Rongeurs
Titre du projet Développement pharmaceutique d’une nouvelle thérapeutique de la maladie de Menkès (EU 2/2)
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
85 souris vont être utilisées, toutes tuées en fin de protocole, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance allant de léger à sévère. Les souris mutantes reproduisent la maladie de Menkès et meurent en trois à cinq semaines sans traitement, par rupture ou anévrisme de l'aorte, tandis que mères et petits reçoivent des injections cinq jours sur sept et passent sept à huit tests neurocomportementaux. Le porteur vise un médicament capable de traiter des enfants à l'espérance de vie très réduite, bénéfice qu'il présente comme une restauration des fonctions. Il affirme qu'aucune approche in vitro ne convient puisque le projet porte sur l'allongement de la survie de l'animal malade.
Objectifs
La maladie de Menkès est une maladie rare causée par un déficit d’un transporteur cellulaire du cuivre (ATP7A) au niveau des barrières intestinales, placentaires et hémato-méningées. Les traitements actuels sont inefficaces et le devenir de ces enfants reste extrêmement pauvre causant alors des déficits multi systémiques et un décès dans les premières années de vie. Dans le contexte de cette maladie, l’obstacle du passage au niveau des barrières intestinales et hémato-méningées est responsable de la pathologie. Le développement et l’étude des nanoparticules ont montré qu’elles avaient une capacité de diffusion inter et intracellulaire augmentée grâce à leur faible taille (
Bénéfices attendus
Chez les animaux malades traités avec le Transporteur synthétique de cuivre : 1) Restauration des fonctions altérées 2) Restaurations des fonctions cognitives principales 3) Amélioration de la survie L'objectif de ce projet est de développer un médicament capable de soigner des enfants porteurs de la mutation et qui ont une espérance de vie très réduite.a
Procédures
1/ Injections sous cutanées répétées de médicament ou de son équivalent dépourvu de principe actif (véhicule) 5 jours sur 7 au cours de la gestation jusqu’à la mise bas - Injections sous cutanées répétées de médicament ou de son équivalent dépourvu de principe actif (véhicule) 5 jours sur 7 à partir de J5 et ce jusqu’à la fin du protocole à J38 pour les mâles descendants et porteurs de la maladie. 2/ Tests neurocomportementaux au nombre de 7 allant de J3 à J38 pour les souris mâles malades.
Impact sur les animaux
Chez les animaux malades non traités avec le TSC : défauts de croissance et difficultés d'alimentation, risque de mort des animaux non traités par rupture/anévrismes aortiques. Chez les animaux malades traités avec le TSC, une toxicité liée au produit peut apparaitre mais cela n'a encore jamais été observé dans les études que nous menons depuis juillet 2020. Des études de recherche de toxicité in vitro sur cellules hépatocytaires ainsi que des études anatomopathologiques sur reins ont été effectués et n’ont montré aucune toxicité.
Devenir
L’ensemble des animaux du protocole (85 animaux) seront gardés en vie après chaque procédure et ce jusqu’à la fin du protocole (fixé à J56 d’âge) afin de suivre l’évolution des animaux malades en réponse au traitement médicamenteux. L’âge de survie des animaux mutants non traités ou traités avec un placebo est compris entre 3 et 5 semaines d’âge. En fin de protocole, les animaux seront mis à mort et tous les organes d'intérêt seront rapidement prélevés et conditionnés afin de réaliser des analyses biochimiques, enzymologiques et anatomopathologiques.
Remplacement
Il n’existe pas d’alternative d’approche in vitro car le projet porte sur l’étude de l’allongement de la durée de vie et l’amélioration du comportement de l’animal porteur de la maladie de Menkès en fonction de la réponse au traitement.
Réduction
L’étude complète prévoit la génération de 13 animaux mâles par groupe pour tenir compte du taux de mortalité élevé liée à la pathologie touchant seulement les mâles, mais s’arrêtera dès que les tests comportementaux seront réalisés sur 10 souris par groupe : donc un minimum de 70 (maximum 85) souris de laboratoire, réparties en 7 groupes de 10 mâles dont 2 groupes de 10 souris saines (sauvages) et 5 groupes de 10 souris mutantes (hémizygotes) seront utilisés jusqu’à l’âge de 2 mois. Il s'agit du nombre d'animaux nécessaires pour mener à bien cette étude afin d’obtenir une puissance statistique suffisante.
Raffinement
Toutes les procédures expérimentales (2 procédures seront appliquées : la gestion de la lignée mutante qui présente un phénotype dommageable pour l’animal, l’injection du TSC en sous-cutanée répétée 5 fois par semaine avec 8 tests pour l’étude comportementale) auront lieu dans l’animalerie, dans un environnement sécurisant pour l’animal. Tout au long de leur vie, les souris ne sont jamais isolées et vivent dans un environnement comportant des éléments d’enrichissement de type buchette ou papier de nidification. Une démarche d’estimation et suppression de la douleur est mise en place : différents éléments cliniques sont évalués chez l’animal afin d’établir un score qui permet d’anticiper et d’éviter d’atteindre les points limites déterminés au préalable, et qui tient compte des signes éventuels de mal-être (isolement, yeux fermés, dos voûté, poils hérissés, immobilité, perte de poids, yeux et abdomen creux). En fin de protocole, les animaux seront mis à mort et des organes prélevés pour permettre des analyses biochimiques, enzymologiques et anatomopathologiques.
Choix des espèces
La souris ATP7AMoblo est le seul modèle de mutation spontanée permettant l'étude de cette maladie génétique, et il mime parfaitement la pathologie car nous observons chez la souris les mêmes symptômes que ceux rencontrés chez l'homme. D’autre part, ce choix se justifie par la possibilité de faire le lien avec d’autres modèles transgéniques murins d’autres maladies métaboliques liées à des troubles du métabolisme des oligo-éléments. Nous focaliserons l’étude sur les souriceaux durant la lactation des souris mères et jusqu’au-delà du sevrage, à J56, correspondant à la fin du dernier test comportemental. En effet, durant cette période nous pourrons évaluer l’efficacité du traitement sur l’évolution de l’activité neurocomportementale des animaux en réponse au traitement médicamenteux.
Effet d’une exposition à une alimentation déséquilibrée, obésogène-diabétogène, associée à des perturbateurs endocriniens environnementaux sur la fonction cérébrovasculaire chez la souris mâle adulte.
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
208 souris mâles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Elles reçoivent pendant douze semaines un régime gras et sucré combiné à des phtalates, perturbateurs endocriniens présents dans les emballages, puis des injections avant d'être tuées pour analyser leur cerveau. L'objet est d'évaluer l'effet combiné de l'alimentation occidentale et de la contamination chimique sur la microvascularisation cérébrale, avec un appui annoncé aux recommandations de santé publique. Le porteur décrit des nuisances "très limitées voire inexistantes" et affirme qu'aucun modèle in vitro ou sur invertébrés ne permet cette étude intégrée.
Objectifs
Le projet a pour objectif d’étudier les effets d’une co-exposition à un régime alimentaire mimant une alimentation déséquilibrée à l’origine de désordres métaboliques (régime obésogène et diabétogène), associée à l’exposition chronique à des doses environnementales de phtalates, composés chimiques exogènes plastifiants reconnus comme perturbateurs endocriniens à action anti-androgénique, sur la fonction cérébrovasculaire chez la souris mâle adulte. Ce travail permettra d’évaluer les effets des inter-relations possibles entre alimentation obésogène-diabétogène, et contamination chimique environnementale par les perturbateurs endocriniens de type phtalates, sur la microvasculature cérébrale et qui pourraient être une des causes d’une altération de la santé reproductive chez le mâle.
Bénéfices attendus
Le projet se place dans le contexte de la transition alimentaire, des changements des comportements de consommation et de l'exposition environnementale aux perturbateurs endocriniens. Le projet analyse les altérations générées sur la fonction cérébrovasculaire et les positionne dans une perspective intégrative, permettant de progresser sur la notion d'exposome qui représente l'ensemble des facteurs auxquels est exposé un organisme tout au long de sa vie et qui influence sa santé, et de vulnérabilité des populations sensibles. A terme, les résultats obtenus sur ce modèle expérimental mimant un mode de vie occidental pourront participer à l'évaluation du risque pour la santé humaine vis-à-vis de l'exposition environnementale aux phtalates. Ce projet servira de support aux recommandations pour la nutrition humaine, en termes de sécurité alimentaire, de toxicité des emballages, mais aussi pour les changements de comportement des consommateurs.
Procédures
Les 6 cohortes d’animaux (total 208 souris mâles adultes) seront soumises pendant 12 semaines à un régime alimentaire riche en graisses et en sucre ou contôle, associé ou non à un mélange de phtalates mimant l’exposition environementale à des phtalates, composés chimiques perturbateurs endocriniens largement utilisés comme plastifiants, entre autres, dans les contenants alimentaires. Les études publiées précédemment indiquent que les souris supportent assez bien ces troubles métaboliques lorsqu’elles sont nourries et abreuvées ad libitum, ce qui sera le cas tout au long des expérimentations. A l’issue de ces 12 semaines : 24 animaux à l’état vigile reçoivent une injection unique par voie intrapéritonéale (durée 1 min) puis sont euthanasiés 3h après par une méthode réglementaire; 24 animaux anesthésiés reçoivent une injection unique par voie intraveineuse (veine de la queue, durée 3 min) puis sont euthanasiés 10 min plus tard par une méthode réglementaire; 160 animaux sont euthanasiés par une méthode réglementaire.
Impact sur les animaux
Les nuisances ou effets indésirables liés au régime alimentaire sont, à priori, très limités voire inexistants. Les études publiées précédemment indiquent que les souris supportent assez bien ces troubles métaboliques lorsqu’elles sont nourries et abreuvées ad libitum, ce qui sera le cas tout au long des expérimentations. Les nuisances qui pourraient survenir sont celles liées aux injections intra-péritonéale et intra-veineuse: inconfort passager dû à la manipulation et à la contention (injection ip) et douleur légère et passagère au point d'injection.
Devenir
L’euthanasie des animaux est nécessaire pour effectuer les analyses post-morten à l’échelle tissulaire, cellulaire et moléculaire dans les régions cérébrales concernées par l’impact d’un régime alimentaire obésogène-diabétogène associé à une exposition à des doses environementales de phtalates.
Remplacement
La modélisation ou les études in vitro (lignées cellulaires, co-cultures, organoïdes, …) ou sur les invertébrés ne permettent pas l’étude de l’impact d’un régime alimentaire obésogène-diabétogène (mimant le régime alimentaire occidental actuel) associé à l’exposition aux perturbateurs endocriniens environementaux, sur l’unité neurovasculaire. Les modèles in vitro de barrière hématoencéphalique existant actuellement ne permettent pas encore ce type d’étude intégrée demandant de s’intéresser non seuleument aux capillaires cérébraux mais également à leur environnement (unité neurovasculaire), en lien avec l’axe hypothalamus-hypophyse-gonades. Les invertébrés ne présentent pas de capillaires cérébraux non fénétrés de structure et de fonction semblables à ceux des mammifères. La modélisation nécessite des données cellulaires pour permettre d’apporter des informations sur le fonctionnement du cerveau et de la microvasculture cérébrale en particulier. De plus, les résultats obtenus sur ce modèle expérimental mimant un mode de vie occidental doivent pouvoir participer à l'évaluation du risque pour la santé humaine vis-à-vis de l'exposition environnementale aux phtalates. Ils serviront de support aux recommandations pour la nutrition humaine, en termes de sécurité alimentaire, de toxicité des emballages, mais aussi pour les changements de comportement des consommateurs. La souris est le modèle animal le plus approprié pour ce type d’étude physio-physiopathologique.
Réduction
Le dimensionnement des groupes expérimentaux pour chaque cohorte est déterminé au plus juste pour obtenir des données quantitatives permettant une analyse statistique robuste, recevable pour publication scientifique dans des journaux internationaux à comité de lecture, et en prenant en compte les variations entre les individus, et les besoins et nécessités des protocoles expérimentaux, selon la règle des 3R. Ce projet est un projet de recherche original et ne bénéficie pas de résultats déjà existants sur lesquels s’appuyer. Le dimensionnement des groupes expérimentaux a été confirmé par un calcul de puissance et des tests statistiques pertinents seront faits pour une interprétation fiable des résultats. Les protocoles utilisés sont adaptés pour limiter le nombre d'animaux.
