Rongeurs

3 340 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules tumorales sous la peau sous anesthésie, puis l'administration de composés pendant 56 jours maximum, une à deux fois par jour, avec des prélèvements sanguins répétés et une ponction intracardiaque terminale. Le projet vise à confirmer l'activité antitumorale d'inhibiteurs de kinases avant un éventuel passage en clinique, les bénéfices pour les patients étant renvoyés au conditionnel et au long terme. Le porteur affirme que le recours à la souris est "indispensable" pour obtenir des résultats transposables à l'humain.

Objectifs

Le projet s'inscrit dans un contexte de développement de nouvelles molécules thérapeutiques ciblées de la classe des inhibiteurs de protéines kinases conçues par "fragment based drug design", dans le but de traiter des pathologies à fort besoin médical en santé humaine, notamment les cancers. L’approche du « fragment-based drug design », ou conception de médicaments par la méthode des fragments, consiste à assembler des petites molécules, ou molécules fragments, dirigées contre une cible thérapeutique choisie dans le cadre d’une pathologie particulière. Chacun des fragments va contribuer à la spécificité de la molécule complète pour sa cible biologique. Ce projet se situe dans la phase d’évaluation préclinique du médicament qui marque les premiers pas de son développement. Les études précliniques ont pour but de collecter des données d’ordre pharmacologique, pharmacocinétique et toxicologique, le tout sur des modèles de protéines recombinantes, de cellules mises en culture et au sein d’organismes animaux vivants. Pour chaque composé test les études sur les modèles de cellules en culture, la pharmacocinétique et l’évaluation de la dose maximale tolérée in vivo auront déjà été évaluées en amont de ce projet, qui quant à lui permettra d’obtenir des informations d’ordre pharmacologique in vivo. Les composés testés dans ce projet auront été préalablement sélectionnés pour leurs propriétés anti-tumorales vis-à-vis de certains types de tumeurs dans des tests cellulaires adaptés et pertinents. L’objectif du projet est donc de confirmer l’efficacité anti-tumorale attendue in vivo sur des modèles murins porteurs de tumeurs pertinents.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de confirmer l’activité anti-tumorale de nouvelles molécules thérapeutiques ciblées sur des modèles vivo bien caractérisés et pertinents. Ces données, en association avec celles obtenues in vitro et in vivo au préalable permettront de poursuivre (ou stopper) le développement du médicament vers les phases d’essais cliniques. Ce projet s'inscrit dans un contexte de thérapie ciblée qui regroupe un ensemble de traitements qui s’intègrent dans une stratégie thérapeutique dite « de précision ». Ce terme est utilisé en oncologie pour caractériser les médicaments qui ciblent spécifiquement une protéine et/ou un mécanisme impliqués dans le développement tumoral, de manière à les bloquer. En théorie leur cible n’est censée être présente (ou surexprimée) que dans les cellules tumorales de certains patients, ces médicaments sont donc à priori sans effet sur les cellules saines, en opposition aux cytotoxiques qui agissent sur leur cible mais aussi sur de nombreuses autres cellules (d’où leurs effets indésirables). A plus long terme cette évaluation de nouveaux composés a donc pour but de sélectionner les meilleures molécules thérapeutiques, présentant peu ou pas d'effets indésirables dus au traitement, pour améliorer la prise en charge des patients dans le traitement de différents cancers.

Procédures

Les animaux seront anesthésiés avec une injection par voie intrapéritonéale, puis une incision sur le dos sera réalisée suivie d’une injection de cellules dans le tissus sous cutané. L’évolution pondérale des animaux et le suivi de la croissance tumorale seront faits au minimum 1 fois par semaine en même temps, et jusqu’à 3 fois par semaine pour les tumeurs à croissance rapide. Les animaux se verront administrer des composés pendant 56 jours maximum, 1 à 2 fois par jour maximum. Les administrations seront faites par injection du produit par voie orale ou intraveineuse ou intrapéritonéale ou sous-cutanée. Des prélèvements de faibles volumes de sang (microsampling) seront réalisés au niveau de la veine caudale ou de la veine mandibulaire dans le respect des volumes maximaux réglementaires. A la fin de la procédure expérimentale, les animaux seront anesthésiés avec une injection par voie intrapéritonéale et une ponction intracardiaque sera réalisée.

Impact sur les animaux

L’implantation de cellules tumorales aux animaux peut générer une perte de poids transitoire. De même l'effet indésirable attendu suite à l'administration des molécules et suite aux prélèvements sanguins répétés est une perte de poids. L’implantation sous cutanée de cellules tumorales peut entrainer un inconfort transitoire au niveau du site d’incision cutané et du site d’injection. Enfin, l'injection d'un composé test ou d'un anesthésique ou la piqure d'une aiguille pour un prélèvement peuvent générer un inconfort transitoire au niveau du site d'injection/piqure.

Devenir

Les animaux sont euthanasiés, ils ne peuvent pas être réutilisés car cela risquerait d’introduire un biais dû aux possibles interactions entre les composés testés.

Remplacement

Les molécules testées dans ce projet sont systématiquement préalablement évaluées in vitro pour leur paramètres physico-chimiques, leur activité biologique, leur selectivité pour la cible visée et leur toxicité. Ces tests permettent de ne retenir que les meilleures molécules candidates et d'avoir une première estimation de leur efficacité in vitro sur un panel de lignées cellulaires tumorales humaines, mais ils ne permettent pas de prédire leur efficacité face à la complexité des mécanismes mis en jeu dans un organisme vivant. Les modèles précliniques se doivent de mimer la réponse thérapeutique chez l’homme, et idéalement les mécanismes prédictifs de résistance. Il convient donc d’utiliser des modèles qui reproduiront la physiopathologie des cancers chez l’homme le plus fidèlement possible. Les souris constituent des organismes-modèles présentant de multiples avantages, notamment liés à leur physiologie proche de l’homme. Le recours à l’utilisation de ce type de modèle animal est donc indispensable afin d’obtenir des résultats transposables chez l’homme.

Réduction

Des études préliminaires in vitro et in vivo ont été réalisées afin de déterminer les propriétés toxicologiques et pharmacologiques des composés testés dans ce projet, ceci permettant de ne tester que les meilleures molécules candidates et d’affiner la dose et la fréquence d’injection aux animaux. Dans le cadre de la thérapie ciblée, les modèles de lignées cellulaires utilisés dans ce projet sont préalablement caractérisés au niveau moléculaire (présence de la cible) afin de s’assurer qu’ils soient pertinents et donc susceptibles de répondre aux thérapies envisagées. En effet la maitrise des modèles permet de cibler uniquement les plus pertinents, de gérer la variabilité attendue, notamment le taux de prise de greffe, et donc de réduire au strict nécessaire le nombre d’animaux greffés pour réaliser une étude d’efficacité pertinente. Le nombre d'animaux par groupe a été determiné de manière statistique afin d'obtenir des résultats analysables avec un test statistique. La réduction du nombre d'animaux utilisés dans ce projet passe également par l'optimisation de l'utilisation des groupes contrôles : dans la mesure du possible des études pourront être définies pour tester plusieurs molécules en parallèles afin de limiter l’utilisation d’animaux dans les groupes contrôles.

