Rongeurs
D?veloppement et caract?risation de deux mod?les murins humanis?s pour l??tude d?une infection virale humaine dans un contexte de greffe
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Jusqu'à seize anesthésies générales pour une même souris : 300 souris fortement immunodéprimées vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, toutes tuées à l'issue. Un fragment de poumon humain leur est greffé au cours d'une opération de vingt à soixante minutes, puis un cytomégalovirus humain est injecté directement dans le greffon, et l'infection est suivie par imagerie jusqu'à huit fois, avec neuf prélèvements sanguins au maximum par animal. Certaines restent dans le protocole plusieurs mois, jusqu'à l'âge de neuf mois. Le porteur écrit que leur déficit immunitaire, qui les rend fragiles aux infections et impose un hébergement particulier, est aussi ce qui permet la greffe de tissus humains, et interdit ensuite toute réutilisation comme toute adoption.
Objectifs
Les personnes ayant re?u une greffe d?organe doivent prendre des traitements diminuant l?activit? du syst?me immunitaire afin d??viter le rejet du greffon. Cette diminution des d?fenses immunitaires augmente cependant le risque d?infections. Parmi elles, le cytom?galovirus humain est l?une des plus fr?quentes et peut provoquer des complications importantes ainsi qu?alt?rer la survie du greffon. L??tude de cette infection est difficile car ce virus infecte uniquement les cellules humaines. Les mod?les animaux classiques ne permettent donc pas de reproduire correctement les interactions entre le virus, les tissus humains et le syst?me immunitaire. L?objectif de ce projet est de d?velopper et caract?riser deux mod?les de souris portant des tissus humains afin d??tudier l?infection par le cytom?galovirus humain dans un contexte proche de la transplantation d?organe. Le premier mod?le permettra d??tudier l?infection du virus dans un greffon pulmonaire humain et de suivre son ?volution au cours du temps gr?ce ? des m?thodes d?imagerie non invasives. Le second mod?le permettra, en plus du greffon pulmonaire, de reconstituer un syst?me immunitaire humain chez la souris. Il servira ? ?tudier les interactions entre le virus, le greffon et les cellules immunitaires humaines, ainsi que la capacit? du syst?me immunitaire ? contr?ler l?infection. Ces mod?les seront ?valu?s en termes de stabilit?, de reproductibilit? et de qualit? de l?infection observ?e. Ce projet a pour objectif d??tablir des mod?les exp?rimentaux robustes pour mieux comprendre les interactions entre le virus, les tissus humains et le syst?me immunitaire dans un contexte de transplantation. Il ne vise pas directement ? tester un traitement, mais ? pr?parer de futures ?tudes th?rapeutiques.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de d?velopper et caract?riser des mod?les exp?rimentaux reproduisant certaines caract?ristiques de l?infection par le cytom?galovirus humain dans un contexte proche de la transplantation d?organe. ? court terme, il permettra de mieux comprendre la mani?re dont ce virus infecte et persiste dans des tissus humains greff?s, ainsi que les interactions entre le virus et le syst?me immunitaire humain. Il permettra ?galement de valider des m?thodes de suivi de l?infection au cours du temps chez les m?mes animaux, afin de limiter le nombre d?animaux n?cessaires aux exp?riences. ? moyen terme, ces travaux fourniront des mod?les exp?rimentaux robustes et reproductibles pour l??tude des infections virales humaines chez les patients immunod?prim?s, notamment apr?s une transplantation d?organe. Ils contribueront ? am?liorer les connaissances sur les m?canismes impliqu?s dans le contr?le ou la persistance de l?infection. ? plus long terme, ces mod?les pourront servir de base au d?veloppement et ? l??valuation de nouvelles approches th?rapeutiques contre les infections opportunistes chez les patients greff?s ou immunod?prim?s. Ils pourront ?galement ?tre adapt?s ? l??tude d?autres infections humaines n?cessitant la pr?sence de tissus et de cellules immunitaires humaines. Les b?n?fices attendus concernent principalement l?am?lioration des connaissances en sant? humaine et le d?veloppement futur d?outils de recherche pr?clinique.
Procédures
Les animaux utilis?s dans ce projet subiront diff?rentes interventions r?alis?es sous anesth?sie g?n?rale. Dix souris recevront une anesth?sie g?n?rale dans le cadre d?une ?tude pilote de validation chirurgicale. Trente souris recevront jusqu?? 10 anesth?sies g?n?rales au cours de la mise en place et du suivi d?un mod?le comportant l?implantation de tissus pulmonaires humains. Soixante-quinze souris recevront jusqu?? 16 anesth?sies g?n?rales dans le cadre du d?veloppement d?un mod?le associant des tissus humains et un syst?me immunitaire humain reconstitu?. Les interventions chirurgicales seront r?alis?es une seule fois et dureront environ 20 ? 30 minutes pour le mod?le d?implant pulmonaire et 45 ? 60 minutes pour le mod?le de reconstitution immunitaire. Apr?s une p?riode de r?cup?ration, certains animaux recevront une injection locale de virus dans les tissus implant?s. Des suivis r?guliers seront r?alis?s tout au long du projet. Ils comprendront des s?ances d?imagerie sous anesth?sie g?n?rale afin de suivre l??volution de l?infection au cours du temps. Chaque s?ance durera moins de 15 minutes et pourra ?tre r?p?t?e jusqu?? 8 fois selon les groupes exp?rimentaux. Certains animaux feront ?galement l?objet de pr?l?vements sanguins sous anesth?sie afin d??valuer la reconstitution du syst?me immunitaire humain et le suivi de l?infection. Ces pr?l?vements seront r?alis?s ? intervalles espac?s, avec un maximum de 9 pr?l?vements de faible volume par animal sur l?ensemble de la proc?dure. Les animaux issus de l??levage feront ?galement l?objet d?un g?notypage, et les animaux inclus dans les proc?dures exp?rimentales seront identifi?s individuellement avant leur inclusion dans l??tude. La dur?e totale de participation des animaux au projet pourra atteindre plusieurs mois selon les proc?dures exp?rimentales.
Impact sur les animaux
Les souris utilis?es dans ce projet pr?sentent un d?ficit important du syst?me immunitaire, ce qui les rend plus sensibles aux infections et n?cessite des conditions d?h?bergement et de surveillance adapt?es. Les principales nuisances attendues sont li?es aux interventions chirurgicales n?cessaires ? l?implantation des tissus humains. Ces interventions peuvent entra?ner une douleur et un inconfort transitoires, principalement dans les jours suivant la chirurgie. Une prise en charge adapt?e de la douleur sera mise en place. Les manipulations r?p?t?es, les s?ances d?imagerie et les pr?l?vements sanguins peuvent ?galement provoquer un stress l?ger et temporaire. L?infection exp?rimentale pourra entra?ner des modifications localis?es des tissus implant?s, telles qu?une inflammation ou des l?sions du greffon pulmonaire humain. Une alt?ration mod?r?e de l??tat g?n?ral des animaux reste ?galement possible en raison de leur fragilit? immunitaire. Les animaux feront l?objet d?une surveillance r?guli?re tout au long du projet afin de d?tecter rapidement tout signe de souffrance ou d?alt?ration de l??tat g?n?ral. Des crit?res d?arr?t anticip? seront appliqu?s si n?cessaire afin de limiter la douleur et les nuisances.
Devenir
? l?issue des proc?dures exp?rimentales, tous les animaux seront mis ? mort afin de permettre le pr?l?vement des tissus et organes n?cessaires aux analyses finales. Ces analyses sont indispensables pour ?valuer la pr?sence du virus, l??tat des tissus humains greff?s et la reconstitution du syst?me immunitaire humain. Les animaux ne pourront pas ?tre r?utilis?s ou propos?s ? l?adoption en raison de leur immunod?ficience, des interventions chirurgicales subies et de la n?cessit? de r?aliser des analyses terminales incompatibles avec leur maintien en vie.
Remplacement
Le cytom?galovirus humain infecte uniquement les cellules humaines et ne peut pas ?tre ?tudi? de mani?re satisfaisante dans des mod?les animaux classiques. Des m?thodes alternatives, comme les cultures cellulaires, les organo?des ou les mod?les de tissus humains en laboratoire, sont utilis?es lorsque cela est possible pour ?tudier certains m?canismes de l?infection. Cependant, ces approches ne permettent pas de reproduire l?ensemble des interactions entre le virus, les tissus humains et le syst?me immunitaire dans un organisme vivant. Elles ne permettent pas non plus de suivre l??volution de l?infection au cours du temps dans des tissus humains vascularis?s et int?gr?s ? un organisme. Les mod?les de souris humanis?es utilis?s dans ce projet constituent actuellement la seule approche permettant d??tudier ces interactions dans des conditions proches de celles observ?es chez les patients greff?s et immunod?prim?s.
Réduction
Le nombre d?animaux utilis? dans ce projet a ?t? d?fini ? partir des donn?es de la litt?rature et des caract?ristiques des mod?les ?tudi?s, notamment les taux attendus de prise des greffons et de reconstitution du syst?me immunitaire humain. Ces param?tres ont ?t? pris en compte afin d??viter de r?p?ter les exp?riences et de limiter l?utilisation d?animaux suppl?mentaires. Le nombre d?animaux par groupe a ?t? limit? au strict n?cessaire pour obtenir des r?sultats scientifiquement exploitables tout en tenant compte de la variabilit? li?e aux tissus humains utilis?s. Le suivi de l?infection sera r?alis? de mani?re r?p?t?e chez les m?mes animaux gr?ce ? des techniques d?imagerie non invasives. Cette approche permet de limiter le nombre total d?animaux n?cessaires en r?duisant les comparaisons entre individus diff?rents. Le protocole exp?rimental a ?galement ?t? con?u afin de limiter le nombre de groupes exp?rimentaux et de r?duire autant que possible le recours ? des groupes t?moins suppl?mentaires.
Raffinement
Plusieurs mesures seront mises en place afin de limiter la douleur, le stress et les nuisances subies par les animaux tout au long du projet. Les souris seront h?berg?es dans des conditions adapt?es ? leur fragilit? immunitaire afin de limiter le risque d?infections. Elles seront maintenues en groupes sociaux autant que possible et b?n?ficieront d?un environnement enrichi pour r?duire le stress. Une p?riode d?acclimatation sera respect?e avant le d?but des proc?dures exp?rimentales. Les interventions chirurgicales seront r?alis?es sous anesth?sie g?n?rale avec administration syst?matique de traitements contre la douleur avant et apr?s la chirurgie. Les animaux seront surveill?s jusqu?? leur r?veil complet puis feront l?objet d?un suivi r?gulier portant notamment sur leur ?tat g?n?ral, leur comportement, leur poids et la cicatrisation. Les techniques utilis?es ont ?t? choisies afin de limiter la dur?e des interventions et les complications. Les s?ances d?imagerie seront r?alis?es sous anesth?sie br?ve afin de limiter le stress li? aux manipulations. Des crit?res d?arr?t anticip? seront appliqu?s en cas de signes de souffrance ou d?alt?ration de l??tat g?n?ral afin de permettre une prise en charge adapt?e ou une euthanasie si n?cessaire.
Choix des espèces
La souris est un mod?le largement utilis? en recherche biom?dicale, notamment pour l??tude du syst?me immunitaire et des maladies infectieuses. Elle permet de r?aliser des ?tudes reproductibles dans un organisme vivant tout en limitant le nombre d?animaux n?cessaires. Les souris utilis?es dans ce projet pr?sentent un d?ficit important du syst?me immunitaire, ce qui permet l?implantation de tissus humains et, dans certains cas, la reconstitution d?un syst?me immunitaire humain. Ce mod?le est particuli?rement adapt? ? l??tude du cytom?galovirus humain, un virus qui infecte uniquement les cellules humaines et ne peut donc pas ?tre ?tudi? correctement dans des souris classiques. Cette souche permet ?galement l?implantation de cellules humaines sans recourir ? certaines proc?dures plus invasives habituellement n?cessaires dans d?autres mod?les, ce qui contribue ? limiter les nuisances pour les animaux. Les animaux seront inclus dans les proc?dures exp?rimentales ? l??ge de 8 ? 10 semaines, ?ge auquel leur d?veloppement et leur ?tat physiologique permettent de supporter les interventions chirurgicales dans de bonnes conditions. Selon les proc?dures exp?rimentales, les animaux pourront ?tre suivis pendant plusieurs mois afin de permettre la stabilisation des tissus humains implant?s, la reconstitution du syst?me immunitaire humain et le suivi de l?infection. Au maximum, les souris seront ag?es de 9 mois en fin de proc?dure.
Etude de l?impact d’une kinase sur la dysfonction endoth?liale en condition inflammatoire dans le mod?le murin (UE 1/4)
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
802 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, certaines maintenues sous anesthésie quatre heures d'affilée pour l'étude d'une thrombose déclenchée au laser, sept heures pour celle d'une inflammation locale. Les procédures sont déclarées d'un niveau de souffrance modéré à sévère et se répartissent sur cinq établissements : irradiation puis greffe de moelle osseuse dans l'un, infection bactérienne et mise à mort dans les quatre-vingt-seize heures dans un autre, ligature d'un vaisseau abdominal sous anesthésie suivie de quarante-huit heures de survie dans un dernier. Il s'agit de comprendre comment une protéine kinase agit sur l'inflammation, la formation de caillots et la paroi des vaisseaux, les retombées pour les patients restant au stade d'une cible thérapeutique à explorer. Sur le remplacement, le porteur écrit qu'aucune méthode de substitution pertinente n'est disponible et que le recours à la souris ne peut être évité.
Objectifs
Nous avons identifi? que l?inhibition d'une prot?ine diminuait de fa?on significative la progression des l?sions dans un contexte inflammatoire. Dans le but de mieux comprendre le mode d?action de cette prot?ine sur la progression de ces l?sions, nous allons ?valuer son impact sur l?inflammation et la fonction de l?endoth?lium (cellules qui tapissent l?int?rieur d?un vaisseau sanguin) gr?ce ? des mod?les pr?cliniques d?infection (sepsis), d?inflammation et de thrombose (activation de l?endoth?lium avec une cytokine inflammatoire ou un laser).