Raffinement
Les souris proviennent d’un fournisseur extérieur agréé, sont réparties par 4 dans chaque cage pour éviter l’isolement et hébergées dans une pièce dédiée de notre animalerie dans des conditions contrôlées. Les cages sont en portoirs ventilés et contiennent de la sciure avec du nid végétal. Les animaux ont libre accès à la nourriture et à la boisson. Aucune procédure expérimentale ne nécessite l’isolement d’animaux. Les souris font l’objet d’une surveillance quotidienne par au moins une personne formée et compétente. Les données relatives à ces contrôles sont enregistrées et validées par la structure du bien-être animale (SBEA) locale et des points limites définis pour permettre de repérer rapidement tout animal malade, blessé ou en souffrance (inconfort, stress, angoisse) et de prendre les mesures appropriées en interagissant avec la SBEA locale et le vétérinaire référent. L'euthanasie des animaux est réalisée sous anesthésie générale et les tissus sont prélevés pour analyses tissulaires, cellulaires et moléculaires.
Choix des espèces
La souris est un des modèles les mieux caractérisés pour les études métaboliques et il existe de nombreux outils biotechniques disponibles pour ce modèle animal (anticorps, lignées transgéniques...). Cela permet également de comparer les résultats obtenus avec ceux de la littérature et avec nos résultats précédents pour affiner nos hypothèses de travail. le projet concerne l’adulte. Les animaux sont commandés chez le fournisseur à l’âge de 6 à 8 semaines pour éviter les effets du transport sur les derniers stades de maturation du système nerveux central. Les animaux sont acclimatés pendant 1 semaine dans notre animalerie (nouvel environnement). Les animaux sont stabulés à raison de 4 souris par cage, les cages sont placées sur des portaoirs ventilés.
Rôle thérapeutique de la voie hème oxygènase/monoxide de carbone (HO-1/CO) au cours de l’infarctus du myocarde
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Rats : 64
256 souris et rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Chaque animal subit une chirurgie cardiaque d'environ 90 minutes reproduisant un infarctus, avec un risque de mort accru les trois premiers jours, puis reçoit les composés à tester avant que son cœur ne soit prélevé. Le projet évalue des molécules libérant du monoxyde de carbone censées protéger le cœur après un infarctus, retombées présentées comme des informations "nouvelles et importantes". Le porteur justifie le choix de la souris et du rat par la comparaison avec les nombreuses études antérieures utilisant les mêmes modèles.
Objectifs
L'infarctus du myocarde (IM) reste l'une des principales causes de morbidité et de mortalité. Les lésions tissulaires au cours de l'IM provoquent la libération de molécules toxiques connues sous le nom de "Danger Associated Molecular Pattern". (DAMP), qui aggravent les lésions cardiaques et stimulent l'inflammation. Nous faisons l’hypothèse que l’hème agisse comme un DAMP important dans l'IM car des quantités importantes d'hème présentes dans le tissu cardiaque, peuvent être libérées pendant l’infarctus, et pourraient favoriser les dommages cardiaques s'il n'est pas correctement neutralisé ou dégradé. Bien que le tissu cardiaque ait la capacité de neutraliser l'hème dans des conditions normales, ces systèmes de protection intrinsèques ne suffisent pas lorsque la quantité d'hème devient excessive comme dans le cas de l’IM. Cependant, une stratégie thérapeutique nécessite de nouvelles approches pharmacologiques car les mécanismes responsables des lésions myocardiques après un infarctus sont multiples et encore mal définis. Le but principal de ce projet est donc d’étudier non seulement le rôle de l'hème en tant que DAMP mais également de vérifier si l'hème peut stimuler certains facteurs de protection dans le cœur pendant l'infarctus du myocarde. De plus, nous évaluerons l'effet pharmacologique de nouvelles molécules (HYCOs) qui pourraient être très efficaces pour neutraliser les effets délétères de l'hème et favoriser la protection contre l'inflammation et les lésions tissulaires pendant l’IM. Pour ce projet, la plupart des expériences sur l'IM seront réalisées sur des souris afin que nous puissions 1) comparer nos résultats avec des données antérieures publiées dans la littérature avec le même modèle et 2) avoir la possibilité de tester l'effet spécifique des HYCOs. Néanmoins, certaines expériences clés seront répétées dans le modèle du rat comme "preuve de concept", une étape essentielle pour vérifier que l'efficacité de nos molécules est reproduite dans différentes espèces. Les objectifs finaux seront de déterminer le rôle de l'hème et les effets bénéfiques des HYCO dans l'IM.
Bénéfices attendus
Il s'agit d'un projet visant à tester les effets pharmacologiques des composés libérant du monoxyde de carbone (CO) et capables de protéger contre l'infarctusl'infarctus du myocarde. Cette étude nous fournira des informations nouvelles et importantes concernant l'applicabilité thérapeutique du CO dans les maladies ischémiques.
Procédures
Dans le modèle d'infarctus du myocarde chez la souris et le rat, chaque animal sera soumis à une intervention chirurgicale sous anesthésie complète. La procédure chirurgicale complète nécessite environ 90 minutes et après l'infarctus les animaux seront traitées avec les composés à tester et chaque administration ne durera pas plus de 5 secondes. A 7 ou 30 jours après l'infarctus, l’effet thérapeutique sera monitoré au niveau fonctionnel par échographie qui durera qui ne durera pas plus de 30 min. A la fin des expériences les animaux seront placés sous anesthésie profonde, un prélèvement de sang sera effectué et le coeur sera excisé.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables sont principalement ceux liés à la chirurgie (modèle d’insuffisance cardiaque postischémique), pouvant dans les trois premiers jours suivant l’opération conduire à une atteinte aigue cardiaque et une mortalité accrue des animaux les plus atteints. Les effets indésirables seront la perte de poids (de 10 à 20%), une diminution de la température corporelle et besoin d’oxygène après la chirurgie, une altération de leur apparence physique (manque de toilettage, poil ébouriffé, paupière fermée, posture anormale) ou un comportement anormal (mobilité réduite, agressivité). Dans notre expérience, passées les premières 72h, il est rare d’observer des signes de souffrance chez l’animal ayant subi une thoracotomie, suggérant que la période critique douloureuse est limitée à ce temps court après la chirurgie.
Devenir
Comme nous avons besoin de collecter les coeurs pour une analyse metabolique, génique et biochimique à la fin de chaque protocole expérimental, tous les animaux seront mis à mort.
Remplacement
Avant de finaliser et d'optimiser les protocoles expérimentaux pour ce projet, nous avons initialement synthétisé et testé 20 composés pour déterminer leurs effets bénéfiques sur les cardiomyocytes en culture remplaçant ainsi l'utilisation de milliers de souris. Tous les 20 composés avaient la capacité de libérer efficacement du CO mais seulement 2 composés sur 20 n'ont montré aucun effet cytotoxique aux concentrations utilisées précédemment pour des composés similaires . Ces tests in vitro nous ont permis de sélectionner les 2 meilleurs en fonction également de leur structure chimique diversifiée. Pour les études sur les souris traité par l'hémopexine et la déféroxamine, ces deux composés ont déjà été testés in vivo et les meilleurs dosages et mode d'administration ont été rapportés dans des articles précédents. Cela évitera l'utilisation inutile de plus d'animaux pour optimiser l'efficacité de ces deux composés.
Réduction
Les tests in vitro (Remplacement) nous ont permis de sélectionner les 2 meilleurs composés et nous a ainsi permis de réduire significativement le nombre de composants qui seront testés in vivo. Pour chacun des groupes étudiés dans les 3 procédures proposées, nous utiliserons 8 animaux en raison de leur variabilité, pour obtenir des données significatives et afin d'avoir une puissance statistique suffisante. Chaque protocole nécessite son propre contrôle. Nos résultats seront comparés à certains résultats de la littérature, ce qui contribuera à éviter la réitération de certains essais déjà réalisés avec d'autres molécules aux mêmes propriétés. Après avoir collecté des résultats, nous analyserons les données avec des tests statistiques. A noter que nous nous sommes efforcés de réduire le nombre total d'animaux puisque la procédure 1 nous permettra de définir le mode d'administration le plus efficace des composés à utiliser ensuite dans la procédure 2. Un nombre réduit de protocoles et donc les expériences les plus nécessaires seront répétées en utilisant des rats dans la procédure 3.
Raffinement
Pour minimiser la douleur et la souffrance des animaux, nous mettrons en place les points limites décrits dans chaque procédure. Pendant leur séjour à l’animalerie, les animaux auront à leur disposition des balles de coton pour nidifier ainsi que des feuilles de kraft pour jouer/se cacher et des bâtons de bois pour jouer/se cacher et feront l'objet d'une surveillance quotidienne. Toutes les interventions sont réalisées sous anesthésie générale (induction de l’infarctus et examens à J7 ou J30). La douleur chirurgicale est prise en charge par des antalgiques. Un antalgique sera administré avant la chirurgie ainsi q’un anti-inflammatoire après la chirurgie. En cas de fortes hémorragies ou de troubles cardiaques, l’animal sera mis à mort sous anestesie.
Choix des espèces
Les modèles animaux que nous utiliserons sont largement utilisé pour étudier l'effet de nouveaux composés thérapeutiques et leur efficacité dans les maladies cardiovasculaires. De manière analogue, les modèles d'infarctus du myocarde (IM) chez la souris et le rat ont été établis et bien décrits dans la littérature. Le choix de ces espèces de souris et rat se justifie par le fait que nous devons également comparer nos données avec les nombreuses études présentes dans la littérature utilisant exactement les mêmes modèles de IM.
Etude de l’effet de différentes molécules ciblant les récepteurs à peptide RFamide sur la modulation de la nociception chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles sensoriels
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
3 020 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance allant de léger à sévère. Selon les groupes, elles subissent des injections répétées et des modèles de douleur, constriction chirurgicale d'un nerf, incision de la patte, immersion et pression de la queue, filaments de von Frey et plaque froide, tests qui mesurent leur seuil de douleur. L'objet est d'évaluer des molécules ciblant les récepteurs RFamide contre la douleur chronique et l'hypersensibilité aux opiacés, de nouvelles stratégies thérapeutiques restant au conditionnel. Le porteur affirme que la nociception ne se mesure que sur l'"animal entier" et qualifie la souris de modèle "incontournable" en neurosciences.
Objectifs
La douleur chronique est un problème de santé publique majeur. Elle diminue la qualité de vie des patients et son traitement a un impact économique considérable. Bien que des progrès importants aient été réalisés dans la compréhension des mécanismes de la douleur, peu de progrès ont été faits dans le développement de nouveaux analgésiques. Dans le cadre d’une douleur modérée à sévère, les opiacés restent à ce jour le moyen le plus efficace de traiter ces douleurs. Par contre, leurs effets indésirables sont nombreux, dont notamment la tolérance analgésique caractérisée par une diminution au cours du temps de l’effet du traitement nécessitant une augmentation des doses pour soulager le patient. La prise chronique d’opiacés entraîne également le développement d’une hypersensibilité à la douleur. Il y a donc des points communs entre l’hypersensibilité induite par les opiacés et le développement de l’hypersensibilité induite par les douleurs chroniques. Nos résultats récents indiquent que les récepteurs à neuropeptides RFamide sont impliqués dans ces phénomènes. Ce projet est un projet de recherche préclinique qui vise à développer de nouvelles voies thérapeutiques analgésiques peu ou pas caractérisées jusqu'à présent. Pour ce faire, nous avons récemment identifié des composés capables de bloquer sélectivement ces récepteurs à neuropeptides RFamide impliqués dans l’hypersensibilité. L’évaluation de l’activité de ces molécules dans différents modèles de douleur chez la souris nous permettra de mieux comprendre le rôle de chaque récepteur dans la modulation de la perception de la douleur et le développement de l’hyperalgésie. Ainsi il nous sera possible d’envisager le développement de nouveaux traitements de la douleur plus sûrs et présentant moins d’effets secondaires que les traitements existants. Le même projet est déposé dans deux établissements utilisateurs pour des raisons de disponibilités d’équipements scientifiques dont le planning des utilisations n’est pas connu à ce jour. Toutefois, le nombre d’animaux annoncé : 3020, sera utilisé sur l’ensemble des deux établissements.
