Rongeurs

295 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une instillation nasale d'adénovirus qui déclenche des tumeurs pulmonaires, puis des injections intrapéritonéales répétées de thérapie ciblée, de chimiothérapie et d'immunothérapie pendant vingt semaines, avec des séances d'imagerie sous anesthésie. Le porteur indique que les tumeurs, invisibles de l'extérieur, peuvent provoquer une insuffisance respiratoire et une cachexie, les souris perdant 20 % de leur poids étant mises à mort. Les retombées annoncées pour les patients atteints de ce cancer du poumon restent au conditionnel, et il affirme qu'aucun modèle in vitro ou in silico ne permet d'évaluer l'anticorps.

Objectifs

Le carcinome squameux du poumon (LUSC) est un sous-type courant de cancer du poumon. Il est la deuxième cause de décès liée au cancer du poumon, causant environ 400 000 décès par an dans le monde. La grande majorité des patients atteints de LUSC sont de gros fumeurs actuels ou anciens indiquant une forte association de la pathologie au tabagisme. Contrairement à d'autres sous-types de tumeurs du poumon, il n'existe pas encore de thérapies ciblées approuvées pour le LUSC, ce qui souligne la nécessité de développer de nouvelles approches thérapeutiques. Le projet vise en prérequis à étudier le développement tumoral dans un modèle murin de LUSC. L'objectif principal de notre projet est d’étudier l’effet d’une thérapie ciblée seule ou en association avec une chimiothérapie ou une immunothérapie sur le développement des tumeurs dans ce modèle murin. Nous analyserons pour cela l’incidence et la progression tumorale. La pertinence de notre thérapie ciblée sera également évaluée par ablation génétique de son gène. De manière secondaire, nous étudierons la biologie de notre cible thérapeutique dans ce même modèle à l’aide de systèmes rapporteurs d’expression.

Bénéfices attendus

Des options thérapeutiques limitées sont disponibles pour le LUSC à un stade avancé. Malgré une compréhension plus approfondie des altérations génétiques qui caractérisent les LUSC et des années de travaux d'essai ciblant ces altérations, les thérapies personnalisées restent peu satisfaisantes. Seule l'immunothérapie a marqué la première amélioration substantielle de la survie globale des patients atteints de LUSC depuis plus d'une décennie, mais moins d’un tiers des patients montrent un bénéfice au traitement. Les travaux présentés dans ce projet permettront une meilleure compréhension du fonctionnement de notre cible thérapeutique (et de son activité en association avec des chimiothérapie et des immunothérapies. Ils permettront également de mieux définir le profil des patients éligibles au traitement et susceptibles d’y répondre.

Procédures

Prélèvement tissulaire sur animaux vigiles, de 2 mm au niveau de la queue pour génotypage à 4 semaines postpartum. 1X 5 sec. Marquage à l’oreille à 4 semaines postpartum. 1x 5 sec. Pour l'injection de virus: Anesthésie par injection. 1X 20 sec. Durée de l'anesthésie 5 min. Pour l'imagerie intra-vitale: Anesthésie gazeuze. 1X20 sec toutes les 4 sem de 4 à 40 sem post-infection. Durée de l'anesthésie 10 min. Instillation nasale de virus 1X 5 min. Injections intraperitonéales sur animaux vigiles : Thérapie ciblée injections 2X/sem pendant 20 sem, 20 sec. Immunothérapie 2X/sem pendant 5 sem, 20 sec. Chimiothérapie 1x/sem pendant 20 sem, 20 sec.

Impact sur les animaux

Les animaux sont anesthésiés pour procéder à l’instillation nasale des adenovirus. La manipulation des souris et les diverses injections intrapéritonéales peuvent générer du stress à l’animal. L’instillation nasale des virus peut provoquer de légères lésions au niveau des narines ainsi qu’induire de la toux. Les tumeurs induites par l'adénovirus se développent au niveau pulmonaire. Elles ne sont par conséquent pas visibles de l’extérieur et peuvent occasionner une insuffisance respiratoire. Les contentions lors des pesées et des traitements peuvent générer du stress. Les méthodes d’imagerie imposent des manipulations, du transport et de l’anesthésie par inhalation qui sont autant de stress pour l’animal. Dans les traitements avec chimiothérapie, une cachexie chez certains individus (associée à une forte perte de poids). Les animaux peuvent présenter des blanchissements et refroidissement des extrémités. Ces signes peuvent être en lien avec l’affaiblissement provoqué par l’atteinte pulmonaire caractéristique de ce modèle de souris.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort et leurs tissus prélevés pour analyse à la fin de chaque procédure.

Remplacement

L’étude de la biologie de notre cible thérapeutique a été réalisée sur des lignées cellulaires au préalable. Des analyses d’expression ont été effectuées sur les données publiques. L’ensemble des résultats obtenus nous a conduit à la nécessité de recontextualiser les cellules tumorales dans leur environnement. La complexité des réponses thérapeutiques de certains traitements anticancéreux rend difficile leur étude sur des lignées cellulaires. Les modèles murins représentent en ce sens un modèle adapté qui intègre la dynamique des nombreux type cellulaires impliqués dans la mise en place de ces réponses. De plus, le modèle génétique utilisé récapitule parfaitement toutes les étapes de développement de ce type de cancer pulmonaire. Son utilisation est donc nécessaire pour évaluer l’effet d’une thérapie sur l’incidence et la progression de la maladie. La présence de tous les différents types cellulaires est nécessaire à la compréhension des mécanismes biologiques qui impliquent l’activité dde notre traitement. Il n'existe pas de modèles d'étude in silico ou in vitro permettant l'évaluation de l'efficacité de notre anticorps dans le contrôle de l’immunité et les cellules cancéreuse.

Réduction

Les travaux actuellement publiés sur ce modèle de tumorigénèse n’indiquent pas la variabilité d’apparition des tumeurs chez les individus et ne permet donc pas une évaluation du nombre d’individus par une approche de calcul statistique. Nous avons calculé le nombre minimum de souris à inclure, en prenant en compte notre expérience sur la réponse aux traitements utilisés dans d’autres modèles et pour disposer de suffisamment de matériel biologique pour rendre nos résultats interprétables. Les effectifs seront évalués au regard de la variabilité observée dans les premières expériences de mise en place du modèle. La stratégie de production des animaux et d’entretien la lignée génétiquement modifiée permet de réduire le nombre d’individus avec un génotype non désiré. 40 souriss seront utilisées pour réaliser un suivi longitudinal afin d’identifier l’hétérogénéité et la rapidité du développement tumoral de ce modèle de 20 à 40 semaines. Les temps de mise à mort pour le reste des proédures pourront être redéfinis au regard de ces résultats. L’autopsie des animaux sera réalisée afin de quantifier les lésions pulmonaires et détecter d’éventuelles invasions métastatiques (celles-ci n’ayant pas été décrites aux temps réalisés dans ce modèle). Certaines expérimentations seront faites 2 fois pour permettre différents types de prélèvements tissulaires. Les effectifs tiennent compte de la variabilité des effets de l’immunothérapie et de la chimiothérapie observée dans d’autres protocoles identiques. Dans un but de réduction, la répétition de ces expériences ne sera pas réalisée en cas d’absence d’effet mesuré. Les effectifs évalués prennent en compte la mise au point des protocoles de traitement des échantillons biologiques récupérés.

