Rongeurs
Evaluation par électrophysiologie ex-vivo des modifications des réseaux neuronaux dans un modèle murin de démence frontotemporale (DFT) associée à une sclérose latérale amyotrophique (SLA) nommé DFT-SLA (2022-E-017)
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
120 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, une partie étant tuée sous anesthésie sans réveil. Génétiquement modifiées pour développer une forme de sclérose latérale amyotrophique associée à une démence, elles perdent du poids et développent des déficits moteurs jusqu'à une paralysie et une mortalité prématurée, avant la mise à mort pour prélever le cerveau. Le porteur indique surveiller le phénotype par un test de suspension caudale qu'il décrit comme sans douleur, avec des points limites de perte de poids et de mobilité. Il affirme que l'organisation des réseaux neuronaux ne peut être étudiée in vitro et nécessite l'étude sur un "organisme entier".
Objectifs
La sclérose latérale amyotrophique (SLA), ou maladie de Charcot, est une maladie neurologique progressive et dévastatrice conduisant à une défaillance progressive du système neuromusculaire et à la mort par insuffisance respiratoire. La perte de motricité est la conséquence d’une dégénérescence des motoneurones, les cellules nerveuses qui commandent les muscles volontaires. C’est la plus fréquente des maladies du motoneurone chez l’adulte. Dans la majorité des cas, la maladie est sporadique, c’est-à-dire qu’elle atteint une personne de manière isolée. Cependant, dans 5 à 10% des cas, la SLA peut toucher plusieurs membres d’une même famille, on parle de SLA « familiale ». A ce jour, aucun traitement n’est disponible contre la SLA ou la DFT-SLA. Il est donc primordial de mieux comprendre cette pathologie, et notamment les mécanismes responsables de la mort des motoneurones, dans l’optique à plus long terme de développer des recherches à visée thérapeutique. Un modèle souris qui reprend les symptômes de la DFT/SLA a été généré. Les données scientifiques obtenus à ce jour indiquent que ces souris développent un phénotype dommageable de type SLA avec une perte de poids (à partir de 200 jours pour les femelles et 125 jours pour les mâles), des déficits moteurs (débutant vers l'âge de 3 mois et de légers problèmes de train arrière sans atteinte majeure de la locomotion vers 4 mois ; pas de troubles moteurs majeurs avant l’âge de 10 mois), des troubles cardiaques à l’âge adulte et une mortalité prématurée (. Des études préliminaires ont montré que cette lignée de souris présente des troubles comportementaux qui implique une structure cérébrale lié à l’apprentissage et la mémoire. L’objectif de ce projet est d’étudier les modifications du réseau neuronal par enregistrement de l’activité des neurones sur coupes cérébrales dans ce modèle souris.
Bénéfices attendus
Ce projet scientifique associé à notre plateforme d'électrophysiologie ex vivo (sur coupes cérébrales) permettra de mieux comprendre les modifications des réseaux neuronaux chez la souris transgénique modèle de la DFT-SLA. La technique utilisée sera l'électrophysiologie ex vivo, c'est-à-dire sur coupes cérébrales.
Procédures
Pendant la période d’acclimatation de 5 jours, seules les observations liées au phénotype seront effectuées (comportement naturel, aspect, mobilité…). Entre la phase d’acclimatation de 5 jours et la mise à mort des animaux, en plus du suivi des observations liés au phénotype, les gestes techniques liés au suivi du phénotype dommageable seront effectués (test de suspension caudale qui est une méthode rapide, fiable et sans douleur).
Impact sur les animaux
Les souris utilisés développent un phénotype de type DFT-SLA avec une perte de poids (à partir de 200 jours pour les femelles et 125 jours pour les mâles), des déficits moteurs (débutant vers l'âge de 3 mois), des cardiomyopathies (vers 330 jours) et une mortalité prématurée (344 jours) . Les différentes étapes de la maladie se divisent en 3 : - le début de la maladie où les animaux commencent à perdre du poids (5-10% de perte). Cette phase débute vers l'âge de 3 mois chez les mâles et 6 mois chez les femelles. Le point limite a été fixé à une perte de poids irréversible supérieure à 15% du poids par rapport à la pesée précédant la réception des animaux. Le poids des souris à la réception et la semaine précédent la livraison nous sera fournie par le client, afin de voir si le phénotype dommageable a commencé à s’exprimer. - le début des symptômes apparents (vers 3 mois) où la perte de poids atteint les 10% et où les souris présentent une perte d'extension des membres inférieurs et une démarche bancale. A partir du moment où sont constatés les problèmes moteurs, de la nourriture gélifiée est ajoutée dans la cage. - la phase avancée où la perte de poids atteint les 15% et où les souris présentent une perte d'extension totale des membres inférieurs et un début de paralysie. Les souris seront soumises à un suivi renforcé grâce à l'utilisation d'une grille d'observation en lien avec le phénotype attendu de DFT-SLA (Cf Annexe). Si un score de 4 est atteint (sur un critère ou par cumul de plusieurs critères), l’animal sera euthanasié. La fréquence d'observation sera à minima de 2 fois par semaine et sera adaptée en fonction des signes observés. Dans le cas de la nécessité d'une surveillance accrue d'un animal (perte de poids, signes de paralysie des membres locomoteurs, activité motrice réduite…), l’observation sera quotidienne. Les animaux seront surveillés sur : - poids : le point limite est fixé à une perte irréversible de poids supérieure ou égale à 15% par rapport à la pesée précédant la réception des animaux. - mobilité : le point limite est fixé à l'apparition d'un affaiblissement des pattes arrières ou à des tremblements associés à une incapacité des souris à se retourner en moins de 15 secondes lorsqu'elles sont sur le flanc. - comportement: le point limite est fixé à l'apparition éventuelle d'un comportement agressif non résolu par l'enrichissement ou l'isolement .