Raffinement

Afin d’éviter un stress des animaux lors du projet et donc d'augmenter la fiabilité des résultats, les animaux seront manipulés et habitués aux conditions expérimentales au cours de la période d’acclimatation. Au cours de la phase expérimentale les animaux seront observés quotidiennement. Leur évolution pondérale et le suivi de la croissance tumorale seront faits au minimum 1 fois par semaine, et jusqu’à 3 fois par semaine pour les tumeurs à croissance rapide. Des limites ont été définies dans le projet pour renforcer le suivi des animaux lorsqu’ils se rapprochent d’un point limite nécessitant une euthanasie, notamment au niveau des pertes de poids. Si un animal devait atteindre l’un de ces points limites il sera euthanasié. Lors de la greffe de tumeurs les animaux recevront un anesthésique et un tranquillisant afin d'éviter un stress ou une douleur. Il en sera de même pour les prélèvements de sang terminaux en fin de phase expérimentale. Pour des prélèvements de sang de faible volume au cours de la phase expérimentale, la technique de microsampling (rapide et entrainant une douleur légère liée à la piqure) sera privilégiée car elle offre la possibilité de réaliser des prélèvements répétés sur le même animal en s’affranchissant des biais interindividuels et en réduisant le nombre total d’animaux nécessaires.

Choix des espèces

Ce projet s'inscrit dans un contexte de développement d'inhibiteurs de kinases pour le traitement de pathologies dans différentes aires thérapeutiques, notamment en oncologie qui constitue le sujet de ce projet. Les modèles implantables ou de greffe dans lesquels des cellules humaines (xénogreffes) ou murines (allogreffes), préalablement cultivées in vitro, sont greffés sur des souris immunodéficientes ou immunocompétentes, sont des modèles animaux indispensables et systématiquement utilisés pour la découverte, la caractérisation et le développement de candidats médicaments en oncologie. Il est donc nécessaire d'y avoir recours pour tester l'activité anti-tumorale in vivo des molécules testées dans ce projet. Nous cherchons à nous rapprocher de la physiopathologie cible du composé développé afin de pouvoir transposer nos résultats à l’homme, les animaux doivent donc être adultes au début de la phase de traitement. De plus, nous devons prendre en compte la période de latence nécessaire avant traitement pour avoir des tumeurs bien implantées, et le fait que le taux de prise de greffe diminue avec l’âge chez certaines souris immunodéficientes. Les animaux seront donc implantés au stade de jeunes adultes, soit un âge de 6 à 9 semaines environ.

672 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Génétiquement modifiées pour reproduire la maladie de Huntington, elles subissent une injection intracérébrale par chirurgie stéréotaxique vers deux à trois mois, puis, pour une partie, des tests moteurs que le porteur qualifie de "peu stressants" et des séances d'imagerie sous anesthésie. Les souris sont ensuite tuées pour une analyse complète des tissus. Le porteur affirme que seul un mammifère doté d'un striatum et de comportements complexes permet de valider les cibles thérapeutiques visées.

Objectifs

La maladie de Huntington (MH) est une maladie génétique héréditaire provoquant la dégénérescence (mort) de neurones ce qui se traduit par l’apparition progressive de troubles moteurs, cognitifs et psychiatriques extrêmement invalidants. Le symptôme le plus visible est la chorée, qui se manifeste par des mouvements brusques, imprévisibles et involontaires qui s’étendent progressivement à tous les muscles. La maladie apparaît généralement à l’âge adulte, entre 30 et 50 ans. Il y a plus de 6000 patients en France. Cette maladie est due à une mutation affectant le gène HTT, codant pour la protéine huntingtine (HTT). Bien que cette protéine soit normalement exprimée dans tout l’organisme, la forme anormale (mutée) de la protéine HTT qui est toxique, affecte plus spécifiquement le striatum, une région du cerveau jouant un rôle central dans le contrôle du mouvement, la mémoire procédurale (mémoire dite « à long terme ») et les mécanismes d’adaptation cognitive (comme la perception ou l’apprentissage). La maladie s’étend ensuite à d’autres structures du cerveau et les patients décèdent environ 15 ans après le début des symptômes. Il n’existe à l’heure actuelle aucun traitement permettant de ralentir l’évolution de cette maladie. Une meilleure connaissance des mécanismes de la maladie est nécessaire pour trouver des nouvelles cibles thérapeutiques et développer des traitements adaptés. Selon notre hypothèse de travail, des gènes sélectivement exprimés dans le striatum pourraient être impliqués dans sa vulnérabilité spécifique dans le contexte de la MH. En partant de cette hypothèse, une comparaison des gènes exprimés par le striatum en conditions normales ou en conditions pathologiques nous a permis d’identifier des protéines spécifiques du striatum et dont l’expression est diminuée dans la MH. Nos résultats préliminaires indiquent que certaines d’entre elles ont une fonction protectrice vis-à-vis de l’huntingtine mutée. Ce projet vise à comprendre quels mécanismes moléculaires expliquent ces effets protecteurs, et fait appel pour cela à la lignée de souris transgéniques R6/1, un modèle génétique bien caractérisé de la MH. Cela nous permettra de valider sur les plans comportementaux, anatomopathologiques et biochimiques l’effet neuroprotecteur des protéines que nous avons identifiées.

Bénéfices attendus

La maladie de Huntington est une maladie génétique héréditaire qui entraine des troubles moteurs, cognitifs et psychiatriques extrêmement invalidants et qui évoluent inéluctablement jusqu’au décès du patient. Il n’existe actuellement aucun traitement curatif contre cette maladie. Il est donc nécessaire de poursuivre des recherches pour identifier des cibles thérapeutiques et développer des nouvelles stratégies de traitements. C’est le but poursuivi par ce projet qui a pour objet de tester trois nouvelles cibles thérapeutiques dans un modèle de souris pertinent et bien caractérisé de la MH. Au-delà du cas spécifique de la MH, ce projet pourrait également permettre l’identification de cibles thérapeutiques d’intérêts pour l’ensemble des maladies neurodégénératives qui impliquent des mécanismes se rapprochant de la MH et pour lesquels les options thérapeutiques sont actuellement très limitées et largement insuffisantes.

Procédures

L’ensemble des animaux seront soumis à une procédure d’injection intracérébrale pratiquée à l’âge adulte (2-3 mois) par chirurgie stéréotaxique. Cet acte chirurgical dure environ 30 minutes, est peu invasif, et les animaux récupèrent généralement très rapidement dans un délai de l’ordre de quelques heures. Ils seront toutefois sous surveillance quotidienne pendant une semaine à la suite de cette chirurgie, période à l’issue de laquelle les agrafes ou fils de suture utilisés pour refermer la plaie seront retirés. Certaines souris (224 animaux) seront soumises à des tests comportementaux peu stressants et destinés à évaluer leur capacité motrice de façon longitudinale en 4 sessions de 12 jours, avec 1 à 2 jours de repos entre chaque test. Chacun de ces tests durent entre 30 sec et 6 min par souris. Lors des sessions d’imagerie qui concernent 192 animaux, le crâne des souris sera immobilisé dans un cadre stéréotaxique sous anesthésie gazeuse légère (isoflurane 1-2%) tout au long de l’acquisition des données d’imagerie qui dure de 12 à 45 minutes en fonction du type d’image réalisé.

