Rongeurs

1 440 souris nouveau-nées ou juvéniles, âgées de un à vingt-et-un jours, vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées en fin d'étude ou plus tôt si elles atteignent un point limite. Pour évaluer des molécules destinées à des épilepsies rares de l'enfant, on leur injecte sous anesthésie gazeuse des candidats médicaments directement dans le cerveau, à travers le crâne encore souple chez les souriceaux de un à trois jours et après incision de la peau chez les plus âgées, avec pour effets possibles un retard de croissance et le rejet par la mère. Les mères et les souriceaux non traités, hors de ce décompte, sont utilisés pour former le personnel à des gestes techniques ou dans un autre projet autorisé. Le porteur qualifie l'incision chez les juvéniles de "nécessaire et justifiée", et l'élargissement à cet âge de "scientifiquement indispensable".

Objectifs

Les DEEs sont des maladies neurodéveloppementales rares, génétiques et syndromiques, caractérisées par une déficience intellectuelle, des troubles du langage, un développement moteur potentiellement altéré et des crises d'épilepsie d'apparition précoce, souvent accompagnées d'une régression du développement. Les traitements actuels (médicaments antiépileptiques) sont peu efficaces pour les formes rares, et les interventions chirurgicales sont lourdes et risquées chez les jeunes enfants. Il est nécessaire d’explorer de nouvelles approches thérapeutiques pour améliorer la qualité de vie et l’apprentissage des patients. L’objectif de ce projet est de définir un modèle permettant d’administrer nos candidats médicaments dans des zones spécifiques du cerveau de souris nouveau nées âgés de 1 à 3 jours par voie intracérébrale (phase développementale cérébrale similaire entre un souriceau de 3 jours et un nourrisson humain de 3 mois). [Afin de couvrir une fenêtre développementale plus large et représentative de l'évolution de ces pathologies durant la petite enfance, ce projet intègre également la réalisation d'injections chez des souris juvéniles âgées de 4 à 21 jours (stade de développement correspondant approximativement à la période allant de 6 mois à 3 ans chez l'enfant humain). Cette extension de la fourchette d'âge est scientifiquement indispensable car les cibles thérapeutiques étudiées peuvent s'exprimer de manière différentielle en fonction de l'âge et de la maturité neuronale.] En effet, les candidats médicaments ne passant pas la Barrière Hémato-Encéphalique, nous sommes obligés de les administrer par voie intra-cérébrale. Il est essentiel d’évaluer l’effet de nos candidats médicaments pendant les stades de développement du cerveau où les crises épileptiques se manifestent le plus dans le cadre des DEEs. Les traitements pharmacologiques peuvent avoir des effets différents sur un cerveau en développement (nouveau-né) par rapport à un cerveau plus mature (souris sevrée, jeune adulte ou adulte). Les composés étudiés dans ce modèle chez la souris nouveau-née, seront issus de sélection par des tests in silico et in vitro, puis in vivo chez la souris adulte afin d’évaluer leur tolérabilité et leur efficacité sur une cible d’intérêt. L’efficacité des meilleurs candidats ainsi sélectionnés sera évaluée dans le cadre du traitement des maladies épileptiques rares, et dans le but d’être administrés à de jeunes enfants (à partir de 3 mois).

Bénéfices attendus

Ce projet s’inscrit dans le cadre de la stratégie de recherche en neurosciences. [En France, le nombre de personnes atteintes de maladies rares (moins d’une personne atteinte sur 2000) est estimé à 3.5 millions. Plus de 7000 maladies rares, dont 800 neurologiques, sont décrites, et de nouvelles sont identifiées chaque semaine. Les maladies rares sont généralement sévères, chroniques et handicapantes. L’atteinte pour certaines d’entre elles peut provoquer des signes cliniques pathologiques apparaissant dès la naissance ou durant l’enfance (entre 3 mois et 6 ans), telle que les encéphalopathies épileptiques et/ou développementales (DEEs).] Les traitements de la DEE reposent sur la prescription de médicaments antiépileptiques, qui ne sont pas toujours efficaces pour les formes rares d’épilepsie, et sur des interventions chirurgicales curatives (ablation de la zone épileptogène, radiochirurgie cérébrale ou thermocoagulation) qui peuvent être lourdes et risquées notamment chez les jeunes enfants. Les futurs candidats médicaments évalués dans ce projet sont connus pour ne pas passer la Barrière Hématoencéphalique (barrière naturelle qui sépare le cerveau du reste du corps). Ils seront donc administrés directement dans le système nerveux central (SNC) des patients afin de permettre un ciblage direct de celui-ci, augmentant ainsi l’efficacité des traitements, et diminuant les effets secondaires qui pourraient survenir après une administration orale ou intraveineuse, améliorant ainsi grandement la qualité de vie des patients. Les bénéfices attendus de ce projet sont de caractériser les potentiels candidats médicaments et de déterminer leur efficacité sur une cible donnée dans le cadre de maladies rares neurologiques infantiles. Chez la souris, afin de mimer au mieux la voie d’administration humaine, les composés seront administrés par voir intracérébrale.

Procédures

- Administration de composés étudiés sous anesthésie générale gazeuse et couverture analgésique (durée maximale de 15 minutes – 1 seule fois en début d’expérience) - Administration des médicaments vétérinaires analgésiques (contention d’une durée maximale de 30s) et administration des médicaments vétérinaires analgésiques (contention d’une durée maximale de 30s) avant l’euthanasie en fin d’étude.

Impact sur les animaux

Une potentielle source de stress ou douleur peut provenir lors : - Des administrations d’anesthésique. La contention de 30s et l’administration d’environ 10s peuvent également générer un léger stress. - De la phase d’anesthésie gazeuse (durée maximale de 20min) et du suivi post-anesthésie qui peuvent générer un stress modéré. - De l’administration de composés sous anesthésie générale, d’une durée maximale de 30s qui peut générer un stress modéré. - [De l’administration pré et post-opératoire d’un analgésique et administration pré-opératoire d’un anesthésique local selon l’âge au moment de l’injection. La contention de 30s et l’administration d’environ 10s peuvent générer un léger stress.] Une potentielle source de nuisance peut survenir lors : D’une non prise de poids des souriceaux jusqu’au sevrage pouvant être induite par l’administration du composé ainsi qu’un retard de croissance (nuisance modérée) Du rejet de la mère (nuisance modérée) Les composés administrés peuvent également induire des effets cliniques (par exemple atteinte des mouvements spontanés, retard du comportement de recherche de la tétée) et provoquer une nuisance pour l’animal (durée maximale de l’étude : [4 mois]).

Devenir

Tous les [animaux] inclus dans les procédures sont soit euthanasiés en cours d’étude si des points limites éthiques sont atteints, soit euthanasiés en fin d’étude afin de réaliser des prélèvements de tissus qui permettront d’effectuer des analyses biochimiques (effet des composés sur l’expression de la protéine d’intérêt par exemple). De plus, les mères ainsi que les souriceaux non-traités, non inclus dans les procédures de cette demande de projet seront soit utilisés pour de la formation à des gestes techniques, soit utilisés dans des études d’évaluation d’efficacité de composé faisant l’objet d’un autre projet autorisé.