Devenir
Les animaux inclus dans une procédure expérimentale seront tous mis à mort à la fin de la procédure afin de réaliser les coupes cérébrales nécessaires à l’évaluation électrophysiologique des modifications neuronales.
Remplacement
L'organisation des réseaux neuronaux peuvent être étudiés sur des coupes cérébrales de rongeurs par électrophysiologie. Elles ne peuvent pas être reproduites, ni étudiées dans des modèles de cultures cellulaires in vitro. Une meilleure compréhension des pathologies du système nerveux central nécessite donc l’étude des réseaux neuronaux sur un organisme entier. Nos expérimentations au sein de la société, même si elles nécessitent l’utilisation d’animaux, sont pratiquées avec un souci permanent de réduction du nombre d’animaux et de bien-être pour nos animaux en expérimentation. Toutes les expériences sont réalisées dans le respect éthique de la règle des 3 R.
Réduction
Le nombre de souris a été réduit autant que possible, tout en étant suffisant pour l'obtention de résultats exploitables. L'évaluation du nombre d'animaux nécessaire a été effectuée par un programme adapté. Les résultats seront analysés par des test statistiques. Nous adapterons les tests statistiques en fonction de la distribution des observables, qu'elle soit normale ou non.
Raffinement
Suivra alors une période d’acclimatation de 5 jours minimum, pendant laquelle aucun geste technique lié à la procédure expérimentale ne sera réalisé. Les conditions d’hébergement et de soins et les méthodes utilisées ont été choisies et conçues de manière à réduire au maximum toute douleur, angoisse ou dommages durables que pourraient ressentir les animaux. Le contrôle mortalité des animaux sera effectué quotidiennement sans exception (Week-ends & jours fériés) par du personnel compétent et qualifié. Le bien-être des animaux sera évalué hebdomadairement. Des points limites spécifiques à la lignée DFT-SLA ont été établis afin d’anticiper toute dégradation de l’état de santé général des animaux et, le cas échéant, d’appliquer des protocoles de soins adaptés. La fiche d'observation sera remplie une fois par semaine pour chaque animal. Dans le cas de la nécessité d'une surveillance accrue d'un animal, la fréquence sera augmentée (deux fois par semaine ou quotidiennement selon la gravité.
Choix des espèces
Nos expérimentations sont réalisées chez la souris, dont l’étude est extrêmement répandue au sein des laboratoires de recherche en Neurosciences, rendant les résultats pertinents pour la communauté scientifique nationale et internationale. Ces rongeurs, de petite taille et d’élevage facile, possèdent un système nerveux dont le développement est extrêmement proche de celui du système nerveux humain, et dont l’organisation, certes simplifiée, est suffisamment complexe. Pour l'étude des déficits de la SLA/DFT, le modèle murin Chchd10S55L nous permettra de comprendre comment la mutation p.Ser59Leu présente chez des patients, est à l’origine d’un dysfonctionnement des réseaux neuronaux. La mutation p.Ser59leu étant à l’origine de pathologies multisystémiques, évolutives et extrêmement complexes tant sur le plan clinique que moléculaire chez l’homme, l’utilisation d’un modèle murin présente de nombreux avantages puisque les effets de la mutation pourront être étudiés précisément dans le cerveau. Les animaux seront utilisés de l'âge de 5 mois à 10 mois, afin de couvrir tous les stades de la maladie .
Mécanisme d’action d’une nouvelle approche de contrôle du développement de mélanome à métastase pulmonaire dans un modèle murin
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
420 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Porteuses d'un mélanome à métastases pulmonaires, elles reçoivent des injections intraveineuses, des inoculations intranasales d'un parasite et des prises de sang, pour identifier les cellules immunitaires impliquées dans la réponse antitumorale. Le porteur indique que la tumeur pulmonaire peut provoquer des difficultés respiratoires et que la mort survient rapidement après l'apparition des symptômes, la mise à mort étant planifiée juste avant. Il reconnaît qu'une approche in vitro a été développée en amont mais affirme qu'elle ne reproduit pas un modèle de régulation complexe.
Objectifs
Les premiers résultats publiés montrent que l’injection intratumorale de tachyzoïtes de Neospora caninum et de N. caninum modifiés pour sécréter de l’IL15 permet le contrôle du développement d’une tumeur sous-cutanée solide EG-7 par action oncolytique, induction d’une forte réponse immunitaire et reprogrammation de l’environnement tumoral. De même, l’efficacité de N. caninum dans un modèle murin de mélanome à métastases pulmonaires (B16F10) a été démontrée par voie sous-cutanée, intraveineuse et intranasale avec une très bonne protection antitumorale induite par voie intraveineuse et intranasale. Le modèle de mélanome à métastases pulmonaires est à la fois un modèle plus relevant d’un point de vue clinique humaine puisqu’il s’agit d’un cancer contre lequel nous avons besoin de développer de nouvelles approches thérapeutiques efficaces, mais aussi un modèle nous permettant d’étudier la réponse antitumorale induite par N. caninum dans un modèle métastatique. La réponse antitumorale induite par N. caninum dans ce modèle a été caractérisée, il nous faut maintenant déterminer si les populations cellulaires qui sont recrutées dans les poumons des souris traitées sont indispensables à la réponse antitumorale et de confirmer ainsi leur rôle. Le rôle des populations cellulaires présentes dans les poumons sera étudié par déplétion locale de ces dernières (n=420souris).