Bénéfices attendus
Dans l’ensemble, les résultats de ce projet, combinés aux résultats obtenus par l’approche génétique, permettront d’affiner le rôle de chacun de ces récepteurs à neuropeptides RFamide et de leurs ligands endogènes (molécules naturellement synthétisées par les neurones pouvant s’y fixer) dans la modulation de la nociception, c’est-à-dire de la perception de stimulus douloureux et dans le développement de l’hyperalgésie induite par les opiacés et les douleurs persistantes. Ils pourraient permettre à terme d’établir de nouvelles stratégies thérapeutiques pour le traitement de la douleur.
Procédures
Gestes techniques subit par animal selon la procédure et le groupe auquel il appartient : PE1 : Injection composé x5 (10 secondes) / 10 tests Tail Immersion Test (TIT) d’une durée de 30 secondes / 10 tests Tail Pressure test (TPT) d’une durée de 30 secondes PE2 : Injection é x20 (10 secondes) / 15 tests TIT d’une durée de 30 secondes / 15 tests TPT d’une durée de 30 secondes PE3 : Injection x5 (10 secondes) / 10 tests TIT d’une durée de 30 secondes / 10 tests TPT d’une durée de 30 secondes PE4 : Groupe 1 : Injection x6 (10 secondes) / 10 tests TIT d’une durée de 30 secondes / 10 tests TPT d’une durée de 30 secondes Groupe 2 : Injection x9 (10 secondes) / 14 tests TIT d’une durée de 30 secondes / 14 tests TPT d’une durée de 30 secondes PE5 : Groupe 1 : Chirurgie CCI (20 minutes) / Injection x10 (10 secondes) / 15 tests du Von Frey d’une durée de 20 minutes / 15 tests de la plaque froide d’une durée de 5 minutes Groupe 2 : Chirurgie CCI (20 minutes) / Injection x10 (10 secondes)/ 15 tests du Von Frey d’une durée de 20 minutes / 15 tests de la plaque froide d’une durée de 5 minutes PE6 : Chirurgie incisionnelle (5 minutes) / Injection (10 secondes) x7 / 10 tests du Von Frey d’une durée de 20 minutes / 10 tests du plantar d’une durée de 15 minutes PE7 : Groupe 1 : Injection ITH sous anesthésie générale gazeuse (10 minutes anesthésie comprise) / 11 tests TIT d’une durée de 30 secondes Groupe 2 : Injection ICV sous anesthésie générale gazeuse (10 minutes anesthésie comprise) / 11 tests TIT d’une durée de 30 secondes PE8 : Injection composé (10 secondes) x1 / Injection anesthésie générale x1 (10 secondes) / injection analgésie locale x1 (10 secondes) / Ouverture thoracique (30 secondes) / Prélèvement de sang (30 secondes) / Perfusion / Prélèvement du cerveau PE9 : Injection composé (10 secondes) x1 / Prélèvement sanguin sur animal vigile (30 secondes)
Impact sur les animaux
Les effets indésirables pouvant apparaitre après application de nos procédures, sont l’abaissement du seuil douloureux, l’apparition d’inflammation / œdème / infection au niveau des points d’injection ou des sutures chirurgicales, comportements anormaux, problème de locomotion, d’alimentation. Nous pouvons aussi nous attendre à une amélioration du niveau de douleur pour les molécules qui s’avéreront efficaces.
Devenir
Les animaux sont mis à mort à l'issue de chaque procédure. Aucune réutilisation d'animaux n'est possible du fait de l'administration de substances pharmacologique et des modèles de douleur subit par les animaux qui mettraient en cause les résultats d'une nouvelle procédure si elle était réalisée.
Remplacement
Les molécules testées in vivo sont au préalable sélectionnées sur la base d’évaluations in vitro afin de déterminer leur affinité et leur activité sur le récepteur d'intérêt ainsi que leurs caractéristiques physicochimiques. Ces expériences permettent de limiter fortement le nombre de molécules à tester sur l'animal. Cependant l'évaluation de leurs effets sur la nociception n’est réalisable que sur l’animal entier ; il n’existe, à ce jour, pas de modèles in vitro permettant de réaliser ce travail. Nous avons choisi la souris pour pouvoir comparer les résultats obtenus avec le phénotype des souris knockout pour les différents récepteurs RFamide disponibles au laboratoire dans les mêmes modèles de douleur.
Réduction
En raison de la variabilité dans les différentes expériences prévues et de nos résultats antérieurs, le nombre d’animaux est limité à 10 par groupe afin d’obtenir des résultats statistiquement exploitables. L’évaluation préalable in vitro de nos molécules permet de réduire grandement le nombre de molécules à évaluer in vivo et par conséquent réduit également fortement le nombre d’animaux nécessaires pour leur évaluation. Les expériences seront menées sur les mâles et étendues aux femelles dans les modèles de douleur les plus pertinents.
Raffinement
Les animaux sont hébergés en cohorte, dans un milieu enrichi, et observés quotidiennement par l’expérimentateur, ou une personne compétente dans un établissement agréé de façon à maximiser leur confort et limiter une quelconque souffrance. Les souris sont habituées à l’expérimentateur et à l’expérimentation afin de limiter leur angoisse et le stress. Pour chacune des procédures, des points limites adaptés ont été définis selon les directives éthiques indiquées par l’association internationale pour l’étude de la douleur et après concertation auprès de la structure chargée du bien-être animal. Dès que cela est possible, les gestes douloureux sont réalisés sous anesthésie générale, accompagnées d’une analgésie locale et sur tapis chauffant afin d’améliorer le confort de l’animal. Le réveil se fait individuellement en cage propre sous lampe chauffante.
Choix des espèces
Les objectifs du projet consistent à étudier les effets de ligands des récepteurs RFamide sur l’hyperalgésie induite par les opiacées ou associée aux douleurs persistantes. Pour ce faire, il nous est indispensable de travailler sur un modèle entier et complexe prenant en compte les cascades de réactions, les voies de signalisation, la communication entre les organes afin d’être dans des conditions au plus proche de la complexité humaine. Le modèle murin présente une forte homologie structurale du cerveau avec l’Homme le rendant incontournable dans la recherche en neurosciences et notamment dans la compréhension des mécanismes de la douleur. En plus de sa proximité physiologique avec l’Homme, la souris possède également une forte homologie génétique faisant d’elle un bon modèle d’étude de la douleur. L’ensemble de nos expérimentations animales est réalisé sur des souris dont le fond génétique permet de visualiser au mieux le développement de l’hyperalgésie. Par ailleurs, c'est également ce fond génétique que nous avons utilisé pour générer des souris génétiquement modifiées pour les différents récepteurs RFamide, ce qui nous permettra de comparer les conséquences du blocage pharmacologique et génétique de ces différents récepteurs. A leur arrivée au laboratoire, les souris sont âgées de 6 semaines avec un poids allant de 25 à 30 grammes. Les animaux sont soumis aux procédures expérimentales à partir de 8 semaines, ce qui correspond à l’âge de la maturité sexuelle et à un développement complet du système nociceptif.
Intérêt du cannabidiol sur les lésions arthrosiques diffuses obtenues par section du ligament croisé antérieur chez le rat
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
28 rats vont être utilisés, tous tués à cinquante-six jours, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une section chirurgicale du ligament croisé du genou provoque une arthrose, puis huit injections de cannabidiol sont faites dans l'articulation, la douleur ne pouvant être soulagée par anti-inflammatoires sous peine de fausser le modèle. L'objet est de tester si le cannabidiol freine les lésions arthrosiques, dans le contexte d'une consommation croissante par les patients. Le porteur affirme qu'aucune méthode in silico ne reproduit ces lésions et juge le modèle rat "indispensable".
Objectifs
L'arthrose est la maladie articulaire la plus répandue. Actuellement en France, 10 millions de personnes souffrent de cette pathologie. L'arthrose est une maladie complexe et sevère qui altère fortement la qualité de vie des patients. Elle se caractérise par une destruction du cartilage qui s'étend à toutes les structures de l'articulation, notamment à l'os et au tissu synovial. À ce jour, il n'existe que des traitements qui visent à soulager la douleur. Face aux douleurs liées à l'arthrose, de plus en plus de patients consomment ou sont tentés de consommer soit du cannabis ou des cannabinoïdes. Plusieurs études cliniques sont en cours concernant la consommation des cannabinoïdes dans les douleurs liées à l'arthrose notamment au Canada et aux États-Unis. En revanche, malgré le nombre important de produits qui apparaissent sur le marché avec différents modes d'administration, leur potentielle efficacité sur les lésions du cartilage n'est pas encore évaluée. Seules des études in vitro ont montré que le système endocannabinoïde est capable de jouer un rôle dans l'arthrose et que les récepteurs aux endocannabinoïdes sont exprimés au sein de l'articulation (cartilage et membrane synoviale). Dans une nécessité d'améliorer les données in vivo sur le rôle des cannabinoïdes dans l'arthrose et leur potentielle utilisation dans le traitement des lésions arthrosiques, nous souhaitons donc étudier l'impact du cannabidiol sur le cartilage sain et sur les lésions du cartilage observées au cours de l'arthrose chez le rat mais également sur le degré d'inflammation de la membrane synoviale. Pour l'exploration de cette nouvelle piste thérapeutique, nous souhaitons injecter directement du cannabidiol dans l'articulation afin de cibler les lésions articulaires et de limiter par ailleurs la diffusion dans l'organisme, chez des rats ayant subi une section du ligament croisé antérieur. La section du ligament croisé antérieur chez le rat est un modèle d'arthrose très utilisé puisqu'il présente les mêmes signes cliniques que ceux observés dans l'arthrose humaine.
Bénéfices attendus
L'arthrose du genou (OA) est un problème majeur de santé publique à travers le monde. Des études basées sur la population révèlent que l'arthrose symptomatique du genou est présente dans 20 à 30% de la population âgée de plus de 65 ans et sa prévalence augmente en partie à cause du vieillissement de la population. En ciblant le système endocannabinoïde dans la pathologie arthrosique, l'injection intra-articulaire de cannabidiol pourrait donc permettre de soulager les patients mais également de retarder l'évolution des lésions arthrosiques, évitant ou retardant la mise en place d'une prothèse (seule technique thérapeutique efficace pour le moment).
Procédures
Tous les animaux subiront une procédure chirurgicale à J0 d'une durée d'environ 20 minutes qui sera réalisée sous anesthésie gazeuse générale. Pour minimiser la douleur post-opératoire, les rats seront traités par un antidouleur une heure avant l'intervention chirugicale. Durant cette procédure chirurgicale, la section du ligament croisé le ligament croisé antérieur sera sectionné afin d'induire une arhrose expérimentale par instabilité. La section sera vérifiée par un mouvement sépcifique de genou (présence d'un tiroir). Le plan musculaire et le plan cutané seront ensuite suturés. Les rats seront ensuite placés sur une plaque chauffante et surveillés jusqu'à leur réveil. Ils seront ensuite replacés dans leur cage par groupe de 3 ou 4. Ils seront également surveillés de façon assidue pendant les 48 heures qui suivent l'opération. Tous les animaux subiront ensuite 8 injections intra-articulaires à J3, J7, J14, J21, J28, J35, J42 et J49 de CBD après l'opération chirurgicale d'une durée de moins d'une minute chacune. Les injections intra-articulaires réalisées sous anesthésie générale d'excipient ou de CBD dont la compositon et la dose ont été choisies sur la base de la littérature (dose antalgique chez le rat), n'induisent pas de douleur "post-injection".
Impact sur les animaux
Ce modèle d'arthrose expérimentale par section du ligament croisé est un modèle très connu et parfaitement maïtrisé par les personnes en charge de la réalisation des procédures expérimentales et tout particulièrement en termes de douleur. La douleur engendrée ne peut cependant pas être prise en charge par des anti-inflammatoires car ces molécules auraient une influence sur l'inflammation et l'apparition des lésions arthrosiques, essentielles dans notre modèle. Les nuisances attendues sur les animaux sont donc une douleur de niveau modérée liée à l'inflammation initiale suite à la chirurgie puis liée au développement de la pathologie arthrosique. Enfin la dernière nuisance considérée comme légère concerne les anesthésies gazeuses à l’isoflurane hebdomadaires pour la réalisation des 8 injections intra- articulaires. La dose de CDB utilisée est la dose antalgique décrite dans la littérature et n'engendre donc aucune douleur.
