endocriniennes observées avant cette tranche d’âges).

Accouplées une seule nuit, soumises sans anesthésie à un frottis vaginal pour dater la gestation, puis nourries d'un régime pauvre en protéines jusqu'au terme, 16 rates Sprague Dawley vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ce régime doit provoquer un retard de croissance chez leurs fœtus, et le porteur indique qu'il peut entraîner chez les mères inactivité et perte de poids, les rates étant hébergées seules à partir du quinzième jour. Au dix-neuvième jour de gestation, chaque rate est anesthésiée puis opérée sans réveil pour exposer ses fœtus un par un et leur injecter un traceur qui mesure la perméabilité des barrières entre le sang et le cerveau. Toutes sont mises à mort ce jour-là, et les fœtus, jusqu'à six analysés par femelle, ne sont pas comptés dans l'effectif de 16.

Objectifs

Le retard de croissance intra-utérin est un facteur de risque d’apparition de troubles du neurodéveloppement chez l’enfant, et des travaux antérieurs montrent que les interfaces sang-cerveau qui protègent le tissu cérébral sont fragilisées à la naissance, avec pour conséquence une exposition augmentées aux stress environnementaux ou inflammatoires. L’objectif de notre projet est de comprendre si le retard de croissance intra-utérin impacte l’intégrité des barrières sang-cerveau avant la naissance, chez le fœtus

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettra d’apporter des informations importantes concernant l’impact du RCIU sur la mise en place des barrières sang-cerveau au cours du développement prénatal, et donc la protection du cerveau en développement. Nos résultats précédents montrent une altération de l'intégrité de ces barrières chez le nouveau-né mais la précocité de cet effet délétère du RCIU n’est pas connue, alors même que la période fœtale tardive est particulièrement impliquée dans l’étiologie des troubles neurodéveloppementaux. Ce projet permettra donc de définir si une vigilance accrue à l’exposition à des stress environnementaux et inflammatoires est nécessaire avant la naissance, voire d’envisager un traitement protecteur des interfaces en fin de grossesse.

Procédures

Le projet débute avec une mise en reproduction de deux animaux (un mâle et une femelle par cage) pendant une nuit seulement. Un prélèvement vaginal sur animaux vigiles est ensuite effectué pour confirmer la présence de spermatozoïdes et donc valider le premier jour de gestation. Quelques secondes seulement sont nécessaires pour procéder au frottis et aucune contrainte physique n’est appliquée à l’animal. Une anesthésie n’est pas envisagée pour éviter d’appliquer un stress supplémentaire à l’animal. Ces femelles gestantes sont ensuite soumises à un régime alimentaire hypo-protéiné durant toute la période de gestation (8 femelles). Enfin au 19ième jour de gestation les animaux sont anesthésiés, une chirurgie expose les fetus un par un et permet d’injecter un traceur pour mesurer la perméabilité des interfaces sang-cerveau (chirurgie sans réveil). Les animaux non injectés sont également utilisés pour collecter des tissus à des fins d’analyses biochimique et moléculaire.

Impact sur les animaux

Les femelles sont soumises à un régime hypo-protéiné qui peut affecter leur comportement durant toute la période de gestation. Une inactivité ainsi qu’une perte de poids associées à ce régime pourront être observées durant la période de gestation. La seconde procédure est sans réveil.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort au 19ième jour de gestation, en raison de l'utilisation des fœtus pour les mesures de perméabilité

Remplacement

Bien que des modèles in vitro de barrières sang-cerveau (e.g. cellules endothéliales cérébrales) existent, ils ne reflètent pas le fonctionnement spécifique des interfaces fœtales, ne permettent pas d’étudier l'influence globale des différentes cellules cérébrales sur la perméabilité de ces interfaces, et ne permettent pas de mimer des pathologies périnatales aussi complexes que le RCIU. L’analyse in vivo reste donc incontournable pour ce projet de recherche.