Impact sur les animaux

Les animaux seront soumis à différents types de manipulations qui pourront entrainer différents types de nuisances ou d’effets indésirables tels que : - Une douleur post-opératoire modérée provoquée par la chirurgie stéréotaxique. - Un stress lié à la contention lors des sessions d’imagerie. - Un stress lié à la manipulation par l’expérimentateur lors des tests comportementaux .

Devenir

A la fin de chaque procédure les animaux seront euthanasiés par des méthodes adaptées et validées, pour la réalisation d’une analyse post mortem complète des tissus.

Remplacement

Ce projet fait appel à un modèle de souris transgéniques déjà caractérisé de la maladie de Huntington. A l’heure actuelle, ce projet ne peut, ni être réalisé à l’aide de modèles cellulaires, ni être simulé par des techniques informatiques. En effet les symptômes neurologiques (moteurs et cognitifs) de la maladie ne peuvent être répliqués que chez l’animal, notamment dans les modèles génétiques murins. Par ailleurs, l’expression des protéines d’intérêt pour le striatum est quasi absente dans les modèles de cultures de cellules striatales. Leur expression est détectée principalement dans le cerveau « adulte », totalement « différencié » (ayant subi toutes les étapes du développement) et requiert toute la complexité des réseaux neuronaux qui se mettent en place au cours de la maturation du cerveau. Au final, seule une approche sur un mammifère modèle possédant un cerveau complexe doté d’un striatum et exprimant des comportements sophistiqués peut nous permettre de valider des nouvelles cibles et stratégies thérapeutiques d’intérêts pour la MH.

Réduction

Une simulation statistique précise a été réalisée pour déterminer le nombre minimum d’animaux par groupe, nécessaire pour observer des effets significatifs compte tenu des valeurs attendues. Cette simulation est fondée, d’une part, sur des données obtenues dans la littérature scientifique et, d’autre part, sur les résultats que nous avons observés dans le passé lors d’expériences utilisant des analyses similaires. Ainsi, nous prévoyons d’utiliser 672 animaux lors des expériences qui seront menées pendant les 5 années de l’étude. Ce nombre maximum (comprenant des groupes témoins de référence) a été déterminé en fonction des expériences à réaliser et des différents groupes expérimentaux requis pour pouvoir répondre à notre question scientifique. Pour minimiser le nombre d’animaux utilisés dans le projet nous prévoyons que les groupes inclus dans les différentes procédures puissent être étudiés sur différents paramètres. Par exemple les animaux inclus dans la procédure 1 permettront de déterminer l’effet des cibles étudiées sur des critères comportementaux et histopathologiques, et ceux inclus dans la procédure 3 permettront une caractérisation par imagerie in vivo, qui sera corrélée à une analyse histologique.

Raffinement

Le suivi quotidien des souris hébergées en groupe dans un milieu enrichi, fournissant une palette de stimulations cognitives et motrices pour les animaux, et l’application de critères d’arrêt en élevage et en expérimentation permettra de garantir leur bien-être. En cas d’apparition d’effets inattendus, le vétérinaire de l’installation sera alerté afin de mettre en œuvre des traitements appropriés. L’état de santé des animaux sera surveillé tout au long de l’expérience. Les protocoles d’anesthésie et d’analgésie des procédures chirurgicales ont été définis et validés par une équipe vétérinaire. Des échelles cliniques journalières permettant d’évaluer l’état de santé des animaux, un soutien nutritionnel adapté et l’application de critères d’arrêts permettent de veiller au bien-être des rongeurs. Les animaux bénéficieront de périodes de récupération suffisantes après les anesthésies générales et les gestes chirurgicaux. Les tests comportementaux seront précédés par une phase d’habituation à l’expérimentateur afin de minimiser le stress et d’assurer une reproductibilité optimale de ces expériences.

Choix des espèces

La région la plus touchée du cerveau des patients atteints de la maladie de Huntington est le striatum. Les modèles invertébrés ne possèdent pas de striatum. Les souris envisagées dans ce projet permettent d’étudier les neurones striataux dans leur environnement cérébral complexe. Ces souris expriment la partie du gène qui porte la mutation, mimant ainsi le défaut génétique observé chez les patients atteints par la maladie de Huntington. Elles présentent aussi des altérations motrices et cognitives et des altérations cellulaires caractéristiques de la maladie de Huntington. La maladie de Huntington est une maladie qui se déclare chez l’adulte mais qui présente des déficits subtils dès le début du développement du cerveau et qui s’aggravent avec le temps. Ce projet vise à valider des cibles thérapeutiques susceptibles d’avoir un effet neuroprotecteur dans la maladie. Pour cette raison les animaux seront traités avant l’apparition des symptômes (2 mois) et les effets sur la pathologie seront étudiés à des stades précoces (jusqu’à 5 mois).

4 650 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent sous anesthésie une greffe de cellules cancéreuses sous la peau du dos, puis des chimiothérapies par voie intra-péritonéale et des molécules par gavage pendant quatre semaines, avec des effets attendus de fatigue, diarrhées, troubles cognitifs et perte de poids. Les souris sont tuées après un prélèvement de sang par ponction cardiaque, pour étudier le rôle de certains lipides dans la résistance des tumeurs aux traitements. Le porteur affirme que des études précliniques sur animaux sont "incontournables" pour saisir la pharmacocinétique des molécules.

Objectifs

Dans la lutte contre le cancer, des échecs thérapeutiques persistent à cause de mécanismes de résistance des tumeurs aux traitements en partie dû à une production accrue de lipides qui constituent la matière grasse du vivant. Dans le cadre des cancers colorectaux (CCR), les travaux de notre équipe ont montré que la résistance des cellules coliques aux traitements des CCR est associée à une augmentation de la quantité de gouttelettes lipidiques (GL), réservoirs de lipides régulant les besoins énergétiques de la cellule, ainsi qu’à la surexpression de l’enzyme lysophosphatidylcholine acyltransferase 2 (LPCAT2), impliquée dans la production de la phosphatidylcholine (PC). La PC est un lipide majeur des membranes cellulaires, séparant l’intérieur des cellules de leur environnement extérieur. Ainsi, l’utilisation de molécules capables de réduire et/ou moduler les taux de PC et GL semble être une approche prometteuse afin de restaurer une sensibilité des cellules résistantes aux agents anticancéreux. La 1ère partie de ce projet s’attachera donc à confirmer chez la souris la capacité de 4 composés candidats à agir comme modulateurs de la production de PC et des GL et sensibiliser les cellules tumorales coliques aux chimiothérapies utilisées en clinique. Nous utiliserons des modèles de souris greffés par des cellules coliques murines surexprimant ou non LPCAT2 et des souris dépourvues de système immunitaire greffées par des cellules coliques humaines résistantes et sensibles aux traitements. La 2ème partie de ce projet concerne l’étude d’autres lipides que sont les cardiolipines (CL), dans la progression et résistance aux chimiothérapies. Les résultats de l’équipe ont montré que des cellules du cancer du col de l’utérus résistantes à un agent anticancéreux, l’Aplidine®, présentent des teneurs en CL supérieures à celles des cellules sensibles. De plus, ces altérations sont associées à une modulation de la composition des CL, corrélée à une altération des enzymes de production dont la cardiolipin synthase 1 (CRLS1) et la tafazzin (TAZ), contribuant à diminuer la sensibilité des cellules à la mort cellulaire induite par l’Aplidine®. Ainsi, il s’agira de confirmer l’implication des enzymes de production des CL dans la résistance à l’Aplidine®. Nous utiliserons des modèles de souris immunodéficientes greffés par 2 modèles cellulaires humains de cancer du col de l’utérus, des cellules sensibles et résistantes génétiquement modifiées pour CRLS1 et TAZ.