Devenir
À la fin de l'étude, les rats seront mis à mort selon la méthode réglementaire, 56 jours après l'induction du modèle d'arthrose expérimentale. Chaque genou (droit et gauche) sera prélevé afin de réaliser les études macroscopiques, histologiques et immunohistologiques pour évaluer les lésions articulaires et osseuse à l'aide de scores quantitatifs en comparaison avec le cartilage natif du genou controlateral. La membrane synoviale sera également prélevée pour l'analyse du degré d'inflammation en histologie, en immunohistochimie.
Remplacement
Face à la consommation absolument non cadrée de cannabidiol par les personnes souffrant d'arthrose et afin d'étudier l'impact de la prise de molécules sur les tissus abarticulaires et de tester également leur efficacité dans le traitement de l'arthrose (atteintes des tissus cartilagineux et degré d'inflammation de la membrane synoviale), des études pré-cliniques sont requises pour évaluer l'impact de cette substance sur les tissus et sur l'évolution des lésions. Il n'existe pas de méthode "in silico" permettant de remplacer un organisme vivant pour obtenir un modèle de lésions diffuses qui reproduit les lésions arthrosiques observées chez l'homme. En effet, ce modèle animal est indispensable pour évaluer l'impact de la prise de ce produit dans un modèle d'arthrose expérimentale chez le rat.
Réduction
Dans un souci d'éthique, le nombre d'animaux par groupe a été réduit au maximum et est nécessaire et suffisant pour les études statistiques. De plus, seul le côté droit sera opéré de façon à préserver le genou gauche comme témoin. Tous les scores histologiques seront réalisés en double aveugle avec moins de 5% d'erreurs entre les deux observateurs expérimentés.
Raffinement
Les rats seront hébergés par 3 ou 4 dans des cages conventionnelles conformes pour cette espèce, en accord avec la législation envigueur, au sein de notre animalerie conventionnelle. De plus, plusieurs éléments plaident en faveur d'une expérimentation en milieu conventionnel en plus de l'expérience historique que nous avons sur ce modèle depuis plus d'une vingtaine d'années, puisque l'envirionnement microbien (microbiote) est particulièrement susceptible d'être impliqué dans le developpement de maladies inflammatoires et/ou dégénératives de l'articulation. L'enrichissement se fera par un tunnel dans la cage et la distribution quotidienne de quelques céréales sucrées. Cet enrichissement ne modifie en rien notre étude et apporte une distraction non négligeable à l'animal et renforce également positivement la relation expérimentateur-animal. Les injections intra-articulaires sont réalisées sous anesthésie gazeuse générale. Ce modèle d’arthrose expérimentale par section du ligament croisé antérieur est un modèle bien connu et maîtrisé au laboratoire en termes de douleur. par ailleurs, une antalgie peropératoire par buprénorphine (0,05 mg/kg) sera réalisée. Nous surveillerons quotidiennement les animaux. Les animaux seront pesés deux fois par semaine. Si des anomalies du comportement (vocalisation, pilo-érection, cachexie), pouvant traduire une douleur intense et/ou une perte pondérale supérieure a 20% sur 3 jours étaient observés, les animaux concernés seraient mis à mort en conformité avec les recommandations éthiques. L’apparition éventuelle d’une infection au niveau du site d'injection nous obligerait également à mettre à mort l’animal.
Choix des espèces
Le rat est couramment utilisé dans l'arthrose et ce modèle dit mécanique reste une alternative à l'utilisation du chien. Les animaux seront livrés à l'animalerie à l'âge de 6 semaines et auront une semaine d'acclimatation. Ils seront opérés à l'âge de 7 semaines pour être en accord avec la littérature. La mise à mort sera ensuite réalisée en fin d'expérimentation 56 jours après l'intervention chirurgicale pour réaliser des explorations macroscopiques, histologiques et immunohistochimiques des lésions arthrosiques et déterminer le degré d'inflammation de la membrane synoviale.
Surexpression de DNM2 par thérapie génique pour l’étude et le traitement de la maladie de Charcot-Marie-Tooth liée à DNM2.
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
- Troubles nerveux
330 souris vont être utilisées, toutes tuées à huit ou neuf semaines, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Porteuses de la maladie de Charcot-Marie-Tooth, elles reçoivent des injections de virus dès les premiers jours de vie, puis huit tests dont l'immersion de la queue en bain chaud et la plaque chauffante pour mesurer leur sensibilité à la douleur, et une mesure musculaire sous anesthésie sans réveil. Le porteur vise une "preuve de concept" de thérapie génique présentée comme une étape vers les essais cliniques, bénéfice formulé au conditionnel. Il affirme que les effets sur les nerfs et les muscles ne s'évaluent que sur l'organisme entier, hors de portée d'une culture de cellules.
Objectifs
Le but de ce projet est de consolider une preuve de concept thérapeutique pour la maladie de Charcot-Marie-Tooth (CMT) en utilisant des modèles de souris. La maladie se manifeste dans l’enfance par une faiblesse musculaire distale, une perte sensorielle et un déficit de coordination évoluant vers une incapacité motrice chez les patients adultes. La CMT est caractérisée par une faiblesse musculaire et des anomalies de gaines de myéline qui entourent et isolent les fibres nerveuses. Ces caractéristiques sont retrouvées chez les modèles souris de la CMT. Le but de notre étude est d'utiliser ces souris et de moduler l'expression du gène impliqué dans la maladie pour tenter d'atténuer les symptômes musculaires et nerveux. Nous réaliserons cette modulation par des techniques d’injections de virus adéno-associés, couramment utilisés dans la recherche médicale.
Bénéfices attendus
Le succès de ce projet fournira une première stratégie thérapeutique pour certaines formes de la maladie de Charcot-Marie-Tooth, et constitue une étape essentielle vers les essais cliniques. Ce travail pourrait être bénéfique pour le traitement d’autres formes génétiques de CMT si un lien moléculaire ou mécanistique entre les différentes formes est découvert. Ce projet permettra également de déterminer si une myopathie coexiste avec la neuropathie chez les patients.
Procédures
Une partie des animaux (10) sera utilisée pour un entrainement à une technique d’injection. Les autres animaux (320) seront injectés (durée d’injection de quelques secondes) avec des virus adéno-associés. 80 animaux seront injectés entre le 3ème et 5ème jour après la naissance et 240 animaux seront injectés à 4 semaines. Entre 7 et 9 semaines, les animaux seront soumis à une série de 8 tests comportementaux : - test de suspension (durée 3x60s) pour évaluer la force musculaire ; - déplacement sur tapis roulant (max 60s) et – déplacement sur une barre crantée (10x30s environ) pour évaluer la coordination motrice ; -test d’immersion de la queue en bain-marie (3x20s max en tout), -mesure de réactivité sur plaque chauffante (3x30s max en tout) et -mesure de réactivité cutanée (4x30s par animal) pour évaluer la sensibilité ; -mesure de l’activité électrique musculaire, sous anesthésie générale (procédure d'une demi-heure) pour évaluer la conduction nerveuse ; et, -mesure des propriétés contractiles musculaires in situ, sous anesthésie générale (procédure d’une heure, sans réveil) pour évaluer la force musculaire développée.
Impact sur les animaux
Dans cette étude, nous utiliserons un modèle de la maladie de Charcot-Marie-Tooth dont les caractérisations ont déjà été effectuées et les animaux ne présentent aucun signe de douleur et aucune incapacité locomotrice. Le second modèle utilisé dans cette étude présente des défauts histologiques au niveau du nerf à 24 jours. Le phénotype général des souris n’a pas été décrit et aucune douleur n’a été reportée chez ces animaux. Les tests phénotypiques (de suspension, de déplacements et de sensibilité) peuvent engendrer un stress physique chez l'animal. Les injections peuvent entrainer une réaction inflammatoire. L’électromyographie sera réalisée sous une anesthésie générale de même que la mesure de force musculaire in situ.
Devenir
Les animaux de cette étude seront mis à mort à 8 ou 9 semaines après caractérisation comportementale, les tissus affectés seront prélevés pour étude histologique.
Remplacement
Le modèle souris étant physiologiquement et structurellement assez proche de l’Homme, il nous permettra d’étudier d’une part la physiopathologie de la maladie de Charcot-Marie-Tooth et d’autre part de mieux comprendre les voies de signalisation impliquées dans le développement de cette maladie. De plus, une étude exclusivement réalisée sur des cellules ne pourrait pas se suffire à elle-même car les effets sur l’ensemble de l’organisme et l’évaluation de la force musculaire, de la coordination motrice et de la conduction nerveuse seraient impossibles à évaluer. Une étude sur culture de cellules mutantes ne peut être envisagée car les symptômes décrits ne se développeraient pas et la caractérisation du modèle serait alors impossible.
Réduction
Les études histologiques et procédures expérimentales seront réalisées avec un nombre d’animaux qui sera réduit au maximum pour obtenir une puissance statistique suffisante. Nos connaissances sur les modèles murins et les études réalisées sur d’autres thérapies montrent que 10 souris par sexe et par groupe pour l'étude comportementale seront nécessaires pour obtenir une étude concluante avec des tests statistiques adéquats.
Raffinement
Les nouveau-nés seront hébergés avec leurs parents jusqu’au sevrage et leur souffrance sera évaluée quotidiennement : capacité à se retourner/à se mouvoir, couleur de la peau. Après le sevrage, les animaux seront hébergés à plusieurs par cage, la qualité de l’air sera assurée par une ventilation et la température sera maintenue constante. Des nids seront disposés dans chaque cage avec un accès illimité à la boisson/nourriture. La litière sera changée hebdomadairement afin de maintenir les animaux au propre et au sec. La pesée des animaux sera réalisée 1 fois par semaine. Une perte de poids de 20% en une semaine conduira à l’arrêt du protocole. Le bien-être des animaux sera contrôlé quotidiennement afin de détecter au plus tôt les premiers signes de souffrance comme l’apathie, la prostration, l’abaissement des paupières et l’apparition d’une cyphose. Si des difficultés de locomotion apparaissent, de la nourriture en gel sera placée dans la cage afin de soulager l’animal dans ses déplacements. La zone d'injection sera observée quotidiennement (couleur/gonflement) pendant les 3 jours suivant l'injection afin de prévenir l’apparition d’une infection. Afin de réduire le stress lié à certaines expériences, une session de familiarisation avec le matériel sera effectuée. Pour la mesure d’électromyographie, l’animal aura une anesthésie gazeuse tout au long de la procédure afin de supprimer le stress lié à la procédure. L'animal sera placé sur une plaque chauffante pour maintenir sa température corporelle à sa valeur basale et celle-ci sera contrôlée à l’aide d’une sonde rectale. Un produit sera appliqué pour prévenir le dessèchement oculaire. Un contrôle visuel de la respiration sera effectué. De même lors des mesures de force, l'animal sera anesthésié par injection intrapéritonéale d'un mélange de produits anesthésiants et analgésiques, la température de l’animal sera maintenue par une plaque chauffante, sa respiration surveillée et l’animal sera mis à mort avant son réveil pour prélèvement et analyse des tissus. En cas de douleur au cours de l’étude, un analgésique sera administré. En revanche, si l’animal devait réaliser des tests sensitifs, les antidouleurs risquant de perturber les résultats aux tests, il sera mis à mort prématurément.
Choix des espèces
Afin de comprendre les mécanismes moléculaires aboutissant à la maladie de Charcot-Marie-Tooth et d’évaluer les effets d’une thérapie, nous avons besoin d’effectuer des expériences physiologiques in vivo. Ces mesures ne peuvent pas être réalisées sur d’autres espèces évolutivement plus éloignées de l’Homme car la structure des muscles et des nerfs, les deux tissus principalement touchés, est trop différente. D’une part, une étude sur des cellules ne pourrait pas se suffire à elle-même car les effets sur l’ensemble de l’organisme et l’évaluation des bénéfices sur la structure des fibres nerveuses et musculaires, sur le la coordination motrice, la conduction nerveuse et la force musculaire seraient impossible à évaluer. D'autre part, une étude sur culture de cellules ne peut être envisagée car le phénotype pathologique ne se développe pas et le bénéfice sur les paramètres décrits ci-dessus ne peut être mesuré. Pour moduler l'expression du gène d’intérêt, nous testerons différentes conditions d’une thérapie génique (prévention ubiquitaire, réversion ubiquitaire et réversion tissu-spécifique). Nous étudierons les effets de ces injections à 8 ou 9 semaines, car à cet âge le phénotype de la maladie est exprimé (défauts histologiques des tissus et structurels), ainsi nous pourrons savoir assez tôt si les différentes modulations sont bénéfiques.