Remplacement

La recherche de nouveaux médicaments dans le domaine des maladies neurologiques rares repose sur une première étape d’identification de molécules efficaces sur leur cible au moyen de tests in vitro (cultures de neurones primaires, cellules souches…) et in silico. Toutefois l’efficacité thérapeutique d’une molécule ne peut être démontrée qu’après administration chez l’animal. Il est donc nécessaire que les molécules les plus abouties dans leur développement soient administrées in vivo. Plus spécifiquement pour ce projet, seul l’animal sain possède de façon intégrée un répertoire comportemental et des caractéristiques neurophysiologiques permettant d’évaluer l’activité de candidats médicaments pour le traitement de maladies neurologiques rares.

Réduction

Un premier filtre in vivo est effectué via une autre autorisation de projet afin d’identifier les meilleurs candidats médicaments pharmacologiquement intéressants. En effet, des études préalables permettront d’évaluer la tolérabilité des composés sur des souris adultes ainsi que leur efficacité sur une cible d’intérêt, afin de pouvoir sélectionner les candidats médicament les plus puissants. A l’issue de ce premier filtre, les administrations chez la souris nouveau-née pourront être réalisées sur un nombre restreint d’animaux (6 souris maximum par groupe) et sur des animaux des deux sexes (la détermination sexuelle ne pouvant être sûre qu’à partir de 21 jours) dans le cadre de l’évaluation pharmacologique des composés. Une consultation du service de Biostatistique sera effectuée après la réalisation des premières études afin de réduire au maximum le nombre d’animaux par groupe mais en assurant l’obtention de résultats exploitable et reproductibles. Au cas par cas, en fonction du projet de recherche concerné et des questions posées, une consultation statistique sera programmée pour réajuster le nombre d’animaux nécessaire ainsi que pour travailler sur le design expérimental le plus adapté. Lors des prélèvements effectués à la fin des études après euthanasie des souris, un maximum de tissus seront collectés sur un même animal. Chaque tissu, cérébral ou périphérique, sera séparé en plusieurs échantillons permettant ainsi la multiplication des analyses biochimiques et/histologiques potentiellement réalisables. Ce processus nous permet de limiter au maximum le nombre d’animaux utilisé par projet de recherche

Raffinement

Les souriceaux seront stabulés avec leur mère jusqu’au sevrage (21 jours) puis maintenus en groupes sociaux une fois retirés de leur mère, dans un environnement adapté limitant au maximum les facteurs de stress (bruits, manipulations fréquentes …) et en séparant les mâles des femelles pour les études de plus de 21 jours. Gestion de la douleur, par anesthésies et analgésies adaptées en fonction de l’âge, afin de couvrir les phases d’administration intracérébrale et de prélèvement terminal : - [Souriceaux de 1 à 3 jours] : Aucune incision ne sera nécessaire pour insérer l’aiguille d’injection dans les ventricules – l’os du crâne étant encore souple. - [Juvéniles de 4 à 21 jours : approche chirurgicale avec incision cutanée nécessaire et justifiée par l'évolution physiologique et anatomique inhérente au stade de développement le crâne se renforce, la peau mûrit, la couleur naturelle apparaît et le pelage commence à pousser. Les volumes administrés respecteront strictement les recommandations de la Structure de Bien Etre Animal en fonction de l'âge et du poids.] Après l'administration, les animaux font l'objet d'une surveillance attentive et régulière de leur état général et de leur bien-être tout au long de l'étude ([max 4 mois]). Leur rétablissement, leur comportement, leur croissance et leur développement sont évalués à l'aide d'observations adaptées et de critères standardisés. Ces suivis permettent de détecter rapidement tout signe d'inconfort, de détresse ou d'effet indésirable. Une attention particulière est portée à la bonne évolution des animaux, notamment par comparaison avec des animaux de référence. Si un animal présente des signes indiquant que son bien-être est compromis au-delà des limites prédéfinies, des mesures appropriées sont mises en œuvre conformément aux procédures établies afin d'éviter toute souffrance inutile. Afin de réduire le risque de rejet des souriceaux, plusieurs précautions sont prises : la mère est progressivement familiarisée avec les odeurs associées aux procédures, les perturbations de son environnement sont limitées au maximum après la naissance, les manipulations sont organisées de manière à maintenir un contact permanent avec une partie de la portée, et les souriceaux sont réimprégnés des odeurs du nid avant leur retour auprès de leur mère. L'environnement des animaux est enrichi à l'aide de matériaux de nidification et d'éléments favorisant l'exploration et l'expression de comportements naturels

Choix des espèces

La souris saine présente une forte homologie génétique, physiologique et comportementale avec l’homme et apporte ainsi une forte valeur translationnelle. 90% des gènes humains ont un équivalent chez la souris saine, permettant d’évaluer l’efficacité des composés sur les cibles génétiques sans avoir systématiquement recours à des souris génétiquement modifiées. Afin d’évaluer l’effet de nos composés dans le cadre des DEEs, il est important de développer des modèles vivo adaptés au stade de développement cérébral et physiologique des patients atteints. Ainsi, il s’avère nécessaire de réaliser les études sur des souris nouveau nées. [L'utilisation de souris juvéniles de 4 à 21 jours est, quant à elle, requise pour évaluer l’effet de nos composés à un stade plus avancé de la maturation cérébrale (expression des cibles thérapeutiques différentes en fonction de l’âge). Ce stade pré-sevrage est indispensable pour étudier l'impact des traitements pour évaluer une fenêtre thérapeutique plus tardive. L'utilisation de ces deux stades de développement est donc scientifiquement incontournable pour garantir la pertinence translationnelle des résultats vers la clinique pédiatrique humaine pour la pathologie ciblée.] Les procédures d’évaluations décrites dans ce projet s’appuient sur une littérature scientifique et une expertise interne robustes. Les administrations seront réalisées sur des souriceaux âgés de 1 à 3 jours [et des souris âgées de 4 à 21 jours.]

Selon les groupes, les 1 260 souris de ce projet subissent une ou deux opérations du cerveau, quinze jours d'injections intrapéritonéales quotidiennes, une imagerie hebdomadaire sous anesthésie et jusqu'à huit prises de sang. Toutes sont tuées à l'issue pour prélever leur cerveau, dans des procédures que le porteur classe à un niveau de souffrance modéré. Des cellules de glioblastome leur sont implantées dans le cerveau pour vérifier si la dopamine libérée pendant un apprentissage modifie la croissance de la tumeur, qui peut entraîner perte d'appétit et de poids, désorientation et déséquilibre. Le porteur prévoit un apprentissage moteur trois fois par jour et un apprentissage de mémoire une fois par jour pendant quinze jours, sans nommer les tâches imposées aux souris.