Bénéfices attendus

La première partie de ce projet de recherche devrait permettre d’approfondir les relations existantes entre les altérations des voies de biosynthèse des lipides complexes, en particulier, celles de la phosphatidylcholine (PC) et les phénotypes de résistance des cancers colorectaux (CCR). Ce projet viendrait également soutenir le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques visant à augmenter l’efficacité des traitements chimiothérapeutiques notamment grâce à l’identification de nouvelles molécules bioactives/d’origine naturelles ou de formulations capables de cibler/d’inhiber la production de PC des tumeurs coliques et d’agir en synergie avec les chimiothérapies conventionnelles, réduisant la toxicité et les effets secondaires de ces dernières. Ainsi, ces travaux conforteraient l’utilisation potentielle en clinique de certaines de ces molécules en complément des traitements conventionnels des CCR. De plus, cette étude devrait mettre en exergue le potentiel de l’analyse des teneurs plasmatique en PC en tant que nouveau biomarqueur pronostique non invasif des CCR. La seconde partie de ce projet viendra renforcer les quelques données de la littérature suggérant qu’une dérégulation de la quantité et de la qualité (composition) des cardiolipines (CL) pourrait influencer la sensibilité des cellules tumorales aux drogues de chimiothérapie. Par ailleurs, à ce jour, la contribution d’une production exacerbée des CL via l’enzyme cardiolipin synthase 1 (CRLS1) dans la résistance tumorale a été montré uniquement dans un contexte de carcinome hépatocellulaire résistant à la radiothérapie. De plus, ce projet permettrait, à plus long terme, d’étendre ces observations à d’autres agents chimiothérapeutiques, ainsi qu’à d’autres types de cancers tels que le cancer colorectal, un cancer récidivant et agressif, ce qui permettrait d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques afin de contrecarrer les mécanismes de résistance.

Procédures

Les souris seront soumises à une anesthésie gazeuse pendant 10 minutes maximum et recevront une injection sous-cutanée de cellules cancéreuses sur le bas du dos à l’aide d’une seringue. Cette injection se réalise en 10 secondes par souris. A partir de ce moment-là, chaque souris entre dans une phase d’expérimentation de 5 semaines maximum avant la mise à mort. Un suivi de la croissance tumorale et du poids des animaux seront réalisés tous les 2 jours, des mesures qui se font respectivement en 10 et 5 secondes pour chaque animal. Les traitements par 2 chimiothérapies et 4 molécules naturelles/chimiques seront administrés respectivement par voie intra-péritonéale (ip) à raison d’1 à 5 fois par semaine pendant 1-3 semaines , et par voie orale (gavage) quotidiennement pendant 4 semaines, et à raison de 1 à 3 concentrations par molécule. Chacune de ces administrations se fera en 15 secondes maximum par animal, prise de l’animal par l’expérimentateur comprise. Sur une partie des animaux sera réalisé un prélèvement sanguin par ponction intra-cardiaque sous anesthésie préalable. Ce prélèvement se réalise en 20 secondes environ pour chaque animal.

Impact sur les animaux

Bien que la croissance et la masse tumorale puissent entrainer une potentielle gêne pour l’animal au cours du temps, la gêne au mouvement pouvant contribuer à une diminution de la mobilité dans la cage devrait être minime compte tenu de notre choix de localiser la greffe de cellules cancéreuses sur la région dorsale de l’animal. Des effets secondaires associées au traitement chimiothérapeutique pourront être observés tels que des signes de fatigue, des diarrhées, des troubles cognitifs et une perte de poids. Afin de prévenir ou diminuer toutes nuisances qui pourraient survenir suite à la répétition des injections en intrapéritonéal (inconfort lié au volume et à la température des solutions injectés, risque de contamination qui peut causer une infection et irritation au site de l’injection), nous veillerons à respecter les règles décrites dans la partie Raffinement (5.10.3).

Devenir

A la fin de la procédure expérimentale, tous les animaux seront euthanasiés. Pour les expériences de mise au point des doses de traitement, compte tenu du fait que les animaux sont porteurs de tumeurs, même si des régressions tumorales pourront être observées en fonction des traitements, une reprise de la croissance tumorale après la période d’arrêt des traitements est toujours possible et nécessite le sacrifice de l’ensemble des souris pour se prémunir de la souffrance qui peut en résulter. Concernant les expériences avec la dose adéquate de traitement, des analyses des teneurs et composition en lipides plasmatiques seront réalisées à partir du sang des souris. De ce fait, les souris seront mises à mort après prélèvement sanguin.

Remplacement

Les travaux réalisés jusqu’à présent sur différents modèles cellulaires ont pu montrer d’une part, que des molécules d’origine chimique ou naturelle sont capables de chimiosensibiliser les cellules résistantes aux chimiothérapies conventionnelles au travers l’inhibition du métabolisme lipidique, en particulier celui de la phosphatidylcholine (PC), et d’autre part, que des lipides complexes tels que les cardiolipines (CL) peuvent constituer des cibles thérapeutiques prometteuses pour contrecarrer les mécanismes de résistance. Des études précliniques avec des animaux sont incontournables pour la finalité de ce projet puisqu’il est nécessaire d’identifier les effets indésirables potentiels des traitements utilisés ou non en combinaison, mais également de considérer l’aspect pharmacocinétique et pharmacodynamique des molécules incluant le processus de transformation de ces molécules par l’organisme (pouvant conduire à une augmentation de leur efficacité ou bien une perte de leur efficacité). En outre, l’utilisation de souris immunocompétentes et au système immunitaire déficient, permettra d’évaluer si le système immunitaire joue un rôle clé dans le processus de chimiosensibilisation des molécules.

Réduction

Les différents modèles cellulaires utilisés au cours de ce projet chez des souris présentant un système immunitaire déficient ou non est parfaitement maitrisée au sein de notre équipe, évitant ainsi de réaliser des étapes de mise au point de greffes de cellules tumorales et réduisant le nombre d’animaux. Pour chacune des expériences, nous utiliserons des groupes de 10 souris maximum, ce qui correspond à la taille d’échantillon minimum nécessaires à la réalisation de tests statistiques.