Réduction

Nous prévoyons, qu’un nombre de 8 rates par lot expérimental (RCIU, Control) est suffisant, afin de remplir les Conditions statistiques de test de significativité. Six foetus peuvent être analysés pour chaque femelle gestante. La valeur de perméabilité fœtale est consolidée par l’analyse de 6 fœtus, mais la variabilité du degré de retard de croissance induit d’une femelle à l’autre, nécessite se nombre d’animaux.

Raffinement

Les rates gestantes soumises au régime pauvre en protéine seront hébergées individuellement à partir du quinzième jour de gestation et leur poids sera suivi régulièrement tous les trois jours à partir de la mise en reproduction. Les conditions d’hébergement sont règlementaires : enrichissement systématique des cages (bâtonnets à ronger), limitation du bruit, manipulations réalisées par un personnel formé et, autant que possible, par les mêmes expérimentateurs afin de limiter le stress. Pendant l’hébergement individuel, les animaux sont logés dans des cages transparentes et grilles espacées, et la présence systématique d’autres animaux dans l’environnement immédiat de la cage est contrôlé afin de maintenir au maximum un contact visuel, olfactif, auditif et dans une moindre mesure tactile, en plus d'un milieu de vie sur-enrichi par l’ajout d’un objet supplémentaire dans la cage et de matériel de nidification. La méthode de RCIU que nous appliquons est reconnue comme moins invasive que les autres méthodes d’induction d’un retard de croissance (ligature des artères utérines). La mesure de perméabilité se fait entièrement sous anesthésie sans réveil.

Choix des espèces

Les expériences décrites dans ce projet seront effectuées sur des rats Sprague Dawley (SD), espèce utilisée dans nos travaux précédents. C’est une espèce de prédilection pour des expérimentations qui requièrent une optimisation des gestations. Les femelles de cette lignée ont en effet des portées importantes et régulières. Elles s’occupent très bien de leurs petits. Les données déjà acquises sur ce projet l'ont été avec ce modèle. Les animaux seront mis à mort lorsque les fetus auront atteint 19 jours de vie embryonnaire . Le but du projet est d'étudier la permeabilité des interfaces sang-cerveau au cours de la periode fetale tardive.

Pour étudier comment l'absence d'une protéine de surface, l'intégrine alpha v, modifie la contraction des artères, 22 souris âgées de 13 à 15 mois vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent trois injections dans le ventre sur trois jours consécutifs pour supprimer cette protéine dans les cellules musculaires de leurs vaisseaux, avec pour effets possibles une baisse d'activité et d'appétit, une perte de poids et un pelage hérissé. Quatre semaines plus tard, toutes sont tuées pour prélever leurs artères fémorales. À court terme, le porteur présente ce projet, mené avec un laboratoire européen, comme une "étape essentielle pour finaliser un article scientifique commun".

Objectifs

Les vaisseaux sanguins doivent rester souples pour permettre au sang de circuler correctement et pour s'adapter aux variations de la pression artérielle. Avec l'âge, ils deviennent progressivement plus rigides, ce qui augmente le risque de maladies cardiovasculaires. Dans nos travaux précédents, nous avons montré qu'un élément présent à la surface des cellules musculaires qui composent la paroi des vaisseaux sanguins, joue un rôle important dans le maintien de leur souplesse. Lorsque cet élément est absente, ces cellules deviennent plus rigides en raison de modifications de leur structure interne ce qui pourrait également modifier la capacité des vaisseaux sanguins à se contracter et à se relâcher normalement. Si cette hypothèse est confirmée, elle permettra de mieux comprendre les mécanismes responsables de la perte de souplesse des artères avec le vieillissement et trouver de nouvelles cible pour développer des médicaments. Pour le vérifier, nous étudierons en laboratoire des segments d'artère prélevés chez des souris âgées de 13 à 15 mois, soit normales, soit dépourvues de l'élement à la surface des cellules musculaires des vaisseaux (souris déficientes). Pour générer la déficiences, nous devrons injecter une molécule dans le ventre 3 jours consécutifs et attendre 4 semaines. Les souris seront euthanasiées pour prélever les artères et étudier leur capacité à se contracter et à se dilater