Bénéfices attendus
Grâce à ce projet nous pourrons identifier les cellules immunitaires dont le rôle est primordial dans la réponse antitumorale induite par N. caninum. En effet, si nous observons un développement tumoral après traitement par N. caninum chez les souris ayant une population cellulaire déplétée, nous pourrons conclure que le rôle de cette population cellulaire est primordial dans la réponse antitumorale. En plus de déterminer quelles populations cellulaires sont impliquées dans la réponse antitumorale, nous pourrons aussi déterminer dans quelle mesure elles sont impliquées.
Procédures
Lot témoin non traité : 1 injection intraveineuse (1 minute), 4 prises de sang (30 secondes). Lots déplétés 1 à 5 (n=20) : 1 injection intraveineuse (1 minute), 2 inoculations intranasales (10 secondes), 4 prises de sang (30 secondes). Lots déplétés 6 à 10 (n=20) : 2 injections intraveineuses (1 minute), 1 inoculation intranasale (10 secondes), 4 prises de sang (30 secondes). Lots contrôles 1 à 5 (n=20) : 1 injection intraveineuse (1 minute), 2 inoculations intranasales (10 secondes), 4 prises de sang (30 secondes). Lots contrôles 6 à 10 (n=20) : 2 injections intraveineuses (1 minute), 1 inoculation intranasale (10 secondes), 4 prises de sang (30 secondes).
Impact sur les animaux
Le développement de la tumeur au niveau pulmonaire peut induire chez la souris une souffrance due à une difficulté respiratoire. Les effets indésirables pouvant apparaitre sont : - Signes cliniques modérés : Agitation/Agressivité, Hypomobilité/hyporéactivité, stéréotypies, Poil piqué, Coloration anormale de la peau, Flacidité musculaire généralisée, Gonflement abdominal, Zone ano-génitale souillée, Perte de poids inférieure à 15% (en tenant compte de la masse tumorale), Diminution/absence de prise de nourriture. - Signes cliniques : Akinésie, Tremblements généralisés, Convulsions, Persistance du pli cutané, Voussure du dos/dos cambré, Difficultés respiratoires, Perte de poids supérieure à 15% (en tenant compte de la masse tumorale), Absence de prise de nourriture> à 2 jours. L’apparition des symptômes précède de peu l’apparition des points limites et la mort de l’animal, qui surviennent rapidement (généralement en deux à trois jours). Dès l’apparition des symptômes sur l’une des souris du lot contrôle, l’ensemble des animaux des animaux sera mis à mort pour éviter toute souffrance inutile. Si les points limites cités précédemment sont atteints, les animaux seront mis à mort sans délai. D’après notre expérience, le développement de la tumeur sans traitement devrait conduire à l’apparition des symptômes cités précédemment vers J30 et conduira à la mise à mort des animaux sans délai. Ce délai d’apparition des symptômes est pris en compte lors du développement du protocole expérimental et la mise à mort des animaux est planifiée pour être réalisée quelques jours avant l’apparition des premiers symptômes pour éviter toute souffrance aux animaux.
Devenir
Afin de pouvoir étudier la réponse immunitaire induite par N. caninum lors du traitement des nodules pulmonaires et de déterminer l’impact de l’absence d’une population cellulaire spécifique sur cette réponse immunitaire, nous devons mettre à mort les animaux pour collecter les poumons et étudier la réponse locale dans cet organe. Il n’existe à ce jour aucune méthode nous permettant de nous affranchir de la mise à mort des animaux.
Remplacement
Une approche in vitro a été développée en amont afin de valider notre hypothèse de travail et l’utilisation des composés sur des cellules immunitaires impliquées dans le contrôle de la tumeur mais cela ne reproduit pas un modèle de régulation complexe permettant la validation de notre stratégie.
Réduction
Le nombre d’animaux est calculé au plus juste à l’aide d’outils statistiques (disponibles sur Anastats.fr) garantissant une puissance de test de 80% minimum en s’appuyant sur les données de la littérature. L’étude statistique des résultats sera réalisée avec le test non paramétrique Kruskall-Wallis pour l’étude des réponses immunitaires humorale (titre en anticorps) et cellulaire (dosage de cytokines) ainsi que pour l’étude du développement tumoral.
Raffinement
Les souris sont hébergées en accord avec les normes réglementaires, en animalerie A2 à raison de 5 souris maximum par cage sur des portoirs ventilés et dans un environnement enrichi (objets en cellulose pour faire un nid ou à ronger). Un suivi quotidien de l’état de santé des animaux sera réalisé avec une surveillance systématique des points limites.
Choix des espèces
Les souches de souris immunocompétentes sont adaptées à la greffe de cellules tumorales syngéniques présentant le même fond génétique que la souche de souris utilisée. Dans le cadre de précédentes études chez la souris, l’utilisation de protozoaires en tant que thérapie antitumorale a montré des résultats probants. Adulte. Il n’y pas la nécessité d’utiliser des animaux plus jeunes ou gestants.