Raffinement

Afin de prendre les mesures nécessaires pour améliorer le bien-être animal, les souris seront observées quotidiennement par le personnel de l’animalerie et lors de chaque intervention des expérimentateurs (injection, pesées, mesures de tumeurs…). Les souris disposeront d’une phase d’habituation à être manipulées par les expérimentateurs pour réduire leur appréhension. Des antalgiques seront utilisés en cas de douleur observée. Si les points limites que nous avons établis sont atteints, les souris seront euthanasiées selon la méthode choisie. Les souris seront hébergées en groupe pour favoriser les contacts sociaux, avec un enrichissement du milieu approprié. Un contenant sera placé dans chaque cage leur permettant de se cacher et de développer leur répertoire comportemental. La nourriture et l’eau de boisson seront fournies ad libitum.

Choix des espèces

Étant donné que l’objectif à long terme sera d’évaluer l’efficacité de nos molécules d'intérêt en thérapie anticancéreuse, nous devons utiliser une espèce présentant une physiologie proche de l’Homme, telle que la souris, qui est un modèle de référence en cancérologie. Par ailleurs, les études antérieures pré-cliniques de notre équipe ont été réalisées chez la souris, dont les résultats ont pu être transposés chez des patients. L’injection de cellules cancéreuses humaines nécessite l’utilisation d’animaux NSG qui sont des modèles génétiquement modifiés présentant un système immunitaire déficient. Les souris d’espèces BALB/c (immunocompétente) seront également utilisées afin de se rapprocher au maximum des conditions physiologiques en présence d’un système immunitaire compétent. De plus, le modèle cellulaire de cancer du côlon murin CT26 que nous utilisons présente le même fond génétique que la souris d’espèce BALB/c. Nous utiliserons des souris âgées de 8- 12 semaines car elles sont considérées comme adultes. En effet, dans le cadre de notre étude, nous avons besoin que les animaux aient atteints l’âge adulte et, en ce qui concerne les modèles de souris immunocompétentes, soient dotées d’un système immunitaire fonctionnel.

60 souris mâles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Rendues obèses par leur alimentation, elles reçoivent une supplémentation en poudre de baie de goji et subissent des prises de sang par incision de la queue, des tests de tolérance au glucose et à l'insuline par gavage et injection, et des isolements temporaires que le porteur relie à un stress social. Les souris sont ensuite tuées pour prélever leurs tissus. Le porteur affirme que l'effet d'une telle supplémentation ne peut s'étudier qu'in vivo.

Objectifs

Les effets santé des baies de goji ont été partiellement étudiés et plusieurs travaux rapportent un effet protecteur vis-à-vis de l’homéostasie glucidique qui semble en partie lié aux polysaccharides, et est très probablement imputable à un effet sur le microbiote. La baie de goji est également riche en phytomicronutriments comme les caroténoïdes ou les composés phénoliques. Cependant, le rôle de ce cocktail de phytomicronutriments dans les effets santé de la baie de goji reste mal compris. En particulier, les interactions entre phytomicronutriments et fibres pourraient jouer un rôle majeur sur la bioaccessibilité et la métabolisation des phytomicronutriments par le microbiote. De plus, les baies en provenance de la Chine sont essentiellement consommées sèches, et les modalités de séchage induisent sans doute des modifications de l’état d’oxydation des phytomicronutriments, de la structure physique et chimique des polysaccharides ainsi que des interactions phytomicronutriments-polysaccharides.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à mieux évaluer l’impact des conditions de culture et des traitements post-récolte sur la santé métabolique. Ce projet s’insère dans un projet plus large qui permettra in fine d’améliorer les effets santé de la baie de goji avec une combinaison innovante du choix de génotypes, de pratiques culturales et de technologie alimentaire.

Procédures

Un prélèvement de sang sur animal vigile sera réalisé au début de l'étude et après 6 semaines (2 au total). Pour ce faire les animaux seront mis sous contention durant environ 2 minutes. Un test de tolérance à l'insuline et un test oral de tolérance au glucose seront pratiqués respectivement en 9ième et 10ième semaine. Ces tests necéssitent une mise en contention d'une minute pour réaliser un gavage (dans le cas du test de tolérence au glucose), et une injection intrapéritonéale (test de tolerance à l'insuline). Le déroulé du test nécessite ensuite une mise en isolement des animaux de 2 heures afin de suivre l'évolution de leur glycémie apres micro-incision du bout de la queue. Un test de perméabilité intestinale sera réalisé en semaine 11. ce test nécessitera une mise en contention d'une minute pour réaliser le gavage avec la solution de FITC-dextran. Lors de la procédure, 3 recueils de fèces nécessitant d’isoler temporairement (environ 30 minutes) l’animal seront effectués.

Impact sur les animaux

Stress social lié à l'isolement de l'animal de ses congénères lors du test de tolérance à l'insuline, du test de tolérance au glucose et du recueil de fecès. Douleurs possibles lors de l'incision à la queue pour les prises de sang, du perçage des oreilles pour l'identification des animaux et lors du gavage avec une dose de glucose (test de tolerance au glucose), ou une dose de FITC-dextran (perméabilité intestinale) et lors des injections intrapéritonéales d'insuline (test de tolérance à l'insuline). Ces nuisances ou effets indésirables sont toutes temporaires et réversibles.

Devenir

Les animaux de cette procédure seront mis à mort afin de prélever les tissus d'interet qui seront ensuite étudiés (expression génique, histologie, dosages protéiques) et de démontrer les effets métaboliques de la supplémentation en poudre de baie de goji.

Remplacement

L’étude d’une supplémentation en poudre de baie de goji sur la santé métabolique ne peut s'envisager que dans un modèle in vivo. Les souris C57Bl/6J sont un modèle largement utilisé et reconnu pour les études sur le métabolisme.

Réduction

Le nombre d'animaux (10 par groupes) est le nombre minimum nécessaire pour mettre en évidence des différences significatives entre les groupes, notamment en ce qui concerne la prise de poids.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en cage de 3 ou 4, et l'environnement sera enrichi par la présence d'un igloo en plastique ou en carton. Les animaux seront manipulés régulièrement pour les habituer à notre contact et ainsi limiter leur stress. Des conflits entre animaux au sein d’une même cage pourraient se produire et engendrer des blessures. Dans ce cas, l’animal blessé sera soigné et placé dans une cage individuelle permettant de garder des contacts visuels, olfactifs et auditifs avec ses congénères jusqu’à la fin du protocole. Des points limites gradés et précis ont été définis pour chaque acte expérimental. Un arbre décisionnel en focntion des observations faites permettra l'applicatiob des points limites et la mise en application de critères d'arret.

Choix des espèces

Le modèle souris est un modèle reconnu pour les études portant sur l’obésité et les pathologies associées. Les mécanismes d’adaptation à une alimentation riche en matière grasse chez la souris sont très proches des mécanismes observés chez l’Homme. Les animaux seront âgés de 6 semaines à l’achat et d’environ 7 semaines lors du début du protocole. Ces animaux correspondent donc à de jeunes adultes, afin de ne pas faire intervenir de paramètres confondants tels que le vieillissement.