Bénéfices attendus

Il s’agit ici d’un profit humain : la rigidité artérielle augmente avec l'âge, touchant plus de 60 % des personnes de plus de 60 ans, et s'accompagne d'une altération du bon fonctionnement des vaisseaux sanguins. Ce projet permettra de trouver de nouvelles cibles thérapeutiques pour limiter ces altérations. Ce projet est mené en collaboration avec un laboratoire européen. A court terme, ce projet constitue également une étape essentielle pour finaliser un article scientifique commun, qui contribuera à diffuser ces résultats au sein de la communauté scientifique et à faire progresser les connaissances sur les maladies cardiovasculaires.

Procédures

Pour déclencher la modification génétique nécessaire à l'étude, les souris recevront trois injections d'un médicament une fois par jour pendant trois jours consécutifs. Elles seront ensuite laissées au repos pendant 4 semaines afin que cette modification soit pleinement effective. À la fin de cette période, les animaux seront euthanasiés de manière conforme à la réglementation en vigueur. Les principales artères seront ensuite prélevées afin d'étudier, en laboratoire, sa capacité à se contracter et à se relâcher. Ces analyses permettront de mieux comprendre le rôle de la protéine d’intérêt dans le fonctionnement des vaisseaux sanguins et son implication dans le vieillissement des artères.

Impact sur les animaux

Les animaux pourront ressentir un stress léger et temporaire lors de leur manipulation et de leur maintien pendant les injections. Les injections elles-mêmes peuvent provoquer une douleur passagère au point d'administration. Le médicament utilisé dans cette étude, peut entraîner des effets secondaires transitoires, tels qu'une diminution de l'activité, une baisse de l'appétit, une légère perte de poids ou un pelage hérissé. Enfin, la répétition des injections sur trois jours consécutifs peut augmenter légèrement le niveau de stress des animaux.

Devenir

A la fin de la procédure, tous les animaux sont mis à mort afin de prélever les artères fémorales et réaliser leur étude morphologique.

Remplacement

Nos travaux réalisés en laboratoire sur des cellules musculaires issues de la paroi des artères ont montré que l'absence d'une molécule de surface cellulaire modifie leur organisation interne. Ces changements pourraient influencer la capacité des vaisseaux sanguins à se contracter et à se relâcher, un mécanisme essentiel pour réguler la circulation du sang et la pression artérielle. Cependant, ces expériences réalisées sur des cellules isolées ne permettent pas d'étudier les interactions entre les différents types de cellules qui composent la paroi des artères. Or, le bon fonctionnement des vaisseaux sanguins dépend de la communication entre ces cellules. Il est donc nécessaire d'étudier des artères intactes prélevées chez des souris, afin d'évaluer leur capacité à se contracter et à se dilater dans des conditions proches de celles observées dans l'organisme. À ce jour, il n'existe pas de méthode alternative permettant de reproduire fidèlement le fonctionnement complet d'une artère en laboratoire.

Réduction

Afin de limiter le nombre d’animaux utilisés dans cette étude, nous avons réalisé un calcul statistique permettant de déterminer le nombre minimum d’animaux nécessaires pour obtenir des résultats fiables. Ce calcul est basé sur des données préliminaires obtenues par nos collaborateurs et sur le principal paramètre étudié dans le projet. De plus, chaque animal permettra d’obtenir plusieurs fragments d’artères qui pourront être étudiés séparément en laboratoire. Cela permettra de réaliser plusieurs tests sur un même animal, notamment en évaluant la réponse des vaisseaux à différentes molécules capables de stimuler ou de bloquer la protéine ciblée. Cette organisation permet d’obtenir un maximum d’informations scientifiques tout en respectant le principe de réduction du nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

Les souris seront surveillées régulièrement après les injections du médicament, en particulier pendant la semaine qui suit le traitement, afin de vérifier leur état de santé et leur bien-être. Le personnel est expérimenté. Des critères précis de surveillance seront définis pour chaque étape de l’étude. Ces critères permettront d’identifier rapidement tout signe d’inconfort ou de souffrance et de prendre les mesures appropriées si nécessaire, conformément aux règles de protection et de bien-être des animaux utilisés en recherche. La mise en place de points limites adaptés à chaque procédure et d'une grille de score ont été établis.