Raffinement

Dans ce modèle de souris, des petites lésions pulmonaires apparaissent à partir de la semaine 30 post induction avec le virus. 100% des animaux présentent des lésions entre 40 et 50 semaines. Tout au long de notre expérience, le suivi rigoureux des animaux permettra la recherche de tout signe de souffrance. Le poids des animaux sera évalué 2 fois par semaine selon les phases du développement tumoral. Pour l’ensemble des expériences, les signes de souffrance seront surveillés 2 fois par semaine puis 3 fois par semaine à partir d’un âge de 30 semaines. Des signes d’insuffisance respiratoire, d'amaigrissement et de prostration sont également possibles en lien avec la pathologie induite ou après l’administration de chimiothérapie. Des mesures d'enrichissement du milieu à partir de 20 semaines permettant un réchauffement des individus seront mis en place afin de limiter l’apparition d’hypothermies. De la nourriture semi-liquide sera mise dans la cage en cas de perte de poids

Choix des espèces

Le modèle de souris génétiquement modifiées utilisé est capable de générer des tumeurs pulmonaires représentatives uniquement du sous-type désiré, dans 100 % des souris et qui récapitulent les aspects génétiques, moléculaires et microenvironnementaux de la maladie humaine. L'administration nasale de virus permet la spécificité d’organe. La souris immunocompétente est le modèle le plus approprié pour faire des suivis pharmacologique dans le cadre de traitements avec des anticorps monoclonaux, de la chimiothérapie ou de l'immunothérapie. Par ailleurs la posologie des drogues utilisées est bien standardisée (voie, doses, volumes, etc...) contrairement à d'autres modèles tels que le poisson zèbre. Par conséquent, les modèles de souris immunocompétentes sont nécessaires à la réalisation de cette étude. Les expérimentations seront effectuées sur des souris jeunes adultes (âge supérieur à 7 semaines) conformément au modèle établi. Le développement tumoral pulmonaire commence à partir de 20 semaines suivant l'administration nasale de virus.

720 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une démyélinisation est induite par la cuprizone, puis les souris reçoivent un gavage quotidien pendant six semaines, des séances d'IRM sous anesthésie et, pour la mise à mort, une perfusion ou une ponction intracardiaque, afin de tester une molécule ciblant le récepteur 5-HT7 dans la sclérose en plaques. Le porteur indique n'attendre pas de douleur liée à la cuprizone mais reconnaît que les injections quotidiennes peuvent stresser les animaux. Il affirme que l'évaluation de ces ligands "nécessite l'utilisation de l'animal" pour considérer un "organisme entier".

Objectifs

L’objectif du projet est de caractériser le rôle du récepteur 5HT7 dans les processus de démyélinisation/remyélinisation, la réponse inflammatoire en particulier son rôle sur la microglie, macrophages résidents du système nerveux central. Nous déterminerons si l’activation de ce récepteur avec une molécule que nous venons de caractériser et qui cible ce récepteur permettra de ralentir les signes pathologiques dans la sclérose en plaques. Nous comparerons son efficacité par rapport à une molécule de référence ciblant également le récepteur 5-HT7 mais qui possède des propriétés pharmacologiques différentes comparées à la molécule à tester. Nous utiliserons un modèle animal de la maladie après traitement cuprizone chez des animaux sauvages et des animaux dont le gène codant pour le récepteur 5-HT7 est non fonctionnel, ceci afin d'explorer le rôle du récepteur dans le développement de la maladie.

Bénéfices attendus

Parmi les bénéfices attendus du projet, nous espérons l'identification d'une molécule qui permettra de réduire d'au moins 50% la demyélinisation et capable d'induire la remyélinisation. L'efficacité du traitement sera évaluée après analyse des images IRM obtenues et la quantification des immunomarquages qui seront réalisés après mise à mort à 6 semaines et 12 semaines pour suivre les paramètres inflammatoires et le niveau de myélinisation.

Procédures

Les animaux ne seront soumis à aucune intervention impliquant des procédures chirurgicales. Des injections par voie orale (15sec/gavage/jour) seront réalisées tous les jours pendant 6 semaines sur 220 animaux vigiles. Une partie des animaux (160 animaux) sera utilisée pour l'imagerie IRM (5 acquisitions de 45 minutes/animal réalisées à intervalle de 3 semaines). Pour se faire les animaux seront anesthésiés et placés dans l'imageur IRM pendant maximum 45 minutes pour l'acquisition des images. 80 animaux recevront un agent de contraste par voie intraveineuse sous anesthésie générale (5min/injection/animal) avant de réaliser les acquisitions IRM sous anesthésie (5 acquisitions de 45 minutes/animal réalisées à intervalle de 3 semaines). La moitié des animaux (360 animaux) recevront une dose sublétale d'anesthésique (15 sec/injection intrapéritonéale) avant perfusion intracardiaque. L'autre motié des animaux (360 animaux) sera anesthésiée sous isoflurane avant prélèvement sanguin intracardiaque (5 min/souris) et récupération des tissus.

Impact sur les animaux

Nous ne nous attendons pas à l'apparition de douleur suite au traitement cuprizone qui est ajoutée dans la nourriture. De même, le suivi par IRM n'est pas connu pour induire de la souffarnce. Cependant l'injection quotidienne de ligands du récepteur 5-HT7 peut induire un stress des animaux. Si nous n'avons pas observé d'effet indésirable après adminisstration unique, l'administration répétée peut induire différents effets indésirables tels qu'un inconfort dû à l’injection ou des effets secondaires liés au composé (comme la sédation par exemple).

Devenir

A la fin des procédures, tous les animaux seront mis à mort afin de réaliser des mesures biochimiques et histologiques (prélèvement sanguin et cerveau).

Remplacement

Des études in vitro seront réalisées en parallèle des études in vivo afin d’obtenir plus d’informations sur les mécanismes d’actions et les voies de signalisation impliquées. Cependant, l’évaluation de l’effet anti-inflammatoire et neuroprotecteur des ligands du récepteur 5-HT7 de la sérotonine nécessite l’utilisation de l’animal afin de considérer un organisme entier et de confronter l'effet de nos ligands à la complexité des mécanismes neurologiques mis en jeux dans la démyélinisation /remyélinisation induite par la cuprizone.

Réduction

Les approches décrites nécessitent des cohortes de 10 animaux minimum par groupe. Chaque expérience sera réalisée deux fois indépendamment afin d’assurer la validité statistique des résultats

Raffinement

Les souris seront hébergées en portoirs ventilés dans des cages disposant d'un environnement enrichi dès leur arrivée. Elles auront un accès à l’eau et la nourriture. Les animaux seront observés tous les jours durant la durée de chaque procédure pour s’assurer de leur bien-être et pour détecter d'éventuels signes de souffrance, en plus des pesées (2 fois/semaine). La cuprizone, contrairement aux modèles animaux d’Encephalomyélite Autoimmune Expérimentale (EAE), mimant la sclérose en plaques chez la souris, n’induit pas de paralysie de l’animal. Le suivi IRM sera effectué sous anesthésie gazeuse et les animaux seront maintenus sur un tapis chauffant à 37°C. Une grille de score, l'utilisation de points limites, d'un arbre décisionnel et de critères d'arrêt de souffrance seont utilisés. Ainsi, si un animal présente un signe de souffrance lors des observations quotidiennes, l'utilisation d'analgésique ou la décision de mise à mort sera prise en concertation avec le responsable du bien- être des animaux du projet.