Evaluation de l’effet du Thiamet-G, de la Triethylenetetramine et de la glucosamine sur l’apparition et l’évolution de l’arthrose post-traumatique chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
180 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures déclarées sans réveil alors que le suivi décrit s'étend sur six à douze semaines après l'opération. Une arthrose est induite chirurgicalement par déstabilisation du ménisque du genou, puis trois composés sont administrés dans l'eau de boisson avant une ponction cardiaque terminale. Le porteur décrit une gêne à la marche postopératoire disparaissant en 48 heures et ne rapporte pas d'autre effet notable. Il affirme que l'arthrose met en jeu l'articulation entière et le système digestif, ce qui rendrait le recours à la souris nécessaire faute d'alternative in vitro.
Objectifs
Ce projet a pour objectif d'évaluer l'impact de la prise orale via l'eau de boisson du Thiamet-G (TG), de la triéthylènetrétramine (TETA) et de la glucosamine (GlcN) sur l'évolution de l'arthrose post-traumatique chez la souris
Bénéfices attendus
L'OA est la maladie articulaire la plus répandue avec une prévalence mondiale de 303 millions de patient dans le monde. Elle touche aussi bien les articulations périphériques que rachidiennes. Au sein des articulations tous les composants de l'articulation sont impactés. L'OA se caractérise par une érosion du cartilage, la formation d'ostéophyte, une sclérose osseuse et une inflammation synoviale. Les composés que nous nous proposons de tester sont des molécules capables de jouer sur la régulation de voies métaboliques dérégulées dans l'OA. Le TG est un composé augmentant la O-GlcNacylation des protéines processus agissant sur l'autophagie. La GLcN composé connu pour ses effets anti-inflammatoires et enfin la molécule TETA mimant la restriction calorique et stimulant l'autophagie. Nous espérons que les composés testés présenteront des effets bénéfiques sur l'apparition et l'évolution de l'OA post-traumatique chez la souris et permettront ainsi l'identification de nouvelles approches thérapeutiques pour la prise en charge de l'OA chez l'Homme.
Procédures
A l’âge de 9 semaines les souris des groupes 2, 3, 4 et 5 subiront une induction chirurgicale d’arthrose unilatérale par déstabilisation du ménisque médial droit alors que les souris du groupe 1 subiront une procédure Sham, c’est-à-dire qu’elles subiront l’intervention chirurgicale sans l’étape de déstabilisation du ménisque médial.Le geste chirurgical par souris est d'environ 5 min. Les souris seront suivies et traitées via l'eau de boisson pendant 6 et 12 semaine après la procédure chirurgicale. 6 et 12 semaines après la chirurgie, la moitié des souris de chaque groupe aura une ponction intracardiaque terminale puis sera euthanasiée comme décrit dans la procédure expérimentale n°1 et les différents organes nécessaires à l'évaluation des traitements et du niveau d'OA seront prélevés.
Impact sur les animaux
En post opératoire une légère gêne à la marche peut être observée chez certaine souris. Cette gêne disparait dans les 48h post chirurgie et est prise en charge comme décrite dans la section 4. Pas d'effet notable de la procédure sur le poids des animaux, sur leur mobilité ou sur leur comportement n'a été reporté.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à l'issue de la procédure.
Remplacement
L’OA est une maladie de l’ensemble de l’articulation : os sous-chondral, membrane synoviale, ménisques et appareil musculo-ligamentaire. Il s’agit aussi d’une pathologie multifactorielle (métabolique, génétique, endocrinienne, mécanique, traumatique) complexe difficilement reproduite par des systèmes cellulaires simplifiés. D’autre part ce projet évalue des principes actifs par prise orale, ce qui implique leur passage par le système digestif, ce qui ne peut pas être reproduit in vitro.
Réduction
Je réduis en utilisant le nombre minimal d'animaux par groupe requis pour chaque type de test afin d'atteindre une significativité statistique. Les études statistiques comparatives seront réalisées en utilisant le test de kruskal-Wallis suivi d’un test de comparaison multiple de Dunn. Cette saisine nécessitera donc 180 souris C57BL/6 âgées de 9 semaines
Raffinement
Je raffine en réduisant la douleur lors de cette expérimentation afin d'améliorer la reproductibilité et la qualité de l'expérimentation. Ainsi, une analgésie péri-opératoire immédiate est prévue par administration de buprénorphine et meloxican en pré et post-chirurgie. Les souris seront hébergées à raison de 4 souris par cage avec de l'enrichissement type frisottis. Elles seront observées quotidiennement jusqu'à la fin de l'expérimentation. Elles seront également pesées quotidiennement pendant les 3 premiers jours après la chirurgie puis 1 fois par semaine jusqu'à la fin de l'expérimentation. Par ailleurs des points limites ont été identifiés et les procédures de raffinement à mettre en place lors de l'atteinte de ces points limites ont été décrites. Malheureusement, je ne peux pas remplacer cette expérimentation animale par un modèle in vitro, car cette étude visant à déterminer l'effet de nos molécules sur l'apparition et l'évolution de l'OA nécessite l'intervention du système digestif et de l'articulation dans son ensemble ce qui ne peut pas être reproduit in vitro. Il n'existe donc pas de méthodes alternatives à l'utilisation d'animaux pour ce projet.