Objectifs

Le glioblastome (GB) est la tumeur cérébrale la plus fréquente et la plus agressive chez l’adulte, représentant 45 pour cent des tumeurs primaires. Malgré le traitement, la récidive est presque inévitable, avec une survie médiane de 15 mois. Les cellules de GB sont fortement influencées par l’activité des neurones qui, grâce à la libération de plusieurs molécules, modulent la progression de la tumeur. Dans ce cadre, la dopamine est capable de stimuler ou inhiber la croissance tumorale in vitro selon le type de récepteur activé. In vivo, la dopamine est libérée dans un contexte de récompense mais surtout d’apprentissage moteur et cognitif. Notre étude émet l’hypothèse qu’une libération importante de dopamine, à la suite d’un apprentissage de tâche, influence la croissance et le développement du GB in vivo. Afin d’étudier cet aspect, les cellules de glioblastome seront implantées dans le creveau des souris, et la progression tumorale sera évaluée après apprentissage d’une tache motrice. En parallèle, les effets de l’apprentissage d’une tâche de mémoire sur la progression tumorale seront également évalués en implantant les cellules de GB dans le cerveau des souris. Enfin, l’effet de la stimulation directe des neurones dopaminergiques sur la progression des cellules de GB, injectées dans le cerveau, sera investigué.

Bénéfices attendus

L'absence de résultats cliniques significatifs pour le traitement des glioblastomes peut s'expliquer par la complexité et la grande plasticité de ces tumeurs et par le manque de transposabilité aux modèles actuels. La dopamine constitue une thérapie prometteuse, mais des études supplémentaires sont nécessaires afin de comprendre leur mécanisme d'action précis dans les tissus tumoraux. Cette étude, en mettant en évidence les principaux acteurs des effets anti-tumoraux de l’apprentissage et de la dopamine, permettra de concevoir des stratégies thérapeutiques non pharmacologiques potentiellement plus efficaces et possiblement en support des médicaments déjà existants sur le long term. Les résultats de ce projet seront accessibles sur le court terme pour les connaissances de base des mécanismes dopaminergique sur le développement de cancer du cerveau.

Procédures

Chirurgie du cerveau: 1 fois ou 2 fois selon la procedure, environ 14 minutes, animal anesthésié. -Traitements pharmacologiques : 1 injections par jour pendant 15 jours, souris vigile. Imagerie de la tumeur : 1 fois par semaine, environ 10 minutes, souris anesthésiée. - Prélèvements sanguins (8 fois au total, une fois par semaine) : 10 secondes sur animal anesthésié. Protocole d’apprentissage moteur pour évaluer l'état psychomoteur des animaux : 3 fois par jour pendant 15 jours, animal vigile. Protocole d’apprentissage cognitif pour évaluer la mémoire chez les animaux :1 fois par jour pendant 15 jours, animal vigile.

Impact sur les animaux

Le développement de tumeurs cérébrales peut générer des souffrances se manifestant par des pertes d’appétit et de poids, des signes neurologiques invalidants (désorientation, déséquilibre). Les animaux seront également soumis à des douleurs légères mais répétées liées aux injections intrapéritonéales lors de la stimulation pharmacogénétique. Les souris seront exposées à des douleurs post chirurgie à l’issue des 1 ou 2 chirurgies. Injection intracrânienne de cellules tumorales et/ou virus : 1 fois, environ 14 minutes, sur animal anesthésié, modéré, nuissance pedant 5 jours (voir pointes limites). -Traitements intrapéritonéal 1 injections par jour pendant 15 jours sur animal vigile, légère, nuissance pedant 15 minutes. Imagerie de la tumeur : 1 fois par semaine, environ 10 minutes sur animal anesthésié, légère, nuissances liées a l'anesthésie (hypothermie, depression cardio-respiratoire pedant 10 minutes). - Prélèvements sanguins (8 fois au total) : 10 secondes sur animal anesthésié, légère. Entrainement moteur et cognitive, 1 fois/jour pédant 15 jours sur animal vigile, légère.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin des toutes les procédures afin de prélever les cerveaux pour analyses.

Remplacement

A ce jour, notre connaissance du comportement et de l'organisation des circuits neuronaux chez les mammifères, y compris l'homme, ainsi que leur plasticité, ne nous permet pas de concevoir et de réaliser des simulations fiables afin d’étudier les changements qui se produisent. Dans ce contexte, le recours à des expériences sur des animaux vivantes reste nécessaire. Le but du projet est d'étudier un phénomène comportemental qui ne peut pas être reproduit par des études in-vitro (dans des cultures cellulaires) car il s’agit de processus d’apprentissage.

Réduction

Le nombre d'animaux utilisés dans chacun des groupes expérimentaux sera de 15 animaux, c'est à dire le nombre minimum d'échantillons permettant l'application des tests statistiques classiques dans le domaine, et également décrits dans la littérature scientifique sur le sujet. Ce nombre permet de atteindre la réalisation d’une conclusion statistique solide à partir de cette population et est justifié compte tenu de la grande variabilité des protocoles comportementaux. La réalisation de l'ensemble de ce projet nécessite l'utilisation au maximum de souris sur une période de 5 ans. Toutefois, si l’expérience démontre que les échantillons peuvent être réduits, ils le seront en conséquence.

Raffinement

Nous attendrons au moins 1 semaine (7 jours) afin de permettre aux animaux de s'adapter au cycle jour/nuit de notre animalerie expérimentale. Pour le R de raffiner, tous les protocoles sont optimisés pour soulager le stress et la douleur des animaux tout au long de cette étude. La mise en place des points limites repose sur une évaluation de l'état général, comportemental et poids des animaux qui ont été définis et bien décrits dans les procédures. Une grille d’évaluation sera utilisée et la décision de soins conservatives ou de mise à mort des animaux sera pris par l’expérimentateur en accord avec le vétérinaire en suivant des critères bien décrit dans la grille. Pour les protocoles comportementaux, les souris seront habituées pendant 1 heure a la piece de comportement avant le début des tests.

Choix des espèces

A ce jour, l'étendue des connaissances concernant l'organisation des circuits neuronaux conservés chez les mammifères y compris l’homme et surtout leur plasticité ne permet pas la conception et la mise en place de simulations numériques fiables qui pourraient permettre d'étudier les changements qui se mettent en place. De plus, l’usage des invertébrés possédant un système nerveux complètement différent serait inapproprié. Dans ce contexte il demeure nécessaire d'avoir recours à l'expérimentation animale chez la souris. L'implantation de tumeurs chez la souris est donc essentielle pour rendre compte de la structure tridimensionnelle, de la composition chimique et de l'interaction tumorale avec les différents types des circuits neuronaux et aussi les effets de l’apprentissage moteur et cognitif. Le choix de la souche de souris est basé sur des étudies précédents que utilisent ce modelé en cancérologie et neurosciences. Les protocoles que nous avons établis débuteront à l'âge adulte des souris afin d’éviter les problèmes de développement et la variabilité associée. Cela nous permettra également de comparer avec d'autres études dans le domaine et d’avoir une croissance tumorale optimale. En effet, les expériences peuvent s’étaler sur plusieurs semaines, donc l’implantation dans des animaux adultes permet de s’affranchir de l’affaiblissement d’individus plus âgés. Les chirurgies seront réalisées à l’âge de 8 semaines, et après une période de convalescence décrite, les protocoles d’apprentissage décrits seront réalisés. Du fait de la nécessité de réaliser ces expériences sur des animaux adultes, les souris utilisées seront âgées de 10 à 16 semaines.