Bénéfices attendus
Ces exp?riences permettront d??valuer, dans un organisme vivant, les effets potentiels de la prot?ine ?tudi?e sur la formation de caillots sanguins et l?inflammation, ce qui ne peut pas ?tre reproduit en laboratoire sur des cellules isol?es. Elles aideront ?galement ? d?terminer si cette prot?ine pourrait repr?senter une cible int?ressante pour d?velopper de nouvelles approches th?rapeutiques visant ? prot?ger les vaisseaux sanguins contre les dysfonctionnements li?s ? des processus inflammatoires ou thrombotiques.
Procédures
Trois types d?interventions seront r?alis?es sur des lots diff?rents d?animaux : 1- Dans le premier ou deuxi?me ?tablissements utilisateur, des lots d'animaux seront soumis ? une irradiation suivie d?une greffe de moelle osseuse (injection des cellules par voie intraveineuse). 2- Dans un troisi?me ?tablissement utilisateur, des lots d'animaux seront soumis ? une infection bact?rienne. Une seule prise de sang sera r?alis?e sur chaque lot ? differents temps (au plus tard 96h apres le d?but de l?infection). Pour cela les souris seront sous anesth?sie g?n?rale profonde (m?lange de Til?tamine, Zolaz?pam et Xylazine), et seront ensuite euthanasi?es. 3- Dans un quatri?me ?tablissement utilisateur, les animaux seront h?berg?s pendant 1 semaine pour acclimatation. 4- Dans le cinqui?me ?tablissement utilisateur, les animaux seront soumis, sous anesth?sie profonde, ? un mod?le de thrombose (activation des cellules du vaisseau par un laser) ou d?inflammation (activation des cellules du vaisseau par une mol?cule inflammatoire). Les animaux sont maintenus sous anesth?sie tout au long de l?exp?rience et sont euthanasi? ? la fin des exp?rimentations qui durent respectivement 4 heures pour ?tudier la thrombose et 7 Heures pour ?tudier l?inflammation locale. Pour ?tudier la thrombose veineuse, des lots diff?rents d?animaux seront expos?s ? une chirurgie sous anesth?sie avec ligation d?un vaisseau sanguin abdominal (40 minutes). 48 heures apr?s la chirurgie les animaux sont euthanasi?s.
Impact sur les animaux
- Les animaux subiront une irradiation sans geste invasif suivi d?une reconstitution de leur moelle osseuse. Les effets ind?sirables possibles sont une l?g?re baisse de l'alimentation avec l?g?re perte de poids. Les animaux peuvent avoir un l?ger stress du fait de l'enfermement et du bruit, mais ce stress est de courte dur?ee. L'irradiation ne procure aucune douleur. - Apr?s l?induction d?une infection (l?g?re ? mod?r?e), les effets ind?sirables attendus dans ce mod?le incluent une perte de poids, une diminution de l?activit? et de la vitalit?. Les souris seront ensuite euthanasi?es au plus tard 96h apres le d?but de l?infection. D?autres exp?rimentations (mod?les de thrombose et d?inflammation) sont conduites sans r?veil des animaux. Les souris sont alors maintenues sous anesth?sie g?n?rale pendant toute la dur?e des proc?dures exp?rimentales. ? l?issue des exp?rimentations, les animaux sont euthanasi?s sans reprise de conscience.
Devenir
Tous les animaux seront mis ? mort ? la fin de la proc?dure pour collecter les tissus et organes qui seront ensuite analys?s. Les animaux seront ?galement euthanasi?s si l'un des points limites ?tait atteint.
Remplacement
Le recours au mod?le murin est irrempla?able pour le d?roulement de ce projet pour deux raisons majeures : (i) la complexit? des m?canismes mis en jeu dans un contexte physiopathologique int?gr? non mod?lisable par des approches in vitro et (ii) l'utilisation de souris exprimant la prot?ine d?interet inactive. Ainsi, l?utilisation d?animaux vivants constitue une ?tape n?cessaire pour r?pondre aux objectifs du projet, aucun mod?le de remplacement pertinent n??tant actuellement disponible.
Réduction
Dans un souci d'utilisation d'un nombre minimal d'animaux, le nombre d'animaux annonc? a ?t? calcul? au plus juste ? l'aide d'outils statistiques. Cependant si une diff?rence significative est obtenue entre deux groupes exp?rimentaux avant la r?alisation de la totalit? du lot, nous ne r?aliserons pas d'exp?rimentations suppl?mentaires. Dans les exp?rimentations de thrombose, plusieurs types cellulaire et/ou mol?cules seront visualis?s dans les m?mes animaux.
Raffinement
Les souris sont h?berg?es en groupes de cinq individus, dans des cages ventil?es, avec un acc?s ad libitum ? l?eau et ? la nourriture. Si une diminution de l?activit? est observ?e, de l?aliment hydrat? sera mis ? disposition dans la cage afin de faciliter l?acc?s ? la nourriture. Du papier sopalin et des cubes de bois seront ?galement rajout?s comme enrichissement environnemental afin de permettre des comportements naturels de nidification et d?exploration, contribuant ainsi ? r?duire le stress et ? am?liorer le bien-?tre des animaux. Une p?riode d?acclimatation de sept jours est respect?e avant le d?but des exp?rimentations afin de limiter le stress li? ? l?environnement. Les transferts entre deux ?tablissements seront r?alis?s par un transporteur agr??. Les animaux b?n?ficient d?une p?riode d?acclimatation d?une semaine avant toute proc?dure exp?rimentale dans l??tablissement d?accueil.
Choix des espèces
Ce projet vise ? am?liorer la compr?hension des m?canismes impliquant une prot?ine kinase dans l?inflammation, la thrombose et la dysfonction endoth?liale en contexte thrombo-inflammatoire. Ces processus reposent sur des interactions complexes entre la paroi des vaisseaux, les cellules sanguines et le syst?me immunitaire, s?inscrivant dans une r?ponse physiopathologique int?gr?e qui ne peut ?tre reproduite de mani?re pertinente par des approches in vitro ou ex vivo. Le recours ? l?exp?rimentation animale constitue donc l?unique approche permettant d??tudier ces m?canismes dans leur globalit?. Le mod?le murin est largement reconnu comme le mod?le de r?f?rence pour les ?tudes pr?cliniques de la thrombose et de l?inflammation, en raison de fortes similitudes avec l?Homme, tant au niveau des cellules impliqu?es que des voies mol?culaires mises en jeu. Par ailleurs, l?utilisation de souris g?n?tiquement modifi?es ciblant sp?cifiquement la prot?ine kinase, sans ph?notype dommageable en conditions basales, permet une analyse m?canistique en contexte pathologique. Nous utiliserons des souris de 6 ? 8 semaines pour les donneuses de moelle osseuse, et de 12 ? 25 semaines pour les exp?rimentations (?ge adulte, syst?me cardiovasculaire mature).
?valuation des effets de candidats m?dicaments sur le sommeil induit par le pentobarbital chez la souris.
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
Endormies de force au pentobarbital, après avoir reçu par la bouche, sous la peau, dans l'abdomen, dans une veine ou dans le nez les substances à tester, 1656 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune peut subir jusqu'à cent vingt et une administrations, une privation de nourriture et un isolement de moins de seize heures. Le porteur indique que le pentobarbital leur fait perdre le réflexe de redressement, abaisse leur tonus musculaire, ralentit leur respiration et fait chuter leur température, et que les injections répétées dans l'abdomen laissent de petits hématomes. Neuf cent soixante-deux souris seront tuées pour des prélèvements d'organes, et six cent quatre-vingt-quatorze gardées en vie pour être réutilisées dans un autre projet, à condition qu'il soit classé en sévérité légère à modérée.
Objectifs
Ce projet est un projet g?n?rique qui vient poursuivre un projet arrivant ? son terme. Il vise ? ?valuer les effets de nouveaux candidats m?dicaments pour le traitement des troubles du sommeil d?origine centrale, tels que l?insomnie (difficult? d?endormissement, et/ou ? maintenir le sommeil) et l?hyper-somnolence ou l?hypersomnie, notamment la narcolepsie. Les traitements actuels des troubles du sommeil pr?sentent soit une efficacit? insuffisante, soit des effets secondaires n?fastes, notamment accoutumance ou addiction. Ce mod?le sera utilis? pour tester l?efficacit? de produits de diff?rents donneurs d?ordre pr?sentant potentiellement moins d?effets secondaires, notamment de produits naturels extraits de plantes. Les donn?es g?n?r?es contribueront ? la caract?risation pharmacodynamique pr?coce des candidats m?dicaments.
Bénéfices attendus
Ce projet contribuera ? la caract?risation pharmacologique pr?coce de nouveaux candidats m?dicaments en permettant l'identification d'?ventuelles propri?t?s s?datives, hypnotiques ou ?veillantes. Le test du sommeil induit pharmacologiquement constitue un outil reconnu pour d?tecter les interactions pharmacodynamiques susceptibles d'influencer l'?tat de vigilance et les fonctions neurocomportementales. Les donn?es obtenues permettront d'am?liorer la s?lection des candidats les plus prometteurs avant leur engagement dans des ?tudes pr?cliniques plus complexes et plus consommatrices en animaux. L'identification pr?coce de compos?s pr?sentant un profil pharmacologique inadapt? ou des effets centraux ind?sirables contribuera ? r?duire les risques d'?chec lors des phases ult?rieures du d?veloppement. ? plus long terme, les connaissances g?n?r?es pourront participer au d?veloppement de nouvelles approches th?rapeutiques dans diverses aires th?rapeutiques n?cessitant une action sur le syst?me nerveux central ou pour lesquelles l'absence d'effets s?datifs constitue un enjeu de s?curit?. Ainsi, les b?n?fices attendus du projet concernent ? la fois l'am?lioration des connaissances scientifiques relatives aux effets neuropharmacologiques des mol?cules ?tudi?es et l'optimisation du d?veloppement de futurs m?dicaments susceptibles d'apporter un b?n?fice aux patients.
Procédures
Les animaux seront soumis ? une ou plusieurs administrations de substances d'essai (orale, intrap?riton?ale, intraveineuse, sous-cutan?e ou intranasale) ainsi qu'? une administration de pentobarbital destin?e ? induire un ?tat de sommeil transitoire (moins d?une minute, au maximum 121). Les fr?quences d'administration d?pendront des caract?ristiques pharmacologiques des candidats m?dicaments. Une privation de nourriture et un isolement des animaux de moins de 16h seront effectu?s lors de ce projet. Un pr?l?vement sanguin sur animal anesth?si? sera r?alis? en fin d??tude d?une dur?e inf?rieure ? 2 min avec un volume maximal de 1 ml.
Impact sur les animaux
Les animaux seront soumis ? une ou plusieurs administrations de substances d'essai ainsi qu'? une administration de pentobarbital destin?e ? induire un ?tat de sommeil transitoire. Les principales nuisances associ?es ? la proc?dure sont li?es ? la contention n?cessaire aux administrations et aux observations cliniques r?alis?es pendant l'?tude. Ces manipulations sont de courte dur?e et susceptibles d'engendrer un stress l?ger et transitoire. L?administration de traitement par injections intrap?riton?ales r?p?t?es pourra provoquer de petits h?matomes au niveau du site de la piq?re. Les administrations per os r?p?t?es peuvent exceptionnellement induire un inconfort lors de l'introduction de la sonde ainsi qu'une irritation de l'?sophage ou du pharynx. Les instillations intranasales r?p?t?es peuvent exceptionnellement induire une g?ne respiratoire transitoire ainsi qu'une irritation des muqueuses nasales. L'administration du pentobarbital induira une diminution de l'activit? locomotrice suivie d'une perte temporaire du r?flexe de redressement . Pendant cette p?riode, les animaux pourront pr?senter une diminution du tonus musculaire, une r?duction de la r?activit? aux stimuli ext?rieurs ainsi qu'un ralentissement mod?r? de la fr?quence respiratoire. Une baisse transitoire de la temp?rature corporelle peut ?galement ?tre observ?e chez certains animaux du fait des propri?t?s pharmacologiques du pentobarbital.
Devenir
En fin d??tude, pour des analyses s?rologiques, histologiques, mol?culaires et immunohistochimiques, certains animaux pourront ?tre soumis ? diff?rents types de pr?l?vements (organes) post mortem, ils seront donc mis ? mort en fin d'?tude. Dans le cas o? le projet ne n?cessite pas de pr?l?vement d'organe post mortem, les animaux pourront ?tre gard?s en vie pour ?tre r?utilis?s dans un projet de s?v?rit? l?g?re ? mod?r?e et sur avis v?t?rinaire. L?ensemble des animaux arrivant au point limite avant la fin de l??tude comportementale sera mis ? mort.
Remplacement
L??tude du comportement animal est une ?tape essentielle dans le d?veloppement des m?dicaments actifs sur le syst?me nerveux. L?effet de mol?cules sur le comportement est la cons?quence de leur action au niveau de l?ensemble de l?organisme et en particulier sur le syst?me nerveux. La mise en ?vidence de ces effets est r?alis?e sur un organisme vivant entier. Pour ?tre valide, un mod?le alternatif devrait prendre en compte l?ensemble des ph?nom?nes pharmacologiques, biochimiques et physiologiques qui ont lieu chez l?animal. A ce jour, aucun test in vitro ou in silico ne permet de rendre compte de l?ensemble de ces ph?nom?nes et en particulier ceux qui conditionnent le comportement. Les tests utilis?s pour les ?tudes comportementales ne peuvent donc pas ?tre remplac?s par des m?thodes alternatives. Le recours ? l?animal de laboratoire s?av?re donc n?cessaire et incontournable pour ?tudier l?efficacit? de nouveaux candidats m?dicaments.