Choix des espèces

La souris est un modèle animal reconnu dans le cadre des études des pathologies du système nerveux central. L’existence de nombreuses lignées transgéniques et la disposition d’outils moléculaires spécifiques (eg. anticorps spécifiques, sondes moléculaires …) ont apporté ces dernières années une meilleure compréhension des neuropathologies et ont conduit aux développements de nouvelles pistes thérapeutiques. Nous utiliserons également des souris inactivées pour le gène du récepteur 5-HT7 (5-HT7 KO), afin de discriminer l’implication des autres récepteurs de la sérotonine dans les résultats observés. Les animaux sont utilisés à l’âge adulte (8 à 14 semaines) afin de garantir un système nerveux central mature.

500 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une chirurgie du crâne avec fixation d'une pièce sur la tête, puis une dizaine de séances d'enregistrement du mouvement, d'imagerie calcique et d'électrophysiologie, pour étudier l'adaptation motrice. Le porteur reconnaît des dommages osseux et tissulaires liés à la chirurgie et une restriction en eau imposée aux souris pour les motiver pendant les tests. Il affirme que ce projet de neurophysiologie "ne peut être conduit que sur animal vivant" et libre de ses mouvements.

Objectifs

La capacité d'apprendre des programmes moteurs précis et coordonnés et de les adapter à un environnement changeant est essentielle à la survie de tous les animaux. Élucider les interactions cellulaires et réseau au cours de l'adaptation motrice nécessite un paradigme comportemental qui permet l'observation simultanée de l'adaptation neuronale et comportementale aux changements entre la réafférence perçue et attendue. Dans une expérience classique chez l'homme, la réafférence perçue est découplée de la réafférence attendue à l'aide de lunettes à prisme qui déplacent le champ visuel de plusieurs degrés tandis que les gens utilisent des mouvements balistiques pour localiser une cible dans l'espace. Chez les sujets en bonne santé, l'échec initial à localiser une cible informe les tentatives futures, et les sujets adaptent les programmes moteurs pour localiser de manière fiable les cibles extrêmement rapidement. Cependant, les patients présentant des déficits cérébelleux ne parviennent pas à adapter les programmes moteurs à la nouvelle réafférence sensorielle produite par les lunettes, vraisemblablement parce que la comparaison entre la réafférence perçue et attendue ne peut être réalisée sans le cervelet. Nous avons récemment développé une nouvelle tâche comportementale chez des souris à tête fixe qui nous permet d'utiliser l'électrophysiologie et l'imagerie pour observer l'activité de cellules individuelles dans le cerveau, et récapitule les composants essentiels de l'expérience des lunettes à prisme chez l'homme : les souris à tête fixe utilisent un membre antérieur pour contrôler un joystick qui déplace un distributeur d'eau. Nous utiliserons des techniques d'électrophysiologie et d'imagerie pour observer comment divers types de cellules du cervelet et cortex perçoivent, apprennent, et stockent la réafférence attendue générée par des perturbations de la réafférence attendue.

Bénéfices attendus

Notre recherche vise à comprendre les bases fonctionnelles qui permettent au cerveau d'effectuer des tâches motrices. Nous serons ainsi en mesure, à terme, de démontrer comment divers types de cellules du cervelet et cortex perçoivent, apprennent, et stockent des mémoires nécessaires pour adapter nos mouvements dans un environnement qui change. Une meilleure compréhension du fonctionnement des neurones dans les structures concernées est nécessaire pour permettre de diagnostiquer et traiter des pathologies neurologiques liées à des dysfonctionnements moteurs.

Procédures

Les souris de cette étude subiront 4 procédures. Les animaux subiront 1 chirurgie de < 1 heure et environ 10 séances (< 2 heures chacune) de comportement couplé à des enregistrements de mouvement d'un membre anterieur, d'imagerie calcique, et d'electrophysiologie.

Impact sur les animaux

Les chirurgies prévues par le protocole impliquent des dommages osseux et tissulaires. En conséquence, les animaux peuvent être potentiellement exposés à la douleur combinée à une perte de poids, à l'immobilité ou à un comportement anormal. Avant, pendant et après la chirurgie, nous traitons ces problèmes potentiels par l'administration de médicaments analgésiques et anti-inflammatoires. La durée typique de récupération après une opération est de 1 à 2 jours, période pendant laquelle les animaux sont traités avec ces médicaments. La fixation crânienne sur la tête va initialement induire un stress chez l'animal et réduire très légèrement sa mobilité. Après que l'animal se soit habitué et afin de s’assurer que les souris boivent au cours des expériences de comportement, les souris seront restreintes en eau. Si il y a une réduction du poids corporel qui dépasse 15 % par rapport au poids initial, le souris est donné de l’eau tout de suite.

Devenir

Tous les animaux sont mises à mort après anaesthésie pour prélèvement d'organes et analyses microscopique des cerveaux. L'étude des cellules post-mortem nous permet d'identifier la localisation et l'identité des neurones qui ont été enregistrés pendant les expériences.

Remplacement

L'intégration des informations sensorimotrices pendant les perturbations sensorielles implique de multiples régions et réseaux cérébraux. Afin de comprendre le rôle des neurones dans le comportement moteur, il est donc primordial de réaliser des expériences sur animal vivant et libre de ses movement afin de conserver la structure et l’activité des réseaux neuronaux sous-jacents. : Il s’agit d’un projet de neurophysiologie intégrative qui ne peut être conduit que sur animal vivant.

Réduction

A fin de réduire le nombre d'animaux, cette étude d'imagerie in vivo est réalisée avec des implants chroniques. Une fois implantés, les animaux sont maintenus en vie et utilisés pour de nombreuses sessions d'enregistrement. L'optimisation des soins aux animaux contribue en outre à l'utilisation d'animaux pour plusieurs sessions d'enregistrement. Enfin, nous utiliserons les tests statistiques appropriés afin d’obtenir des résultats exploitables à partir du plus petit nombre d’animaux possible.

Raffinement

Les animaux sont gardés dans des cages dans l'animalerie avec leurs congénères. Les cages seront enrichies de roues de course et des rouleaux pour se cacher. Les souris seront maintenues avec nourriture ad libitum. Leur état général sera surveillé de façon quotidienne pendant toute la durée du protocole. Pour éviter toute souffrance, tout signe de douleur, angoisse ou stress chez les animaux sera soulagé avec des analgésiques et anti-inflammatoires. Une grille précise d’évaluation des points limites sera utilisée. La surveillance régulière de l'animal permettra d'arrêter toute procédure expérimentale en cas de signes d’anxiété ou de souffrance définis dans l’échelle d’évaluation.

Choix des espèces

La souris a été choisie car nous pouvons utiliser des techniques génétiques qui ne sont pas possible avec d'autres espèces. Nous serons en mésure de mésurer et perturber l’activité dans le cerveau pendant une tâche motrice. Il s'agit de mammifères dont le fonctionnement du cerveau peut être comparé à celui de l'homme pour les questions abordées dans ce projet. Les animaux seront utilisés à partir de l’âge où structures cérébrales impliquées dans le mouvement sont maturées, au-déla de 30 jours après la naissance.

140 rattes vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. La seule intervention sur l'animal vivant décrite est un frottis vaginal quotidien pendant deux semaines, les rattes étant ensuite tuées pour prélever l'hypophyse et étudier la régulation de la fertilité femelle. Le porteur affirme que ce geste, bien réalisé, "n'induit pas de nuisance au-delà de l'acte de contention". Il indique retenir la ratte pour la régularité de ses cycles et la richesse de la littérature, aucun modèle in vitro ne recomposant selon lui ce cycle biologique complexe.