Rendues asthmatiques par exposition à des allergènes, 240 souris âgées de six semaines vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Elles reçoivent sous sédation des instillations dans le nez, dont le nombre et le rythme ne sont pas précisés, avec un risque de fausse route et d'étouffement, et certaines subissent des injections dans l'abdomen. Le projet teste une stratégie repérée sur des cellules bronchiques de patients, comparée à un anti-inflammatoire. En fin de protocole, une trachéotomie sous anesthésie sert à mesurer leur respiration pendant une dizaine de minutes, et elles sont tuées sans réveil pour prélever leurs organes.

Objectifs

La mise en place du remodelage du muscle lisse bronchique dans l’asthme sont méconnus. Pourtant, l’augmentation de la taille du muscle lisse bronchique chez les patients asthmatiques est associé à la sévérité de la maladie. Nos travaux, réalisés in vitro à partir de cellules bronchiques de patients asthmatiques, nous ont permis d’identifier le rôle clé du métabolisme énergétique dans l’hyperprolifération de ces cellules et également de développer une stratégie thérapeutique potentielle. Toutefois, nos travaux chez l’homme ne permettent pas d’analyser complètement les mécanismes de la maladie. Afin d’étudier l’effet de notre stratégie thérapeutique dans le remodelage du muscle lisse bronchique dans l’asthme, nous souhaitons utiliser un modèle murin d’asthme. Ce modèle est particulièrement pertinent, car il permet le développement de l’asthme à partir de l’exposition aux allergènes et il nous permet de venir tester l’efficacité de notre stratégie thérapeutique en comparaison à un traitement anti-inflammatoire, molécule classiquement administrée dans l’asthme. L’objectif de ce nouveau projet est d’étudier l’effet synergique potentiel de cette stratégie thérapeutique en comparaison avec un anti-inflammatoire, traitement classique dans l’asthme, afin à terme de proposer une meilleure prise en charge pour les patients asthmatiques.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour objectif d’étudier in vivo les mécanismes du blocage de la cible d’intérêt thérapeutique potentiel favorisant la mise en place du remodelage du muscle lisse bronchique (MLB) et une meilleure compréhension des mécanismes cellulaires des effets thérapeutiques et leur efficacité in vivo sur le remodelage du MLB. Le bénéfice attendu de l'étude et de la validation de la stratégie thérapeutique en comparaison avec un anti-inflammatoire, traitement classique dans l’asthme et à terme de proposer une meilleure prise en charge pour les patients asthmatiques et le traitement de leur pathologie.

Procédures

Les animaux seront soumis à des instillations nasales sous sédation (durée de moins de 2 minutes) et certains animaux à des injections intrapéritonéales (quelques secondes). Pour les mesures terminales de mesure des paramètres respiratoires, ces expérimentations seront faites par la méthode de trachéotomie sur les animaux anesthésiés. Il n’y a pas de réveil après les mesures des paramètres respiratoires qui durent environ dix minutes.

Impact sur les animaux

L’administration de molécule liquide en instillation nasale chez les souris pourraient conduire à une fausse route/étouffement. Le refroidissement des animaux pendant les manipulations d’instillation nasale et injection intrapéritonéale peut être un effet indésirable. L'injectionintrapéritonéale peut engendrer une faible inflammation au site d'injection

Devenir

Chaque animal sera utilisé pour analyser la fonction respiratoire, l’inflammation et le remodelage du muscle lisse bronchique. La procédure est sans réveil en fin de projet et les organes d’intérêt seront prélevés ex vivo pour des analyses.

Remplacement

L’asthme est une maladie complexe mettant en jeu différents types cellulaires qui ne peuvent pas être étudiés in vitro. Le modèle murin d’asthme permettra d’élucider les mécanismes complexes conduisant au remodelage du MLB et l’efficacité des nouveaux traitements thérapeutiques ciblant le remodelage du MLB.

Réduction

Nous avons calculé le nombre de souris minimal par groupe pour obtenir des résultats interprétables. Les expérimentations seront planifiées afin d’obtenir un maximum de résultats expérimentaux sur le plus faible nombre d’animaux. Chaque protocole nécessite la comparaison des paramètres de fonction respiratoire entre différents groupes de souris exposées à différents traitements. Notre but est de réduire au maximum le nombre d’animaux par expérience tout en pouvant interpréter les résultats. De plus, se souciant de réduire le nombre des animaux en expérimentation, après la mise à mort, nous réaliserons de multiples études ex vivo sur différents organes.

Raffinement

Des contrôles quotidien permettent de repérer tout animal en souffrance, d’en avertir le responsable du projet et de prendre les mesures appropriées selon l'arbre décisionnel mis en place par l'équipe en charge du projet. Afin d’éviter toute souffrance, les animaux seront anesthésiés et analgésiés en fonction de l’évaluation de l’état des animaux par rapport aux points limites. L'anesthésie et l'analgésie sont adaptées à la procédure et prennent en compte l'ensemble des critères d'alerte et d'arrêt des souffrances éventuelles.

Choix des espèces

La souris est l’espèce la plus classiquement utilisée pour l’étude de l’asthme. Il n’existe pour l’instant pas de système in vitro permettant de faire coexister les différents types cellulaires dans leur entièreté. Grâce à un modèle de souris asthmatique et l’utilisation de molécules thérapeutiques, nous pouvons envisager une meilleure compréhension des phénomènes qui permettent le remodelage du MLB. Le modèle souris apparaît donc comme un modèle indispensable pour évaluer les mécanismes du remodelage du MLB dans l’asthme et pour tester l’efficacité des nouvelles cibles thérapeutiques. Les animaux utilisés sont des souris âgées de 6 semaines.

Jusqu'à trois prises de sang, un gavage quotidien d'un "composé X" pendant un mois et, pour 360 d'entre elles, seize heures de jeûne suivies d'un gavage de calcium et de huit heures d'isolement pour recueillir l'urine attendent des souris dont certaines lignées portent un gène inactivé dans l'intestin. Au total, 4 200 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour analyser leurs tissus, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, et le porteur annonce des diarrhées et des effets sur la croissance chez les lignées modifiées. Étudiées de deux semaines à six mois, elles servent à comprendre le rôle de certains gènes dans le métabolisme du calcium et à tester ce composé, qui n'est jamais nommé. La modification ajoute une lignée et 600 souris, sur la base de "la lecture de publication", sans autre justification de l'effectif.