917 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent sous anesthésie une greffe de fragment de tumeur humaine ou une injection de cellules tumorales, suivies de jusqu'à quatre injections de virus dans la tumeur, pour tester des virus dits oncolytiques contre le cancer. Le porteur indique que la tumeur peut évoluer vers l'ulcération ou la nécrose et entraîner une perte de poids. Il qualifie les tumeurs de patients greffées à la souris de "modèle incontournable" et renvoie les essais cliniques au conditionnel.

Objectifs

Les virus oncolytiques (virus naturels ou modifiés capables d'infecter et d'éliminer sélectivement les cellules cancéreuses), sont des alternatives prometteuses aux traitements anti-cancéreux classiques. Néanmoins leur efficacité et leur sécurité doivent être améliorées. Nous avons développé des virus oncolytiques optimisés qui n'infectent pas les cellules saines. Les tests réalisés in vitro nous ont montré que ces rOVs sont capables d'infecter et de lyser des cellules tumorales en culture et des modèles tumoraux 3D (organoïdes tumoraux pancréatiques). L'étape suivante du projet nécessite de tester l'efficacité de virus modifiés, sur des modèles tumoraux provenant de patients ou des lignées cellulaires, qui reproduisent plus fidèlement les caractéristiques biologiques des cancers. Dans un premier temps, les tumeurs PDX amplifiées chez la souris seront testées ex vivo par 5 virus différents, ciblant 3 marqueurs tumoraux distincts. Cette étape permettra de sélectionner les tumeurs et les virus les plus appropriés, ainsi que la dose virale optimale en utilisant un minimum d'animaux. Dans un deuxième temps, les meilleurs virus seront injectés dans les tumeurs de patients sélectionnées pour tester leur capacité d'infection puis leur capacité à inhiber la croissance tumorale. Plusieurs types de tumeurs de patients seront testées pour augmenter la probabilité de trouver un candidat adéquat, et seuls 2 à 3 seront selectionnées pour la suite, afin de réduire le nombre d'animaux.

Bénéfices attendus

Ce projet est l'étape finale pour apporter la preuve de concept de l'intéret des virus oncolytiques modifiés développés comme traitement dans des pathologies tumorales. Les modèles de tumeurs humaines greffées aux souris (tumeurs de patients) sont maintenant un outil incontournable et exigé pour l'évaluation préclinique de nouveaux agents. Si nous apportons la démonstration de l'efficacité de ces virus sur l'inhibition de la croissance tumorale de tumeurs humaines, nous pourrons envisager de démarrer des essais cliniques, dont nous espérons qu'ils aboutissent à une meilleure prise en charge des cancers pour lesquels il n'existe encore que peu de solutions thérapeutiques.

Procédures

les souris seront soumises aux interventions suivantes: i) greffes de fragments de tumeurs humaines: 1 greffe par souris; acte chirurgical de 5 minutes, sous anesthésie générale ou ii) injection de cellules tumorale: 1 injection par souris; sous anesthésie générale , durée: 5 minutes . Certaines souris recevront également une ou plusieurs injections de virus oncolytiques en intra-tumoral (4 maximum); sous anesthésie générale ; durée 5 minutes.

Impact sur les animaux

Les virus développés ne sont pas capables d'infecter des cellules de souris (données de la littérature et de notre laboratoire). Il est donc attendu que le virus injecté ne se propage que dans la tumeur humaine greffée et pas dans la souris. La croissance de la tumeur implantée ne gêne pas les animaux sauf si elle évolue (rare) vers l'ulcération/la nécrose, et entraîne une gêne ou une perte de poids.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de l'expérience pour mettre en oeuvre des analyses post-mortems sur certains organes et tissus.

Remplacement

Le projet fait suite à des études préalables que nous avons conduites sur des systèmes ex vivo de remplacement cellulaires: cellules primaires et cultures de cellules 2D et 3D (organoïdes). Celles-ci ont démontré l'efficacité des virus oncolytiques recombinants produits à i) infecter les cellules tumorales, ii) se propager au sein d'une structure 3D tumorale, iii) lyser les cellules infectées et iv) à épargner les cellules saines humaines (différents ypes cellulaires) comme attendu. Ces analyses in vitro ne peuvent être que partielles et ne reproduisent pas la croissance de la tumeur et sa guérison dans le contexte d'un organisme entier. Les tumeurs PDX dérivées directement d'échantillons de patients et greffées en souris immunodéficientes fournissent une représentation très précise des caractéristiques des tumeurs humaines. De plus, la possibilité de les greffer en parallèle dans un grand nombre de souris permet d'évaluer fiablement de nouvelles thérapies anti-tumorales en tests précliniques. Notre projet prévoit donc de tester maintenant sur des modèles de tumeurs de patients greffées les virus modifiés qui ont déjà été sélectionnés et validés sur modèles cellulaires sophistiqués. Notons que cess expériences réalisées au préalable sur modèles cellulaires ont permis de sélectionner 5 virus sur les 15 développés, et donc de réduire fortement le nombre de souris utilisées.

Réduction

Afin de réduire le nombre d'animaux utilisés, le projet est conçu en étapes successives. Chacune permettra de sélectionner les meilleurs candidats de virus qui seront utilisés à l'étape suivante. Ainsi, l'efficacité d'infection et la dose optimale des différents virus sera d'abord mesurée ex vivo sur des tranches de tumeurs établies sur animaux, puis in vivo sur un nombre plus limité de tumeurs et de virus . Au final, seuls les meilleurs virus et tumeurs seront testés dans les expériences de mesure de la croissance tumorale. Dans chaque procédure, le nombre d’animaux par groupe a été réduit au maximum sans mettre en péril la validité statistique des résultats. Le calendrier expérimental sera basé sur des expériences séquentielles. Cela permettra d'analyser les résultats et de modifier le protocole si besoin, afin de réduire le nombre d'expériences et d'animaux.

Raffinement

Les animaux bénéficient d'une période d'acclimatation d'une durée de 7 jours avant toute intervention. Ils seront suivis quotidiennement pour vérifier leur bien-être. Un suivi clinique quotidien sera fait. Si les souris commencent à présenter une perte de poids, même minime, de la nourriture en gel sera ajoutée. Des points limite précoces ont été définis et seront strictement appliqués. Les interventions au cours des procédures expérimentales seront effectuées sous anesthésie locale ou générale.En cas de besoins, les animaux recevront un analgésique.

Choix des espèces

Des tumeurs de patients greffées directement dans des souris immunodéficientes s'avèrent actuellement le modèle tumoral incontournable pour de les études pré-cliniques en oncologie. Ils fournissent une représentation très précise des caractéristiques des tumeurs humaines. Nous avons donc choisi la souris en raison de la possibilité offerte d'utiliser ce modèle, en appliquant à ce projet les exigences de remplacement, de réduction et de raffinement nécessaires. Les souris seront utilisées à l’âge de 6 semaines, dans la phase de jeune adulte qui permettra un développement optimal de la tumeur.