Régulation de la traduction d’ARNm spécifiques par la voie des MAP kinases et leur implication dans les interactions réciproques entre cellules tumorales et immunitaires du microenvironnement tumoral
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
6 720 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une partie est irradiée puis reçoit une greffe de moelle osseuse, toutes reçoivent une injection de cellules tumorales sous la peau et, pour certaines, des chimiothérapies ou immunothérapies pendant plusieurs mois, la tumeur pouvant se nécroser et s'ulcérer. Le projet étudie comment la cellule cancéreuse échappe au système immunitaire, la pertinence clinique d'inhibiteurs étant annoncée comme un espoir. Le porteur affirme que les études in vitro ne reproduisent pas les voies d'un modèle intégré et que le remplacement n'est "pas applicable".
Objectifs
La cellule tumorale a besoin de s'adapter rapidement à un environnement dynamique, parfois hostile, afin de continuer à se multiplier et à survivre. Notre système immunitaire est initialement capable de reconnaître une cellule cancéreuse et de l’éliminer. Toutefois la cellule cancéreuse est capable de s’adapter et de devenir invisible afin de ne pas être éliminée par ce système de défense. Un des mécanismes impliqués dans l’adaptation rapide de la cellule cancéreuse, permet la production de protéines spécifiques qui rendront la cellule cancéreuse invisible au système immunitaire. Une des nouvelles pistes thérapeutiques dans le traitement du cancer consiste à utiliser des molécules qui inhibent la production des protéines. Etudier ce mécanisme d’adaptation de la cellule cancéreuse qui empêche le système immunitaire d’être efficace et définir l’impact des inhibiteurs de ce mécanisme sur le développement de la tumeur et les propriétés des cellules cancéreuses et immunitaires sont les objectifs principaux de ce projet.
Bénéfices attendus
La dynamique d’interaction entre les cellules cancéreuses et immunitaires font intervenir des mécanismes d’adaptation rapide qui impliquent la production de protéines spécifiques. Analyser cette dynamique au niveau de la production des protéines est particulièrement innovant et important car il existe des études pré-cliniques montrant l'intérêt d'utiliser des inhibiteurs de la production des protéines dans le traitement de certains cancers. Alors que nous comprenons de mieux en mieux comment ces inhibiteurs affectent la cellule tumorale, peu d’études portent sur les effets de ces inhibiteurs dans la réponse immunitaire anti-tumorale. Enfin, la pertinence clinique de l'utilisation de ces inhibiteurs sera évaluée au regard des thérapies conventionnelles, d’autres thérapies ciblées et immunothérapies utilisées en clinique, en espérant définir de nouvelles stratégies thérapeutiques.
Procédures
Certaines souris seront irradiées. Dans les 24 heures suivant l'irradiation, les souris seront anesthésiées puis recevront de la moelle osseuse par voie intraveineuse (injection dans la veine retro-orbitale). 6 semaines après l’irradiation, ces souris seront anesthésiées afin de réaliser un prélèvement de sang et d’analyser la reconstitution de la moëlle osseuse. Toutes les souris recevront une injection sous-cutanée de cellules tumorales et les tumeurs seront mesurées au minimum 3 fois par semaines pendant 3 à 22 semaines en fonction du modèle de tumeur. Certaines souris recevront un traitement (Chimiothérapie conventionnelle, thérapie ciblée, immunothérapie) dès que le volume tumoral atteint 50 mm3. Ce traitement sera administrés per os ou par voie intrapéritonéale. La fréquence des traitements dépend de leur nature et s’étend de 5 fois par semaine à tous les 21 jours et ce pendant 21 à 154 jours selon le modèle de tumeurs.
Impact sur les animaux
Le modèle syngénique de tumeurs sous-cutanées chez la souris qui consiste à injecter des cellules tumorales murines de même fond génétique que les souris réceptrices immunocompétentes, est communément utilisé pour l’évaluation de l’efficacité d’une thérapie dans de nombreux types de cancers. Au cours du développement de la tumeur sous-cutanée, aucune nuisance ni effet indésirable n’est observé chez la souris. Si toutefois les tumeurs grossissent très rapidement, il peut arriver qu’elles se nécrosent au centre et commencent à s’ulcérer ou à saigner. Dans ce cas, c’est un point limite et les souris seront sacrifiées. Aussi, la santé des souris et l’aspect des tumeurs seront surveillés 3 fois par semaine après injection des cellules tumorales puis tous les jours lorsque l’on se rapproche de la taille tumorale maximale. La chimiothérapie conventionnelle est bien tolérée chez la souris, les effets secondaires sont faibles et les plus fréquents sont des diarrhées. Les effets indésirables les plus fréquents associés à l’immunothérapie sont d’ordre cutanés (rash, prurit dans 15 à 25% des cas) ou gastro-intestinaux (diarrhées dans 15 à 30% des cas), dans les deux cas ces atteintes sont bénignes et réversibles dès l’arrêt du traitement. Ces effets indésirables sont les mêmes dans le cas de traitements avec des inhibiteurs de la voie des MAPK. Une photosensibilité cutanée est également souvent observée dans le cas de traitements avec certains inhibiteurs de cette voie de signalisation. Aucun effet indésirable n’a été reporté dans le cas de traitements des tumeurs chez la souris avec des inhibiteurs de la traduction. Il est important de noter que les effets indésirables observés en monothérapie sont les mêmes que ceux observés en thérapie combinée.
Devenir
18 lots de souris (soit 432 souris) serviront à réaliser des modèles syngéniques de tumeurs et seront euthanasiés en fin d’étude afin de prélever les organes nécessaires aux analyses. 90 lots de souris (soit 2160 souris) serviront à réaliser des modèles syngéniques de tumeurs afin de tester l’efficacité de différents traitements anti-cancéreux tumeurs et seront euthanasiés en fin d’étude afin de prélever les organes nécessaires aux analyses. 6 lots de souris chimères hématopoïétiques (soit 144 souris) serviront à réaliser des modèles syngéniques de tumeurs et seront euthanasiés en fin d’étude afin de prélever les organes nécessaires aux analyses. 30 lots de souris chimères hématopoïétiques (soit 720 souris) serviront à réaliser des modèles syngéniques de tumeurs afin de tester l’efficacité de différents traitements anti-cancéreux tumeurs et seront euthanasiés en fin d’étude afin de prélever les organes nécessaires aux analyses.
Remplacement
Ce projet fait suite à des nombreuses expériences réalisées in vitro dans des modèles cellulaires. Malheureusement le principe de remplacement n’est pas applicable à ce projet car les études in vitro ne reproduiraient pas l’ensemble des voies impliquées dans des modèles physiopathologiques intégrés et par conséquent ne permettent pas l’obtention de résultats scientifiques exploitables et pertinents de la pathologie humaine et l’évaluation de l’efficacité des traitements pour cette pathologie.
Réduction
Les expériences sont organisées de manière à réduire au maximum le nombre d’animaux. Les résultats préliminaires ont permis de valider que des lots de 8-10 souris selon les paramètres à évaluer permettent d’acquérir des données fiables.
Raffinement
Les animaux ont une semaine d’acclimatation avant que le protocole ne débute. Les conditions d’expérimentation font l’objet d’une procédure de suivi du bien-être animal. Les animaux seront suivis au minimum 3 fois par semaine dès l’initiation du modèle. Un animal sera euthanasié s’il présente un des points limites d’arrêt de la procédure, que nous aurons définis pour limiter la douleur, la souffrance ou l’angoisse de l’animal.
Choix des espèces
Nous disposons de souris knockout (KO) présentant des altérations de la voie des MAPK. Ces souris immunocompétentes seront utilisées pour générer des modèles syngéniques de tumeurs sous-cutanées. Ces modèles sont communément utilisés pour étudier les mécanismes moléculaires impliqués dans le développement tumoral et pour évaluer l’efficacité des thérapies anti-cancéreuses car ils reproduisent la complexité des tumeurs observées chez l’homme. Nous réaliserons des chimères hématopoïétiques qui présenteront des altérations de la voie des MAPK uniquement dans les lymphocytes B et T. La comparaison des résultats obtenus dans les deux modèles, KO total vs. chimères, permettra d’établir si l’impact des altérations de la voie des MAPK sur la croissance tumorale, le phénotype et la réponse aux traitements est extrinsèque et/ou intrinsèque aux lymphocytes. Enfin des altérations de la voie des MAPK seront réalisées uniquement dans les lymphocytes T CD4 ou T CD8 ayant un récepteur permettant la reconnaissance spécifique d'antigène présent à la surface des cellules cancéreuses.
Evaluation comportementale des effets de nouvelles entités pharmacologiques sur la mémoire émotionnelle de rongeurs, dans un contexte physiologique et dans un contexte pathologique avec un modèle du syndrome de stress posttraumatique
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
Rats : 1728
5 888 souris et rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Ils subissent un conditionnement par la peur avec chocs aversifs et, pour une partie, un modèle de stress post-traumatique qui les maintient jusqu'à trente jours dans un état de peur, d'anxiété et d'hypervigilance, certains isolés en cage. L'objet est de tester l'effet de candidats médicaments d'un centre de recherche sur la mémoire émotionnelle, les retombées cliniques étant renvoyées au long terme. Le porteur affirme qu'un processus aussi intégré que la mémoire ne peut s'évaluer in vitro et que le rat et la souris reproduisent la mémoire de peur humaine.
Objectifs
La mémoire émotionnelle correspond à la mémoire d’un évènement ayant suscité une émotion, et toutes les formes de mémoire sont plus ou moins émotionnelles. De nombreuses pathologies perturbent cette mémoire émotionnelle, et il est nécessaire de passer par des modèles animaux afin de chercher des pistes thérapeutiques. Chez le rongeur, c’est la mémoire de peur qui est classiquement évaluée comme modèle de la mémoire émotionnelle humaine. Nous utiliserons dans ce projet le test comportemental de conditionnement de peur afin d’évaluer cette mémoire de peur chez le rongeur. Il s’agit dans ce cas d’une mémoire de peur physiologique qui permet d’associer des indices prédictifs avec un danger. Cette mémoire émotionnelle physiologique est susceptible d’être modifiée par des composés pharmaceutiques, d’autant plus qu’une majorité des composés développés par notre centre de recherche ont pour cible des récepteurs de la sphère du système nerveux central. C’est pourquoi un des objectifs de ce projet est d’évaluer les possibles effets sur la mémoire émotionnelle (ici la mémoire de peur) de ces nouveaux candidats médicaments et de les comparer à des produits références. Il existe des cas où la mémoire de peur devient pathologique, quand la réponse de peur est déclenchée en l’absence des indices prédictifs d’un danger, comme chez les patients souffrant de syndrome de stress post-traumatique. A l’échelle d’une vie, cette pathologie présente une prévalence de 6-8% dans la population générale, qui s’élève à 20-30% pour les victimes d’évènements extrêmement traumatiques. Malgré le fait que le syndrome de stress post-traumatique soit reconnu comme un problème majeur de santé publique, les traitements disponibles (thérapies cognitives et antidépresseurs) ne sont que partiellement efficaces, d’où un enjeu important pour de nouveaux traitements. Notre second objectif est de développer un modèle rongeur de syndrome de stress post-traumatique afin d’évaluer l’effet de nouveaux candidats médicaments sur les symptômes de cette pathologie.
Bénéfices attendus
A court terme, et à l’échelle du laboratoire dans le développement préclinique de nouveaux candidats médicaments, ce projet permettra de caractériser leur effet sur la mémoire émotionnelle physiologique. On pourra ainsi sélectionner des composés présentant des effets pro-mémoire intéressants pour des applications dans des pathologies comportant des déficits dé mémoire (exemples : maladie d’Alzheimer, schizophrénie, autisme…). Ou à l’inverse, nous pourrons par exemple exclure du développement préclinique des molécules ayant un effet néfaste sur la mémoire émotionnelle. D’autre part, nous mettrons en place un modèle préclinique du syndrome de stress post-traumatique chez le rongeur afin d’évaluer l’efficacité de nos candidats médicaments sur les symptômes de cette pathologie. Ainsi, à plus long terme et à l’échelle du développement clinique chez l’humain, ce projet pourrait permettra de fournir des données scientifiques précliniques robustes indispensables pour le développement de nouveaux candidats médicaments, aussi bien pour les patients souffrant du syndrome de stress post-traumatique que pour d’autres pathologies mettant en jeu des déficits de mémoire.