Choix des espèces
Le choix des souris est fondé sur plusieurs critères : - Le besoin de travailler sur des animaux adultes et à maturité squelettique ; - La taille des animaux permet une gestion aisée de l’anesthésie et de l’analgésie ; - Ces animaux sont faciles à gérer en stabulation ; - Le modèle murin d’OA est le plus décrit dans la littérature internationale. De plus, il représente une référence dans l’étude de cette pathologie. Les animaux inclus dans cette étude seront à maturité squelettique et âgés de 9 semaines lors du début de la procédure n°1 car c’est à cet âge qu’est classiquement induit l’OA par déstabilisation du ménisque médial « DMM ».
Etude par manipulation génétique des plexus choroïdes et de leur fonction sur le cerveau
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
- Troubles endocriniens
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles immunitaires
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
- Système nerveux
4 790 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des vecteurs viraux sont injectés dans leur cerveau par stéréotaxie, sur des embryons via une laparotomie de la mère, sur des nouveau-nés ou sur des adultes, avant des tests comportementaux non précisés puis la mise à mort par exsanguination. Le porteur indique que les chirurgies peuvent provoquer une douleur modérée et que les nouveau-nés atteignant un point limite sont mis à mort par décapitation avant quinze jours. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ou ex vivo ne rend compte de la complexité du tissu et que l'étude ne peut être menée qu'in vivo.
Objectifs
Depuis la découverte de la barrière hémato-encéphalique par Paul Erhlich à la fin du XIXe siècle, le cerveau a été considéré comme virtuellement séparé des autres organes et de la circulation sanguine. Pourtant, cette dernière décennie a vu l'émergence du concept selon lequel la fonction cérébrale est façonnée par divers facteurs biologiques, tels que le microbiote intestinal, les cellules et signaux immunitaires systémiques ou encore le cycle jour/nuit. Parallèlement, les zones barrières du cerveau, comme les méninges et les plexus choroïdes, ont été identifiées comme des interfaces de dialogue croisé actif entre la périphérie et le cerveau, plutôt que comme des tissus barrières inertes. Les plexus choroïdes constituent la barrière sang-fluide céphalorachidien, l'une des frontières séparant le cerveau de la périphérie. Ils sont situés dans chacun des quatre ventricules du cerveau et sont adjacents à des zones impliquées dans la neurogenèse. D'un point de vue structurel, les plexus choroïdes sont composés d'un réseau de capillaires sanguins fenêtrés entourés d'une monocouche de cellules épithéliales et peuplés entre les deux par une grande variété de cellules immunitaires. Les principaux rôles physiologiques des plexus choroïdes sont la production de liquide céphalorachidien, qui débarrasse le cerveau des déchets métaboliques et des agrégats de protéines, ainsi que la production et le passage contrôlé du sang au cerveau de diverses molécules de signalisation, notamment des hormones et des facteurs neurotrophiques. Les molécules sécrétées par les plexus choroïdes façonnent l'activité du cerveau, par exemple en modulant la neurogenèse et la fonction des cellules immunitaires microgliales localisées dans le cerveau, ce qui rend les plexus choroïdes cruciaux pour l'homéostasie du cerveau. Des travaux antérieurs et d’autres travaux préliminaires ont montré que le niveau d’expression de certains gènes exprimés par l’épithélium des plexus choroïdes varient en fonction de l’âge et notamment au cours du vieillissement, et en réponse aux variations environnementales telles que celles du microbiote et du cycle circadien. Notre but est de mieux comprendre comment ces facteurs influent sur la biologie des plexus choroïdes et la fonction du cerveau.
Bénéfices attendus
Cette analyse permettra l’identification des facteurs produits par les plexus choroïdes et potentiellement impliqués dans la modulation de l’activité neuronale en fonction de l’âge, depuis la naissance et au cours du vieillissement, en fonction des facteurs environnementaux que représentent les variations de la composition du microbiote et celles du cycle circadien. Cette étude devrait permettre une meilleure compréhension de la biologie de cette interface barrière que constitue les plexus choroïdes et qui reste encore très peu étudiée et d’identifier de nouveaux mécanismes via lesquels les plexus choroïdes modulent la fonction du cerveau. A terme, ce projet pourrait permettre la mise au point d’immunothérapie afin de mieux lutter notamment contre les maladies dégénératives associées au vieillissement.
Procédures
Les animaux seront soumis à une procédure chirurgicale sous anesthésie générale et analgésie : - soit une laparotomie sur femelle gestante (durée de la procédure : 45 min à 1h), - soit une injection de vecteurs viraux dans le cerveau par stéréotaxie (durée de la procédure : incluse dans la durée de la laparotomie quand réalisée sur embryons, 5 à 10 min sur nouveau-nés, 30 min à 1h sur adulte). 12 jours (dans le cas des nouveau-nés injectés à la période embryonnaire) à 12 semaines (adultes) après chirurgie, les animaux seront mis à mort par exsanguination sous anesthésie générale et analgésie. Les animaux adultes auront été avant mise à mort (4 à 8 semaines après chirurgie) impliqués dans des tests de comportement non invasifs.