Choix des espèces

La souris est le modèle animal le plus adapté pour cette étude, car elle permet de reproduire de nombreux mécanismes impliqués dans le fonctionnement des vaisseaux sanguins chez l'être humain. De plus, il est possible de modifier précisément certains gènes chez la souris afin d'étudier le rôle d'une protéine spécifique. Dans ce projet, cette approche permettra de supprimer la protéine ciblée uniquement dans les cellules musculaires des vaisseaux sanguins et uniquement chez des animaux adultes, afin d'étudier son rôle sans perturber le développement normal des artères. Avec l'âge, les vaisseaux sanguins perdent progressivement leur capacité à se dilater et deviennent plus rigides. Cette évolution est liée à des modifications des cellules qui composent la paroi des artères et constitue un facteur important de risque cardiovasculaire. Nous utiliserons donc des souris âgées de 13 à 15 mois, un âge auquel ces changements sont déjà présents et comparables à ceux observés chez les personnes âgées. Ce modèle nous permettra d'étudier le rôle de notre protéine d'intérêt dans un contexte proche du vieillissement naturel et de mieux comprendre son implication dans la perte de souplesse des artères.

Les rats de ce projet ont une maladie chronique du foie provoquée par chirurgie, et certains arrivent déjà opérés de chez un fournisseur spécialisé. 2 010 rats vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, nourris pour certains d'un régime enrichi en protéines ou en ammoniac, et reçoivent une substance impliquée dans les troubles neurologiques de la maladie. S'y ajoutent des prises de sang, des traitements expérimentaux par voie orale, sous-cutanée, intrapéritonéale ou intraveineuse, jusqu'à vingt minutes en enceinte thermostatique avant certaines injections, et des tests de mémoire, d'apprentissage et de motricité que le porteur ne nomme pas. Tous sont tués à l'issue, car les dosages prévus exigent un grand volume de sang prélevé en fin de vie et plusieurs tissus.

Objectifs

Les maladies chroniques du foie peuvent entraîner des troubles du fonctionnement du cerveau. Les personnes atteintes peuvent présenter des difficultés de concentration, de mémoire, de coordination des mouvements ou des changements de comportement. Dans les formes les plus sévères, l’état de conscience peut être altéré. L’objectif de ce projet est de développer et caractériser des modèles reproduisant certaines de ces complications chez le rat et d’utiliser ces modèles pour évaluer de futurs traitements. Pour cela, une maladie chronique du foie sera induite par une intervention chirurgicale. Cette intervention sera associée à une alimentation enrichie en protéines ou en ammoniac ainsi qu’à l’administration ponctuelle d’une substance impliquée dans l’apparition des troubles neurologiques observés chez les patients. Ces travaux permettront d’améliorer la compréhension des mécanismes responsables de la maladie et d’identifier de nouvelles approches thérapeutiques destinées à prévenir ou à réduire les troubles neurologiques associés aux maladies chroniques du foie. Les conditions expérimentales seront définies afin de reproduire des formes modérées de la maladie compatibles avec le bien-être des animaux.

Bénéfices attendus

Les maladies chroniques du foie peuvent provoquer des troubles du fonctionnement du cerveau. Les personnes atteintes peuvent présenter des difficultés de concentration, de mémoire, d’apprentissage ou de coordination des mouvements. Dans certains cas, ces troubles peuvent réduire l’autonomie des patients et avoir un impact important sur leur vie quotidienne et celle de leurs proches. Ce projet vise à développer des modèles permettant de mieux reproduire ces complications et de mieux comprendre les mécanismes responsables de leur apparition. Ces modèles seront également utilisés pour évaluer de nouveaux traitements destinés à prévenir, limiter ou corriger les troubles observés. À terme, ces travaux pourraient contribuer à améliorer la prise en charge des patients atteints de maladies chroniques du foie, à réduire les conséquences neurologiques associées à ces maladies, à préserver leur autonomie et à améliorer leur qualité de vie.