Procédures
Ce projet comporte deux parties indépendantes réalisées sur des groupes d’animaux différents. Pour la première partie, les rongeurs seront soumis au test comportemental de conditionnement de peur en 2 étapes : une phase de conditionnement avec stimuli aversifs et un test de rappel de mémoire, chacune durant 5min pour chaque souris au sein du dispositif. Le délai séparant ces deux phases sera de 24h ou bien de 7 ou 30 jours. Des candidats médicaments seront administrés aux rongeurs à différentes phases du protocole (avant conditionnement ou rappel) selon l’effet recherché. Les administrations de produits ne dureront que quelques secondes, et auront lieu en une seule fois. Concernant la seconde partie de ce projet sur le modèle de syndrome de stress post-traumatique, les animaux seront tout d’abord soumis à un conditionnement de peur (4min avec stimuli aversifs et sons), immédiatement suivi d’une injection mimant un second stress (la durée de l'injection ne sera que de quelques secondes). Après un délai de 3-7 jours ou bien 30 jours post-trauma, les symptômes de la pathologie seront évalués par plusieurs tests comportementaux sur des jours consécutifs ou des groupes d’animaux différents (selon les résultats de la mise au point) : 1) test de la réponse au son du conditionnement de peur pendant 2 min ; 2) test de la réponse au contexte du conditionnement de peur pendant 6 min; 3) test d’anxiété pendant 5 min; 4) test de l’hyper-réactivité des animaux pendant 20 min; 5) test de dépression pendant 6 min ; 6) test d’anhédonie (diminution subjective de la capacité à ressentir du plaisir) par mesure de consommation d’eau sucrée par rapport à de l’eau standard pendant 4 jours (ce test nécessite un hébergement isolé, auquel les animaux seront habitués pendant au moins 5 jours). La phase de mise au point de notre modèle nous permettra de sélectionner les tests comportementaux pertinents pour mettre en évidence des symptômes du syndrome de stress post-traumatique. Une fois notre modèle bien caractérisé, nous évaluerons l’effet de candidats médicaments sur ces symptômes. Ces médicaments pourront être administrés soit juste après le trauma, soit juste avant les tests comportementaux qui suivront. La durée nécessaire à ces administrations de médicaments ne sera que de quelques secondes, et ceux-ci pourront être administrés en une seule fois ou bien sur plusieurs jours consécutifs.
Impact sur les animaux
Parmi les effets indésirables attendus sur les rongeurs, on aura le stress de la courte contention le temps de l’administration de produit, qui pourra également causer une courte et légère douleur dans le cas d’une injection. De plus, le conditionnement de peur comprend des stimuli aversifs qui sont susceptibles de causer une douleur passagère chez les rongeurs. Pour certaines expériences les rongeurs seront hébergés en individuel, ce qui est un facteur de stress chez ces animaux sociaux. Enfin, ce projet visant à mettre au point un modèle de syndrome de stress post-traumatique, on s’attend à l’apparition d’émotions négatives (peurs, anxiété, hypervigilance, dépression) chez les rongeurs, qui seront de plus maintenus dans cet état pendant une durée allant jusqu’à 30 jours.
Devenir
Ce projet ayant été classé dans le degré de sévérité « sévère », les animaux ne pourront pas être réutilisés dans d’autres projets et seront donc mis à mort à l’issue des 2 procédures.
Remplacement
Ce projet ayant pour but de tester l’action pharmacologique de nouveaux composés sur la mémoire émotionnelle normale et pathologique, il est nécessaire de passer par des modèles animaux. En effet, l’évaluation d’un processus aussi complexe et intégré que la mémoire, mettant en jeu de multiples aires cérébrales ne peut être réalisée in vitro ou in silico.
Réduction
Un effectif minimum de 16 souris/12 rats par groupe expérimental est prévu afin d’obtenir une robustesse satisfaisante des tests statistiques, au vu de la variabilité attendue du comportement des rongeurs dans nos tests comportementaux. Ces tests statistiques nous permettront en effet de déterminer pour chaque expérience s’il existe bien une différence entre notre groupe contrôle et notre/nos groupe(s) traités avec des composés pharmacologiques.
Raffinement
Une période d’acclimatation de 5 jours après l’arrivée des animaux est prévue avant le début des expérimentations. Tout au long des études, les animaux sont hébergés dans des cages adaptées à l’espèce avec la présence d’enrichissement de milieu (tunnel, igloo, appareil de nidification…), et avec accès illimité à l’eau et à la nourriture. Pour ce projet, l’hébergement pourra se faire soit en groupe soit dans des cages isolées mais avec contact visuel, olfactif et auditif avec les cages voisines. Les animaux sont observés chaque jour (week-end compris), et font l’objet d’un suivi du bien-être par l’expérimentateur chaque semaine avec entrée des observations (et des éventuelles actions prises) dans une base de données. Chaque animal est manipulé et pesé quotidiennement en phase active de protocole afin de diminuer le stress induit par la manipulation. Autant que possible, les animaux seront placés de manière transitoire dans des cages de transfert individuelles après l’administration de produits afin de réduire le stress induit par le replacement de l’animal au sein de ses congénères. De plus, des points limites adaptés (impliquant l'arrêt des expériences sur l'animal concerné), suffisamment prédictifs et précoces, ont été définis afin de limiter la douleur des animaux à son minimum, notamment pour les animaux soumis au protocole d'induction d'un syndrome de stress post-traumatique.
Choix des espèces
Le rat et la souris sont très classiquement utilisés dans la littérature au sein de tests comportementaux évaluant la mémoire émotionnelle, et les protocoles sont bien établis pour ces deux espèces, notamment pour le test du conditionnement de peur et pour la création de modèles du syndrome de stress post-traumatique. De plus, de nombreux parallèles existent entre les caractéristiques de la mémoire émotionnelle telle qu’elle est testée chez le rat ou la souris et les caractéristiques de la mémoire humaine. D’autre part, la souris et le rat sont deux espèces pour lesquelles il est possible d’avoir des effectifs permettant d’avoir une robustesse des résultats statistiques, et pour lesquelles les quantités nécessaires de lots de recherche synthétisés par la chimie sont minimes. Les animaux sont utilisés au stade adulte chez la souris comme chez le rat. En effet les tests de mémoire de peur et les protocoles d’induction de PTSD sont classiquement réalisés dans la littérature sur des animaux adultes, avec un développement cérébral complet et des capacités cognitives et d’attention fonctionnelles.
Etude des rôles du microbiote intestinal et d’une voie de la réponse immunitaire (ALPK1) dans le traitement des dérèglements métaboliques dans des modèles murins.
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
4 022 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent pendant six mois un régime riche en gras et en sucre, des gavages et injections quotidiens pouvant atteindre 210 gestes, une coupure de la queue pour les prises de sang et un isolement en cage individuelle que le porteur décrit comme stressant. L'objet est de comprendre le rôle du microbiote intestinal dans le diabète et la stéatose, avec des pistes thérapeutiques annoncées pour une "préoccupation majeure de santé publique". Le porteur affirme qu'aucun système in vitro ne simule le lien entre microbiote, intestin et organes, et juge le recours aux souris "nécessaire".
Objectifs
Le tube digestif est un milieu complexe dans lequel coexistent des cellules de l’hôte, une grande diversité de microorganismes (constituant le microbiote) et des molécules provenant de l’alimentation. Les bactéries et les produits qu’elle sécrètent y jouent un rôle crucial pour la bonne santé de l’hôte. Ainsi un déséquilibre de la diversité de microorganismes a été montré chez les patients atteints de maladies métaboliques comme le diabète ou stéatose hépatique non alcoolique. Notre travail de recherche vise à mieux comprendre les interactions entre l’hôte et les bactéries intestinales dans des conditions physiologiques (individus sains) et pathologiques (individus malades). Des travaux suggèrent que certaines bactéries du tube digestif et produits bactériens sont responsables de dérèglements métaboliques chez l’hôte. L’objectif de ce projet est d’explorer les mécanismes, d’identifier le rôle des bactéries et les cellules associées impliquées dans ces dérèglements dans trois modèles murins de maladies métaboliques (prédiabète, diabète et stéatose hépatique non alcoolique).
Bénéfices attendus
Les maladies métaboliques sont une préoccupation majeure de santé publique et leur incidence est en constante augmentation. Les maladies métaboliques sont associées à un régime alimentaire déséquilibré et à l’obésité. De nombreux travaux étudiant l’obésité témoignent d’une perturbation du microbiote intestinal et d’une augmentation des réponses inflammatoires dans les intestins ou dans les organes périphériques, associées à une dérégulation métabolique de l’hôte. Malgré la prise en charge thérapeutique des patients obèses, la persistance de l’inflammation et d’une perturbation du microbiote conduisent souvent à un retour de la maladie au cours de la vie de l’individu. Il apparait alors aujourd’hui essentiel d’identifier les mécanismes impliqués pour proposer des solutions permettant le dépistage et le traitement des maladies métaboliques. Ce projet amènera une meilleure compréhension de l’implication du microbiote dans la réponse inflammatoire liée à l’obésité et de ses effets sur les maladies métaboliques comme le diabète et la stéatose et ainsi proposer de nouvelles voies thérapeutiques permettant le traitement et la prévention de ces maladies.
Procédures
Pendant une durée maximale de 30 semaines, les souris recevront un régime alimentaire riche en gras, en sucre ou en cholestérol susceptible de moduler leur ingestion quotidienne et leur prise de poids. Les souris seront soumises à des injections (quelques secondes) ou des gavages (quelques secondes) quotidiens pour une période comprise entre 12 et 30 semaines soit 210 au maximum. Deux gavages et 1 injection seront aussi réalisés en fin de protocole au cours de deux tests qui seront espacés d’une semaine chacun, ainsi qu’une petite coupure à l’extrémité de la queue (1 seconde) et massage (quelques secondes). Nous effectuerons 2 collectes de fèces lors de l‘émission naturelle en début et fin de protocole. La durée maximale de la collecte est estimée à 30 min maximum. Un prélèvement de sang de la joue sera réalisé une fois sur animaux vigiles en fin de procédure avant l’euthanasie. Ce prélèvement dure 15 à 20 secondes.
Impact sur les animaux
Pour étudier l’impact du microbiote qui est différent entre les individus et suivre la prise alimentaire qui est une donnée essentielle à nos études, les animaux seront placés en cage individuelle ce qui entraine un stress modéré. Les prélèvements fécaux (émission naturelle de fèces par la souris en début et en fin de protocole) et pesées des animaux (une fois par semaine) seront réalisées sur tous les animaux dans des pots de récolte ou de pesée, ce qui entraine un stress léger. Les animaux seront soumis à des gavages et des injections quotidiens tout au long du protocole. Bien que chaque action engendre un stress léger et de très courte durée (moins de 10 secondes), cette répétition de gestes engendre un stress requalifié de léger à modéré. La procédure de prélèvement de sang nécessaire à la lecture de la glycémie (OGTT, IPGTT) et l’insulinémie (ITT) présente une douleur légère car il est réalisé via une petite coupure au niveau de la queue réalisée une seule fois par l'expérimentateur lors du premier prélèvement du test. . Par la suite un simple massage permet de prélever du sang sans avoir à recouper la queue. L'état de santé des animaux sera surveillé tout au long de l'expérience. Ces trois tests nécessitent une mise à jeun de 6 heures. Afin d’éviter une période de jeûne trop drastique lors de ces tests, ceux-ci ne seront pas réalisés durant la phase nocturne mais en phase diurne. Un délai minimum d’une semaine séparera deux tests (OGTT/IPGTT/ITT). Les bactéries (pro-ALPK1) et molécules (ADP-H, agonistes et antagonistes) administrées n’ont pas d’effet indésirable connu chez les animaux. Pour les souris soumises aux régimes riches en graisse, la prise de poids associée à ces régimes sur la durée d’exposition n’affecte pas leur mobilité.
Devenir
L’ensemble des animaux sera mis à mort à la fin de chaque procédure pour le prélèvement de leurs organes et tissus utilisés pour des analyses nécessaires à ce projet.