890 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des femelles gestantes subissent une chirurgie pour introduire de l'ADN dans le cerveau des embryons, geste qui peut provoquer un avortement, ou reçoivent du tamoxifène par gavage, tandis que des souriceaux sont opérés à la naissance sous anesthésie sur glace. Les mères comme les petits sont ensuite tués pour prélever les cerveaux, le porteur jugeant les femelles non réutilisables après ces interventions. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ne reproduit l'architecture de la région cérébrale étudiée.

Objectifs

L'objectif de ce projet est de déterminer si les différents types de neurones dans une structure du cerveau appelée gyrus denté sont générés à partir des mêmes cellules ou de populations distinctes et à quel moment de la vie ils sont générés. Pour se faire, nous utiliserons une souris particulière qui permet l'expression de multiples protéines fluorescentes (les cellules d'une même couleur sont issues d'une même cellule).

Bénéfices attendus

Ce projet devrait contribuer à terme à élargir nos connaissances fondamentales sur le développement du gyrus denté, une structure du cerveau particulièrement impliquée dans la mémoire. Aussi cette compréhension sur l'origine des cellules du gyrus denté, permettra à terme de mieux les cibler pour éventuellement les manipuler et étudier leurs fonctions spécifiques.

Procédures

Les animaux seront soumis soit 1) à une chirurgie pendant la gestation pour faire rentrer de l'ADN dans le cerveau des embryons et ainsi induire l'expression des multiples protéines fluorescentes pendant la vie embryonnaire (30 min maximum), 2) soit à une chirurgie à la naissance pour faire rentrer de l'ADN dans le cerveau des souriceaux et ainsi induire l'expression des multiples protéines fluorescentes à la naissance (5 min), 3) soit à une injection pendant la gestation (1 injection, mois d'une minute) ou 4) après la naissance (1 injection, mois d'une minute)

Impact sur les animaux

La chirurgie sur souris gestante pour faire rentrer de l'ADN dans le cerveau des embryons peut conduire à un avortement si l’intégrité des vaisseaux sanguins ou de la paroi utérine est altérée lors de la procédure. Aussi, cette procédure sera effectuée par une spécialiste de ce type de chirurgie, ce qui garantit des gestes précis respectant l'intégrité de l'animal. Les sutures de la peau et des muscles peuvent s’ouvrir à la suite de cette procédure. Si les sutures de la peau ne se sont pas maintenues le jour suivant la chirurgie, de nouvelles sutures seront réalisées sous anesthésie gazeuse. Si les sutures de l'abdomen ne sont à nouveau pas maintenues le jour suivant, l'animal sera mis à mort. L’anesthésie sur glace, nécessaire à faire rentrer de l'ADN dans le cerveau des souriceaux à la naissance, pourrait entraîner la mort des animaux si prolongée. Cependant, dans notre procédure, l’acte à réaliser pendant cette anesthésie est très court (moins de 1 minute) ce qui diminue très fortement cette éventualité. L’injection de tamoxifène par gavage chez les souris gestantes peut conduire à un stress des animaux. Pour réduire au maximum l’angoisse liée à cette injection, celle-ci sera effectuée par une personne expérimentée pour ce type d'approche. Chez la souris gestante, l'injection de tamoxifène peut conduire à un avortement ou à un problème de mise bas. Les femelles seront maintenues sous surveillance par l’expérimentateur jusqu’à la naissance. En cas de fausse couche, la mère sera mise à mort par dislocation de même en cas de problème de mise bas. Dans ce dernier cas, les souriceaux seront adoptés par des souris CD1/Swiss, préalablement gestantes au même stade. Les souriceaux seront sous surveillance lors de leur première semaine de vie. A la suite ce chaque procédure, nous réaliserons un suivi systématique quotidien des animaux. Nous utilisons des grilles permettant de scorer de façon objective le bien-être de l’animal par la mesure de son poids et l’évaluation de son apparence et de son comportement. A partir d’un score de 2, nous administrerons un analgésique (buprénorphine, 0.1mg/kg, sc, toutes les 6 à 12h jusqu'à amélioration) et à partir de 5, les animaux sont mis à mort.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort car les cerveaux des animaux sont récupérés pour des analyses anatomiques. De plus les mères initialement gestantes seront également sacrifiées car elles auront déjà subi une incision de la peau et des muscles abdominaux ou une injection de tamoxifène. L’injection de tamoxifène peut engendrer des effets secondaires non compatibles avec la réutilisation de ces femelles quel que soit le protocole expérimental (reproduction ou autre).

Remplacement

N'existant pas de modèle in vitro ou in silico permettant de reproduire l'environnement complexe (multiples types cellulaires, architecture complexe…) caractéristique de la structure cérébrale d'intérêt (le gyrus denté), cette étude ne peut être réalisée que chez l'animal in vivo.

Réduction

Nous prévoyons d’utiliser le nombre minimal de souris nécessaire pour obtenir des analyses statistiques fiables et cohérentes, nombre dépendant de la technique utilisée. De plus, mâles et femelles seront utilisés. La taille de nos groupes expérimentaux est définie sur la base de nos expériences antérieures et en respectant des conditions statistiques précises. Pour les études anatomiques, notre expérience nous a permis de déterminer qu'un effectif de 8 animaux par groupe est nécessaire pour effectuer des analyses statistiques cohérentes.

Raffinement

Un soin particulier sera accordé à l’observation des animaux, en particulier lors des périodes post-chirurgie et post-injection. Pendant ces périodes, nous utiliserons des grilles permettant de scorer de façon objective le bien-être de l'animal par la mesure du poids, l’évaluation de l’apparence et du comportement. A partir d’un score de 2, nous administrerons un analgésique (buprénorphine, 0.1mg/kg, sc, toutes les 6 à 12h jusqu'à amélioration) et à partir de 5, les animaux seront mis à mort. En cas de fausse couche des souris gestantes, la mère sera mise à mort par dislocation. Si les sutures de l'abdomen ne sont pas maintenues 2 j après la chirurgie, l'animal sera mis à mort. En cas de problème de mise bas suite à l'injection de tamoxifène, la souris gestante sera mise à mort par disolocation et les souriceaux seront adoptés par des souris CD1/Swiss, préalablement gestantes au même stade. En dehors de ces périodes, les points limites reposent sur des critères généraux de bien être qui seront évalués à travers la surveillance quotidienne effectuée par les zootechniciens. De plus, des traitements appropriés (anesthésie, anti-douleur) seront utilisés pour pallier à la douleur associée aux opérations chirurgicales. Concernant l’hébergement, les animaux seront hébergés dans des cages en présence de litière favorisant l’absorption des liquides vers le bas (par conséquent, la surface de la litière reste saine plus longtemps). Ces cages sont transparentes afin de favoriser le contact visuel. Ils auront également à leur disposition des formes d’enrichissement (carrés de coton) afin de réduire l’ennui et le stress. Les souris seront hébergées en cage collective. Seules les souris gestantes seront isolées sur une courte période, à partir de l'injection de tamoxifène ou le jour de la chirurgie (donc à E12.5, E13.5 ou E14.5). Cet hébergement permet d'identifier correctement les portées, ce qui est difficilement possible dans le cas d'un hébergement collectif de femelles gestantes.