Réduction
Le nombre d'animaux est d?termin? ? partir de l'exp?rience historique de notre EU et d'une analyse statistique de puissance. Les calculs coupl?s ? notre exp?rience indiquent qu'un effectif de 12 animaux par groupe est n?vessaire et suffisant pour mettre en ?vidence un effet biologiquement pertinent. Pour chaque lot, des analyses statistiques seront utilis?es pour comparer soit 2 groupes entre eux soit plusieurs groupes au groupe contr?le.
Raffinement
Une p?riode d?acclimatation au nouvel environnement de 5 jours minimum sera respect?e avant que les animaux ne soient inclus dans le protocole exp?rimental. Toutes les manipulations seront r?alis?es par du personnel form?. Les doses du produit inducteur de sommeil utilis?es dans ce projet ont ?t? choisies d?apr?s la litt?rature et l?exp?rience acquise dans notre EU pour que celles-ci, seule ou lorsqu?elle est coupl?e ? l?administration d?une r?f?rence positive qui augmente la dur?e du temps de sommeil, n?induisent aucun probl?me de r?cup?ration des animaux apr?s leur r?veil. Les animaux seront soumis ? une grille de scoring sp?cifique adapt?e ? l?exp?rience durant toute la p?riode de sommeil et pendant les 72h qui suivent l?exp?rience s'ils sont gard?s en vie. Si des animaux pr?sentent des signes de souffrance au cours de l'?tude, des croquettes humides ou de l'hydrogel seront ajout?s dans les cages et le v?t?rinaire en sera inform?. Si un animal atteint un des crit?res d?arr?t pr?d?finis dans notre grille de scoring ? un moment donn? de l'exp?rience, il sera imm?diatement mis ? mort. Si le candidat m?dicament est administr? de fa?on chronique et par voie intrap?riton?ale, une alternance du site d?administration sera r?alis?e. Si l?administration du candidat m?dicament est effectu?e par voie intranasale, une habituation progressive ? la manipulation, ? la contention sp?cifique li?e ? l?instillation intranasale et ? l?instillation en elle-m?me sera effectu?e. Chaque s?ance d?habituation est accompagn?e d?une r?compense alimentaire pour l?animal. Si le projet n?cessite un pr?l?vement sanguin celui-ci sera effectu? sur animaux anesth?si?s.
Choix des espèces
La souris a ?t? retenue pour ce projet en raison de sa pertinence scientifique dans l'?valuation pr?clinique des effets des substances d'essai sur le syst?me nerveux central. Cette esp?ce est largement utilis?e et valid?e dans les mod?les de s?dation et notamment d'hypnose induites par le pentobarbital. Le test du sommeil induit par le pentobarbital est un mod?le historiquement d?velopp? et largement document? chez la souris. L'utilisation de la souris facilite ?galement la comparaison des donn?es obtenues avec celles issues de compos?s de r?f?rence ou d'?tudes ant?rieures. La souris pr?sente par ailleurs des caract?ristiques physiologiques, neurobiologiques et pharmacologiques bien connues, ainsi qu'une sensibilit? adapt?e ? la mise en ?vidence des effets s?datifs, hypnotiques ou stimulants des substances ?tudi?es. Aucune m?thode alternative in vitro, ex vivo ou in silico ne permet actuellement de reproduire l'int?gration des m?canismes pharmacocin?tiques et pharmacodynamiques impliqu?s dans l'induction du sommeil observ?s chez un organisme vivant. L'utilisation d'animaux demeure donc n?cessaire pour r?pondre aux objectifs scientifiques du projet. Les animaux seront utilis?s ? l'?ge de 6 ? 15 semaines, correspondant au stade de jeune adulte. ? cet ?ge, les syst?mes physiologiques impliqu?s dans l'absorption, la distribution, le m?tabolisme et l'?limination des substances administr?es sont pleinement d?velopp?s, permettant une ?valuation fiable et reproductible des effets pharmacologiques des candidats m?dicaments. L'utilisation d'animaux jeunes adultes permet ?galement de limiter la variabilit? li?e aux processus de croissance observ?s chez les animaux plus jeunes ainsi qu'aux modifications physiologiques associ?es au vieillissement. Cette tranche d'?ge correspond ? celle utilis?e dans la majorit? des ?tudes de pharmacologie comportementale et pour laquelle le laboratoire dispose de donn?es historiques de r?f?rence. Le recours ? des animaux de cet ?ge contribue ainsi ? la robustesse scientifique du mod?le tout en permettant de limiter le nombre d'animaux n?cessaires ? l'obtention de r?sultats interpr?tables.
D?veloppement de nouveaux candidats m?dicaments : Etude comportementale chez la souris MODIFICATIONS
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
Une société de services vend des tests de comportement sur souris à des laboratoires publics et privés : 5612 souris vont être utilisées pour évaluer une vingtaine de candidats médicaments, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, modéré ou sévère, toutes tuées à l'issue. Chacune peut recevoir jusqu'à quatre-vingt-dix administrations sur animal vigile et jusqu'à trois implantations de pompe sous la peau, sous anesthésie. Les tests employés vont de l'activité locomotrice à la nage forcée, que le porteur range lui-même dans le stress sévère, en passant par la reconnaissance d'objet, les trois chambres, la piscine de Morris, l'hyperthermie induite par un stress après soixante-douze heures d'isolement, et l'alimentation supprimée par la nouveauté après vingt-quatre heures sans nourriture. Les médicaments annoncés pour les maladies du système nerveux central relèvent d'un développement futur, quand l'immobilité d'une souris qui cesse de nager sert dès maintenant à mesurer ce que le porteur appelle un état dépressif.
Objectifs
Notre ?tablissement utilisateur est une soci?t? de services sp?cialis?e dans les ?tudes pr?cliniques qui fournit une offre vari?e de tests de comportement chez la souris. Nous souhaitons par ce projet pouvoir offrir notre expertise du comportement murin dans le domaine des maladies li?es au syst?me nerveux central (maladies neurod?g?n?ratives, maladies neurologiques ou psychiatriques ou troubles neuro-d?veloppementaux) ? des acteurs scientifiques acad?miques ou priv?s. Les mod?les d?velopp?s dans notre soci?t? nous permettent d??valuer l?effet de nouveaux candidats m?dicaments sur les fonctions cognitives, la m?moire, le comportement anxio-d?pressif, l?activit? motrice ainsi que la force motrice des animaux. Dans les pathologies telles que la maladie d?Alzheimer par exemple, on retrouve diff?rents sympt?mes comme les troubles cognitifs et perte de m?moire mais ?galement des sympt?mes anxieux et d?pressifs. Notre objectif est donc ici de pouvoir proposer une gamme de tests comportementaux chez le rongeur permettant d??tudier l?effet d?un potentiel candidat m?dicament dans des maladies li?es au syst?me nerveux central. Selon la cible th?rapeutique d?int?r?t du candidat m?dicament et donc de ses propri?t?s pharmacologiques, il pourra ?tre test? dans un ou plusieurs tests de comportement r?alis?s en routine dans notre EU afin de d?finir son efficacit? th?rapeutique dans un des domaines cit?s pr?c?demment ainsi que ses potentiels effets secondaires. Le nombre estim? de candidats m?dicaments test?s lors de ce projet est de 20.
Bénéfices attendus
Ce projet a pour but de permettre l?avanc?e de potentiels candidats m?dicaments dans leur d?veloppement pr?clinique afin de d?velopper et de rendre accessibles des nouveaux m?dicaments dans des pathologies touchant le syst?me nerveux central et qui aujourd?hui ne poss?dent pas de r?el traitement ou des traitements ayant des effets limit?s avec beaucoup d?effets secondaires.
Procédures
Des administrations seront r?alis?es sur animaux vigiles (moins d?une minute, au maximum 90). Les fr?quences d'administration d?pendront des caract?ristiques pharmacologiques des candidats m?dicaments. Un pr?l?vement sanguin sur animal anesth?si? sera r?alis? en fin d??tude d?une dur?e inf?rieure ? 2 min avec un volume maximal de 0.5 ml. Les animaux seront soumis ? un ou plusieurs tests de comportement (maximum 5 d?une dur?e de 5 min ? 15 jours selon le test). Les animaux pourront ?tre soumis ? une implantation de pompe osmotique par voie sous-cutan?e d?une dur?e de 5 minutes environ qui aura lieu au maximum 3 fois avec 2 semaines entre chaque renouvellement minimum. Selon le test comportemental, les animaux pourront ?tre soumis ? une privation de nourriture (inf?rieure ? 24h une seule fois) ou ? un isolement de 72h maximum une seule fois sur la dur?e de l'?tude.
Impact sur les animaux
Les administrations d?un produit peuvent induire une l?g?re douleur au site d?administration et un stress li? ? la contention de l?animal. Les administrations r?p?t?es peuvent ?galement induire des h?matomes. L?implantation d?un dispositif de diffusion de candidat m?dicament en sous-cutan? (? 3 reprises maximum au court d?une ?tude) implique la r?alisation d?un acte chirurgical sous anesth?sie g?n?rale pr?c?d?e d?une analg?sie de moins de 10 minutes. Les risques li?s ? ce type de proc?dure sont les suivants : douleur post-op?ratoire, ?d?me, inflammation ou h?matome au point d?implantation, risque faible d?infection locale. Les tests de comportement utilis?s dans ce projet peuvent induire un stress l?ger (ex : Test d?activit? locomotrice) ? s?v?re (pour le test de la nage forc?e) de courte dur?e. Les animaux doivent ?tre isol?s durant une p?riode de 72h avant le test d?hyperthermie induite par un stress. Durant les 24h qui pr?c?dent le test d?alimentation supprim?e par la nouveaut?, les animaux sont soumis ? une restriction alimentaire compl?te. L?administration de candidats m?dicaments peut entra?ner des effets tels que l?hyperactivit?, la s?dation ou une myorelaxation. Les mol?cules administr?es pour l?induction des mod?les de pathologie peuvent induire des d?ficits de m?moire et/ou une hyperactivit?.
Devenir
En fin d??tude, pour des analyses s?rologiques, histologiques, mol?culaires et immunohistochimiques, les animaux pourront soumis ? diff?rents types de pr?l?vements (organes) post mortem. L?ensemble des animaux arrivant au point limite avant la fin de l??tude comportementale sera mis ? mort.
Remplacement
Le d?veloppement de candidats m?dicaments, en amont de l?utilisation de l?animal, est r?alis? en plusieurs ?tapes : L?identification de la cible th?rapeutique (pathologie), la compr?hension des voies neurobiologiques de cette pathologie, la d?couverte de compos?s modulant la cible th?rapeutique, l?optimisation de ces compos?s pour am?liorer leur sp?cificit?, leur profil pharmacocin?tique et leur s?curit?, leur validation fonctionnelle in vitro (cultures de neurones, organo?des) et leur ?valuation pharmacocin?tique et toxicologique in vitro. Suite ? ces ?tapes et en amont du pr?sent projet, des ?tudes in vivo pourront ?galement ?tre r?alis?es ou sous-trait?es par le donneur d?ordre afin de d?terminer plus pr?cis?ment leur pharmacocin?tique et leur toxicit?. L?ensemble de ces ?tudes permettent de choisir les doses d?nu?es de toxicit?, ainsi que la voie et le temps d?administration qui seront optimaux pour notre projet. Ce projet consiste ? ?valuer diff?rents comportements chez l?animal repr?sentatifs de pathologies. Pour ?tre valide, un mod?le alternatif devrait prendre en compte l?ensemble des ph?nom?nes pharmacologiques, biochimiques et physiologiques qui ont lieu chez l?animal. A ce jour, aucun test in vitro ou in silico ne permet de rendre compte de l?ensemble de ces ph?nom?nes et en particulier ceux qui conditionnent le comportement. Les tests utilis?s pour les ?tudes comportementales ne peuvent donc pas ?tre remplac?s par des m?thodes alternatives. Le recours ? l?animal de laboratoire s?av?re donc n?cessaire pour ?tudier l?efficacit? de nouveaux candidats m?dicaments.
Réduction
Selon notre exp?rience, les tests statistiques utilis?s dans ce projet montre la n?cessit? d?un nombre d?animaux par groupe ?gal ? 12 pour observer des effets significatifs des candidats m?dicament (p
Raffinement
Une p?riode d?acclimatation de 6 jours minimum sera respect?e avant d?inclure les animaux dans une ?tude. Autant que possible, les animaux sont h?berg?s en groupe sociaux. Une strat?gie d?enrichissement particuli?re sera mise en place pour les animaux isol?s et les animaux stabul?s durant plus d?un mois. Leur ?tat g?n?ral sera ?valu? selon notre grille de surveillance pour d?tecter des signes ?ventuels de douleurs. Si un animal atteint un des crit?res pr?d?finis dans notre grille de scoring ? un moment donn? de l'exp?rience, il sera imm?diatement mis ? mort. Lors de la chirurgie pour l?implantation de syst?me de diffusion sous-cutan?e, l?administration d?antidouleur sera r?alis?e afin de garantir l?analg?sie. Une p?riode de r?cup?ration minimale de 5 jours sera respect?e avant le passage en test de comportement et, pour les tests de piscine de Morris ou de stress de nage forc?e, la p?riode n?cessaire ? la cicatrisation compl?te sera respect?e (environ une semaine confirm?e par avis v?t?rinaire). Les injections intrap?riton?ales seront pr?f?rentiellement r?alis?es dans le quart inf?rieur gauche afin d??viter le colon descendant situ? dans le quart inf?rieur droit. Les administrations sous-cutan?es seront r?alis?es sur 3 sites d?injection alternativement (entre les omoplates ou sur chacun des flancs lat?raux). L?implantation d?un syst?me de diffusion sous-cutan? sera r?alis?e sous anesth?sie g?n?rale pr?c?d?e d?une analg?sie. Les animaux seront soumis ? une habituation progressive ? la contention et ? l?instillation intranasale (suivie d?une r?compense alimentaire) sur une dur?e de 3-4 semaines avant l?administration du candidat m?dicament. Apr?s chaque s?ance dans la piscine de Morris et apr?s le test de la nage forc?e, les animaux sont plac?s dans une cage contenant un tissu sec sur tapis chauffant jusqu?? ce que l?animal soit sec. La r?signation des animaux, mesur?e par le temps d?immobilit?, sert ? ?valuer un potentiel ? ?tat d?pressif ? ou un effet antid?presseur par exemple. Dans les deux cas, une vigilance particuli?re est apport?e aux animaux pendant (avec des crit?res d?arr?t strict) et apr?s le test. Des ?tudes in vitro et in vivo seront r?alis?es pr?alablement ? ce projet pour d?finir les doses non toxiques, n?induisant pas de nuisances potentiellement invalidantes pour les animaux (nuisances sup?rieures ? une hyper ou hypoactivit? ou myorelaxation chez les animaux), qui seront utilis?s dans notre projet.