Objectifs

Chez le mammifères dont l’espèce humaine, la fonction de reproduction est contrôlée par l'axe gonadotrope, constitué par l'hypothalamus, l'hypophyse et des gonades. Dans l'hypophyse, les cellules gonadotropes jouent un rôle essentiel dans le contrôle de la fonction de reproduction. En effet, ces cellules intègrent différents signaux venus de l'organisme et secrètent en réponse deux hormones, la LH (hormone luteinisante) et la FSH (hormone folliculo stimulante) qui régulent les fonctions gonadiques et donc la fertilité. L'un des régulateurs majeurs de la fonction des cellules gonadotropes est le neuropeptide hypothalamique GnRH, mais il est maintenant bien décrit que les cellules gonadotropes sont sensibles à de très nombreux signaux comme les hormones sexuelles secrétées par les gonades, faisant de ces cellules de véritables plateformes d'intégration de signaux. De plus, le cocktail de stimulation que reçoit les cellules gonadotropes varie fortement au cours de la vie des mammifères, entraînant des modifications de secrétions des hormones gonadotropes. Cela permet la mise en place des étapes clefs de la vie reproductive comme la puberté ou le déroulement des cycles sexuelles chez les femelles. Cette stimulation complexe, associée à la complexité structurelle de l'hypophyse, composée de 6 types cellulaires endocrines chez les rongeurs, a cependant longtemps représenté un frein à l'étude des mécanismes moléculaires de l’intégration par les cellules gonadotropes. Etudier ces phénomenes complexes et dynamiques dans des modèles de cellules en culture est cependant difficile : Les modèles de cellule en culture, par nature réductionniste, peinent en effet à cette complexité physiologique, et les résultats obtenus à partir de ceux-ci traduisent donc mal les processus se déroulant dans l'animal vivant. L’avènement récent des techniques en cellules uniques représente une opportunité extra-ordinaire pour étudier les mécanismes régulant la fonction gonadotrope dans toutes leurs complexités physiologiques, dans l’animal vivant. Ces nouvelles techniques de pointe permettent, en effet, de dissequer les méchanismes moléculaires au sein même des tissus, dans toute leur complexité biologique. Ce projet permettera donc de comprendre comment les cellules gonadotropes régulent la fertilité alors que celle-ci décline dans l’espèce humaine et chez de nombreux animaux d’élevage.

Bénéfices attendus

Ce projet devrait, à cours terme, permettre de mieux comprendre comment les cellules gonadotropes intègrent une signalisation complexe et changeante afin de réaliser sa fonction de régulation hormonale de la fertilité femelle. Ce projet permettra de découvrir de nouveaux acteurs moléculaires impliqués dans la régulation de la fonction gonadotrope et donc dans la régulation de la fertilité chez les mammifères. A plus long terme, les résultats de ce projet pourraient permettre d’identifier de nouvelles causes génétiques des infertilités humaines, un sujet de préoccupation émergent dans nos sociétés modernes.

Procédures

Le projet n'inclu qu'un seul type d'intervention sur l'animal vigil: La réalisation de frottis vaginaux quotidien pendant deux semaines. Chaque frottis est réalisé en moins d'une minute (environ 10 à 30 secondes)

Impact sur les animaux

Ce projet ne fait intervenir qu’une étape, hors mise à mort, pouvant induire un éventuel inconfort : la réalisation des frottis vaginaux. Ceux-ci seront cependant réalisés par un personnel compétent qui veillera à réduire l’inconfort des animaux. Ce geste, quand il est réalisé dans les règles de l’art, n’induit pas de nuisance au-delà de l’acte de contention.

Devenir

La finalité de l'expérience est de prélever l'hypophyse. Ceci ne peut être fait sur animal vivant. L'ensemble des animaux seront donc mis à mort à la fin de la procédure pour permettre le prelevement de l'hypophyse.

Remplacement

Les modèles cellulaires in vitro ne peuvent se substituer aux modèles animaux dans ce projet car nous nous interessons à des phénomenes physiologiques qui se déroulent aux cours d'un cycle biologique complexe, impossible à recapituler fidelement in vitro. Le modèle rat est particulierement approprié car c'est le modele animal dans lequel les connaissances en physiologie de l'axe gonadotrope sont les plus pointues d'un part, et d'autre part, les rattes présentent des cycles oestriens extrêmement répétables et réguliers, en comparaison d'autres especes comme la souris. Ceci permet de selectionner des animaux de façon fiable et donc de réduire le nombre d'animaux utilisé.

Réduction

Comme indiqué si dessous, la robustesse des événements physiologiques programmant la fertilité femelle chez la ratte permet de limiter le nombre d'animaux necessaire pour obtenir des résultats significatifs. De plus, les echantillons seront analysés par des methodes de pointe en cellule unique permettant l'acquisition d'une grand nombre de donnée sur le même echantillon. Cela permettra donc de réduire le nombre d'échantillon necessaire. Un projet pilote montre que trois hypophyses prélévées au même moment du cycle donnent une representation statistiquement fiable des evenements moléculaires qui se déroulent à ce moment précis. Des expériences de confirmation des résultats ainsi acquis seront cependant necessaire et necessiteront des animaux supplementaires. Notre recul expérimental nous permet de penser que, pour les verification de l'expression des genes et des proteines, 3 hypophyses par groupe de ratte seront suffisantes. Pour les expériences necessitants des cultures primaires de cellules hypophysaires, notre experience montre que les résultats sont fiables à partir de 10 rattes par culture primaire.

Raffinement

Le projet ne fait pas intervenir de pratique invasive générant des dommages sur animaux vivants. Les frottis vaginaux necessitant toutefois une contention, les animaux seront accoutumés quotidienement à la contention et par simulation d’un frottis pendant une semaine avant le début des vrais frottis. Conditions d'environement: Les rattes seront hébergées dans les conditions suivantes: deux femelles par cage, cage enrichie de materiel de nidification et de rongeage, nourriture et eau ad libitum, cycle jour nuit 12H-12H. Points limites: L'aspect global des animaux sera évalué quotidiennement (pelage propre, présence de blessure...). En cas de signe de déterioration de l'état de santé (perte de poinds, pélage sale, prostration), les animaux seront mis à mort.

Choix des espèces

Comme déja indiqué, le rat est une espèce de choix pour l'étude des processus de régulation neuro-hormonale de la fertilité femelle chez les mammifères de part : 1) la régularité des cycles sexuels et 2) par l'existence d'une bibliographie étendue sur le sujet. Nous utiliserons des rattes femelles adultes de 8 semaines puisque nous nous intéressons à la régulation du cycle estrien qui se met en place après la puberté (7-8 semaines chez le rat Wistar)

270 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent des injections de cytokines inflammatoires, dont jusqu'à six injections directement dans le liquide céphalo-rachidien au niveau du tronc cérébral, pour provoquer une allodynie, une douleur déclenchée par un contact normalement indolore, puis subissent des tests comportementaux avant d'être tués. Le porteur reconnaît qu'il lui est "impossible de soulager la douleur de ces animaux le temps de l'expérience", puisque c'est la douleur elle-même qui est étudiée. Il affirme qu'aucune méthode alternative ne remplace l'étude in vivo de l'intégration de la douleur.