Remplacement
Il n’existe aujourd’hui pas de modèle ou de technique in vitro permettant de simuler un système digestif en lien avec le microbiote, l’inflammation intestinale, les tissus périphériques (foie, tissus adipeux) et la régulation de la glycémie. Le recours à des animaux est donc nécessaire pour intégrer l’ensemble des données sur les bactéries du microbiote intestinal en lien avec les données biologiques obtenues à partir des différents tissus.
Réduction
Le choix des molécules et bactéries testées dans ce projet l’ont été préalablement sur des systèmes cellulaires in vitro. Ainsi, nous avons sélectionné les bactéries et molécules les plus intéressantes et les plus activatrices pour réduire le nombre de molécules et bactéries à tester in vivo. Nous avons prévu d’inclure 12 souris par groupe expérimental, car d’après les études déjà menées au laboratoire, ce nombre apparait nécessaire afin de permettre la mise en évidence de différences statistiques significatives compte-tenu de la variabilité connue des paramètres mesurés. Nous allons tester 2 bactéries ou molécules en même temps ce qui permettra de diminuer le nombre de contrôles entrant dans le protocole expérimental. Chaque lignée de souris provient d’élevages indépendants.
Raffinement
Les souris bénéficieront d’un enrichissement avec du papier pour réaliser des nids et une maison en propylène rouge pour permettre aux souris de faire ce nid et se cacher. Elles auront également un bâton à ronger. Afin de palier au stress induit par l’isolement, les cages seront en plexiglass transparentes et mises côte à côte pour permettre les interactions visuelles, sonores et olfactives entre les animaux. Ces enrichissements permettent d'assouvir au mieux les comportements naturels de l'animal. Les animaux seront observés chaque jour (surveillance visuelle) et plus précisément deux fois par semaine au moment de la prise alimentaire quantifiée (par pesée de l’aliment) et de la prise de poids des animaux. En cas de blessure, un traitement local sera appliqué si celle-ci est légère sinon l’animal sera exclu du protocole et euthanasié. Les souris dormant le jour, nous réaliserons les mises à jeun pendant la journée afin de limiter la sensation de faim.
Choix des espèces
Les animaux auront 8 semaines au début de la procédure, âge auquel le système immunitaire est mature et le microbiote intestinal stabilisé. Le modèle souris est largement étudié dans les recherches sur les maladies métaboliques, ce qui permet l’accès à de nombreuses données physiologiques et metaboliques. Nous disposons également de données préliminaires sur ce modèle animal. De plus, les délétions de gènes spécifiques dans un type de cellules donné sont uniquement présent dans ce modèle.
Surexpression de DNM2 par croisement génétique pour le traitement de la maladie de Charcot-Marie-Tooth liée à DNM2.
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
- Troubles nerveux
216 souris vont être utilisées, toutes tuées à huit semaines, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Porteuses de la maladie de Charcot-Marie-Tooth, elles passent par des tests de force et de coordination, suspension à une grille retournée, tapis roulant et barre crantée, puis une mesure de la force musculaire sous anesthésie sans réveil. Le porteur cherche une "preuve de concept thérapeutique" par croisement génétique pour une maladie qu'il décrit comme incurable, bénéfice formulé au conditionnel. Il affirme qu'une étude sur cellules ne peut suffire car les effets sur la coordination et la force ne s'évaluent que sur l'organisme entier.
Objectifs
Le but de ce projet est de développer une preuve de concept thérapeutique pour la maladie de Charcot-Marie-Tooth (CMT) en utilisant des modèles de souris. La maladie se manifeste dans l’enfance par une faiblesse musculaire distale, une perte sensorielle et un déficit de coordination évoluant vers une incapacité motrice chez les patients adultes. La CMT est caractérisée par une faiblesse musculaire et des anomalies de gaines de myéline qui entourent et isolent les fibres nerveuses. Ces caractéristiques sont retrouvées chez les modèles souris de la CMT. Le but de notre étude est d'utiliser ces souris et de moduler l'expression du gène impliqué dans la maladie pour tenter d'atténuer les symptômes musculaires et nerveux. Nous réaliserons cette modulation par des techniques de croisement génétique.
Bénéfices attendus
Cette étude va permettre une meilleure compréhension des mécanismes pathologiques à l’origine de la maladie, causant des défauts à la fois dans le tissu musculaire et dans le tissu nerveux. Ce projet pourrait également conduire à une preuve de concept thérapeutique pour une maladie aujourd’hui incurable.
Procédures
Une partie des animaux (14) sera utilisée pour évaluer le phénotype des souris transgéniques (analyses purement observatoires de la naissance à 8 semaines). Une partie sera utilisée uniquement pour les croisements (21 ou 42). L’autre partie des animaux (entre 80 et 160 en fonction des résultats obtenus) seront soumis à une série de tests comportementaux pour évaluer la force musculaire et la coordination motrice. Pour évaluer leur force générale, leur durée de suspension à une grille retournée sera mesurée (durée 3x60s). Pour évaluer leur coordination motrice, les animaux se déplaceront sur un tapis roulant (max 60s) et une barre crantée (10x30s environ). Pour évaluer la force musculaire développée, la mesure des propriétés contractiles se fera sous anesthésie générale (procédure d’une heure, sans réveil).
Impact sur les animaux
Dans cette étude, nous utiliserons un modèle de la maladie de Charcot-Marie-Tooth dont les caractérisations ont déjà été effectuées et les animaux ne présentent aucun signe de douleur et aucune incapacité locomotrice. Pour les animaux transgéniques, la modulation d’expression du gène d’intérêt peut engendrer une faiblesse musculaire, nous effectuerons une étude de phénotype dommageable. Les nuisances ou effets indésirables causés par les différents tests phénotypiques sont les suivants : pour la mesure de force générale, le fait d’être suspendu à une grille engendre du stress physique chez l’animal.
Devenir
Les animaux de cette étude seront mis à mort à 8 semaines après caractérisation comportementale. Une étude histologique des tissus affectés sera ensuite effectuée.
Remplacement
Le modèle souris étant physiologiquement et structurellement assez proche de l’Homme, il nous permettra d’étudier d’une part la physiopathologie de la maladie de Charcot-Marie-Tooth et d’autre part de mieux comprendre les voies de signalisation impliquées dans le développement de cette maladie. De plus, une étude exclusivement réalisée sur des cellules ne pourrait pas se suffire à elle-même car les effets sur l’ensemble de l’organisme et l’évaluation de la force musculaire, de la coordination motrice et de la conduction nerveuse seraient impossibles à évaluer. Une étude sur culture de cellules mutantes ne peut être envisagée car les symptômes décrits ne se développeraient pas et la caractérisation du modèle serait alors impossible.
Réduction
Les études histologiques et procédures expérimentales seront réalisées avec un nombre d’animaux qui sera réduit au maximum pour obtenir une puissance statistique suffisante. Nos connaissances sur les modèles murins et les études réalisées sur d’autres thérapies montrent que 10 souris par sexe et par groupe pour l'étude comportementale seront nécessaires pour obtenir une étude concluante avec des tests statistiques adéquats.
Raffinement
Les nouveau-nés seront hébergés avec leurs parents jusqu’au sevrage. Pour le nouveau-né, la souffrance sera évaluée visuellement quotidiennement : capacité à se retourner, couleur de la peau, capacité à se mouvoir. Des nids seront disposés dans chaque cage et la litière sera changée hebdomadairement afin de maintenir les animaux au propre et au sec. La pesée des animaux sera réalisée 1 fois par semaine. Une perte de poids de 20% en une semaine conduira à l’arrêt du protocole. Le bien-être des animaux sera contrôlé quotidiennement afin de détecter au plus tôt les premiers signes de souffrance comme l’apathie, la prostration, l’abaissement des paupières et l’apparition d’une cyphose. Si des difficultés de locomotion apparaissent, de la nourriture sera placée dans la cage afin de soulager l’animal dans ses déplacements. Si les animaux transgéniques sont très faibles, de la nourriture en gel leur sera procurée. La plupart des tests réalisés sur les animaux dans cette étude sont non invasifs, ce qui limite la probabilité d’apparition de douleur. Pour les mesures de force in situ, l'animal sera anesthésié par injection intrapéritonéale d'un mélange de produits anesthésiants et analgésiques, permettant d'éliminer le stress et la douleur liés à la procédure. L'animal sera placé sur une plaque chauffante tout au long de la procédure pour maintenir sa température corporelle à sa valeur basale. Un contrôle visuel de la respiration sera effectué. En cas de douleur observée au cours de l’étude, un analgésique sera administré (buprénorphine à différentes doses selon l'intensité de la douleur). L'étude sera stoppée prématurément si nécessaire pour éviter des douleurs aiguës pendant de longues périodes.
Choix des espèces
Afin de comprendre les mécanismes moléculaires aboutissant à la maladie de Charcot-Marie-Tooth et d’évaluer les effets d’une thérapie, nous avons besoin d’effectuer des expériences physiologiques in vivo. Ces mesures ne peuvent pas être réalisées sur d’autres espèces évolutivement plus éloignées de l’Homme car la structure des muscles et des nerfs, les deux tissus principalement touchés, est trop différente. D’une part, une étude sur des cellules ne pourrait pas se suffire à elle-même car les effets sur l’ensemble de l’organisme et l’évaluation des bénéfices sur la structure des fibres nerveuses et musculaires, sur le la coordination motrice et la force musculaire seraient impossible à évaluer. D'autre part, une étude sur culture de cellules ne peut être envisagée car le phénotype pathologique ne se développe pas et le bénéfice sur les paramètres décrits ci-dessus ne peut être mesuré. Pour moduler l'expression du gène d’intérêt, nous ferons un croisement génétique de souris et nous étudierons les effets de ce croisement à 8 semaines, car à cet âge le phénotype de la maladie est exprimé (défauts moteurs et structurels), ainsi nous pourrons savoir assez tôt si la modulation de ce gène est bénéfique.
Déchiffrer les dysfonctionnements des barrières cellulaires et acellulaires dans les maladies cérébrovasculaires .
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système nerveux
424 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles subissent une chirurgie reproduisant un accident vasculaire cérébral par occlusion d'une artère du cerveau, suivie d'une imagerie cérébrale, puis sont tuées dans les 24 à 48 heures, une moitié sans jamais être réveillée. Le projet cherche à préciser le rôle des cellules immunitaires des méninges dans la réparation après un AVC, avec des retombées thérapeutiques présentées comme un espoir. Le porteur affirme que les organoïdes et autres substituts ne peuvent reproduire les échanges entre circulation sanguine et barrières méningées, et que seules des lignées de souris transgéniques rendent l'étude possible.
Objectifs
Lors d’un Accident Vasculaire Cérébral (AVC) il se produit une occlusion vasculaire suivie d’une reperfusion sanguine, entraînant un œdème et une inflammation. La plupart des traitements de l'AVC ont ciblé les lésions de reperfusion en bloquant les leucocytes ou les molécules d'adhésion endothéliales connues pour être essentielles dans l'inflammation périphérique, avec peu ou pas de succès. Peu d'attention a été accordée au fait que le dysfonctionnement des barrières cérébro-vasculaires et méningées est une condition préalable à l'œdème et à l'inflammation. Plus particulièrement le rôle joué par les cellules immunitaires mérite d’être investigué. En effet, les différentes études concernant l’AVC ont conduit au concept que l'équilibre entre les dommages et la réparation après un AVC dépend de l'étendue de l'inflammation. L'objectif principal de ce projet est de combler les lacunes en investiguant le rôle des cellules des méninges dans la réparation des dommages induits par un accident vasculaire cérébral.
Bénéfices attendus
Les approches thérapeutiques de l'AVC ciblant uniquement les cellules immunitaires du sang ont à ce jour échoué du fait de la méconnaissance du rôle joué par les cellules immunitaires méningées. Ce projet permettra de clarifier le rôle positif ou négatif qu'elles jouent dans la réparation d'un accident vasculaire cérébral.
Procédures
Les animaux vigiles subiront une injection intrapéritonéale de quelques secondes pour leur anesthésie et deux injections sous cutanées d'analgésiques de quelques secondes qui couvriront les douleurs post opératoires pendant 48h.