Choix des espèces
Le choix des rongeurs se justifie par la richesse et la complexit? de leur r?pertoire comportemental, qui permettent d?explorer de mani?re pertinente les fonctions motrices, cognitives et ?motionnelles cibl?es dans ce projet. Des esp?ces pr?sentant un syst?me nerveux central moins d?velopp? ne disposent pas d?une organisation neurobiologique ni d?expressions comportementales suffisamment ?labor?es pour r?pondre de fa?on fiable aux objectifs scientifiques poursuivis. De plus, la souris est le mod?le le plus courant en premi?re intention pour ?valuer les effets de candidats m?dicaments et les donn?es obtenues permettent de transposer (par des mod?les A partir de 5 semaines d??ge. Les pathologies ?tudi?es peuvent toucher l?adolescent, l?adulte comme le sujet ?g?.
Analyse de la r?gulation de la fission de crypte chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
Pour savoir si les cellules de la niche intestinale commandent le dédoublement des cryptes de l'intestin, 162 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, toutes tuées pour prélever leur tissu intestinal. Elles reçoivent une injection de tamoxifène sur animal vigile, une seule fois ou une fois par jour pendant trois jours consécutifs, entre le dixième et le quarantième jour après leur naissance, encore hébergées avec leur mère. L'injection supprime leurs cellules de Paneth, dont le porteur reconnaît que l'absence pourrait avoir des conséquences chez les souriceaux. Pour écarter ce risque, il s'appuie sur des observations non publiées de la collaboratrice qui lui a fourni la lignée.
Objectifs
L??pith?lium intestinal se caract?rise par une intense capacit? de renouvellement et de r?g?n?ration assur?e par les cryptes qui abritent les cellules souches et sont donc riches en m?canismes de r?gulation et de contr?le. Lors de cette r?g?n?ration, le nombre de cryptes augmente par un processus appel? fission de crypte qui consiste en un d?doublement d?une crypte m?re en deux cryptes filles. De plus, le processus de fission de crypte est essentiel pour la croissance intestinale pendant la maturation postnatale. Malgr? son importance dans la formation et le maintien de l?intestin, ce processus reste aujourd?hui tr?s mal document?. La litt?rature montre que les cellules de la niche des cellules souches intestinales jouent un r?le pr?pond?rant au cours du processus de crypte fission. Le but de notre projet est de d?finir si et comment les cellules de la niche intestinale contr?le cette fission de crypte. Notre hypoth?se est que la m?canique des cellules souches est cruciale lors de la fission de cryptes.
Bénéfices attendus
De r?centes ?tudes ont montr? qu?une perturbation de ce fonctionnement peut entrainer des fissions anormales et donner des cryptes corrompues impliqu?es dans la formation de micro-ad?nomes et d?ad?nomes dans le petit intestin et le c?lon. Notre ?quipe a notamment identifi? des fissions de cryptes anormales ? l?origine du d?veloppement de maladies intestinales infantiles rares. Ainsi, la fission de crypte est au c?ur de la physiopathologie intestinale humaine. Cependant, les m?canismes r?gissant la fission de crypte sont mal connus. Ainsi, notre ?quipe cherche ? caract?riser ce processus post-d?veloppemental en collaboration avec des cliniciens gastroent?rologues.
Procédures
Une injection sur animal vigile (geste de 1 minute maximum) par jour. Seront test?s 2 types d'administration : soit une seule injection, soit une injection par jour pendant 3 jours cons?cutifs.
Impact sur les animaux
Du stress peut subvenir lors de la contention pour l?injection, ainsi qu?une douleur de faible intensit? lors de l?introduction de l?aiguille. Les lign?es de souris avec lesquelles nous travaillerons n'ont pas de ph?notype dommageable. Toutefois, l?ablation des cellules de Paneth pourrait avoir des cons?quences durant la p?riode postnatale, bien que les observations non publi?es de notre collaboratrice ayant fourni la lign?e murine, sugg?rent qu'un ph?nom?ne de compensation limite les r?percussions majeures sur l'hom?ostasie intestinale globale m?me chez les souriceaux. N?anmoins, afin de prendre en compte un ?ventuel impact transitoire sur la fonction de barri?re intestinale ou sur la physiologie digestive dans les jours suivant l'induction, nous int?grerons un suivi renforc? des animaux entre 5 et 20 jours post-injection tamoxif?ne. Ce suivi comprendra notamment l'?valuation quotidienne de l'?tat g?n?ral, de la croissance pond?rale, de l'aspect de l'abdomen, de l'activit? spontan?e, de la prise alimentaire (appr?ci?e indirectement chez les jeunes animaux par l'?tat g?n?ral et la croissance) ainsi que de la pr?sence ?ventuelle d'anomalies digestives. Lorsque cela sera possible en fonction de l'?ge des animaux et de la production de f?ces individualisables, l'aspect des selles (consistance, diarrh?e, souillure p?rianale) sera ?galement surveill?. Toute alt?ration persistante de ces param?tres entra?nera une ?valuation rapproch?e de l'animal et l'application des points limites d?finis dans le protocole. Ces mesures permettront de d?tecter pr?cocement toute cons?quence inattendue li?e ? la perte des cellules de Paneth durant cette fen?tre postnatale sensible.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasi?s ? la fin des proc?dures afin de pr?lever le tissu intestinal.
Remplacement
Une grande partie du projet est d?j? r?alis?e in vitro ? l?aide de cultures d?organo?des dans notre ?quipe ; des cultures d?organo?des intestinaux nous permettent d??tudier le m?canisme de fission des cryptes de fa?on globale. Cependant, pour ?valuer sp?cifiquement le r?le des cellules de la niche intestinale dans l?environnement complexe du tissu, nous devons utiliser des animaux. En effet, les m?thodes utilisant les cellules en culture ne peuvent pas remplacer la complexit? des interactions tissulaires dans un organe tel que l?intestin. Nos mod?les d?organo?des permettent de reconstituer les populations cellulaires du tissu intestinal afin de r?aliser des tests in vitro pour comprendre l?importance, le r?le des cellules de Paneth. Cependant leur utilisation pr?sente des limites, ils ne miment pas l?architecture et le fonctionnement du tissu ?pith?lial intestinal dans son entier, ainsi que ses interactions avec le m?senchyme sous-jacent. Afin d??tudier le ph?nom?ne de fission de crypte pendant le d?veloppement post-natal, nous avons besoin de suivre in vivo le tissu intestinal fonctionnel dans son entier dans son environnement.
Réduction
Nous nous effor?ons de limiter le nombre d?animaux par groupe en utilisant un maximum de donn?es pour chaque animal. Ainsi, pour chaque animal, sont pr?lev?s des ?chantillons pour l?histologie, l?immunohistologie et analyse en microscopie ? fluorescence confocale, et isolation de cryptes pour pr?paration de cultures d?organo?des. De plus, le nombre d'animaux a ?t? d?termin? ? partir d'une analyse de puissance statistique.
Raffinement
Les souris sont h?berg?es avec leur m?re, dans des zones satisfaisant leurs besoins physiologiques et leur apportant un maximum de bien-?tre. Les conditions de temp?rature, lumi?re, et humidit? sont contr?l?es. Les souris nouveaux-n?s et leur m?re sont ensemble isol?s dans une cage, et disposent de diff?rents enrichissements (coton, d?me et tubes en carton). Une d?sinfection syst?matique du site d?injection ? l??thanol sera r?alis?e sur chaque souris pour l?injection du tamoxif?ne. Les souris qui auront subi cette injection seront plac?es dans une zone de stabulation d?di?e, avec moins de bruit et de passages et seront observ?es quotidiennement par un animalier ou l?exp?rimentateur. Les personnes pratiquant les injections sont form?es et ont une expertise afin de maitriser le geste et r?duire le temps de contention et de ce fait r?duire le stress chez les souris. Enfin, des points limites ont ?t? mis en place et seront appliqu?s.
Choix des espèces
Chez la souris, l?organisation du tissu intestinal est similaire ? celle d?crite chez l?Homme et c?est un mod?le exp?rimental tr?s utilis? dans la litt?rature pour l??tude du d?veloppement et de la physiologie intestinale. Les animaux seront utilis?s au stade juv?nile entre les jours postnataux/ jeune adulte 10 (jour postnatal P10) et 40 (jour postnatal P40) car c?est dans cette fen?tre d?veloppementale que se r?alisent la grande majorit? des fissions de crypte. Nous utiliserons des animaux g?n?tiquement modifi?s pour pouvoir supprimer la pr?sence de cellules de la niche intestinale et permettre de d?terminer leur r?le sp?cifique ? l'aide de la microscopie lors du d?veloppement intestinal.
Evaluation du r?le d?un facteur de croissance dans un mod?le murin de maladie r?nale chronique
- Recherche fondamentale
- Système urogénital
480 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Un régime enrichi en adénine leur provoque une maladie rénale chronique sur quatre semaines, ce qui réduit leur prise alimentaire et ralentit leur croissance. Une partie d'entre elles passe deux séjours en cage individuelle, quarante-huit heures puis vingt-quatre heures, isolées de leurs congénères et posées sur une grille métallique, le temps de recueillir urines et fèces. Le porteur indique que les souris dont aucun organe n'est prélevé sont tuées elles aussi, parce que le traitement les a rendues insuffisantes rénales, une atteinte qu'il qualifie d'irréversible et d'incurable.
Objectifs
La maladie r?nale chronique constitue un probl?me majeur de sant? publique, touchant environ 10 pourcents de la population mondiale et pr?s de 6 millions de fran?ais. Elle se caract?rise par une perte progressive et irr?versible de la fonction r?nale, associ?e ? des complications m?taboliques et nutritionnelles. Les principaux sympt?mes, en plus de l?alt?ration des fonctions r?nales, incluent la d?nutrition et la perte de masse adipeuse et musculaire. R?cemment, des analyses ont mis en ?vidence une association entre la s?v?rit? de cette maladie et les concentrations circulantes d?une prot?ine. Cette prot?ine est ?galement impliqu?e dans le maintien du taux de potassium dans le sang et de son acidit?. Ces deux param?tres pouvant ?tre fortement perturb?s lors de la maladie r?nale chronique, la question du r?le de cette prot?ine se pose. une alimentation enrichie en ad?nine permettra l?induction d?une maladie r?nale chronique r?nale chez des souris qui poss?dent ou non cette prot?ine et l??volution de la fonction r?nale, le d?veloppement de la fibrose, l?acidit? et le taux de potassium sanguin seront ?tudi?s, ces crit?res correspondant directement aux alt?rations observ?es chez les patients.
Bénéfices attendus
? court terme, ce projet permettra d??valuer si l?absence de la prot?ine ?tudi?e exerce un effet b?n?fique ou d?l?t?re sur les complications de la maladie r?nale chronique. Il s?agit d?un travail exploratoire dont les r?sultats pourront servir ? d?velopper un projet de plus grande ampleur. ? plus long terme, ces travaux pourraient contribuer ? l??mergence d?une nouvelle strat?gie th?rapeutique visant ? am?liorer la fonction r?nale, l??tat nutritionnel et la qualit? de vie des patients atteints de maladie r?nale chronique.
Procédures
Tous les animaux recevront un r?gime sp?cifique pour induire la pathologie ?tudi?e ou le r?gime contr?le pour une dur?e de 4 semaines (prise spontan?e). Une partie des animaux sera plac?s 2 fois en h?bergement individuel durant 48h (habituation) puis 24h (recueil) afin de r?cup?rer les urines et fec?s sur animal vigil. Une partie de ces animaux subiront un pr?l?vement de sang sous anesth?sie et analg?sie (1 fois, 5 minutes par animal). Une autre partie de ces animaux subiront une intervention chirurgicale sous anesth?sie et analg?sie sans r?veil (10 minutes par animal).Tous les animaux seront euthanasi?s par une m?thode r?glementaire sous anesth?sie et analg?sie.
Impact sur les animaux
L?induction de la maladie r?nale chronique r?duit la prise alimentaire et ralentit la croissance pond?rale, entra?nant un inconfort pendant les 4 semaines. Les effets ind?sirables des interventions pr?vues sont connus car d?j? test?s chez la souris dans d?autres contextes que celui du pr?sent projet. En fonction des groupes exp?rimentaux, certains animaux seront h?berg?s individuellement permettant ainsi de recueillir leur urine et leur f?ces. Ce type d?h?bergement g?n?re des nuisances sur les animaux car ceux-ci sont h?berg?s individuellement (stress social) et se d?placent sur une grille m?tallique de surface r?duite. En fonction des groupes exp?rimentaux, une partie des animaux subira un pr?l?vement de sang sous anesth?sie et analg?sie (risque d?arr?t cardio-respiratoire) pouvant entrainer une h?morragie (stress h?modynamique).
Devenir
En fin de proc?dure, tous les animaux sont euthanasi?s. Les analyses permettant de r?pondre ? la question scientifique, n?cessitent des pr?l?vements d?organes qui rendent incompatible leur maintien en vie. Pour ceux qui n?ont pas subi de pr?l?vements d?organes, le traitement les ayant rendus insuffisants r?naux, maladie irr?versible et incurable, les animaux seront ?galement euthanasi?s.