Objectifs

La douleur est un processus physiologique nécessaire à la survie : elle prévient l’organisme d’un danger imminent et permet la mise en œuvre de réponses adaptées qui visent à en limiter les effets délétères. Cependant, lorsque la douleur est chronique ou persistante, elle devient alors pathologique car elle n’offre plus aucun avantage mais provoque au contraire une extrême souffrance. C’est notamment le cas de douleurs inflammatoires qui aparaissent suite à une inflammation du système nerveux périphérique ou central. Les traitements disponibles ne sont souvent que partiellement efficaces et peuvent s’accompagner d’effets secondaires importants. Il est donc essentiel de découvrir de nouveaux traitements, et pour ce faire, de déchiffrer les mécanismes responsables de l’apparition de ces douleurs chroniques. Parmi les symptômes douloureux, nous nous intéressons à l’allodynie qui correspond à une douleur provoquée par une stimulation normalement non douloureuse qui peut être déclenchée suite à l’inflammation. En condition physiologique, les informations non douloureuses et douloureuses ne sont pas intégrées au même niveau du tronc cérébral, permettant ainsi de dissocier distinctement les deux modalités sensorielles (tact et douleur). Cependant, en condition pathologique, comme dans le cas de l’allodynie, le tact va être capable de devenir douloureux. Ce phénomène provoque l’activation de plusieurs populations neuronales, mais fait également intervenir les astrocytes, un sous-type de cellules gliales. Cependant, les mécanismes astrocytaires impliqués dans l'apparition de l’allodynie en condition inflammatoire au niveau trigéminal sont peu connus. Les résultats obtenus ont permis notamment de mettre en évidence que l’inflammation induisait une réactivité astrocytaire ainsi qu’une diminution des canaux astrocytaires. Cependant, la question de comment l’inflammation est capable d’entrainer cette dérégulation de canaux astrocytaires, ainsi que la réactivité astrocytaire reste toujours en suspend. Diverses études démontrent que certaines molécules libérées, dont les cytokines, sont capables d’activer les astrocytes. C'est pourquoi nous nous intéresserons à savoir quelle cytokine induit un dysfonctionnement et de déterminer si son blocage a des effets bénéfiques.

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettra de mieux comprendre les mécanismes centraux induisant la dérégulation d'un canal astrocytaire, impliquée dans les phénomènes d’hypersensibilité douloureuse. Au travers des résultats attendus, ce travail pourrait avoir des répercussions positives sur la recherche pré-clinique s’intéressant aux douleurs chroniques, et pourrait à terme mettre en lumière de nouvelles pistes thérapeutiques.

Procédures

Les différents gestes techniques utilisés lors de ce projet sont au nombre de 3 : • Injections intra-péritonéales : ces injections(

Impact sur les animaux

Injectant des cytokines pro-inflammatoires chez l’animal, nous nous attendons au développement d’une hypersensibilité douloureuse. Cependant, puisque nous travaillons sur la douleur, il nous est impossible de soulager la douleur de ces animaux le temps de l’expérience. Les résultats obtenus des travaux du laboratoire ne montrent pas d'effets indésirables sur les animaux mise à part le développement d'une allodynie faciale suite à une stimulation tactile. La douleur occasionnée à l’animal est estimée comme étant « modérée » (retrait de la face). Ces mesures sont peu douloureuses puisqu’elles consistent en la mesure d’un seuil avec possibilité d’échappement et n'entrainent pas de réactions visibles autres que le retrait moteur de la zone stimulée. Les rats doivent pouvoir continuer à se mouvoir, se toiletter, exercer leurs gestes habituels.

Devenir

A la fin des procédures , les animaux seront profondément anesthésiés et seront mis à mort: pour prélever les tissus nerveux d'intérêts afin de réaliser une analyse immunohistochimique, protéique ou électrophysiologique.

Remplacement

Aucune méthode alternative ne permet de remplacer ce protocole. Il est nécessaire de réaliser ces études in vivo, car l’intégration de la douleur implique de nombreuses régions du système nerveux aussi bien central que périphérique (fibres afférentes). Des études comportementales chez l’animal vivant sont donc nécessaires pour mettre en évidence l’installation d’une l’allodynie mécanique.

Réduction

Le nombre de rats par groupe a été évalué sur la base des travaux précédents en tenant compte des divers problèmes que nous pourrons rencontrer au cours des différentes phases expérimentales (lésion de notre région d’intérêt lors des injections intracisternales, problème au moment de la dissection, mauvaise apprentissage lors de l’habituation aux tests comportementaux…). Le nombre de 6 rats /groupe pour les études comportementales est d’après nos données antérieures au sein du laboratoire le minimum requis pour discriminer un effet statistique significatif . Cependant, plusieurs étapes sont limitantes donc il est préférable de prévoir 10 animaux maximum par groupe: habituation, injections médullaire et systémique,comportement, stimulation et perfusion. Pour chaque procédure, nous allons adapter notre approche statistique aux données obtenues afin d'obtenir des résultats statistiquement fiables et pertinents avec une puissance d’analyse d’au moins 70%. Si lors des procédures, 6 animaux sont suffisants, nous n'utiliserons pas plus d'animaux. Des tests statistiques seront utilisés pour déterminer le nombre d'animaux suffisant et nécessaire. Afin de limiter le nombre d'animaux, les études comportementales et immunohistochimiques seront réalisées avec les mêmes groupes.

Raffinement

Les animaux seront stabulés dans des pièces ventilées, thermorégulées (22±1 °C) avec hygrométrie contrôlée. Le cycle de lumière est inversé (lumière de 19h à 7h). L’accès à la nourriture et à l’eau se fait ad libitum et le changement de la litière se fait 2 fois par semaine. Les rats sont placés 3 par cage de 800 cm2 (enrichissement social). Les animaux seront utilisés avant d'atteindre un poids supérieurs à 300g.Des rouleaux de cartons sont ajoutés pour pouvoir se cacher et grignoter. La surveillance des animaux se fera quotidiennement par les personnes compétentes du laboratoire conformément à la législation en vigueur. L’expérimentation sera réalisée à J+7 après réception (période d’adaptation) et après 5 jours d’habituation pour les expériences encomportement. Plusieurs critères seront surveillés quotidiennement durant tout le temps des procédures, et des points limites ont été établis par une grille de scores. Les animaux seront notamment surveillés quoditiennement lors des différentes procédures. Le poids est mesuré quotidiennement. Si la perte de poids excède 15% du poids initial, les animaux seront mis à mort par injection intrapéritonéale létale de pentobarbital (150 mg/kg). Nous regarderons également l’apparence et le comportement (poils ébouriffés, animal prostré, posture anormale, vocalisations, agitation, toilettage). S’il apparait un comportement correspondant aux points limites définis par la grille de scores, alors les animaux seront exclus de l'expérimentation.

Choix des espèces

La souche de rat Sprague-Dawley est couramment utilisée et est la plus adaptée pour les études comportementales dans le domaine de la douleur en santé humaine. Nous utiliserons des animaux entre 3 à 5 et de 5 à 8 semaines (de 3 à 8 semaines), pour comparer avec les données du laboratoire.

213 rats immunodéficients vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une tumeur humaine leur est greffée sous anesthésie, puis ils reçoivent pendant quatre semaines des injections d'un anticorps testé contre les lymphomes T, avec suivi de la tumeur. Le porteur indique que la tumeur sous-cutanée peut nécroser ou s'ulcérer et devenir douloureuse, l'animal étant tué si elle dépasse 10 % de sa masse corporelle. Il affirme avoir déjà validé l'anticorps in vitro mais juge "nécessaire" de le confirmer dans un environnement "plus physiologique" pour préparer un essai clinique.