Procédures

Les animaux subiront une intervention chirurgicale sous anesthésie générale accompagnée d'un traitement adapté contre la douleur. Cette intervention vise à provoquer une maladie chronique du foie similaire à celle observée chez certains patients. Selon la procédure concernée, les animaux pourront recevoir une injection sous-cutanée d'une substance impliquée dans l'apparition des troubles neurologiques observés chez les patients atteints de maladie du foie. Cette administration dure moins d'une minute. Un prélèvement sanguin pourra être réalisé au cours de l'étude ainsi qu'un prélèvement final. Ces actes sont effectués sous anesthésie gazeuse de courte durée, généralement comprise entre 2 et 5 minutes, et le prélèvement lui-même dure environ une minute. Les animaux pourront également recevoir un traitement expérimental administré par voie orale, sous-cutanée, intrapéritonéale ou intraveineuse. Chaque administration dure habituellement moins d'une minute. Certaines administrations intraveineuses pourront nécessiter un maintien temporaire dans une enceinte thermostatique pendant une durée maximale de 20 minutes afin de faciliter l'administration. Dans certaines études, un traitement unique pourra être administré selon un principe de dialyse péritonéale sous anesthésie gazeuse de courte durée. L'administration dure environ une à deux minutes et l'anesthésie quelques minutes. Enfin, les animaux participeront à des tests comportementaux non invasifs destinés à évaluer l'activité, la mémoire, l'apprentissage ou les capacités motrices. Ces évaluations reposent principalement sur l'observation des animaux et ne nécessitent pas d'acte invasif.

Impact sur les animaux

Les animaux subiront une intervention chirurgicale réalisée sous anesthésie générale et bénéficieront d'un traitement adapté contre la douleur. Après l'opération, ils pourront présenter une gêne temporaire, une diminution transitoire de l'activité ou une baisse de l'alimentation. Au cours de l'étude, le développement de la maladie pourra entraîner une diminution modérée de la prise de poids, une baisse de l'activité spontanée ainsi que des modifications du comportement, de la mémoire, de l'apprentissage ou de la coordination des mouvements. Certains régimes alimentaires utilisés dans le projet pourront renforcer temporairement ces effets. Une substance impliquée dans les mécanismes de la maladie pourra également être administrée afin de reproduire certains épisodes observés chez les patients. Cette administration pourra entraîner, pendant une courte durée, une diminution de l'activité ou des capacités motrices. Les animaux feront l'objet d'une surveillance régulière tout au long du projet. Des critères d'arrêt prédéfinis permettront d'intervenir rapidement en cas d'aggravation inattendue afin de préserver leur bien-être.

Devenir

À l’issue des procédures, l’ensemble des animaux sera mis à mort afin de permettre la réalisation des prélèvements biologiques nécessaires à l’atteinte des objectifs scientifiques du projet. Les analyses prévues nécessitent le recueil d’un volume sanguin terminal important ainsi que la collecte de plusieurs tissus d’intérêt, notamment au niveau cervical. Ces prélèvements permettent la réalisation concomitante de nombreux dosages qui ne sont pas compatibles avec le maintien en vie des animaux. L’utilisation de prélèvements terminaux permet également de maximiser la quantité de données obtenues à partir d’un même animal et contribue ainsi à l’application du principe de réduction en limitant le nombre total d’animaux nécessaires au projet. En raison de la nature des prélèvements réalisés et de leur caractère invasif, aucun animal ne pourra être réutilisé à l’issue de l’étude.