Remplacement
Dans la mesure du possible, le remplacement des animaux par des m?thodes alternatives (par exemple des cellules en culture) est pr?f?rable. Toutefois, seules des ?tudes sur des animaux nous permettront d??tudier les cons?quences de la maladie r?nale chronique. En effet ces processus font intervenir des syst?mes complexes qui travaillent de concert et qui agissent ?galement les uns sur les autres. L?identification de l?implication possible de ces diff?rents acteurs pourra ouvrir de nouvelles possibilit?s pour d?velopper des strat?gies th?rapeutiques novatrices.
Réduction
Ce projet a une dur?e de 4 ans, et n?cessitera l?utilisation de 480 souris. Nous avons calcul? la taille des effectifs, en nous appuyant sur notre exp?rience des m?thodes envisag?es, la connaissance de leur reproductibilit? et un calcul de puissance le nombre d?animaux au plus faible nous permettant d'obtenir des r?sultats statistiquement robustes. Nous r?duirons le nombre d?animaux en r?alisant des exp?riences sur les m?mes animaux en limitant toutefois les exp?riences qui aboutiraient ? des souffrances trop importantes et et/ou qui pourraient impacter n?gativement certains r?sultats, les rendant inexploitables. Le nombre d?animaux calcul? dans ce projet tient compte du taux de succ?s de l?induction de la maladie r?nale chronique.
Raffinement
Les animaux auront un acc?s libre ? la nourriture et ? de l?eau filtr?e, et seront plac?s dans des cages ventil?es. Leur environnement sera enrichi avec au moins deux objets : du nid v?g?tal et/ou des cylindres en carton et/ou des bouts de bois et/ou des maisons en plastique. Afin de limiter les d?sagr?ments li?s aux cages ? m?tabolisme et ? la grille, nous pla?ons une coupelle en verre de 6 cm de diam?tre ce qui permet ? la souris de dormir ou de se r?fugier sans ?tre en contact avec la grille. Nous avons v?rifi? que la majorit? des souris s?installent dans les coupelles pour dormir mais que cela ne change en rien les recueils d?urine et de f?ces. Ces cages sont situ?es sur des racks qui permettent aux souris de maintenir un lien olfactif, visuel et sonore entre elles. Afin de limiter la perte de poids li?e ? une baisse de consommation de nourriture, du chocolat en poudre est ajout? ? la celle-ci pour en augmenter l?app?tence. Par ailleurs, l?aspect g?n?ral des animaux et leur comportement (vivacit?, capacit? ? se mouvoir, propret? du pelage etc?) seront observ?s en m?me temps que la mesure du poids corporel, ces crit?res servant ? ?tablir des points limites En cas d?atteinte de ceux-ci, les animaux seront euthanasi?s pour ?viter toutes douleurs/souffrances suppl?mentaires. Les actes invasifs sont effectu?s par un personnel qualifi? et form? ? l?exp?rimentation animal et ? la chirurgie sous anesth?sie et analg?sie.
Choix des espèces
Le mod?le animal permet de r?aliser des exp?riences de physiopathologie r?nale de mammif?re en prenant en compte tous les param?tres physiologiques qui existent in vivo. Les analyses in vitro ou in silico ne sont pas suffisantes en ce qui concerne l'?tude des fonctions r?nales qui ont des effets syst?miques. Nous avons choisi de mener nos exp?riences chez la souris, car les mod?les d?invalidation des g?nes susceptibles de nous int?resser ont ?t? g?n?r?s chez la souris et pourrais nous ?tre utiles pour la suite de ce projet. Il s?agit d?animaux adultes car la maladie r?nale chronique touche particuli?rement les personnes adultes chez l?humain. De plus, ces exp?riences ont pour objectif d'?tre associ?es ou compar?es ? des exp?riences d?j? r?alis?es dans le laboratoire sur ces m?mes lign?es de souris.
Evaluation in vivo du stress oxydant c?r?bral dans un mod?le murin par une m?thode de spectroscopie et d?imagerie non invasive
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
Une partie des souris reçoit dans le cerveau des molécules destinées à y produire un stress oxydant, après une opération de vingt minutes sous anesthésie, puis passe jusqu'à deux heures sous les appareils d'imagerie. 472 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, toutes tuées à l'issue, du sang étant prélevé sous anesthésie juste avant. Il s'agit de mettre au point des molécules qui deviennent visibles en imagerie quand un stress oxydant est présent, et d'évaluer leur toxicité en prélevant les tissus après la mort. Le résumé ne nomme ni les molécules injectées, ni la région du cerveau visée, ni la nature de l'opération de vingt minutes, et ne dit pas combien de souris passent dans chacun des deux groupes.
Objectifs
Le stress oxydant correspond ? un d?s?quilibre dans l?organisme qui peut endommager les cellules et les tissus. Il joue un r?le important dans de nombreuses maladies fr?quentes comme les maladies cardiaques, certaines maladies c?r?brales ou encore les cancers. Aujourd?hui, il est difficile de d?tecter ce ph?nom?ne ? un stade pr?coce de ces maladies chez un ?tre vivant sans faire de pr?l?vements. Ce projet a pour objectif de d?velopper une nouvelle m?thode permettant de d?tecter ce stress oxydant de mani?re non invasive, c?est-?-dire sans avoir besoin d?effectuer un pr?l?vement ou une biopsie. Pour cela, nous utilisons des mol?cules sp?cialement con?ues pour devenir visibles en imagerie uniquement lorsqu?un stress oxydant est pr?sent. L??tude men?e chez la souris vise ? v?rifier si ces nouvelles mol?cules permettent de localiser et de mesurer ce ph?nom?ne dans le cerveau. Elle permettra ?galement d??valuer leur s?curit? d?utilisation. ? terme, ces travaux pourraient contribuer ? am?liorer le diagnostic pr?coce de certaines maladies et ? faciliter le d?veloppement de nouveaux traitements.
Bénéfices attendus
Ce projet a pour objectif de d?velopper de nouvelles mol?cules permettant de d?tecter le stress oxydant de mani?re non invasive, c?est-?-dire sans avoir besoin d?effectuer un pr?l?vement ou une biopsie. A court terme cette m?thode pourrait permettre de suivre un m?me individu dans le temps sans avoir recours ? des analyses n?cessitant de multiples pr?l?vements, ainsi qu?une m?thode plus fiable d??valuation du stress oxydant. Cela pourrait contribuer ? r?duire le nombre d?animaux utilis?s en recherche. ? plus long terme, cette approche pourrait am?liorer la compr?hension de nombreuses maladies fr?quentes, notamment celles qui touchent le cerveau, les maladies cardiovasculaires ou encore certains cancers. Elle pourrait aussi contribuer au d?veloppement de nouveaux traitements en permettant de mieux ?valuer leur efficacit?.
Procédures
Un groupe d'animaux subira seulement une injection de moins de 2 minutes. L'autre groupe sera soumis ? une proc?dure chirurgicale sous anesth?sie et analg?sie d'une dur?e de 20 minutes puis ? une injection et ? diff?rents examens d'imagerie non invasifs sous anesth?sie qui dureront au maximum deux heures. Pour l'ensemble des animaux, du sang sera pr?lev? sous anesth?sie g?n?rale et analg?sie (moins d'une minute) avant la mise ? mort.
Impact sur les animaux
L?injection dans le cerveau de mol?cules g?n?rant un stress oxydant cause un stress et une douleur l?g?re de courte dur?e. L?injection des mol?cules d?imagerie et l?administration d?analg?siques peuvent provoquer un stress et une douleur l?g?re de courte dur?e.
Devenir
L?ensemble des souris seront mises ? mort afin de pr?lever certains tissus pour des analyses permettant d??valuer l??ventuelle toxicit? des mol?cules utilis?es pour l?imagerie, ainsi que la r?partition de ces mol?cules dans diff?rents organes et tissus (en plus du cerveau).
Remplacement
Des ?tudes ont d?abord ?t? r?alis?es en laboratoire sur des cellules afin de v?rifier que les mol?cules utilis?es ne sont pas toxiques et pour s?lectionner les plus prometteuses. Cependant, ces mod?les ne permettent pas de reproduire le fonctionnement complet d?un organisme vivant. Ils ne permettent pas non plus de savoir comment ces mol?cules se distribuent dans le corps ni d??valuer leur comportement dans le cerveau. M?me si leur capacit? ? d?tecter le stress oxydant a d?j? ?t? d?montr?e sur des cellules, il est n?cessaire de confirmer ces r?sultats dans un organisme vivant, o? ce ph?nom?ne peut ?tre reproduit de mani?re contr?l?e. ? l?heure actuelle, il n?existe pas de m?thode alternative permettant de r?pondre ? ces questions sans avoir recours ? l?animal.
Réduction
Les effectifs ont ?t? ramen?s au minimum permettant toutefois d?avoir un effet statistique significatif. Nous avons utilis? un outil informatique pour calculer le nombre minimum d'animaux n?cessaire en utilisant les donn?es pr?liminaires.
Raffinement
Toutes les mesures sont mises en place pour limiter au maximum la douleur, le stress et l?inconfort des animaux. Les animaux re?oivent syst?matiquement des m?dicaments contre la douleur avant, pendant et apr?s les interventions. Les proc?dures chirurgicales et d?imagerie sont r?alis?es sous anesth?sie g?n?rale afin qu?ils ne ressentent pas de douleur ou de stress, et une anesth?sie locale est ?galement mise en place avant la chirurgie. Apr?s les interventions, les animaux sont surveill?s r?guli?rement jusqu?? leur r?veil, puis tout au long de l??tude afin de d?tecter rapidement tout signe de souffrance. Une grille de score est mise en place et des points limites adapt?s aux interventions ont ?t? d?finis afin de prendre en charge de mani?re pr?coce et adapt?e la douleur qui pourrait ?tre ressentie par les animaux inclus dans l??tude. En cas d?atteinte de points limites, une administration d?analg?sique sera mise en ?uvre. Enfin, des crit?res d?arr?t de souffrance ont ?galement ?t? d?termin?s et aboutiront ? la mise ? mort des animaux.
Choix des espèces
La souris est l'animal classiquement d?crit dans litt?rature pour ce type d?exp?rimentation. Dans ce projet, son utilisation est notamment li?e au fait que les ?quipements disponibles sont sp?cialement con?us pour des animaux de petite taille comme la souris ou le rat, et ne permettent pas d??tudier des esp?ces plus grandes. Une lign?e de souris ? pelage clair est utilis?e afin de faciliter les injections, qui sont ainsi plus facilement r?alis?es et moins stressantes pour les animaux. Enfin, des souris adultes pesant de 17 ? 22 g sont utilis?es car leur taille est adapt?e aux appareils d?imagerie employ?s, permettant de r?aliser les examens dans des conditions ad hoc.
Vaccin th?rapeutique contre le carcinome de Merkel dans un mod?le murin
- Recherche appliquée
- Cancers
Les souris rejoignent l'évaluation des vaccins une fois leur tumeur parvenue à 150 mm3. 40 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue, pour tester des vaccins contre le carcinome à cellules de Merkel. Huit servent d'abord à caler la dose de cellules tumorales, les trente-deux autres reçoivent une injection de cellules tumorales sous la peau puis quatre injections vaccinales espacées d'une semaine, avant d'être tuées vingt-huit jours plus tard. Le porteur indique qu'une graine de tournesol ou une cacahuète est proposée après chaque injection, et justifie l'effectif de huit souris par lot par une puissance statistique suffisante, sans donner de calcul.
Objectifs
Le carcinome ? cellules de Merkel (CCM) est un cancer rare et agressif de la peau qui touche principalement les personnes ?g?es de plus de 65 ans et les personnes dont le syst?me immunitaire est affaibli. Sa fr?quence augmente progressivement et la survie des patients ? 5 ans reste limit?e. Lorsque la maladie est avanc?e et ne peut pas ?tre trait?e par chirurgie, les possibilit?s th?rapeutiques restent encore insuffisantes pour obtenir des r?ponses durables chez tous les patients. L'objectif de ce projet est de d?velopper et d'?valuer de nouveaux vaccins th?rapeutiques capables d'aider le syst?me immunitaire ? reconna?tre et ? ?liminer les cellules tumorales du carcinome ? cellules de Merkel. Pour cela, des souris seront utilis?es afin de reproduire la maladie et d'?tudier l'efficacit? de diff?rents vaccins candidats. Apr?s l'apparition des tumeurs, les animaux recevront soit un vaccin candidat, soit une pr?paration contr?le. L'?volution de la taille des tumeurs sera ensuite suivie afin de d?terminer si ces nouveaux traitements permettent de ralentir ou de r?duire leur d?veloppement.
Bénéfices attendus
Cette ?tude vise ? ?valuer une nouvelle strat?gie th?rapeutique pour les carcinomes ? cellules de Merkel (CCM) dus au MCPyV pr?sentant une r?sistance primaire ou acquise aux immunoth?rapies actuellement disponibles. L'efficacit? de cette approche sera appr?ci?e au travers de sa capacit? ? ralentir la croissance tumorale, ? r?duire le volume des tumeurs, voire ? obtenir une r?gression tumorale. Au-del? de ce projet, ce travail permettra de valider le potentiel d?une plateforme vaccinale fond?e sur l'utilisation de la capside du virus de l'h?patite B comme vecteur d'antig?nes. Cette d?monstration de preuve de concept pourrait ouvrir la voie au d?veloppement de nouvelles strat?gies vaccinales th?rapeutiques applicables ? d'autres cancers ou ? des maladies infectieuses.
Procédures
L'ensemble des animaux exp?rimentaux recevront une injection sous-cutan?e de cellules tumorales (proc?dure 1) ou dans le cadre de la proc?dure 2 une injection sous-cutan?e de cellules tumorales et 4 injections sous-cutan?es de pr?parations vaccinales espac?es d?une semaine (J0, 7, 14, 21).