Objectifs

Notre étude longitudinale vise à caractériser l’incidence de certains facteurs majeurs impliqués dans le métabolisme calcique, en se concentrant spécifiquement sur leurs effets au niveau de l’intestin, des reins et du sang, afin d’évaluer leur impact sur ce métabolisme et sur l’homéostasie phosphocalcique durant différents stades de développement. MODIFICATION : ajout d’une lignée d’étude, suite à la lecture de publication montrant que les gènes de la famille RXR joue un rôle important au niveau de l’intestin pour la régulation du calcium.

Bénéfices attendus

Ces études permettront de mieux comprendre l’impact des gênes étudiés dans le métabolisme du calcium et l’efficacité du composé X sur ces troubles.

Procédures

Afin de réaliser les études des biomarqueurs circulants, du sang sera prélevé sur les animaux à chaque point de la cinétique, un animal pourra être sujet à 3 prélèvements sanguins maximum au courant de sa vie, ces prélèvements seront espacés d’au moins 28 jours. Le prélèvement sanguin prend 30 secondes de manipulation (contention+prélèvement, puis injection de sérum physiologique en sous-cutanée) par souris. 360 souris au total dans la 1ere procédure expérimentale, seront gavées une fois, avec une solution de calcium diluée dans de l'eau de boisson, et, dans la seconde procédure expérimentale, une administration quotidienne par gavage (30 secondes par administration) pendant 1 mois. Tous les 2 jours, un suivi du poids corporel (30 secondes par souris) est réalisé. Ces gestes seront réalisés par des manipulateurs expérimentés et compétents, si malgré tout un animal présente des complications expérimentales (extrêmement rare) des signes de souffrance, il sera sorti du groupe et mis à mort.

Impact sur les animaux

Pour les souris ayant une inactivation dans l’intestin, un impact sur les courbes de croissance et l’homéostasie phosphocalcique est anticipée. Les animaux ayant une inactivation au niveau de l’intestin, un dysfonctionnement digestif pouvant entrainer des diarrhées. Concernant les gestes subis par les animaux : Les animaux subiront trois prélèvements sanguins, chacun suivi d’une légère compression pour stopper le saignement. Ce geste est effectué par un personnel compétent et formé mais dans de rares cas peuvent conduire à une infection de la zone d'administration. Un groupe de 360 souris subiront une mise à jeun de 16h sans restriction hydrique suivie d’un gavage d’une solution riche en calcium, suivi d’un isolement de 8h afin de récolter les urines. Dans une autre procédure expérimentale, les souris recevront un gavage du composé X pendant un mois. Cela peut entraîner une légère gêne, mais des expériences similaires menées auparavant n’ont pas montré de souffrance particulière chez les animaux, grâce à la compétence des expérimentateurs.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort en fin de procédure pour analyses des tissus (histologiques, analyses des transcrits, expression protéiques...).

Remplacement

Les gènes étudiés étant exprimés dans de nombreux tissus, les systèmes cellulaires ne sont pas appropriés pour modéliser la complexité du développement ou des fonctions intestinales et ses conséquences sur les autres tissus. Notamment l’homéostasie calcique qui implique de nombreux organes aux fonctions différentes (par exemple intestin pour l’absorption, reins pour l’excrétion, les os pour la résorption).

Réduction

Les différents protocoles expérimentaux ont été consciencieusement réfléchis et le nombre d’animaux utilisés sera réduit au strict minimum, tout en s’assurant que les cohortes utilisées permettent de conclure de manière significative. Ces expériences seront réalisées sur des souris mâles et femelles. Les analyses statistiques seront effectuées pour chaque lignée. Afin de déterminer le potentiel thérapeutique de notre molécule, des analyses histologiques, de l'expression de gènes et de protéines, ainsi que de cytométrie devront être réalisées sur les animaux. Les souris ayant 2 reins, nous pourrons diminuer le nombre de souris par lot. Les deux reins d'un animal ne seront jamais analysés deux fois par la même technique. Des analyses statistiques utilisant les différents lots de souris seront réalisées pour déterminer avec précision les effets thérapeutiques. Ce projet utilisera au maximum 3600 souris au total sur 5 ans. MODIFICATION : ajout d’une lignée d’étude, suite à la lecture de publication montrant que les gènes de la famille RXR joue un rôle important au niveau de l’intestin pour la régulation du calcium. Augmentation de l’effectif de 3600 à 4200, soit ajout de 600 souris.

Raffinement

Les souris seront gardées par groupes sociaux dans des cages agrémentées avec un enrichissement (nid...) en animalerie. Les animaux seront suivis, tout au long de leur vie, par observations de leur comportement général, par mesure de leurs poids. Nous effectuerons 3 prélèvements sanguins au cours de la vie de l’animal, le saignement sera stoppé par pression de la zone de prélèvement qui seront par la suite surveillées et désinfectées jusqu’à cicatrisation complète. De plus, afin de compenser la baisse de volémie, nous réaliserons une injection sous cutanée de sérum physiologique réchauffé. Le gavage sera réalisé par du personnel formé et expert en expérimentation animale, le risque de fausse route au moment du gavage sera également pris en compte en évitant de mettre l'animal sur le dos et en lui délivrant lentement le liquide contenu dans la seringue à l’aide d’une sonde adaptée à la taille de l’animal. Si, malgré tout, les signes d’une souffrance ou d’une douleur sont manifestés (posture inhabituelle, poil hérissé, dos vouté, retrait et absence d’interaction avec les congénères, état défensif), ), l'inconfort sera évalué en fonction du niveau de douleur observé par une grille de scoring et sera géré si besoin en prenant les mesures appropriées (analgésie), si malgré les mesures d’analgésie l’animal sera retiré de l'étude et sera mis à mort immédiatement. Par ailleurs, dans le laboratoire, les manipulateurs prévus pour ce projet possèdent une expérience importante dans la réalisation de ces procédures qui n’entraine généralement pas de souffrance pour les animaux.

Choix des espèces

L'utilisation du modèle murin dans ce protocole est justifiée car les souris ont leur génome bien caractérisé et sont des modèles biologiques utiles qui partagent de nombreuses similitudes physiologiques et génétiques avec les humains. L’étude complète utilisera les stades 2 à 6 semaines correspondant à des enfants, 8 à 12 semaines correspondant à de jeunes adultes, 20 semaines à 6 mois correspondant à des adultes. Ces stades étudiés correspondent aux stades physiopathologiques connus chez le patient.

Pour 1 112 souris utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, le protocole prévoit selon les groupes jusqu'à deux injections par jour pendant neuf jours, l'implantation sous anesthésie d'une puce à capteur de température, ou une série de cinq à sept tests de comportement. Ces tests portent sur l'interaction sociale, la mémoire, l'anxiété, la locomotion et le seuil de douleur, ce dernier sur une plaque chauffante dont le porteur reconnaît qu'elle "peut entraîner une douleur persistante au-delà de l'arrêt du test". Le THC injecté provoque une hypothermie qui peut durer au-delà de six à huit heures, dans une étude sur le rôle d'une molécule du cerveau, la pregnénolone, face à ses effets. Toutes les souris sont tuées à l'issue pour prélever sang et cerveau, et les bénéfices se résument à de "nouvelles pistes de recherche" qui "pourront être explorées ultérieurement".