Impact sur les animaux
Les procédures décrites visent à réduire autant que possible le mal-être animal. Toutes les chirurgies seront réalisées sous anesthésie générale et sur tapis chauffant sur lesquels ils seront maintenus pendant leur réveil. Les chirurgies sur adultes peuvent entraîner une douleur modérée au cours de la cicatrisation qui sera prévenue par une injection de buprénorphine, 30 min avant chirurgie, 6h après, puis toutes les 12h pendant 48h en cas de douleur. De la lidocaïne sera appliquée sur les zones à inciser. De l’acétaminophène sera également ajouté après chirurgie dans l’eau de boisson pendant la cicatrisation soit 2-3 jours pour une stéréotaxie et 4-5 jours pour une laparotomie. Les signes de douleur plus importante qui pourraient provenir de complications seront surveillés en observant les signes suivants : prostration, altération de la qualité́ du poil (hirsute, terne) ou apathie. Si l’animal présente deux de ces trois signes (point limite), il sera mis à mort. Les chirurgies sur embryons seront indirectement surveillées via le suivi des femelles gestantes : toute perte de sang vaginale qui pourrait attester de la mort d’un ou plusieurs embryon(s) sera surveillée et nous appliquerons les points limites définis précédemment. Les stéréotaxies sur nouveau-nés pourront entrainer une douleur légère qui sera prévenue par application de lidocaïne au niveau du site d’injection. Après chirurgie, l’acceptation des nouveau-nés par leur mère sera surveillée au travers des signes suivants synonymes d’abandon : isolement du reste de la portée, bleuissement de la peau associé à une hypothermie et absence visible de lait dans l’estomac. Si le nouveau-né présente ces trois signes (point limite), il sera mis à mort. Les animaux en élevage et ceux qui auront récupérés de leur chirurgie seront régulièrement surveillés et nous suivrons les signes et points limites précédemment définis. Nous éviterons que les animaux soient isolés dans leur cage et nous ajouterons un abri dans la cage des portées, femelles gestantes et géniteurs en plus du papier/coton présent dans toutes les cages. La procédure 2 s’achève par l’injection par voie-intrapéritonéale de l’anesthésique et analgésique qui pourra générer un peu de stress à l’animal mais peu ou pas de douleur.
Devenir
Les animaux ne peuvent être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés. Les géniteurs qui n’auront pas subi de chirurgie (procédures 1 et 2) seront mis à mort par exposition croissante en CO2 après 6 mois de reproduction. Les femelles gestantes qui auront subi une laparotomie (procédure 1) seront mis à mort par exposition croissante en CO2 au moment de la séparation avec les nouveau-nés P6 ou P21. La mise à mort des souris auxquelles auront été injectés les vecteurs viraux (procédure 2) aura lieu par perfusion de PBS (exsanguination) sous anesthésie générale profonde et analgésie afin de prélever les tissus nettoyés du sang et à analyser post-mortem. Si un animal atteint les points limites définis, il sera mis à mort par exposition croissante en CO2 (jeunes de plus de 15 jours et adultes) ou par décapitation (nouveau-nés de moins de 15 jours).
Remplacement
Notre but est d’étudier comment les cellules situées au niveau des plexus choroïdes, agissent sur le cerveau, en condition physiologique, au cours du développement, du vieillissement et en réponse aux variations de composition du microbiote et du cycle circadien. Les plexus choroïdes sont un tissu composé d’un endothélium fenêtré, de cellules épithéliales, de cellules de type neuronal, de cellules mésenchymateuses et de cellules immunitaires. Les cellules immunitaires du système périphérique pourraient induire l’expression de facteurs produits par les cellules des plexus choroïdes qui pourraient eux-mêmes moduler l’activité neuronale du cerveau. Il n’existe aucun modèle in vitro ou ex vivo rendant compte de la complexité́ d’un organisme ou d’un tissu avec ses composantes endothéliale, épithéliale, neuronale, mésenchymateuse et immunitaire. De plus, nous étudions la physiologie des plexus choroïdes en fonction de l’âge et des variations des facteurs environnementaux tels que le microbiote et le cycle circadien, ce qui ne peut être étudié qu’in vivo.
Réduction
Nous souhaitons étudier les gènes des plexus choroïdes et du cerveau qui auront montré par une précédente approche transcriptomique des différences d’expression considérables en fonction des paramètres comparés. Les quantités d’animaux utilisées pour mener à bien notre projet sont établies en tenant compte de notre précédente expérience et de tests statistiques (test ANOVA, source SHADE). Les 4 plexus choroïdes d’un animal doivent être groupés pour pouvoir réaliser une analyse moléculaire ou transcriptomique sur ces petits tissus. Seuls 10 microlitres de liquide céphalo-rachidien peuvent être prélevés à partir du cerveau d’une souris, ce qui ne permet qu’un seul type d’analyse. Les analyses moléculaires du liquide céphalo-rachidien, des plexus choroïdes et des zones d’intérêt du cerveau pourront cependant être réalisées sur les mêmes animaux qui auront au préalable été impliqués dans des tests de comportement (adultes). Nous prévoyons pour chaque groupe, 4 animaux par analyse. Le sexe des animaux pouvant influer sur les phénotypes observés, des mâles et femelles seront inclus (ratio 1/1). Des triplicatas d’expérience seront réalisés pour permettre l’obtention de résultats solides. Selon le nombre de groupes comparés, avec une puissance de 80% et un risque alpha de 5% : - 3 groupes comparés (P6, P21 et adultes) : les effectifs proposés (36 individus) devraient nous permettre d'obtenir des résultats significatifs pour des tailles d'effet supérieures à 1.07 (effets considérables à extrêmes). - 2 groupes comparés (adultes jeunes et âgés) : les effectifs proposés (24 individus) devraient nous permettre d'obtenir des résultats significatifs pour des tailles d'effet supérieures à 1.65 (effets très forts à considérables). - 6 groupes comparés (4h cycle fixe et 2h cycle perturbé) : les effectifs proposés (72 individus) devraient nous permettre d'obtenir des résultats significatifs pour des tailles d'effet supérieures à 0.85 (effets très forts à considérables). - 4 groupes comparés (P21 et adultes, conventionnels et axéniques) : les effectifs proposés (48 individus) devraient nous permettre d'obtenir des résultats significatifs pour des tailles d'effet supérieures à 0.97 (effets considérables à extrêmes). Ces résultats nous permettront d’identifier les différences majeures dans la biologie des plexus choroïdes et sa fonction sur le cerveau en fonction de l’âge, du microbiote et du cycle circadien, tout en réduisant au maximum le nombre d’animaux utilisés.