Impact sur les animaux
Les contraintes pour les animaux au cours de cette ?tude seront principalement li?es au stress occasionn? par les manipulations et les contentions, ainsi qu'? une douleur l?g?re et temporaire associ?e aux injections r?alis?es pour l'implantation des tumeurs et l'administration des vaccins candidats. Ces interventions seront de courte dur?e (moins de 20 secondes par injection et par manipulation). Le volume maximal des tumeurs ainsi que leur localisation ont ?t? choisis afin de limiter autant que possible l'impact sur les d?placements et les activit?s normales des animaux. Toutefois, le d?veloppement des tumeurs peut entra?ner une alt?ration de l'?tat g?n?ral des souris, pouvant se traduire par une perte de poids, une diminution de la mobilit? ou une baisse de la r?activit?. Les animaux feront l'objet d'une surveillance r?guli?re afin de limiter leur inconfort et d'intervenir d?s l'apparition de signes de souffrance.
Devenir
Proc?dure 1 : Les 8 souris utilis?es pour d?terminer la dose de cellules tumorales ? injecter seront euthanasi?es au plus tard ? J28 apr?s l'implantation des cellules tumorales, ou avant ce d?lai si un point limite d?fini dans le protocole est atteint. Proc?dure 2 : Les 32 souris utilis?es pour l'?valuation des vaccins candidats seront incluses dans l'?tude apr?s atteinte d'un volume tumoral de 150 mm?. Elles seront euthanasi?es ? J28 apr?s la premi?re injection de pr?paration vaccinale, ou plus t?t si elles atteignent un point limite exp?rimental. Les pr?l?vements r?alis?s apr?s euthanasie permettront l'analyse des tumeurs et des organes internes afin d'?valuer la r?ponse immunitaire induite et l'efficacit? des traitements.
Remplacement
Malgr? les progr?s r?alis?s dans le d?veloppement d'organo?des int?grant des cellules du syst?me immunitaire, ces mod?les ne permettent pas, ? ce jour, de reproduire l'ensemble des m?canismes impliqu?s dans l'induction et le d?veloppement d'une r?ponse immunitaire adaptative. L'?valuation de l'efficacit? d'une vaccination th?rapeutique n?cessite donc le recours ? un animal immunocomp?tent, seul capable de d?velopper une r?ponse immunitaire int?gr?e, faisant intervenir l'ensemble des populations cellulaires et des m?canismes effecteurs observ?s chez l'Homme.
Réduction
Le nombre d'animaux n?cessaires dans chaque groupe exp?rimental a ?t? d?termin? afin d'obtenir une puissance statistique suffisante tout en limitant le nombre d'animaux utilis?s conform?ment au principe de R?duction (8/lot)
Raffinement
Les injections r?alis?es par voie sous-cutan?e sont des proc?dures rapides, associ?es ? une douleur faible et transitoire. Le geste technique est parfaitement ma?tris? par les personnels impliqu?s dans la manipulation des animaux, limitant ainsi le stress et l'inconfort li?s aux interventions. Afin de favoriser une exp?rience positive lors des manipulations, une r?compense alimentaire (graine de tournesol ou cacahu?te) sera propos?e aux souris apr?s chaque injection, qu'il s'agisse de l'administration des cellules tumorales ou des pr?parations vaccinales. - Mise en place de points limites grad?s : une grille d??valuation des points limite a ?t? cr??e prenant en compte l?apparence g?n?rale, l?activit?, le poids corporel, le volume et l?aspect de la tumeur, la g?ne locomotrice li?e au d?veloppement de la tumeur et l??tat clinique global. En fonction de l??volution de ces diff?rents signes, la surveillance des animaux sera renforc?e et une prise en charge sera adapt?e.
Choix des espèces
La souris repr?sente l'animal classiquement d?crit dans litt?rature, pour ce type d?exp?rimentation. L'utilisation de ce mod?le nous permettra de valider nos observations dans un syst?me immunocomp?tent ce qui est essentiel pour envisager un d?veloppement chez l'humain par la suite. Les souris arriveront au stade 6 semaines et seront incluses dans l??tude ? 7 semaines apr?s une semaine d'acclimatation. A cet ?ge, le syst?me immunitaire est mature et permet d?avoir des r?ponses immunitaires optimales.
Développement d’un modèle murin humanisé du système immunitaire cérébral pour la recherche en neurosciences
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
Choisies pour ne pas rejeter les cellules humaines qu'on leur greffe, 120 souris reçoivent chacune une injection de cellules immunitaires humaines dans le cerveau, au cours d'une chirurgie de quarante-cinq à soixante minutes sous anesthésie générale. Les procédures sont déclarées d'un niveau de souffrance modéré et toutes les souris seront tuées. Entre l'opération et la fin de l'étude, elles sont pesées deux fois par semaine et saignées tous les quinze jours sous anesthésie, à la jugulaire, à la saphène ou à la queue. Le porteur indique que l'injection de cellules humaines dans le cerveau peut provoquer une inflammation locale ou des troubles neurologiques, une perte d'équilibre ou de coordination, et que le liquide céphalo-rachidien est prélevé juste avant la mise à mort.
Objectifs
Le cerveau contient des cellules immunitaires spécialisées, appelées microglies, qui jouent un rôle essentiel dans son bon fonctionnement. Elles participent à la protection du cerveau contre les infections, éliminent les cellules endommagées et contribuent au maintien de l'équilibre du système nerveux. De nombreuses études ont montré que ces cellules sont également impliquées dans plusieurs maladies neurologiques, comme la maladie d'Alzheimer, la maladie de Parkinson ou certaines maladies inflammatoires du cerveau. L'objectif de ce projet est de développer un nouveau modèle de souris dans lequel des cellules immunitaires humaines du cerveau pourront être implantées et étudiées. Ce modèle permettra de mieux comprendre le comportement de ces cellules dans un organisme vivant et d'observer leur capacité à survivre, à se développer et à s'intégrer dans le cerveau. Les différentes sources de cellules humaines seront comparées afin d'identifier celle qui permet d'obtenir le modèle le plus fiable et le plus représentatif de la biologie humaine. Des analyses seront ensuite réalisées pour vérifier que les cellules implantées sont présentes dans le cerveau et qu'elles présentent les caractéristiques attendues. À terme, ce modèle pourra être utilisé pour améliorer la recherche sur les maladies neurologiques et faciliter le développement de nouveaux traitements. Il contribuera également à disposer de modèles expérimentaux plus proches de la biologie humaine, ce qui pourrait améliorer la qualité des études précliniques et favoriser le développement de thérapies plus efficaces pour les patients.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de mettre au point un modèle de recherche plus représentatif du fonctionnement des cellules immunitaires humaines du cerveau que les modèles actuellement disponibles. Les connaissances acquises aideront les chercheurs à mieux comprendre le rôle de ces cellules dans le fonctionnement normal du cerveau et dans le développement de certaines maladies neurologiques. À moyen terme, ce modèle pourra être utilisé pour étudier les mécanismes impliqués dans des maladies telles que la maladie d'Alzheimer, la maladie de Parkinson, la sclérose en plaques ou d'autres maladies inflammatoires et neurodégénératives. Il pourra également servir à évaluer de nouvelles approches thérapeutiques avant leur utilisation chez l'Homme. Le modèle développé dans ce projet pourra être réutilisé dans d'autres travaux de recherche sur les maladies du système nerveux central. Il constituera un outil utile pour la communauté scientifique et contribuera à améliorer les connaissances sur le rôle des cellules immunitaires du cerveau, avec pour objectif à long terme de favoriser le développement de traitements plus efficaces au bénéfice des patients.
Procédures
Chaque souris subira une seule intervention chirurgicale sous anesthésie générale (45 à 60 minutes). Les animaux seront pesés (moins de 5 min, deux fois par semaine) Les prélèvements sanguins seront effectués tous les 15 jours sous anesthesie par une des voies suivantes • Jugulaire (moins d’1 min) • Saphène (moins d’3 min) • Queue (moins d’1 min) Le prélèvement de liquide cephalo-rachidien sera réalisé juste avant la mise à mort de l’animal. Les prélèvements de tissus/organes seront réalisés post-mortem.
Impact sur les animaux
Les animaux pourraient ressentir un inconfort lié aux différentes étapes de l'étude. La randomisation pour former des groupes homogènes peut entrainer un stress de 1-2j lié au changement de congénères L'intervention chirurgicale réalisée sous anesthésie générale peut entraîner une douleur légère à modérée au niveau de la zone opérée pendant quelques jours, ainsi qu'une diminution temporaire de l'activité ou de l'appétit. Des médicaments contre la douleur seront administrés afin de limiter ces effets. Les prélèvements de sang peuvent provoquer un inconfort de courte durée au moment de la manipulation et de la ponction. Le régime alimentaire utilisé pour préparer les animaux à la transplantation est généralement bien toléré, mais une légère baisse de la consommation alimentaire ou une perte de poids modérée peut parfois être observée. Dans de rares cas, l'injection de cellules humaines dans le cerveau peut entraîner des complications, telles qu'une inflammation locale ou l'apparition de troubles neurologiques (par exemple une diminution de l'équilibre, de la coordination ou de l'activité). Bien que ces effets soient peu fréquents, les animaux feront l'objet d'une surveillance attentive tout au long de l'étude. Les souris seront observées chaque jour afin de détecter rapidement tout signe de douleur, de souffrance ou de mauvaise récupération. Si un animal présente une altération importante de son état de santé ou des signes indiquant qu'il pourrait souffrir de manière durable, il recevra les soins appropriés. Si son bien-être ne peut pas être rétabli, il sera euthanasié de façon à éviter toute souffrance inutile.
Devenir
Après les procédures, les animaux seront mis à mort afin de pouvoir procéder à la récupération des organes, de sang, et de liquide cephalo-rachidien nécessaires pour évaluer la réussite de la transplantation
Remplacement
Avant de recourir aux animaux, des méthodes alternatives, telles que des cultures de cellules humaines produites en laboratoire sont utilisées. Ces méthodes permettent d'étudier certaines caractéristiques des cellules et de vérifier leur qualité avant leur utilisation. Cependant, l'objectif de ce projet est de comprendre comment ces cellules humaines survivent, se déplacent, s'intègrent et fonctionnent dans le cerveau au sein d'un organisme vivant. Il est également nécessaire d'étudier leurs interactions avec les autres cellules du cerveau et de mesurer certains marqueurs biologiques présents dans le sang ou le liquide entourant le cerveau. À l'heure actuelle, aucune méthode alternative ne permet de reproduire l'ensemble de ces phénomènes complexes. Le recours aux animaux est donc indispensable pour répondre aux objectifs scientifiques du projet. Les expérimentations sont limitées au strict nécessaire et ne sont réalisées que lorsque les informations recherchées ne peuvent pas être obtenues par d'autres méthodes. Les connaissances acquises grâce à ce projet pourraient également contribuer, à terme, au développement de modèles expérimentaux plus performants et permettre de réduire encore davantage le recours aux animaux dans les recherches futures.
Réduction
Le nombre d'animaux utilisés dans ce projet a été limité au minimum nécessaire pour obtenir des résultats fiables. Il a été déterminé à partir des connaissances scientifiques disponibles. Chaque animal fournit un grand nombre d'informations. Plusieurs analyses différentes seront réalisées à partir des mêmes prélèvements de sang, de liquides biologiques et de tissus, ce qui permet d'éviter d'utiliser des groupes supplémentaires d'animaux. De plus, les mêmes souris seront suivies tout au long de l'étude grâce à des prélèvements réalisés à différents moments, ce qui permet d'observer l'évolution des cellules transplantées sans avoir à utiliser de nouveaux animaux à chaque étape. Les procédures expérimentales ont été soigneusement préparées et seront réalisées par du personnel qualifié afin de limiter les échecs techniques qui pourraient conduire à répéter les expériences.
Raffinement
Le bien-être des animaux est pris en compte à chaque étape du projet afin de limiter autant que possible la douleur, le stress et l'inconfort. Les souris sont hébergées dans des conditions adaptées à leurs besoins, avec de la nourriture et de l'eau à volonté, des matériaux leur permettant de construire un nid, des abris et un environnement favorisant leurs comportements naturels. Elles bénéficient d'une période d'adaptation avant le début des expériences. Toutes les interventions sont réalisées par du personnel spécialement formé. La greffe est effectuée sous anesthésie générale et des médicaments contre la douleur sont administrés avant et après l'intervention afin de limiter l'inconfort. Les animaux sont maintenus au chaud pendant leur réveil et leur état est surveillé attentivement jusqu'à leur récupération complète. Pendant toute la durée de l'étude, les souris sont observées quotidiennement afin de vérifier leur état de santé, leur comportement, leur alimentation et leur poids. Une surveillance renforcée est mise en place après la chirurgie. Si un animal présente des signes de douleur, de souffrance ou une altération de son état de santé, il reçoit rapidement les soins appropriés. Lorsque son bien-être ne peut plus être assuré ou que son état risque de se dégrader, il est euthanasié sans attendre la fin de l'étude afin d'éviter toute souffrance inutile.
Choix des espèces
La souris a été choisie car il s'agit de l'espèce la plus utilisée et la mieux connue pour étudier le fonctionnement de cellules humaines dans un organisme vivant. Elle partage de nombreuses caractéristiques biologiques avec l'Homme, ce qui en fait un modèle particulièrement utile pour comprendre certaines maladies et développer de nouvelles approches thérapeutiques. Les souris utilisées dans ce projet présentent également des caractéristiques particulières qui permettent l'implantation de cellules humaines sans qu'elles soient rejetées, ce qui est indispensable pour atteindre les objectifs de l'étude. Les animaux seront utilisés au stade de jeune adulte, à l'âge d'environ huit semaines. À cet âge, le cerveau est complètement développé et fonctionne de manière stable. Cela permet d'étudier dans de bonnes conditions l'implantation, la survie et le comportement des cellules humaines greffées, tout en limitant les variations liées à la croissance ou au vieillissement. Les jeunes souris adultes récupèrent également généralement mieux après une intervention chirurgicale que les animaux plus âgés, ce qui contribue à limiter les contraintes liées aux procédures expérimentales et à améliorer leur bien-être.