Objectifs

Les lymphomes T périphériques appartiennent au groupe des lymphomes non hodgkiniens. Diiférents sous-types de lymphomes T existent mais ils se caractérisent tous par un pronostic sombre. Le pronostic des lymphomes T périphériques traités par polychimiothérapie conventionnelle reste médiocre. L’association Cyclophosphamide, Doxorubicine, Vincristine, Prednisone (CHOP) en reste l’un des traitements de référence mais le taux de lymphomes réfractaires primaires avoisine les 30%. Lors d’un contrôle de la maladie à 5 ans tout type confondu, ce taux n’est d’environ que 20% chez les patients. Il semble primordial de définir de nouvelles stratégies thérapeutiques, qui pourraient être fondées sur l’administration de thérapies ciblées. Nous avons développé un nouvel anticorps polyclonal dirigé contre un large spectre de cibles antigéniques exprimées à la surface de différents sous-types de lymphomes T.

Bénéfices attendus

Dans le cadre du lymphome cette étude permettra de confirmer l’intérêt thérapeutique de notre anticorps polyclonal et ainsi d’offrir une vraie alternative thérapeutique aux patients atteints de lymphomes T périphériques et ne bénéficiant d’aucune prise en charge actuellement

Procédures

Les animaux seront soumis à une inoculation de tumeur humaine via injection en sous-cutanée sous anesthésie ou via injection en intra-péritonéale sous anesthésie également. Pour le suivi de chaque modèle, les animaux seront également soumis à des injections en intrapéritonéal pour les traitements avec les anticorps polyclonaux(2 fois par semaine pendant 4 semaines) ou une fois par intraveineuse pour l'admnistration de la chimiothérapie sous anesthésie. L'anesthésie pour l'injection en sous-cutanée sera de courte durée :< à 5 min par rat. Les injections intraveineuse ou intra-péritonéale seront également < à 5 min par rat. Les manipulations des rats pour les mesures des tumeurs avec le pied à coulisse se feront aussi sous anesthésie et n'excèderont pas 5 min. Elle seront couplées 2 fois par semaine à l'admnistration des traitements , de manière à ne pas multiplier les manipulations et anesthésies sur les rats

Impact sur les animaux

Les modèles tumoraux sous-cutanées peuvent provoquer de la douleur si la tumeur nécrose ou s’ulcère (points-limites). La tumeur ne devant pas provoquer de gêne pour la mobilité de l’animal, celui-ci sera mis à mort si la tumeur devient trop importante (pas plus de 10% de la masse corporelle). Aucun autre effet indésirable n’a été remarqué sur ce type de modèle au laboratoire. Les modèles tumoraux sous-cutanés sont considérés comme des procédures modérées. Les modèles PTCL peuvent induire une augmentation de la taille de la rate, mais aucune autre altération majeure n’est attendue. L’état clinique et le poids des rats seront suivies 3 fois par semaine. Ces modèles sont également considérés comme des procédures modérées.

Devenir

A la fin de chaque procédure, les animaux seront mis à mort et des organes d’intérêts (rates, ganlions) ainsi que des prélèvements sanguins pourront être récupérés pour compléter les analyses

Remplacement

L’efficacité de notre anticorps polyclonal a d’abord été validé in vitro par la reconnaissance de biopsies de patients puis la cytotoxicité tumorale a été confirmée par des expérimentations in vitro sur des lignées cellulaires. Cependant Il est nécessaire de confirmer cet effet dans un environnement plus physiologique. Cela nous permettra d’évaluer la biodistribution de notre produit dans les tissus et en intra tumoral, de déterminer la dose nécessaire et la fréquence d’administration chez l’homme dans un essai clinique basée sur les calculs de demi-vie et de pharmacocinétiques obtenus chez le rat.

Réduction

Dans le but d'utiliser un nombre d'animaux cohérent avec une pertinence statistique, nous avons défini le nombre d'animaux par groupe de 8-10 animaux selon les étapes pour l’ensemble des groupes. Ce nombre d'animaux a été déterminé en utilisant un logiciel statitisque permettant de définir le nombre d'animal optimal permettant de répondre à la question biologique posée de manière statistique.

Raffinement

Une étape d’acclimatation de 4 jours minimum sera systématiquement réalisée à l’arrivée des animaux pour éliminer le stress dû au transport et permettre l’habituation aux nouveaux locaux et personnels animaliers avant tout acte sur l’animal. La douleur sera dans la mesure du possible évitée en euthanasiant les animaux si il n'est pas possible de la supprimer par des traitements médicamenteux. En outre, les animaux sont maintenus dans un cycle jour/nuit de 12h/12h avec un accès à l’eau et à la nourriture à volonté. Le nombre d’animaux par cage est de 3 pour limiter le stress de la surpopulation. Les animaux disposeront d'un igloo en PVC.

Choix des espèces

Le rat RRGS est un rat immunodéficient qui présente un complément actif, indispensable pour le mode d’action de notre anticorps. De plus, ce modèle a déjà été utilisé pour mettre en place des modèles de tumeurs humaines Animaux : 4-8 semaines, car la prise tumorale est homogène dans cette tranche d’âge et le poids des rats est encore faible et permet donc de réduire la quantité d'anticorps polyclonaux qui seront admnistrés

320 rongeurs, souris et rats, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une pompe est implantée chirurgicalement sous anesthésie pour administrer en continu des molécules candidates, avec des prélèvements de sang à la jugulaire sous anesthésie, dans le cadre du développement de médicaments. Le porteur présente cette pompe comme un "raffinement" évitant les injections répétées, tout en reconnaissant des douleurs post-opératoires pendant 48 heures et un risque d'infection au site d'incision. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ne reflète l'absorption et le métabolisme d'une molécule dans un organisme vivant.

Objectifs

La recherche et le développement de nouveaux médicaments impliquent la réalisation de tests visant à caractériser les molécules candidates et leur comportement après administration chez l'animal que ce soit dans des études de pharmacocinétique ou d'efficacité. La réalisation de ces tests nécessite parfois d'effectuer des administrations répétées de la molécule à étudier. Les pompes osmotiques sont des pompes miniatures pouvant être implantées chez la souris, le rat ou d'autres animaux de laboratoire lors de protocoles de recherche expérimentale. Ces mini-pompes permettent d’administrer des médicaments, des hormones et d'autres substances à l’étude à des débits continus et contrôlés sur une période allant d'un jour à six semaines, sans recours à des branchements externes, ni à des manipulations fréquentes. Leur fonctionnement automatisé libère le personnel de laboratoire des astreintes liées aux injections répétées durant la nuit ou pendant le week-end et permet de raffiner les techniques d'administration des molécules. Ce projet a donc pour objectif de raffiner ces administrations grâce à la pose d'une pompe Alzet®, cette dernière permettra l'administration en continue de la molécule chez les animaux en évitant par la suite des contentions et des injections répétées, ce qui n'affectera pas leur bien-être.

Bénéfices attendus

L'ajout d'un dispositif à administration lente en continu permettra de raffiner les modèles animaux en réduisant les manipulations / contentions chez l'animal, ainsi que les éventuelles administrations répétées de molécules. L'ensemble de ces données aident à la prédiction du comportement d'un médicament lors d'une administration chez l'Homme.