Objectifs

Dans le cerveau, il existe une machinerie, appelée « système endocannabinoïde », qui joue un rôle majeur dans le bon fonctionnement du cerveau, liés notamment aux émotions, à la mémoire et à certains comportements. Le cannabis contient une substance active, appelée THC, qui agit sur ce système. En cas de consommation répétée, le THC peut dérégler ce système et ces modifications peuvent provoquer une dépendance, malgré les conséquences négatives. Ce projet cherche à comprendre le rôle d’une molécule produite par le cerveau, appelée pregnénolone (PREG). Il a été montré que lorsque le THC arrive dans le cerveau, il augmente la production de cette molécule. Celle-ci agit alors comme un mécanisme naturel de défense en limitant certains effets nocifs du THC. Plus précisément, cette étude cherche à comprendre comment fonctionne ce mécanisme chez la souris, dans des conditions mimant la dépendance au cannabis, et à vérifier si la PREG intervient également dans le fonctionnement normal du système endocannabinoïde, en dehors de la consommation de cannabis. Cette étude permettra de mieux comprendre le fonctionnement du cerveau et les mécanismes impliqués dans les effets de la dépendance au cannabis. À plus long terme, elle pourrait contribuer à identifier de nouvelles pistes pour le développement de traitements contre l’addiction au cannabis.

Bénéfices attendus

Le THC, en agissant sur le système endocannabinoïde, peut dérégler le fonctionnement de certains comportements liés notamment aux émotions et à la mémoire. Notre organisme a mis en place un système de défense naturel avec la production d’une molécule protectrice, la pregnénolone. Cette production locale lui permet d'exercer une action rapide afin de maintenir des conditions optimales pour le fonctionnement cérébral. Ce projet vise à comprendre les mécanismes d’action du THC et de la pregnénolone dans le cerveau. L’identification de ces mécanismes vise à proposer de nouvelles pistes de recherche. Celles-ci pourront être explorées ultérieurement dans des contextes pathologiques ou thérapeutiques.

Procédures

Les types d’intervention seront les suivants : •584 souris seront anesthésiées sous isoflurane (4% pendant 3 min) avec la mise en place d’une puce RFID (1.25 x 7mm) (en sous-cutanée). •188 souris vigiles seront soumises à des injections répétées (30 s par injection ; deux injections par jour espacées de 8h) pendant 9 jours. •396 souris vigiles seront soumises à des injections répétées (30 s par injection ; une injection par jour) pendant 6 jours. 144 souris vigiles seront soumises à une injection (30 s par injection). •384 souris vigiles seront soumises à deux injections espacées de 10 min (30 s par injection). •116 souris vigiles seront soumises à des tests comportementaux pendant 4 jours consécutifs. Ces tests ont pour objectif d’étudier les performances d’interaction sociale, les capacités de mémoire, ou des comportements liés à l’anxiété. Sept tests seront effectués chez le même animal avec trois expositions maximum par jour, espacées d’une à deux heures (exposition entre 15 min et 1h pour chaque test). Chaque test ne sera réalisé qu’une seule fois. •252 souris vigiles seront soumises à 5 tests comportementaux réalisés sur une même journée (exposition entre 30 sec et 15 min pour chaque test, soit 40 min par jour). Chaque test sera réalisé deux fois avec un intervalle de 6 jours. Ces tests ont pour objectif d’analyser la locomotion, les mouvements volontaires, les capacités de mémoire ou le seuil de nociception. •384 souris vigiles seront soumises à 5 tests comportementaux réalisés sur une même journée (exposition entre 30 sec et 15 min pour chaque test, soit 40 min au total). Chaque test ne sera réalisé qu’une seule fois. Ces tests ont pour objectif d’analyser la locomotion, les mouvements volontaires, les capacités de mémoire ou le seuil de nociception.

Impact sur les animaux

Les tests expérimentaux et l’administration de substances, ainsi que la contention nécessaire à leur réalisation peuvent entrainer de légères douleur et un incomfort modéré de courte durée. La mise en cage individuelle (avec la présence d’enrichissement dans la cage et sans isolement visuel, sonore et olfactif), de courte durée, peut entraîner un stress modéré. L’exposition sur une plaque chauffante peut entraîner une douleur persistante au-delà de l’arrêt du test (qui a lieu dès l’apparition de signes de douleur ou avec un délai de 30 sec maximum). L’hypothermie, induite par le THC, peut être durable (au-delà du délai de 6 à 8 h, correspondant au retour vers des valeurs normales). L’implantation sous-cutanée d’une puce munie d’un capteur de température, réalisée sous anethésie générale, peut engendrer un petit saignement et une légère réaction inflammatoire au niveau du site de l’implantation, et une hypothermie de courte durée.

Devenir

A l’issue des procédures, les animaux seront mis à mort afin de récupérer des échantillons (sang, structures cérébrales et/ou biopsie de queue) nécessaires pour des analyses ultérieures.

Remplacement

Dans le cadre de la stratégie de remplacement, des approches substitutives à l’expérimentation animale ont été réalisées en amont de ce projet. Ces approches ont permis d’identifier comment notre molécule d’intérêt se liait à sa cible, et ces connaissances ont permi de créér le modèle d’étude. Ce modèle a été validé par des approches in vitro (modèles cellulaires) avant d’être étudier chez l’animal. Bien que nous menons ces études in vitro, qui permettent certes d’appréhender certains processus moléculaires; ce projet a pour objectif l’étude de systèmes intégrés (mettant en jeu des comportements), qui ne peuvent être réalisés que chez l’animal vivant.

Réduction

Nous avons utilisé une formule de calcul qui permet d’ajuster le nombre d’animaux par groupe en fonction de la variabilité des paramètres mesurés. Nous utiliserons des souris mâles et femelles afin de déterminer d’éventuelles différences liées au sexe. Le cas contraire, les données des mâles et femelles seront regroupées. Les effets analysés seront les effets du traitement, du génotype et du sexe. Le nombre d’animaux sera optimisé en combinant les stratégies suivantes. Tout d’abord, nous effectuerons plusieurs tests chez les mêmes animaux, lorsque cela est possible sans biaiser les résultats de l'experience. De plus, des études pilotes seront réalisées (chez un nombre réduit d’animaux) afin de déterminer les conditions expérimentales optimums. Selon les résultats, les groupes seront complétés avec la condition la plus appropriée. Aussi, des efforts de réduction seront réalisés pour la production des animaux transgéniques, en adéquation avec les besoins expérimentaux.