Évaluation de la capacité du microbiote intestinal de donneurs humains, de différents niveaux d’entraînement physique, à moduler la susceptibilité et la sévérité d’une colite induite par le Dextran Sulfate de Sodium (DSS) chez la souris.
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
Vidées de leur flore intestinale par un cocktail d'antibiotiques à large spectre, gavées du microbiote fécal de donneurs humains, puis exposées au dextran sulfate de sodium pour déclencher une colite, 67 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue après un prélèvement sanguin terminal par ponction intracardiaque. Les procédures sont déclarées d'un niveau de souffrance sévère. Le projet cherche à savoir si le microbiote de donneurs plus ou moins entraînés physiquement change la gravité de la colite, la souris servant d'intermédiaire entre une étude clinique menée sur des humains et ses conclusions. Le porteur écrit que "Les effets attendus sont modérés et limités à la durée du traitement", puis qu'aucun soin pharmacologique n'est possible et que les souris atteignant un point limite seront tuées.
Objectifs
Les Maladies Inflammatoires Chroniques de l’Intestin (MICI), comprenant la maladie de Crohn et la rectocolite hémorragique, touchent environ 7 millions de personnes dans le monde. Elles se caractérisent par des lésions digestives discontinues pour la première et une inflammation colique continue pour la seconde. Leur origine reste partiellement inconnue, mais elles résultent d’une réponse inflammatoire inappropriée chez des individus génétiquement prédisposés, influencée par des facteurs environnementaux, une dysbiose du microbiote intestinal et une altération de la barrière intestinale. L’activité physique (AP) est aujourd’hui reconnue comme un levier thérapeutique, notamment dans la prévention des maladies chroniques, et influence également le microbiote intestinal. Plusieurs études, dont une de notre laboratoire, ont montré un lien entre niveau d’entraînement et signatures microbiennes. Une AP modérée à élevée est associée à une plus grande diversité microbienne et à une production accrue de métabolites bénéfiques, tandis que la sédentarité ou un entraînement très intensif peuvent altérer ces fonctions. Cependant, le rôle exact de l’AP dans le développement et l’évolution des MICI reste encore mal compris. Dans ce cadre, nous menons une étude clinique visant à caractériser le microbiote intestinal en lien avec la capacité cardiovasculaire et le profil métabolique à l’exercice chez des individus de niveaux d’activité variés. En parallèle, une étude préclinique repose sur la transplantation de microbiote fécal de ces participants chez des souris, suivie de l’induction d’une colite chimique. Afin de de permettre l’étude du rôle causal du microbiote intestinal dans la susceptibilité aux maladies inflammatoires chroniques de l’intestin, les souris recevront dans un premier temps un cocktail d’antibiotiques à large spectre. Cette étape permet une déplétion importante du microbiote résident, réduisant la variabilité interindividuelle et créant une niche écologique disponible pour une recolonisation contrôlée. Puis, les animaux recevront une transplantation de microbiote fécal issu de donneurs humains présentant des profils distincts liés au niveau d’activité physique, permettant d’établir des microbiotes expérimentaux différenciés. Enfin, les animaux recevront une transplantation de microbiote fécal issu de donneurs humains présentant des profils distincts liés au niveau d’activité physique, permettant d'établir des microbiotes expérimentaux différenciés.
Bénéfices attendus
Les résultats obtenus dans le cadre de cette étude permettront de déterminer si une relation existe entre une signature bactérienne et fonctionnelle retrouvée chez les populations de différents niveaux d’entraînement et la susceptibilité de la réponse à une colite induite. Sur le plan de la santé, cette étude permettra d’identifier des profils ayant des signatures bactériennes et fonctionnelles pour 1) mieux comprendre les mécanismes d’apparition ou non des MICI et 2) développer des stratégies de prévention et de prise en charge personnalisées de ces maladies, fondées sur la modulation du microbiote intestinal.
Procédures
Aucune intervention chirurgicale n'est prévue. Des prélèvements fécaux non-invasifs seront réalisés chez les animaux (durée de la manipulation : moins d'une minute), un prelèvement sanguin de 100 μL et un prelèvement terminal intra-cardiaque avant la mise à mort. Les animaux subiront également le gavage oral pour la transplantation du microbiote fécale (FMT) des sujets humains et l’induction de la colite par le Dextran Sodium Sulfate.
Impact sur les animaux
Le traitement par antibiotiques à large spectre est administré à des doses extrapolées de celles utilisées en clinique humaine et ajustées au modèle animal. Les effets attendus sont modérés et limités à la durée du traitement. Ils comprennent, pour le traitement antibiotique, une déplétion du microbiote intestinal pouvant entraîner une modification temporaire du transit et une diminution de la fermentation bactérienne. Le gavage de suspension de microbiote peut induire un stress aigu transitoire lié à la manipulation ainsi qu’une possible fausse route. Enfin, l’induction de la colite par DSS entraîne des effets dose-dépendants incluant une perte de poids, une modification du transit intestinal (diarrhée), et une inflammation colique transitoire associée à une altération de la barrière épithéliale Les procédures de gavage peuvent engendrer un stress transitoire chez les animaux. Le traitement au Dextran Sodium Sulfate (DSS) peut induire des troubles gastro-intestinaux tels qu’une diarrhée et une inflammation intestinale transitoire, pouvant entraîner une perte de poids et une diminution de la prise alimentaire. Ces effets sont attendus, surveillés et limités dans le temps.
Devenir
A la fin de ces protocoles expérimentaux, les animaux seront euthanasiés. La mise à mort des animaux est indispensable à l’étude pour avoir accès aux différents organes. L’objectif sera entre autres de réaliser des analyses histologiques et moléculaires sur ces tissus.
Remplacement
L’objectif de ce projet est d’étudier les interactions dynamiques entre le microbiote intestinal de différentes signatures fonctionnelles et bactériennes et la réponse à la colite induite sur la physiogie de la barrière intestinale de l’hôte. Ces phénomènes impliquent des réponses systémiques, des interactions multi-organes et des adaptations physiologiques complexes. Il n’existe, à ce jour, aucun modèle in vitro ou ex vivo permettant de reproduire fidèlement ces interactions intégrées et mimer la colite. Le recours à l’expérimentation animale est donc indispensable pour répondre aux objectifs scientifiques du projet.
Réduction
Le nombre d’animaux a été déterminé afin de permettre la mise en évidence d’une différence de sévérité de la colite entre les groupes expérimentaux, évaluée à partir de critères cliniques incluant la perte de poids, la consistance des selles et la présence de saignements. L’étude comprend cinq groupes expérimentaux. Afin de limiter le nombre d’animaux utilisés, le donneur de microbiote est considéré comme l’unité de réplication biologique. Plusieurs souris recevront le microbiote d’un même donneur, ce qui permet de prendre en compte la variabilité technique liée à la transplantation tout en réduisant le nombre total d’animaux. Par ailleurs, une procédure pilote sera réalisée sur 9 animaux (3 par groupe) afin d’évaluer la faisabilité du modèle et d’ajuster les conditions expérimentales. Cette étape permettra notamment de suivre la tolérance, la cinétique de perte de poids et la sévérité clinique, sans objectif de démonstration statistique. Elle vise à réduire le risque d’échec de la procédure principale et à éviter l’utilisation inutile d’animaux supplémentaires.
Raffinement
Les animaux seront hébergés à 2 animaux par cage. Des jouets seront introduits afin de minimiser le stress induit par les différents traitements. Le raffinement est complété par une surveillance journalière des animaux pour s'assurer que les conditions de bien-être sont respectées. Un questionnaire pour mesurer le niveau d’inconfort des rongeurs est mis à disposition dans les locaux. En cas de souffrance ou inconfort constaté, toutes les mesures nécessaires pour réduire la souffrance seront mises en place. Compte tenu de la pathologie développée dans ce projet et de l’impossibilité de recourir à des soins pharmacologiques, les animaux présentant un inconfort lié à au moins l’un des points limites seront euthanasiés.
Choix des espèces
La souris constitue un modèle approprié pour l’étude du microbiote et de la barrière intestinale en raison : •De sa facilité de manipulation •De son homogénéité génétique Nous disposons par ailleurs de précédentes expériences validant l'usage d'un traitement antibiotique à large spectre ainsi qu’une transplantation du microbiote fécal du l’Homme vers l’animal chez cette espèce. Les animaux seront âgés de 7 semaines au début de l'expérimentation. Pour étudier l'effet de la flore intestinale sur la susceptibilité de la réponse à la colite induite, il faut disposer d'animaux adultes dont le développement de la barrière intestinale et du système immunitaire est stabilisé.
Amélioration de la réponse à la stimulation ovarienne chez la ratte Wistar par immunothérapie
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
- Troubles urogénitaux
- Recherche fondamentale
- Système urogénital
Injectées dans l'abdomen à répétition, soumises à des frottis vaginaux et à des prises de sang hebdomadaires, 120 rattes Wistar subissent une stimulation ovarienne destinée à tester un anticorps censé augmenter le nombre d'ovocytes récoltés. Les procédures sont déclarées d'un niveau de souffrance modéré, et toutes les rattes seront tuées pour des prélèvements d'organes destinés à des analyses morphologiques, histologiques et endocriniennes. Le porteur signale un risque de passage de liquide vers la cavité abdominale, suivi par dosage de l'hématocrite, et un point limite fixé à 15 % de perte de poids qui déclenche la mise à mort. Il écrit par ailleurs que "La stimulation ovarienne est une procédure courante sans effets secondaires rapportés".
Objectifs
L’objectif du projet est d’améliorer la réponse à la stimulation ovarienne. En effet, les échecs de procréation in vitro sont souvent dus à une mauvaise réponse des patientes à la stimulation ovarienne lors de leur prise en charge en assistance médicale à la procréation. L'hormone anti-Müllérienne est un des principaux régulateur des différentes étapes de la folliculogénèse. C'est pourquoi, nous avons développé un anticorps bloquant anti AMH et nous avons montré qu’un traitement avec cet anticorps est capable d’induire une ovulation chez des rattes anovulantes. Nous prévoyons maintenant de tester si cet anticorps pourrait augmenter le nombre d’ovocytes récoltés après une stimulation ovarienne chez des rates Wistar ovulantes.
Bénéfices attendus
Le projet a pour but d'améliorer la prise en charge des patientes répondant mal à la stimulation ovarienne en procréation médicalement assistée. Actuellement, en cas de mauvaise réponse à la stimulation ovarienne, les doses de gonadotropines sont augmentées ainsi que le nombre de stimulations ovariennes mais souvent sans qu'une amélioration du nombre d’ovocytes récoltés soit observée. La seule alternative pour ces patientes est alors le don ovocytes.
Procédures
Les animaux subiront au maximum un prélèvement de sang par semaine d’un volume inférieur à 5 % du volume sanguin total soit 2 à 4 prélèvements en fonction du protocole. Les animaux seront traités par des injections intra-péritonéale d’anticorps. Nous privilégions cette voie d'administration car nos tests précédent avec des injections en sous cutanée donnaient de moins bons résultats. Ce type de traitement avec des injections répétées d’anticorps anti-AMH a déjà été réalisé sur une durée plus longue (1 mois) sans effet secondaire. La stimulation ovarienne est une procédure courante sans effets secondaires rapportés.
Impact sur les animaux
Pour le suivi du cycle ovarien par la méthode des frottis vaginaux ainsi que pour l'injection intra péritonéale et les prélèvements sanguins, les femelles sont préalablement habituées à la contention par les expérimentateurs habilités. Pour les prélèvements sanguins, le volume de sang prélevé à chaque prise de sang (2 maximum, 1 par semaine) sera toujours en dessous du volume maximal autorisé (5% du volume sanguin total).
Devenir
Toutes les procédures conduiront à la mort des animaux afin d'effectuer les prélèvements d'organes nécessaires aux analyses morphologiques, histologiques, endocriniennes ...
Remplacement
Sur le plan scientifique, il est impossible de remplacer ces animaux par des systèmes ex vivo, in vitro ou in silico. L’anticorps anti-AMH utilisé dans ce projet est une IgG de rat, développée et validée dans cette espèce, notamment dans des modèles de dysfonction ovarienne. De plus, le fait que le rat ait une réponse plus modérée que la souris à la stimulation ovarienne en fait un meilleur modèle pour mettre en évidence une augmentation du nombre d'ovocyte après stimulation ovarienne comme nous l'avons déjà observé. L’utilisation de rattes permet ainsi de s’appuyer sur des données préexistantes robustes concernant sa spécificité, son efficacité et sa tolérance. De plus, la nature homologue de cet anticorps garantit une compatibilité optimale avec l’espèce étudiée et limite le risque de réponse immunitaire anti-anticorps lors d’administrations répétées. À l’inverse, son utilisation chez la souris pourrait induire une réponse immune dirigée contre cet anticorps hétérologue, ainsi qu’une incertitude quant à sa capacité à reconnaître et bloquer efficacement sa cible. Enfin, un changement d’espèce nécessiterait des études préalables de validation, impliquant l’utilisation d’animaux supplémentaires, ce qui serait contraire au principe de Réduction. La voie intrapéritonéale a été retenue sur la base de données expérimentales préalables issues de notre équipe, ayant montré une meilleure efficacité de l’anticorps anti-AMH par rapport à la voie sous-cutanée. L’utilisation de la voie sous-cutanée entraînerait ainsi une diminution de l’efficacité du traitement et une variabilité accrue des réponses, nécessitant une augmentation du nombre d’animaux pour atteindre une puissance statistique suffisante, ce qui irait à l’encontre du principe de Réduction. La voie intra-veineuse n'a jamais été testée car la majorité de nos protocoles incluent des injections répétées. Il faudrait tester cette nouvelle voie d'injection ce qui augmenterait le nombre d'animaux et irait à l’encontre du principe de Réduction. Les injections intrapéritonéales seront réalisées par du personnel formé et expérimenté, dans le respect des bonnes pratiques (choix du matériel adapté, volumes conformes aux recommandations, contention appropriée). Une surveillance clinique régulière des animaux sera assurée afin de détecter précocement tout signe d’inconfort, conformément au principe de Raffinement.