Procédures

Pour la pose de la pompe Alzet® les animaux seront anesthésiés puis subiront une procédure chirugicale (durée d'intervention 10 minutes pour les procédures 1 & 3 et 20 minutes pour la procédure 2). Les animaux seront anesthésiés pour effectuer les prélèvements de sang plusieurs fois au cours des procédures, l'animal sera alors endormi puis prélevé à la veine jugulaire (durée d'intervention 5 minutes).

Impact sur les animaux

L'installation de la pompe chez l'animal peut entraîner des douleurs post-opératoires les premières 48h. Malgré l'aseptie rigoureuse pratiquée lors de l'étape chirurgicale, il est également possible que l'animal présente de légères complications (infections) au niveau de la zone incisée. Une désinfection locale de la plaie sera alors mise en place (Vétédine) et l'animal placé sous surveillance renforcée.

Devenir

Tous les animaux des procédures seront mis à mort car ils auront subi une administration de molécules et ne pourront donc pas être inclus dans un nouveau protocole expérimental. De plus, pour la plupart des tissus seront prélevés afin d'analyses complémentaires.

Remplacement

La recherche et le développement de nouvelles molécules thérapeutiques impliquent la réalisation de tests chez l’animal pour plusieurs raisons : - Il n’existe pas de modèle in vitro permettant d'intégrer et de refléter les caractéristiques d'absorption, de distribution, de métabolisme et d'élimination d'une molécule donnée au sein d'un organisme vivant. Il existe cependant des modèles cellulaires permettant d'évaluer la cytotoxicité, l'absorption et le métabolisme de molécules in vitro. Ces tests permettent d'effectuer un premier criblage de molécules, mais doivent ensuite être confirmés chez l’animal. - Des premières données concernant la pharmacocinétique, le métabolisme et la tolérance des molécules in vivo doivent être apportées avant de passer au stade clinique de développement de ces molécules (tests cliniques chez l’Homme). L'ensemble de ces données aident à la prédiction du comportement d'un médicament lors d'une administration chez l'Homme.

Réduction

Le nombre d'animaux nécessaire dans chaque lot a été défini de façon à obtenir une puissance statistique suffisante pour pouvoir interpréter et valider les résultats d'expérience.

Raffinement

La pose d'une pompe va permettre un meilleur confort de l'animal puisqu'il implique une réduction du nombre de contentions et d'administrations répétées chez ce dernier. Les expérimentateurs qui effectueront la chirurgie de la pose de la pompe sont exclusivement des personnels formés à la chirurgie et maîtrisent les bons gestes garantissant l'aseptie pendant la chirurgie ainsi que le bien-être animal en pré, per et post opératoire. Le milieu sera enrichi dans les cages (igloo, bûchettes, cotons pour nidification). Afin de minimiser le poteniel de souffrance et /ou de détresse chez les animaux, des points limites précis et spécifiques ainsi que des critères d'arrêt des souffrances seront mis en oeuvre tout au long du projet.

Choix des espèces

Les multiples homologies de séquences entre le rat, la souris et l'Homme rendent ces modèles prédictifs du comportement des molécules après administration. Il est ainsi d'un grand intérêt pour le criblage de nouvelles molécules. De plus, ces espèces présentent certains intérêts pratiques décisifs : faibles coûts, cycles de reproduction courts, croissance rapide, facilité de transport, facilité de manipulation et une très bonne adaptation aux conditions expérimentales. Les animaux seront utilisés au stade de jeunes adultes (4-10 semaines) car il s'agit du stade auquel ils sont les plus susceptibles de fournir des résultats satisfaisants. Il permet d'allier à la fois maturité sexuelle, hormonale et immunitaire. Ces modèles animaux sont ainsi adaptés aux études d'efficacité de nouvelles molécules thérapeutiques.

560 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. La lignée Harlequin utilisée présente d'elle-même un retard de croissance, une ataxie, une perte de vision et, pour une partie des animaux, hydrocéphalie, prolapsus pénien ou dermatite ulcéreuse, avant même le protocole d'injection intraveineuse d'un gène-médicament et les neuf tests comportementaux. Le porteur indique que 20 souris seront écartées pour anomalies et que la mise à mort sert à prélever cervelet et cerveau. Il affirme que la preuve d'efficacité "ne peut être obtenue que par une étude exhaustive chez l'animal", les approches in vitro restant selon lui insuffisantes.

Objectifs

Les maladies neurologiques liés à un gène défectueux sont incurables malgré les progrès de la génétique de ces 35 dernières années. Il a été démontré que des anomalies mitochondriales sont très souvent impliquées dans ces maladies. Les mitochondries sont des structures cellulaires produisant de l’énergie et régulant des processus essentiels à la vie cellulaire, spécialement des neurones. Les pathologies mitochondriales affectent un adulte sur 5000 ; le système nerveux central est atteint dans la grande majorité des patients et à ce jour aucune thérapie efficace n’existe pour améliorer leur qualité de vie. Nous avons pour objectif de développer un traitement conduisant à la surexpression du gène qui code une protéine mitochondriale sur laquelle nous travaillons depuis 12 ans et qui possède des propriétés protectrices de la fonction des neurones. Ce traitement va consister à injecter, grâce à un vecteur approprié, le gène dont nous comptons augmenter l’abondance de notre protéine d’intérêt par voie intraveineuse chez un modèle de souris souffrant d’une maladie mitochondriale qui entraine, entre autres, une ataxie cérébelleuse (trouble de l'équilibre et de la coordination). Le but de notre projet de recherche est donc de démontrer qu’en augmentant la quantité de notre protéine d’intérêt dans le cerveau et cervelet, nous pourrions améliorer l’état de santé générale de nos animaux grâce à la diminution de leurs troubles moteurs. Ainsi, une étude clinique pourrait être développée pour améliorer les conditions de vie des patients souffrant d'un éventail de maladies neurologiques.

Bénéfices attendus

Les mitochondries sont des structures cellulaires produisant de l’énergie et régulant des processus essentiels à la vie cellulaire, spécialement des neurones. Toute anomalie des mitochondries est responsable des pathologies graves qui affectent des tissus à forte demande énergétique (cerveau, cœur, muscle, foie) nommées « maladies mitochondriales ». Ces maladies sont très fréquentes (1 adulte sur 5000) et aucun traitement n’existe permettant de les soigner efficacement et de façon pérenne les patients. L'objectif de notre projet de recherche est de développer un traitement conduisant à une expression élevée du gène de notre protéine d’intérêt. Cette protéine se localise dans les mitochondries et possède des propriétés neuroprotectrices ; le traitement vise à augmenter son abondance dans les neurones. Si nous parvenons à montrer le rôle bénéfique de cette protéine pour la survie des neurones chez les souris Harlequin, nous pourrons ensuite montrer son efficacité dans d’autre modèle de maladies mitochondriales et ainsi une étude clinique chez l’Homme pourrait être initiée dans le cadre d’une grande variété de maladies neurologiques. Elle visera à améliorer les conditions de vie de patients pour lesquelles aucune thérapie n’a démontré son efficacité à ce jour.