Remplacement

Avant de réaliser les études chez l'animal, des tests in vitro et des approches de modélisation informatique sont utilisés pour sélectionner les candidats médicaments les plus prometteurs. Ces méthodes permettent notamment d'étudier l'action de composés sur des cellules, des tissus ou certaines bactéries présentes dans l'intestin, ainsi que de prédire certains de leurs effets dans l'organisme. Cependant, les troubles étudiés dans ce projet résultent d'interactions complexes entre plusieurs organes, notamment l'intestin, le foie, les reins et le cerveau. Aucune méthode alternative disponible aujourd'hui ne permet de reproduire simultanément l'ensemble de ces mécanismes dans un organisme vivant. Les méthodes sans animaux ne permettent pas non plus d'évaluer les effets de la maladie sur la mémoire, l'apprentissage, le comportement ou les capacités motrices, ni de mesurer l'efficacité globale d'un traitement dans l'organisme. Elles ne permettent pas davantage de suivre la façon dont un médicament est absorbé, transformé et agit sur différents organes. À ce jour, aucune méthode alternative validée ne permet donc d'atteindre les objectifs de ce projet sans recourir à l'animal.

Réduction

Le nombre d'animaux utilisés a été limité au strict minimum nécessaire pour atteindre les objectifs scientifiques du projet. Avant les études thérapeutiques, plusieurs phases de caractérisation permettront d'identifier les conditions expérimentales les plus adaptées et de vérifier la reproductibilité des modèles. Les connaissances acquises lors de ces premières étapes seront utilisées pour concevoir les études suivantes et éviter l'utilisation d'animaux supplémentaires. Les mêmes animaux seront suivis à plusieurs reprises au cours des études afin de recueillir différentes informations (état général, prélèvements biologiques et évaluations comportementales) sans avoir à utiliser de nouveaux animaux. Les groupes expérimentaux ont également été conçus de façon à permettre la comparaison de plusieurs traitements au sein d'une même étude lorsque cela est possible. Cette stratégie permet d'obtenir un maximum d'informations à partir de chaque animal tout en utilisant le plus petit nombre d'animaux compatible avec la qualité et la fiabilité des résultats scientifiques.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans des conditions favorisant leur bien-être, avec un enrichissement du milieu comprenant notamment des abris, des matériaux permettant la construction de nids et des objets à ronger. Lorsque leur état le permet, ils seront maintenus en groupe. Certains animaux pourront être reçus déjà opérés auprès d'un fournisseur spécialisé. Dans tous les cas, une période d'acclimatation et une surveillance renforcée seront mises en place après leur arrivée ou après l'intervention chirurgicale. Les interventions chirurgicales seront réalisées sous anesthésie générale avec traitement contre la douleur. Les animaux bénéficieront d'une surveillance adaptée jusqu'à leur rétablissement complet et d'un complément alimentaire favorisant la reprise de l'alimentation. Avant le début des évaluations, les animaux seront progressivement habitués aux manipulations et aux différents tests afin de limiter le stress. Les conditions expérimentales seront définies de manière à reproduire des formes modérées de la maladie sans rechercher l'apparition de troubles sévères. Une surveillance régulière sera réalisée tout au long du projet afin de détecter rapidement toute dégradation de l'état des animaux. Des mesures adaptées seront mises en place si nécessaire et des critères d'arrêt prédéfinis permettront d'éviter toute souffrance excessive.

Choix des espèces

Aucun modèle alternatif ne permet aujourd'hui de reproduire l'ensemble des mécanismes impliqués dans les complications neurologiques associées aux maladies chroniques du foie. Le rat a été choisi car son organisme présente de nombreuses similitudes avec celui de l'Homme concernant le fonctionnement du foie, de l'intestin et du cerveau. Il permet également d'étudier la mémoire, l'apprentissage, l'activité et le comportement à l'aide de méthodes reconnues et largement utilisées en recherche pharmaceutique. Cette espèce est particulièrement adaptée au modèle utilisé dans ce projet, notamment pour la réalisation de l'intervention chirurgicale nécessaire à l'induction de la maladie. De plus, de nombreuses études scientifiques ont déjà été réalisées chez le rat, ce qui facilite la comparaison des résultats et contribue à limiter le nombre d'animaux nécessaires. Les animaux utilisés seront de jeunes adultes. Ce stade de développement a été retenu car il correspond à celui le plus fréquemment utilisé pour l'étude de ces maladies et permet de réaliser les interventions et les évaluations prévues dans des conditions optimales.