Réduction
Le projet comporte trois protocoles expérimentaux distincts visant à évaluer l’effet du schéma d’administration de l’anticorps anti-AMH sur la réponse à la stimulation ovarienne (1, 3 ou 4 injections). Chaque protocole comprend deux groupes (IgG témoin vs anticorps anti-AMH), avec un effectif de 20 animaux par groupe (soit 40 animaux par protocole).Les effectifs ont été déterminés sur la base de nos données préalables et de la variabilité observée dans ce modèle de ratte, déjà caractérisé dans notre équipe. Ces données permettent d’estimer de manière fiable le nombre d’animaux nécessaire pour mettre en évidence des différences biologiquement pertinentes, tout en garantissant une puissance statistique suffisante. La taille des groupes a ainsi été définie de manière à éviter à la fois un sous-dimensionnement (conduisant à des résultats non conclusifs et à la répétition des expériences) et un surdimensionnement (utilisation excessive d’animaux), conformément au principe de Réduction. Les trois protocoles correspondent à des schémas d’administration distincts et complémentaires, nécessaires pour répondre à la question scientifique posée. Leur dissociation permet d’éviter l’introduction de facteurs de confusion expérimentaux. Par ailleurs, plusieurs paramètres biologiques seront analysés chez les mêmes animaux, permettant de maximiser les données obtenues par individu. Les conditions expérimentales seront standardisées afin de limiter la variabilité interindividuelle et ainsi optimiser les effectifs requis. Les analyses statistiques seront adaptées à la distribution des données (tests paramétriques ou non paramétriques), afin d’optimiser la détection des différences entre groupes sans augmentation du nombre d’animaux.
Raffinement
Les animaux seront habitués à la manipulation en amont des procédures expérimentales afin de réduire le stress lié aux interventions. Les prélèvements sanguins seront réalisés dans le respect des recommandations en vigueur, en limitant les volumes à moins de 5 % du volume sanguin total et en espaçant suffisamment les prélèvements afin d’éviter toute altération de l’état général des animaux. Les injections intrapéritonéales, susceptibles d’induire une gêne locale, seront réalisées par du personnel formé et expérimenté, avec du matériel adapté et dans des conditions de contention maîtrisées, afin de minimiser la douleur et le stress. Un suivi clinique quotidien des animaux sera réalisé afin de détecter précocement tout signe d’inconfort ou de douleur (altération de l’état général, prostration, poils hirsutes, irritation au point d’injection, perte de poids). En cas d’apparition de tels signes, les animaux feront l’objet d’une surveillance renforcée et, si nécessaire, de mesures correctives telles que l’adaptation des conditions d’hébergement ou une réduction des manipulations. En cas de signes cliniques persistants, les animaux pourront être retirés du protocole expérimental et exclus de l’analyse, afin de préserver leur bien-être. Un point limite sera appliqué en cas de perte de poids supérieure à 15 % du poids initial, conduisant à la mise à mort de l’animal afin d’éviter toute souffrance prolongée. Par ailleurs, des administrations répétées d’anticorps par voie intrapéritonéale (toutes les 48 h pendant 15 jours) ont déjà été réalisées dans notre équipe sans impact observable sur le bien-être des rattes. Afin de renforcer le suivi du raffinement, des dosages de marqueurs biologiques seront réalisés avant et après traitement, incluant notamment des paramètres de tolérance générale (ALAT, ASAT pour la fonction hépatique). Un hématocrite sera également mesuré en fin de protocole. En effet, dans le contexte de stimulation ovarienne, une réponse excessive au traitement peut entraîner une augmentation de la perméabilité vasculaire, à l’origine d’un passage de liquide vers la cavité abdominale (ascite). Ce phénomène peut être associée à une altération de l’état général des animaux. L’élévation de l’hématocrite constitue ainsi un indicateur indirect de cette situation. En cas d'anomalies biologiques, les animaux concernés feront l'objet d'une surveillance renforcée, et pourront être retirés du protocole ou mis à mort.
Choix des espèces
La rate Wistar est un modèle validé pour l’étude de la physiologie de la reproduction et de la stimulation ovarienne. Son cycle œstral court (4–5 jours), bien caractérisé et reproductible, permet une analyse fine des mécanismes hormonaux et folliculaires. Les profils endocriniens présentent des similitudes fonctionnelles avec ceux observés chez l’humain, conférant à ce modèle une bonne pertinence biologique. À ce jour, aucun modèle in vitro ou in silico ne permet de reproduire de manière intégrée les interactions entre l’axe hypothalamo-hypophyso-ovarien et l’environnement systémique nécessaires à l’étude de la réponse à une stimulation hormonale. L’anticorps anti-AMH utilisé a été développé et validé chez le rat. Son utilisation chez la souris exposerait à un risque de réponse immunitaire et nécessiterait des études de validation supplémentaires, impliquant l’utilisation d’animaux additionnels, ce qui serait contraire au principe de Réduction. Femelles adultes de 2 à 4 mois, correspondant au début de l’âge adulte lorsque le stock d’ovocyte est encore important.
?tude du r?le des fibroblastes tumoraux dans la r?sistance aux chimioth?rapies et aux immunoth?rapies dans le cancer de la peau
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Dix-huit semaines d'applications de substances destinées à faire pousser des tumeurs sur la peau du dos pour une première procédure, dix pour une seconde : 714 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère, toutes tuées à l'issue. Les tumeurs cutanées provoquent des rougeurs, un épaississement de la peau, des croûtes, parfois une ulcération ou une infection locale, et peuvent devenir assez volumineuses pour gêner les déplacements. Il s'agit de savoir si le blocage de certains fibroblastes du voisinage de la tumeur ralentit la maladie et rend les immunothérapies plus efficaces. Le porteur justifie le choix de la souris par son statut de référence dans l'étude des cancers de la peau et par son système immunitaire intact, qu'il présente comme la condition pour étudier les réponses aux immunothérapies.
Objectifs
Ce projet vise ? mieux comprendre pourquoi certains cancers de la peau r?sistent aux traitements, notamment aux immunoth?rapies, qui stimulent les d?fenses naturelles de l'organisme contre les cellules canc?reuses. Nous ?tudierons, chez la souris, le r?le de cellules normales pr?sentes autour de la tumeur, appel?es fibroblastes. Ces cellules participent ? l'organisation et au fonctionnement du tissu tumoral. Nos travaux sugg?rent que certaines favorisent la croissance de la tumeur en cr?ant un environnement protecteur autour des cellules canc?reuses, tandis que d'autres limitent l'action des cellules immunitaires charg?es de d?truire la tumeur. L'objectif est de d?terminer comment ces diff?rentes populations de fibroblastes contribuent ? la r?sistance des cancers de la peau aux traitements, qu'il s'agisse des immunoth?rapies ou des chimioth?rapies. Une meilleure compr?hension de ces m?canismes pourrait permettre, ? terme, de d?velopper de nouvelles strat?gies th?rapeutiques afin d'am?liorer l'efficacit? des traitements chez les patients atteints de cancer de la peau.
Bénéfices attendus
Les cancers de la peau peuvent ?tre trait?s par des immunoth?rapies, qui stimulent le syst?me immunitaire pour ?liminer les cellules canc?reuses. Cependant, ces traitements ne sont efficaces que chez une partie des patients. Il est donc essentiel de comprendre pourquoi certaines tumeurs r?sistent aux traitements afin de d?velopper des approches plus efficaces. Ce projet a pour objectif d'?tudier le r?le de certaines cellules normales pr?sentes autour de la tumeur, appel?es fibroblastes. Nos travaux sugg?rent que ces cellules contribuent ? la croissance du cancer et prot?gent les cellules canc?reuses contre les traitements. En utilisant un mod?le de cancer de la peau chez la souris, nous ?valuerons si le blocage de l'activit? de ces fibroblastes permet de ralentir la progression de la maladie et d'am?liorer l'efficacit? des traitements, notamment des immunoth?rapies. Les r?sultats attendus pourraient ouvrir la voie ? de nouvelles strat?gies th?rapeutiques visant ? rendre les traitements actuels plus efficaces et ? am?liorer la prise en charge des patients atteints de cancer de la peau.
Procédures
Les animaux recevront, pendant l'?tude, des applications r?guli?res de substances sur la peau du dos afin de provoquer le d?veloppement de tumeurs cutan?es. Ils recevront ?galement des traitements exp?rimentaux administr?s par injection dans l'abdomen et par voie orale, selon un calendrier d?fini, afin d'?valuer leur efficacit? contre ces tumeurs. La dur?e totale des traitements sera de 18 semaines pour une premi?re proc?dure et de 10 semaines pour une seconde.
Impact sur les animaux
Au cours de l'?tude, les animaux seront manipul?s r?guli?rement pour l'administration des traitements, ce qui peut provoquer un stress l?ger et de courte dur?e. Le d?veloppement progressif des tumeurs cutan?es entra?nera des modifications de la peau, telles que des rougeurs, un ?paississement de la peau, des cro?tes ou une irritation. ? mesure que les tumeurs se d?veloppent, certains animaux pourront pr?senter un inconfort, une sensibilit? de la peau ou des d?mangeaisons. Dans les stades plus avanc?s, les tumeurs pourront devenir volumineuses et entra?ner une g?ne dans les d?placements, une diminution de l'activit? ou une perte de poids. Dans certains cas, des complications telles qu'une ulc?ration ou une infection locale pourront appara?tre. Les animaux seront examin?s tr?s r?guli?rement tout au long de l'?tude afin de d?tecter pr?cocement tout signe de souffrance. Des crit?res d'arr?t pr?d?finis seront appliqu?s afin de limiter au maximum les douleurs et les atteintes au bien-?tre des animaux.
Devenir
? l'issue de l'?tude, tous les animaux seront euthanasi?s de mani?re r?glementaire afin de permettre le pr?l?vement des tumeurs et des diff?rents organes n?cessaires aux analyses biologiques. Ces pr?l?vements sont indispensables pour comprendre les m?canismes de progression du cancer, ?valuer l'efficacit? des traitements test?s et r?pondre aux objectifs scientifiques du projet. Les animaux ne peuvent pas ?tre r?utilis?s dans d'autres ?tudes, car les traitements administr?s et le d?veloppement des tumeurs modifient durablement leur ?tat de sant?.
Remplacement
Ce projet ne peut pas ?tre r?alis? sans l?utilisation d?animaux vivants, car il est n?cessaire d??tudier simultan?ment le d?veloppement des tumeurs, les interactions entre les cellules de la tumeur et leur environnement, ainsi que la r?ponse globale de l?organisme aux traitements. Ces ph?nom?nes complexes ne peuvent pas ?tre reproduits de mani?re fiable avec des mod?les cellulaires ou informatiques seuls. Le mod?le murin de cancer cutan? est largement utilis? et bien caract?ris?. Il permet de reproduire des ?tapes essentielles de la maladie humaine et d??valuer l?efficacit? de traitements dans un contexte biologique complet, incluant le syst?me immunitaire. Lorsque cela est possible, des approches alternatives sont utilis?es en amont ou en compl?ment des exp?riences chez l?animal, afin de limiter leur nombre et de r?duire leur utilisation au strict n?cessaire pour atteindre les objectifs scientifiques.
Réduction
Le nombre d?animaux utilis? sera r?duit au minimum n?cessaire pour obtenir des r?sultats scientifiquement fiables. Une planification statistique des exp?riences sera r?alis?e afin d??viter toute utilisation excessive d?animaux et de garantir une puissance suffisante pour l?analyse des r?sultats. Lorsque cela est possible, plusieurs analyses seront effectu?es sur les m?mes animaux, notamment ? partir des m?mes tissus pr?lev?s, afin de limiter le nombre total d?animaux requis pour le projet. Les exp?riences seront ?galement organis?es de mani?re ? optimiser chaque groupe exp?rimental et ? ?viter les r?p?titions inutiles. Enfin, les donn?es d?j? disponibles dans la litt?rature et issues d??tudes ant?rieures seront prises en compte afin de r?duire au maximum le recours ? de nouveaux animaux.
Raffinement
Toutes les proc?dures seront mises en ?uvre de mani?re ? limiter au maximum la douleur, le stress et l?inconfort des animaux. Les manipulations seront r?alis?es par du personnel form?, selon des techniques standardis?es et valid?es. Une surveillance r?guli?re sera assur?e tout au long de l??tude afin de d?tecter pr?cocement tout signe de souffrance. Des crit?res d?observation pr?cis permettront d?intervenir rapidement si n?cessaire, notamment par une prise en charge adapt?e ou une euthanasie anticip?e lorsque le bien-?tre de l?animal est compromis. Des mesures de confort seront mises en place, incluant l?adaptation des conditions d?h?bergement, la limitation des manipulations au strict n?cessaire et l?utilisation de proc?dures anesth?siques ou analg?siques lorsque cela est pertinent. L?ensemble du protocole est con?u afin de respecter les principes ?thiques et de r?duire au maximum l?impact sur le bien-?tre animal.
Choix des espèces
La souris a ?t? choisie car elle constitue un mod?le de r?f?rence pour l??tude des cancers de la peau. Elle permet de reproduire de mani?re fiable les ?tapes de d?veloppement tumoral observ?es chez l?humain, tout en offrant un cadre exp?rimental contr?l?. Ce mod?le pr?sente ?galement l?avantage de disposer d?un syst?me immunitaire fonctionnel, indispensable pour ?tudier les interactions entre les cellules tumorales, leur environnement et les r?ponses aux immunoth?rapies. Les animaux seront utilis?s ? un stade adulte, lorsque leur d?veloppement est complet. Ce choix permet de garantir des r?sultats biologiquement pertinents tout en ?vitant d?interf?rer avec des processus de croissance ou de d?veloppement pr?coce.