Procédures

Le modèle expérimental utilisé présente des signes cliniques dommageables de par sa modification génétique : retard de croissance, perte de poids, atrophie musculaire, déficits moteurs, perte de la vision, troubles de l’équilibre et de la coordination. Ils sont dus à la perte des neurones dans le cerveau et le cervelet car ils ne produisent pas l’énergie requise pour assurer leur bon fonctionnement. Le gène médicament que nous testerons sera administré aux souris par voie intraveineuse. Cette injection se fera sous anesthésie générale et ne durera au maximum que 4-5 minutes. Chez certains animaux, un prélèvement de sang, sur l’œil non injecté, sera réalisé deux mois après le traitement pour vérifier l’absence du médicament dans le sang périphérique et permettre la sortie des souris traitées de la zone de confinement. Ce prélèvement se fera sous anesthésie gazeuse et durera 2 à 3 minutes. Des tests comportementaux seront réalisés 2 et 5 mois après la thérapie génique ainsi que sur un groupe d’animaux non traités. Ces tests seront réalisés sur animaux vigiles et seront répartis sur 10 jours à raison de 1 ou au maximum 2 tests par jour. Un dernier test sera effectué la semaine suivante, il sera réalisé 3 fois avec une journée de repos entre chaque test.

Impact sur les animaux

Effets indésirable liés au modèle animal : Dès leur plus jeune âge, les souris étudiées présentent un retard de croissance avec un poids corporel plus faible que la normal et une alopécie importante avec des zones des poils irrégulièrement reparties dans le corps. À partir de 4 mois d’âge, ces souris développent une ataxie qui se caractérise par des troubles de locomotion, des pertes d’équilibre, de l’incoordination des mouvements et la réduction de la force musculaire. En géneral, une perte de la vision survient chez les souris entre 6 à 8 mois d’âge. Un petit pourcentage de ces souris souffre également de : - Hydrocéphalie, excès de liquide céphalo-rachidien dans le cerveau pouvant entraîner des troubles neurologiques (2 souris /100). - Microphtalmie, réduction de la taille du globe oculaire pouvant compromettre la fonction visuelle (2 souris/100). - Prolapsus pénien, gonflement des organes génitaux qui pourrait être douloureux et empêcher l’animal d’uriner normalement (4 souris/100). - Dermatite ulcéreuse, inflammation cutanée avec démangeaison ; elle est fréquente chez la souris Harlequin à cause de leur alopécie. Effets indésirables liés au projet : Les injections intraveineuses sont réalisées sous anesthésie gazeuse ; cette dernière pourrait produire de l’hypothermie ou un arrêt respiratoire. Malgré sa rapidité, l’intervention pourrait entraîner du stress chez l’animal enfin dans de rares cas un petit saignement à l’œil pourrait se produire. Huit tests comportementaux seront réalisés, pendant 10 jours puis un dernier test sera effectué la semaine suivante, il sera réalisé 3 fois avec une journée de repos entre chaque test. Cette série de tests sera effectuée 2 mois après l’injection et avant l’euthanasie, 3 mois plus tard. La réalisation de ces tests pourrait augmenter le stress chez l’animal de par leur fréquente manipulation mais aussi de la fatigue.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés lorsque le projet sera terminé pour pouvoir utiliser les cervelets / cerveaux pour les études histologiques, biochimiques et de biologie moléculaire.

Remplacement

La démonstration de l’efficacité biologique de la thérapie génique avec notre protéine d’intérêt dans le modèle expérimental d’ataxie cérébelleuse ne peut être obtenue que par une étude exhaustive chez l’animal. Elle combinera des évaluations morphologiques et fonctionnelles du cervelet mais aussi l’étude des capacités motrices et cognitives des souris traitées pour établir une amélioration de celles-ci suite à la thérapie, amélioration qui indiquera que leur cervelet fonctionne mieux. Les études in vitro ou ex vivo (cultures de neurones cérébelleux ou tranches de cervelet) pourraient être effectuées pour compléter les études histologiques. Cependant, les données récoltées in vitro resteront insuffisantes et ne permettront pas d’aboutir à une preuve de concept robuste dans le cadre de cette étude préclinique pour rédiger une demande d’autorisation d’un essai clinique chez l’homme.

Réduction

Pour ce projet nous allons utiliser au total 560 souris dont 310 souris souffrant de la pathologie : 250 entre elles recevront les différents traitements, 40 ne seront pas traitées pour nous servir de référence et 20 seront exclues car présentant des anomalies. Pour comparer les effets de nos traitements, 250 souris en bonne santé seront également utilisées : 220 recevront les différents traitements et 40 autres ne seront pas traitées. Ces nombres ont été rigoureusement définis en fonction de notre expérience sur le modèle des souris utilisées et grâce à un calcul de puissance et du nombre des souris nécessaires. Ainsi, la taille de chaque groupe de souris incluses dans les procédures a été définie afin de récolter suffisamment de données expérimentales pour appliquer des tests statistiquement robustes.

Raffinement

Les souris seront hébergées entre 2 et 4 par cage dans des portoirs ventilés, nourries et abreuvées ad libitum. Chaque cage comportera un environnement enrichi (maisonnette en plastique ou cellulose et coton). Les pièces de l’animalerie sont maintenues à 20-22 °C avec contrôle d’humidité et un cycle jour/nuit de 12 heures. Les injections intraveineuses de chacun des vecteurs chez les souris seront réalisées sous anesthésie volatile. Si une détresse respiratoire est observée pendant l’anesthésie, la quantité d’anesthésiant sera diminuée pour entraîner ainsi une meilleure oxygénation des souris. Le site d'injection sera examiné pour rechercher un saignement ou autre traumatisme. Chaque animal sera évalué les 2 jours qui suivent l’injection pour confirmer l’absence de blessure / inflammation ou signe de souffrance dans l’œil injecté et la grille d’évaluation sera renseignée. Les souris traitées seront évaluées à deux reprises (2 et 5 mois après la thérapie génique) pour établir leurs capacités motrices et cognitives en les faisant réaliser 9 tests comportementaux. Avant ces séances, les souris auront une semaine pour s’habituer à l’expérimentateur. Le jour du test, les souris seront installées dans la pièce 30 minutes avant celui-ci pour minimiser leur stress et assurer la fiabilité des données obtenues. Huit de ces tests seront répartis sur 10 jours, puis la semaine suivante le dernier test sera réalisé afin d’éviter l’angoisse, la fatigue ou le stress des animaux ; l’ordre de réalisation de tests sera également choisi pour réduire au minimum les nuisances chez les souris testées. Par ailleurs, tous les 2 jours pendant ces séances la grille d’évaluation sera remplie de manière détaillée et avec soin pour chaque souris ; des mesures adaptées seront prises si le bien-être des souris venait à être compromis suite à ces tests.

Choix des espèces

Le modèle de souris sur lequel nous travaillons est particulièrement adapté à notre projet de recherche puisqu’il reproduit fidèlement une maladie neurologique chez l’Homme dont la cause génétique est le dysfonctionnement des structures cellulaires responsables de la production d’énergie, les mitochondries. Comme l’anomalie génétique responsable de la pathologice chez ces souris se localise dans le chromosome X, les souris mâles présentent des symptômes plus graves que les souris femelles. En effet, ces dernières accumulent deux fois plus de la protéine déficitaire chez les mâles ; ceci réduit significativement la gravité de leurs symptômes. Ainsi, des souris mâles âgées de 26-28 jours recevront le traitement par voie intraveineuse. Les souris seront soumises à un ensemble de tests comportementaux et seront euthanasiées cinq mois après le traitement ; les cervelets seront récoltés pour des évaluations morphologiques et fonctionnelles.