Choix des espèces

Le modèle utilisé dans ce projet est la souris car il fait appel à une lignée génétiquement modifiée développée uniquement chez la souris. Dans la structure cérébrale étudiée, différents types de neurones sont générés de la vie embryonnaire à l'âge adulte. Nous ciblerons les cellules à l'origine de ces neurones et ce à différents moments de la vie de l'animal: 1) pendant la vie embryonnaire, 2) à la naissance , 3) en période juvénile (à 3 semaines de vie) et à 4) l'âge adulte (à 12 semaines de vie). Ces temps précis d'analyse ont été choisi en fonction de la littérature et de nos études précédentes.

75 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit une chirurgie sous anesthésie pour créer une plaie cutanée puis y greffer un substitut de peau suturé, et reste ensuite hébergé seul pour éviter que les souris ne s'arrachent les greffes, ce que le porteur reconnaît comme une source de stress. Les souris sont tuées par lots à trois, sept, douze, vingt-huit et quatre-vingt-dix jours pour analyser la greffe. Le porteur affirme qu'aucun modèle in vitro ne permet de caractériser sur la durée la résorption d'un substitut greffé.

Objectifs

Les objectifs de ce projet sont 1) d’évaluer chez la souris la fonctionnalité d’un nouveau substitut dermique développé selon une nouvelle technique de fabrication brevetée, en comparaison avec un substitut dermique acellulaire commercial, 2) et d’évaluer sa résorption progressive au cours du temps. Les substituts dermiques seront greffés sur des souris possédant un système immunitaire fonctionnel après induction d’une plaie cutanée. Des prélèvements seront effectués à différents temps après réalisation de la greffe de substitut dermique pour la réalisation d'analyses spécifiques.

Bénéfices attendus

Les substituts dermiques sont des biomatériaux capables de remplacer temporairement ou définitivement une partie de la peau et constituent une alternative précieuse pour la gestion des plaies lorsque les thérapies standards sont un échec. Cependant, sélectionner le bon substitut n’est pas une décision thérapeutique aisée. Le développement de nouveaux substituts dermiques acellulaires biosynthétiques constitue une des nouvelles voies envisagée pour traiter les plaies chroniques qui ne cicatrisent pas, les greffes de tissus mous chez les patients présentant des brûlures à épaisseur partielle, des plaies chirurgicales… Les analyses qui seront effectuées vont permettre d'évaluer les substituts dermiques acellulaires et de valider et/ou d’améliorer leur process de fabrication.

Procédures

Les souris seront soumises à une procédure chirurgicale pour l’induction de la plaie cutanée et la réalisation ou non des greffes de substitut dermique effectuées sous anesthésie. Un substitut dermique sera placé dans la plaie cutanée et suturé en plusieurs points indépendants. Un traitement analgésique des souris sera administré 1 heure avant la chirurgie puis 6 heures, 12 heures et 24 heures après. La chirurgie sera réalisée en 20 minutes environ et ne sera effectuée qu’une seule fois. Les greffes de substitut dermique ou les plaies cutanées seront protégées par des pansements et compresse changés 2 fois par semaine, et des observations et un scoring de différents paramètres seront réalisés lors de chaque change effectué. Un suivi quotidien de l’ensemble des souris sera réalisé pendant toute la durée des expérimentations. Le maintien des souris greffées ou non en cage individuelle sera nécessaire pour éviter qu’elles ne s’arrachent entre elles les pansements, la compresse et surtout le substitut dermique greffé.

Impact sur les animaux

L’induction de la plaie cutanée et de la procédure de greffe ou non de substitut dermique pourra engendrer une souffrance passagère des animaux mais qui sera limitée au maximum par une couverture analgésique appropriée avant et après la chirurgie effectuée. L’hébergement en cage individuelle des souris greffées ou non, nécessaire tout au long de l’étude pour éviter qu’elles ne s’arrachent entre elles le substitut dermique, les pansements, la compresse et la bande de sparadrap, peut conduire à un stress par la limitation des interactions sociales directes mais cet effet sera limité par l’utilisation de cages transparentes, permettant à chaque souris de voire au moins une de ses congénères.

Devenir

Procédure expérimentale 1 (seule procédure expérimentale) : les 75 souris seront mises à mort à différents temps après réalisation de la greffe ou non de substitut dermique, 3, 7, 12, 28 et 90 jours après, avec 5 souris par temps de prélèvement. Un prélèvement cutané sera réalisé au large de la région greffée ou non pour réaliser un ensemble d’analyses permettant de caractériser les effets des substituts dermiques testés.

Remplacement

Le remplacement des expérimentations animales par des méthodes alternatives n’est pas envisageable dans le contexte de ce projet. Il n’est en effet pas possible d’utiliser des modèles in vitro ou ex vivo permettant de caractériser sur un temps prolongé la fonctionnalité et la résorption de substituts dermiques greffés, processus dépendants de mécanismes complexes. L’ensemble de ces facteurs complexes ne peut être appréhendé qu’in vivo sur un modèle animal.

Réduction

Nous utiliserons le nombre minimum d’animaux nécessaire à la réalisation de ce projet mais permettant d’obtenir des résultats prédictifs et représentatifs. Ce nombre a été déterminé sur la base de résultats d’études précédentes obtenus sur ce modèle de greffe cutané. D’autre part, la réalisation de l’ensemble des analyses envisagées sur un même prélèvement cutané permet de limiter le nombre d’échantillons et donc d’animaux nécessaires.

Raffinement

Une attention toute particulière sera portée aux animaux lors de l’induction de la plaie cutanée puis de la réalisation de la greffe cutanée (analgésie pré-opératoire, maintien des conditions d’asepsie, maintien de la température corporelle), effectuées toutes deux sous anesthésie générale, ainsi qu’après réalisation de la greffe cutanée (analgésie post-opératoire). Les animaux seront observés quotidiennement tout au long de l’expérimentation, leur poids sera mesuré deux fois par semaine à chaque renouvellement de pansement, et si une perte de poids supérieure à 20% par rapport au poids maximal atteint est observée ou si des signes d’infection de la plaie greffée, ou des modifications du comportement des animaux sont observés, ceux-ci seront mis à mort dans des conditions éthiques. Des bâtonnets d’ouate seront placés dans chaque cage comme dispositif d’enrichissement pour assurer leur bien-être, et seront remplacés lors de chaque change de litière.

Choix des espèces

La souris est l’espèce animale la plus adaptée pour réaliser ce projet en raison de sa taille et de sa facilité de manipulation permettant d’induire une plaie cutanée représentative des plaies à traiter chez l’Homme. Son utilisation est largement décrite dans la littérature scientifique pour les études sur les greffes cutanées et pour le développement de substituts cutanés. Les animaux seront des souris âgées de 6 semaines à l’arrivée au laboratoire et de 7 semaines pour le démarrage des expérimentations. Cela correspond à l’âge de souris décrit dans la littérature scientifique pour la réalisation d’études sur des greffes cutanées (généralement 6 à 8 semaines).