Raffinement

Pour réduire la souffrance pouvant être imposée par le protocole, les règles suivantes seront appliquées pour améliorer le bien-être des animaux : (1) Des points limites suffisamment prédictifs et spécifiques au projet seront appliqués et des critères d’arrêt seront mis en place si nécessaire. (2) La mise en cage individuelle temporaire sera réalisée dans des conditions pour maintenir des contacts olfactifs, sonores et visuels entre les animaux. (3) La manipulation des animaux se fera à l’aide des tunnels en carton présents dans les cages, afin de réduire le stress pouvant être lié à cette manipulation. (4) L’administration (locale ou générale) d’analgésiques est prévue pour minimiser les douleurs éventuelles liées à certaines procédures. (5) De nouvelles règles pourront être mises en place au cours du projet sur la base de données scientifiques ou réglementaires, et/ou de préconisations faites par le responsable du bien-être animal et du vétérinaire.

Choix des espèces

La souris est un modèle animal communément utilisé pour réaliser des modifications génétiques, de par la similitude du génome de la souris et celui de l’être humain. La souris permet d'étudier des mécanismes conservés du système endocannabinoïde et dispose de modèles génétiques et comportementaux adaptés. De plus, les effets comportementaux étudiés dans ce projet ont été clairement décrits et validés chez la souris. Enfin, le modèle murin utilisé dans le projet a été validé. Tous les animaux utilisés seront de jeunes-adultes car les systèmes étudiés ne subissent pas à cet âge de modifications majeures, comme celles survenant au cours du développement ou au cours du vieillissement, ce qui limite la variabilité des mécanismes étudiés dans ce projet et renforce la pertinence des résultats obtenus.

Les rats qui ne se mettent pas à boire de l'alcool en excès après environ huit semaines d'accès à une bouteille d'alcool à 20 % sont tués, de même que ceux qui n'apprennent pas à appuyer sur un levier pour en obtenir. 3 240 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour comprendre pourquoi certaines personnes perdent le contrôle de leur consommation d'alcool. Les rats retenus sont opérés du cerveau pendant 90 à 120 minutes pour recevoir un vecteur viral et une lentille d'imagerie, logés seuls, puis s'administrent de l'alcool cinq jours par semaine pendant trois à quatre mois, et les tests de compulsion ajoutent de la quinine à l'alcool ou des chocs électriques aux pattes, jusqu'à 0,35 mA, sur neuf séances au plus. Sur 30 rats par groupe au départ, le porteur prévoit que 5 à 6 au plus développeront le comportement compulsif étudié, et qu'il faudra parfois refaire l'expérience sur une seconde cohorte.

Objectifs

L’alcoolodépendance est une maladie chronique caractérisée par une perte progressive du contrôle de la consommation d’alcool. Certaines personnes continuent à rechercher ou à consommer de l’alcool malgré des conséquences négatives importantes. Les traitements actuellement disponibles ne sont pas efficaces chez tous les patients, et les raisons de cette efficacité variable restent encore mal comprises. Ce projet vise à mieux comprendre les mécanismes cérébraux impliqués dans les comportements liés à l’alcool, en particulier la motivation à obtenir de l’alcool, la persistance de la recherche d’alcool malgré une conséquence négative, et la reprise de ce comportement après une période d’arrêt. Pour cela, nous utiliserons un modèle chez le rat permettant de suivre plusieurs dimensions du comportement : la consommation volontaire d’alcool, l’apprentissage d’une réponse pour obtenir de l’alcool, la motivation, la perte de contrôle, l’extinction du comportement et sa reprise. Les animaux seront aussi étudiés avant et après administration de traitements pharmacologiques afin d’identifier pourquoi certains individus répondent à un traitement alors que d’autres y répondent peu ou pas. Le projet utilisera deux approches complémentaires. La première permettra d’enregistrer l’activité de neurones chez l’animal éveillé pendant les tests comportementaux. La seconde permettra de modifier temporairement l’activité de certains groupes de neurones pendant ces mêmes tests, afin de déterminer s’ils participent directement aux comportements observés. Ces approches permettront de mieux relier l’activité cérébrale aux comportements liés à l’alcool et à la réponse aux traitements.

Bénéfices attendus

Ce projet devrait permettre de mieux comprendre pourquoi les individus ne sont pas tous égaux face au risque de perte de contrôle de la consommation d’alcool. Certains sujets développent des comportements persistants malgré des conséquences négatives, alors que d’autres restent plus sensibles à ces conséquences et diminuent leur recherche d’alcool. Les résultats attendus permettront d’identifier des mécanismes cérébraux associés à ces différences individuelles. Ils permettront également d’étudier comment l’activité de certains groupes de neurones change pendant la consommation, la motivation, la persistance du comportement et la reprise de la recherche d’alcool après une interruption. Un autre bénéfice important du projet est de mieux comprendre pourquoi certains traitements de l’alcoolodépendance sont efficaces chez certains individus mais pas chez d’autres. En comparant les animaux répondeurs et non répondeurs aux traitements, il sera possible d’identifier des signatures comportementales et cérébrales associées à une bonne ou à une mauvaise réponse thérapeutique. À plus long terme, ces connaissances pourraient contribuer à améliorer la compréhension des mécanismes de l’alcoolodépendance et à orienter le développement de stratégies thérapeutiques mieux adaptées aux différences individuelles entre patients.

Procédures

1- Chirurgies (Implantation de lentille, injection de vecteur viral, implantation de lentilles) : 1 seule chirurgie par rat - Durée de la chirurgie : 90 à 120 minutes. 2- Deux prélèvements de sang par rat au maximum sous anesthésie générale : durée de l'intervention : 3 minutes. 3- Auto-administration d'alcool : protocole de 15-30 minutes par jour, 5jours par semaine pendant 3-4 mois. 4- Injection intra-péritonéales : chaque animal recevra plusieurs injections sur toute la durée des mois d'auto-administration - Maximum de 12-14 injections.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues sont classées comme modérées. L’hébergement individuel est indispensable pour mesurer précisément la consommation d’eau et d’alcool de chaque rat, attribuer les réponses opérantes à un individu donné et éviter les biais liés à la hiérarchie sociale ou à l’accès différentiel aux bouteilles. Il peut entraîner un stress social. Cette contrainte sera compensée par un enrichissement compatible avec les objectifs expérimentaux et par une habituation régulière aux manipulations. Les étapes de consommation d’alcool ne sont pas associées à une douleur. Les procédures chirurgicales peuvent entraîner une douleur post-opératoire transitoire, un risque d’infection locale, une perte de poids transitoire ou une gêne liée à l’implant. Dans le cadre de l’imagerie in vivo, la connexion du miniscope à la base fixée sur le crâne est brève et non douloureuse, mais elle nécessite une manipulation à laquelle les animaux seront progressivement habitués. Les traitements pharmacologiques ou les ligands chemogénétiques pourront entraîner une gêne brève liée à la contention et à l’injection, ainsi que des effets transitoires dépendant du composé: baisse d’activité, sédation légère, modification de la locomotion ou irritation locale. Ces effets seront limités par l’utilisation de doses déjà décrites dans nos publications ou nos études en cours comme compatibles avec des tests comportementaux chez le rongeur, par l’adaptation des volumes au poids corporel, par l’habituation aux injections factices et par une surveillance post-administration. Toute altération persistante du comportement, de la mobilité, de l’alimentation ou du poids entraînera l’arrêt de l’administration, l’avis du responsable du bien-être animal et, si nécessaire, du vétérinaire.Les tests de compulsion pourront utiliser soit l’adultération de la solution d’alcool par la quinine, soit une punition électrique brève et de faible intensité, comprise entre 0,1 et 0,35 mA pendant 0,5 sec, au maximum pendant 9 sessions opérantes de 15 min. Cette conséquence peut induire une gêne transitoire aux pattes, évitable par l’arrêt de l’appui sur le levier actif. La perfusion transcardiaque réalisée sous anesthésie terminale sera effectuée uniquement sur des animaux profondément anesthésiés, sans réveil, et ne provoquera donc pas de perception consciente de douleur. Les nuisances associées seront limitées à la phase précédant l’anesthésie intrapéritonéale kétamine/xylazine.