Raffinement
Les procédures décrites visent à réduire autant que possible le mal-être animal. Toutes les chirurgies seront réalisées sous anesthésie générale et sur tapis chauffant sur lesquels ils seront maintenus pendant et quelques heures après leur réveil. Les chirurgies sur adultes peuvent entraîner une douleur modérée au cours de la cicatrisation qui sera prévenue par des administrations d’analgésiques (buprénorphine, 30 min avant chirurgie, 6h après, puis toutes les 12h pendant 48h en cas de douleur ; lidocaïne appliquée sur les zones à inciser ; de l’acétaminophène sera également ajouté après chirurgie dans l’eau de boisson pendant la cicatrisation soit 2-3 jours pour une stéréotaxie et 4-5 jours pour une laparotomie). Les signes de douleur plus importante qui pourraient provenir de complications seront surveillés en observant les signes suivants : prostration, altération de la qualité́ du poil (hirsute, terne) ou apathie. Si l’animal présente deux de ces trois signes (point limite), il sera mis à mort. Les chirurgies sur embryons seront indirectement surveillées via le suivi des femelles gestantes : toute perte de sang vaginale qui pourrait attester de la mort d’un ou plusieurs embryon(s) sera surveillée et nous appliquerons les points limites définis précédemment. Les stéréotaxies sur nouveau-nés pourront entrainer une douleur légère qui sera prévenue par application de lidocaïne au niveau du site d’injection. Après chirurgie, l’acceptation des nouveau-nés par leur mère sera surveillée au travers des signes suivants synonymes d’abandon : isolement du reste de la portée, bleuissement de la peau associé à une hypothermie et absence visible de lait dans l’estomac. Si le nouveau-né présente ces trois signes (point limite), il sera mis à mort. Les animaux en élevage et ceux qui auront récupérés de leur chirurgie seront régulièrement surveillés et nous suivrons les signes et points limites précédemment définis. Nous éviterons que les animaux soient isolés dans leur cage et nous ajouterons un abri dans la cage des portées, femelles gestantes et géniteurs en plus du papier/coton présent dans toutes les cages. La procédure 2 s’achève par l’injection par voie-intrapéritonéale de l’anesthésique et analgésique qui pourra générer un peu de stress à l’animal mais peu ou pas de douleur.
Choix des espèces
La souris est l'espèce la plus utilisée en laboratoire pour l’étude des fonctions cognitives et notamment des maladies dégénératives car de nombreuses lignées sont disponibles, invalidées pour de nombreux gènes d'intérêt et/ou génétiquement manipulable après injection de vecteurs viraux. Elle est facile à élever et ses grandes capacités de reproductions facilitent les études sur embryons et nouveau-nés. Il est aisé d’en manipuler le microbiote. La souris permet également l’analyse des capacités cognitives au cours d’expériences comportementales. L’ensemble de ces avantages permet, en utilisant ce modèle, de répondre rapidement aux questions scientifiques posées. Ce modèle permet de travailler avec la meilleure efficacité́ possible tout en offrant une représentation certes imparfaite mais néanmoins proche de la physiologie humaine. Le phénotype induit par les vecteurs viraux n’est analysable qu’au minimum 10 jours après injection. Afin d’étudier comment la biologie des plexus choroïdes et sa fonction sur le cerveau évoluent avec l’âge, nous injecterons les vecteurs viraux à des souris embryonnaires afin d’en étudier les effets chez les souris : (i) âgées de 6 jours, stade important avec la mise en place du système immunitaire et de nombreuses variations métaboliques en réponse à l’allaitement maternel, (ii) âgées de 21 jours qui correspond à la période du sevrage avec d’importantes variations métaboliques et du microbiote qui devient mature, (iii) adultes, âgées de 7 à 12 semaines, qui seront notre point de référence physiologique. De la même manière, nous étudierons les effets du microbiote en injectant les vecteurs viraux à des souris âgées de 3-4 jours afin d’en étudier les effets lorsqu’elles auront 21 jours ou qu’elles seront adultes et les effets du vieillissement en injectant les vecteurs viraux à des souris adultes jeunes de 7 à 12 semaines et âgées de 10 à 20 mois.
Défaut maxillaire chez le rat : un modèle pour tester des biomatériaux destinés à la régénération de l’os alvéolaire
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
280 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une perte osseuse est créée chirurgicalement dans leur mâchoire, puis la régénération est suivie au microscanner pendant deux mois avant la mise à mort pour analyse histologique, afin de tester des biomatériaux de comblement. Le porteur indique que la chirurgie maxillo-faciale provoque une douleur modérée et une gêne à la mastication les premiers jours. Il affirme que les produits destinés à l'humain doivent "nécessairement" être testés sur l'animal et qu'aucune approche in vitro ne répond à la réglementation sur les dispositifs implantables.