Impact sur les animaux
L’animal vigile subira un stress modéré à court terme lors de l’anesthésie ou lors de l’injection d’analgésiques. Ce stress sera de quelques secondes à quelques minutes. La durée d'immobilisation de l'animal vigile est réduite au minimum. Puis les animaux anesthésiés subiront une chirurgie avec occlusion transitoire de l'artère cérébrale moyenne, simulant un AVC, suivie ou non d'une imagerie intra-vitale. L'animal sera ensuite réveillé et gardé en vie pendant 24 ou 48 heures maximum. La moitié des animaux seront de nouveaux anesthésiés pour réaliser une imagerie intra-vitale d'une heure et ne seront pas réveillés. L’autre moitié sera mise à mort selon les méthodes réglementaires pour analyser méninges et cerveau. Après la chirurgie Il peut y avoir de la douleur au niveau de la plaie que nous réduirons par analgésie en sous cutanée. Les dommages neuronaux induits par la chirurgie peuvent induire de l’inconfort et de la douleur que nous évaluerons en post opératoire grâce à des tests adaptés et des points limites précoces. Nous arrêterons la procédure si nous n’arrivons pas à réduire la douleur par analgésie.
Devenir
Les animaux seront gardés en vie entre 24 et 48 heures maximum puisque l'étude ne nécessite pas d'aller plus avant, les effets de l'AVC sur les barrières méningées se déroulent dans les premières 48h.
Remplacement
L'objectif principal de ce projet est de combler les lacunes thérapeutiques en investigant le rôle des cellules immunitaires des méninges dans la réparation des dommages induits par un accident vasculaire cérébral. Les organoïdes ou autres moyens de substitution ne peuvent modéliser les interactions entre circulation sanguine et barrières méningées. Du fait de la complexité des échanges cellulaires ainsi que du rôle de la vascularisation dans ce procédé (pour l’apport de cellules immunes), il n’est pas possible de se passer d’un animal modèle. La capacité de différencier les cellules immunitaires venant des méninges de celles venant du sang dans les différents compartiments cérébraux, sera apportée par l''imagerie intra-vitale. Ce n'est qu'en utilisant des lignées de souris transgéniques que nous pouvons clairement distinguer les différentes compartiments du système nerveux central . Cela permettra d' analyser le dysfonctionnement de la barrière méningée dans la pathogenèse de l'accident vasculaire cérébral.
Réduction
Nous tenterons de limiter au maximum le nombre d’animaux utilisés tout en effectuant des expériences pertinentes et complètes. Pour calculer le nombre d'animaux nécessaires, on souhaite déterminer si la moyenne des valeurs observées dans une situation est égale ou différente de la moyenne observée dans une autre condition et savoir si la distribution des valeurs dans l'une et l'autre des conditions suivent la même courbe. Nous avons utilisé le logiciel de tests statistiques Gpower3.1.9.4. qui nous a permis de déterminer la taille de l’échantillon requise : 12 animaux par groupe de chaque sexe. Nous aurons des résultats d’animaux expérimentaux à comparer aux résultats obtenus sur les animaux dits « contrôles ». Cela permet d'avoir une évaluation rationnelle du nombre d'animaux pour pouvoir effectivement observer l'effet escompté.
Raffinement
Les souris seront hébergées dans des animaleries protégées, conçues dans le respect de la réglementation et des principes éthiques liés à l'utilisation d'animaux à des fins scientifiques et exemptes d’organismes pathogènes spécifiques. Les cages utilisées dans les zones ont une surface de 530 cm2. Il est possible d'y héberger 5 souris adultes d'un poids >= à 30 g. Du coton pour confectionner des nids et des dômes sont introduits dans chaque cage. - Les animaleries bénéficient d'une température régulée à 21°c, d'une hygrométrie contrôlée, ainsi que d'une photopériode contrôlée. - Les animaleries sont calmes. Les souris seront anesthésiées et sous analgésique lors des procédures chirurgicales. Elles auront également un accès facile à de la nourriture humide (contenant 70% d’eau) afin d’améliorer leur rétablissement. Le bien- être et la douleur des animaux seront évalués par une grille de score prenant en compte les paramètres physiologiques, le comportement et l'apparence pour déterminer les points limites nécessitant l'arrêt de la procédure.
Choix des espèces
De nombreux modèles physiopathologiques étant partagés entre l’homme et la souris, nous utiliserons des souches de souris consanguines ainsi que des lignées génétiquement modifiées. De plus, le vaste développement de modèles transgéniques rapporteurs permettant de visualiser certains types cellulaires nous donnera la possibilité de tester plus rapidement et plus efficacement nos hypothèses. Ce n'est qu'en utilisant ces lignées de souris transgéniques que nous pouvons clairement distinguer les différents compartiments du système nerveux central et analyser le dysfonctionnement de la barrière méningée dans la pathogenèse de l'accident vasculaire cérébral. Pour ces différentes raisons, la souris représente le modèle le plus prometteur pour effectuer notre étude. Nous utiliserons deux modèles de souris transgéniques différenciant les cellules immunitaires du sang de celles du cerveau et des méninges. Elles seront âgées de 12 à 15 semaines. En effet les modèles d'AVC se réalisent sur des souris adultes puisque c’est une pathologie de l’adulte.
Altération de l’activité corticale et maladie d’Alzheimer
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
760 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, certaines menées sous anesthésie sans réveil. Ces souris transgéniques produisant du peptide amyloïde subissent une ou deux chirurgies cérébrales, des injections pendant sept jours et des tests de mémoire, dont un conditionnement par la peur qui les expose à un stimulus redouté. L'objet est de relier l'oubli précoce d'Alzheimer à des changements de l'activité corticale, l'espoir d'identifier de nouvelles cibles thérapeutiques restant au conditionnel. Le porteur affirme que seule la souris réunit tous les critères recherchés et que les modèles in silico ne modélisent pas le cerveau entier.
Objectifs
La maladie d'Alzheimer (MA) est une maladie progressive, mortelle et est la cause principale de syndrome démentiel et en représente au moins deux tiers des cas la plus courante. MA commence bien avant le stade démentiel par l’apparition de troubles cognitifs donc le diagnostic précoce est un objectif important pour la recherche préclinique et clinique sur la MA. Il peut représenter une fenêtre thérapeutique critique où les interventions peuvent être initiées avant que ne se produise un déclin cognitif sévère. Une accumulation de peptide bêta-amyloïde (Aß) dans le cortex préfrontal est corrélée à un oubli rapide. Ensable, ils constituent un symptôme précoce de la MA qui peut être détecté par des mesures d'évaluation cognitive expérimentale et clinique bien avant l'apparition d'une démence sévère. En effet, les déficits d'apprentissage et de mémoire sont parmi les premiers symptômes rapportés par les familles de patients. Aβ a des effets sur les signalisations impliquées dans la régulation des diverses formes de plasticité corticale et donc la formation de la mémoire. L'objectif de notre projet actuel est d'aboutir à une meilleure compréhension des processus neurobiologiques qui sous-tendent les mécanismes sous-jacents de la formation de mémoire altérée aux premiers stades de la maladie. Nous proposons d'explorer les altérations corticale en tant que marqueur précoce de l'oubli anormal dans la MA.
Bénéfices attendus
La diagnose précoce de la maladie d`Alzheimer est l'étape la plus importante dans l'identification : i) de l'altération cérébrale initiale et par conséquent ii) des thérapies possibles. L'oubli précoce pourrait représenter une cible pour des études précliniques visant à prévenir ou retarder l'apparition de formes plus sévères de la MA. Notre projet vise à relier l'oubli précoce aux changements moléculaires responsables de l'altération de l'activité corticale en offrant une nouvelle voie pour l'identification de nouvelles cibles thérapeutiques.
Procédures
Les animaux subissent les interventions chirurgicales (< 40 min) réalisées sous anesthésie, pour lesquelles ils reçoivent un traitement analgésique et des soins appropriés. Ils sont soumis à une tâche comportementale classe de sévérité modère. La tâche comportemental se compose de deux épreuves, l'apprentissage de la mémoire associative et le rappel (chaque épreuve dure 6 à 7 minutes). Ils reçoivent également des injections pendant 7 jours.
Impact sur les animaux
Les animaux subissent un ou deux brèves procédures chirurgicales sous anesthésie. Les effets indésirables potentiels de ces procédures sont un inconfort modéré, une perte de poids potentielle et un risque d'infection. Les autres procédures expérimentales de ce projet comprennent des tests comportementaux : conditionnement par la peur (CdP) et procédure sans reveil. Le conditionnement par la peur peut être un événement stressant pour les souris. Afin de réduire le stress, nous gardons le groupe d'animaux en cage, ce qui leur permet d'exprimer leur comportement social naturel et nous permet de suivre le toilettage mutuel et la nidification des animaux après l'exécution de la tâche. Les projets précédents qui ont utilisé cette tâche comportementale ont montré que les animaux expriment leur comportement naturel dans les 15 minutes qui suivent la tâche, ce qui signifie que cette procédure n'entraîne pas une augmentation significative du niveau de stress. Le test est également effectué dans une pièce différente, avec des odeurs différentes de celles de la cage, afin de désactiver le lien entre la cage d'origine et l'événement redoutable.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés et leurs tissus récupérés pour les analyses post-hoc.
Remplacement
Le projet porte sur l'étude des mécanismes qui sous-tendent la mémoire dans le néocortex et leur changement dans MA. Pour mener à bien notre étude, nous aurions besoin d'un modèle : i) complexe et intact, ii) adapté à la réalisation de tests cognitif, iii) pour lequel il existe déjà des tests comportementaux validés dans la littérature scientifique, iv) qui se prête facilement à la modification de son génome, v) possédant un néocortex, vi) adapté aux approches expérimentales invasives. En accord avec la Directive Européenne et le principe des 3Rs, nous avons réfléchi à nos expériences afin d'intégrer les approches alternatives si possibles. A notre connaissance, seuls les modèles mammaliens, et plus particulièrement la souris, répondent à tous ces critères. Bien que des tests comportementaux simples soient possibles chez des espèces moins sensibles, ces animaux ne possèdent pas la structure cérébrale ciblée et par conséquent ne sont pas adaptés à l'objet de notre étude. Les études humaines ne sont pas adaptées à notre question scientifique car des tests invasifs sont nécessaires pour détecter et analyser les neurones et leur altération dans MA. Les modèles in silico actuellement disponibles ne permettent pas la modélisation au niveau du cerveau entier. Pour toutes ces raisons, et malgré notre réflexion, le recours à l'animal est malheureusement nécessaire.
Réduction
Afin de ne pas utiliser plus que le nombre minimal d'animaux nécessaire, nous avons estimé, sur la base des études précédentes, le nombre d’animaux nécessaires pour atteindre une signification statistique (stratégie : études antérieures au sein de l'équipe et étude bibliographique). Nous sommes très attentifs à l’objectif de limiter au maximum le nombre d’animaux utilisés. Pour cette raison nous proposons d'adopter une stratégie expérimentale permettant une analyse précoce de nos données au fur et à mesure (c.à.d. les expériences réalisées au fur et à mesure sur de petits lots de 4-6 animaux). Cela nous permettra de modifier la taille de l'échantillon si nécessaire selon les premiers résultats obtenus. L'utilisation de ces petits groupes permettra également de repérer rapidement les problèmes potentiels de la procédure et de modifier notre approche si nécessaire pour le lot suivant. Approche statistique : Selon les caractéristiques de nos données (normalité, variance, cohérences avec les critères de chaque test), nous appliquons les tests statistiques. Selon les caractéristiques de nos données certains tests supplémentaires seront effectués.
Raffinement
i) Surveillance quotidienne. ii) Vérification de l'état de l'animal (avant chaque manipulation) selon les critères généraux ainsi que les signes cliniques spécifiques à la manipulation. iii) Manipulation quotidienne des animaux avant les expériences pour réduire le niveau de détresse. iv) Mécanismes d'intégration des nouvelles techniques de raffinement : formation régulière des expérimentateurs, consultation de sites éducatifs tels que NC3R. vii) Adaptation des conditions d’hébergement : animaux maintenus dans des cages collectives avec l'enrichissement et le matériel pour la nidification.
Choix des espèces
Nous utiliserons la souris car nous voudrions exploiter certains modèles transgéniques impliquant la production d’amyloïde beta. À ce jour, la souris est la seule espèce mammalienne pour laquelle il est possible, d'une manière routine, de modifier le génome et pour laquelle les modèles créés ont été caractérisés au niveau comportemental et moléculaire. Selon les données précédemment rapportées et les données sur le développement de la pathologie, nous les utilisons à l'âge auquel les animaux commencent à développer les premiers signes de la maladie avant l'apparition de la maladie grave.