Devenir

Pour induire une forte consommation d'alcool chez les rats, une première étape de consommation volontaire intermittente est réalisée pendant environ 8 semaines. Les rats ont accès à deux bouteilles pendant 24 heures : une contenant de l'alcool à 20% v/v et une contenant de l'eau. Certains rats développent une consommation excessive d'alcool après environ 10 à 12 sessions, tandis que d'autres ne le font pas. Ceux qui ne développent pas une consommation excessive d'alcool sont euthanasiés, et des échantillons de tissus tels que le foie ou le cerveau peuvent être prélevés sur ces animaux pour des tests ultérieurs. Les rats qui réussissent la tâche d'auto-administration opérante d'alcool sont sélectionnés pour les chirurgies. Ceux qui ne parviennent pas à acquérir cette compétence sont également euthanasiés eet des échantillons de tissus peuvent être prélevés sur eux. À la fin de l'étude, une perfusion transcardiaque sera réalisée pour chaque animal afin de réaliser des analyses histologiques, anatomiques ou neurobiologiques. La perfusion transcardiaqu sera effectuée sous anesthésie générale profonde, sans réveil de l’animal. L’anesthésie sera induite par une injection intrapéritonéale de kétamine/xylazine à la dose de 200/20 mg/kg. La perfusion ne sera initiée qu’après vérification de la profondeur anesthésique, comprenant l’absence de réflexe cornéen, l’absence de réflexe de retrait à un pincement de la patte et l’absence de réaction à une stimulation nociceptive. Si ces critères ne sont pas atteints, la perfusion sera différée et l’anesthésie sera prolongée ou complétée avant toute intervention. Après confirmation de l’anesthésie profonde, une thoracotomie sera réalisée, puis la perfusion transcardiaque sera effectuée avec une solution tampon, suivie si nécessaire d’une solution fixatrice adaptée aux analyses prévues, par exemple du paraformaldéhyde à 4 %. L’animal restera sous anesthésie profonde pendant toute la procédure. La mort sera confirmée par l’arrêt respiratoire et cardiaque à l’issue de la perfusion.

Remplacement

Les études de mécanismes complexes de maladies psychiatriques comme l'addiction ne sont pour le moment pas remplaçables par des méthodes in vitro ou in sillico. Les mécanismes impliqués sont trop complexes pour pouvoir être simplifiés à ce jour. Les modèles que nous avons choisis font partie des modèles les plus utilisés et les plus complets avec une validité de ressemblance, une validité de construction et une validité de prédiction très bien décrites dans la littérature. L'animal dans son entièreté est le seul modèle disponible actuellement pour remplir les objectifs de ce projet.

Réduction

Pour les tests comportementaux, nous identifions le minimum d’animaux nécessaires pour un résultat statistiquement significatif, qui est déterminé en utilisant une « power analysis » basée sur nos résultats précédents, et un n = 30/groupe est généralement suffisant. Il est donc nécessaire de commencer avec un grand nombre d'animaux dans nos groupes. Si nous avons initialement 30 rats par groupe, nous perdrons ensuite environ 15 à 20 % des rats après la première étape d'acquisition de consommation volontaire excessive d'alcool, puis encore 15 à 20 % à la seconde étape d'acquisition de tâche opérante. Cela nous amènera à avoir une vingtaine de rats par groupe avant les tests de compulsivité. Théoriquement, nous aurons au maximum 5 à 6 rats qui développeront un comportement compulsif. Cela représente le nombre minimum nécessaire pour effectuer des tests statistiques. A noter donc qu’il est des fois nécessaires de répéter chaque expérience sur deux cohortes indépendantes, si le nombre de rats compulsif est inférieur à 5. Les tests statistiques utilisés seront des analyses ANOVA suivi d’analyses post hoc. Ces études se feront de manière longitudinale, afin de tester plusieurs paramètres (la consommation du type «binge »; perte de contrôle ; motivation ; consommation compulsive ; abstinence et rechute) chez le même animal afin de réduire au maximum le nombre de rats utilisés. Par ailleurs, les animaux sont surveillés quotidiennement.

Raffinement

Les animaux seront stabulés dans des cages enrichies grâce à un tube en carton et une buchette en bois. Les animaux seront manipulés 5 jours par semaine avec une intensification du "handling" durant les jours suivant l'arrivée des animaux au sein de la plateforme, permettant ainsi une forte réduction du stress. Par la suite tous les jours de la semaine (5 jours par semaine) les animaux seront manipulés avant et après la mise en place dans les cages d'auto-administration. Nous utiliserons la Rat Grimace Scale (RGS) tout au long de ce projet pour l'évaluation du niveau de souffrance/douleur. En fonction du score différentes procédures d'analgésie (paracétamol, Pracétam 20% 100 ou 200 mg/kg) seront appliquées pour réduire voire annuler toute souffrance ressentie par les animaux. Dans les cas où un rat présenterait une faiblesse musculaire, tonique, nous lui administrerons une injection de solution glucosée (5%, 10 mL/kg) 2 fois par jour en intra-péritonéale et nous utiliserons de l'aliment en poudre supplémenté en solution glucosée (5%) pour faciliter la prise alimentaire. Pour la chirurgie, une prémédication au paracétamol (Pracétam 20%) à 200 mg/kg 24 heures avant la chirurgie sera mise en place. Les animaux seront sur un tapis chauffant avec pose de gel occulaire. La profondeur de l'anesthésie sera controlée toutes les 5 minutes. Les opérations d'injection ou d'implantation seront réalisées sous anesthésie gazeuse et analgésie générale et locale. Au cours de la période post-opératoire, les rats recevront automatiquement une dose de 200 mg/kg de paracétamol dans l'eau de boisson pour au minimum 3 jours. Ensuite en fonction du score obtenu par la RGS, nous utiliserons soit une dose de 200 mg/kg (score de 5 et 6) ou 100 mg/kg (score de 3 et 4).

Choix des espèces

Le rat est l’animal le plus couramment utilisé dans les études d’auto-administration opérante d’alcool de part ses capacités d’apprentissage de la tâche opérante mais également pour son attrait naturel pour l’alcool. Les rats adultes seront agés de 8 semaines à leur arrivée au laboratoire pour une utilisation allant de quelques semaines à plusieurs mois.