Objectifs
Les pertes de substances osseuses représentent un challenge en chirurgie orale et une problématique de santé. Ces pertes osseuses au niveau de la mâchoire peuvent avoir différentes origines : traumatismes dû à un accident, tumeurs bénignes ou malignes, infection, .... En clinique, l'utilisation de greffe pour réparer la zone est très répandue mais présente certains inconvénients (chirurgie lourde, problème de compatibilité et d'intégration du greffon...). Ainsi, le développement de biomatériaux en régénération osseuse est indispensable pour pallier à ces limitations et optimiser la prise en charge des patients. Pour évaluer le potentiel ostéogénique des biomatériaux étudiés et envisager à terme de les utiliser chez l'homme, il est nécessaire d'avoir recours à un modèle animal. Dans notre projet le modèle proposé est le rat, qui est une espèce pertinente et reconnue dans le cadre de la validation des biométériaux implantables à visée humaine. Le suivi de la régénération osseuse sera réalisé par de l'imagerie par un micro-scanner, cette technologie est composée d'un système d'acquisition et d'un logiciel dédié, qui effectue des analyses de densité radiologique point par point pour reconstituer des images du site d'intérêt extrêmement précises. Cette technologie permet un suivi performant du site d'intérêt et est indolore pour l'animal. Ainsi l'objectif du projet est de tester le pouvoir ostéogénique de biomatériaux implantés spécifiques de ce type de reconstruction au niveau de la face en vue de futur essai clinique chez l'Homme.
Bénéfices attendus
Ce projet permettrait le développement de nouveaux dispositifs médicaux (matériaux de comblement ou membranes pour la régénération osseuse guidée) dans le domaine de l'ingénierie tissulaire osseuse au vue d'être utilisé en clinique.
Procédures
Les animaux subiront une chirurgie au niveau de la mâchoire (création d'un défaut). Cette intervention dure environ 30 min par animal. Suite à l'opération, le suivi par micro scanner de la régénération osseuse pour chaque rat sera réalisé à des intervalles de temps espacés de 2 semaines. L'acquisition du microscanner dure environ 15 min. Il est envisagé de réaliser 5 fois cette acquisition sur chaque rat (suivi longitudinal sur 2 mois, avec une acquisition à: T0, 2, 4, 6 et 8 semaines).
Impact sur les animaux
Les animaux subiront une intervention chirurgicale maxillo-faciale. Cette chirurgie engendrera une douleur modérée pour les animaux et une éventuelle difficulté lors de la mastication pour s'alimenter lors des premiers jours post-opératoires. Une surveillance sera établie afin de pallier à ces inconvénientset et toutes les mesures sont mises en place pour prendre en charge le bien-être des animaux tout au long du projet.
Devenir
Suite à la chirurgie, les animaux seront suivis par microscanner sur 2 mois (examen d'imagerie non invasive). Après le dernier temps d'acquisition (2 mois après la chirurgie), les animaux seront euthanasiés par les expérimentateurs formés à ce geste, afin de pouvoir réaliser des analyses histologiques sur ces animaux et poursuivre les examens post-mortem permettant de valider le pouvoir ostéogénique du biomatériau étudié.
Remplacement
Les produits destinés à être implantés chez l'Homme doivent nécessairement être testés chez l'animal avant les essais cliniques. Il n'existe pas de méthode basée sur une approche in vitro permettant d'évaluer ces matériaux pour répondre à l'objectif du projet et à la réglementation en vigueur dans le cadre de l'évaluation des dispositifs médicaux implantables chez l'Homme.
Réduction
Pour réduire le nombre d'animaux utilisé, un suivi longitudinal par analyse au micro scanner sera réalisé. L'intérêt est qu'il est ainsi possible d'obtenir des informations sur l'aspect cinétique du processus, sans avoir à sacrifier des animaux à différents temps. Il est ainsi possible de s'assurer que le processus se déroule correctement, et de décider de sacrifier les animaux en fonction de ces observations.
Raffinement
Pour réduire l’angoisse des animaux, une période d’adaptation d’une semaine au sein de l'animalerie sera respectée avant le début des expérimentations. Les mesures de raffinement sont mises en place tout au long du projet, notamment lors de la phase de la chirurgie : les animaux recevront au préalable une couverture analgésique (anti-douleur), ils seront ensuite endormis, sous anesthésie générale durant toute l'opération. Après la chirurgie, chaque rat se réveille dans une cage à part sur tapis chauffant. Après le réveil complet, le rat reviendra dans sa cage et il sera suivi individuellement pendant quelques jours afin de s'assurer que l'opération s'est bien passé et que l'animal récupère correctement. Les critères d'évaluation et de suivi sont définis et adaptés au projet. Suite à cette surveillance, les animaux seront hébergés en groupes sociaux, avec un raffinement des conditions d’hébergement adapté à leur espèce : enrichissement de l’environnement d’hébergement (litière en copeaux, jouets, bâton à ronger...).
Choix des espèces
Le rat est une espèce adaptée à la première étape de validation chez l'animal de matériaux destinés au traitement des pertes osseuses chez l'homme. De par sa taille, il permet de réaliser des lésions circulaires de diamètre suffisant dans l'os alvéolaire de la mâchoire. Le rat permet ainsi de valider la biocompatibilité, la stabilité dans le temps et l'efficacité thérapeutique du produit. En cas de résultats satisfaisant et supérieur à ce qui est obtenu avec les produits de référence actuellement sur le marché, le processus de validation pourra se poursuivre, afin à terme leur utilisation chez les patients. Des rats Sprague-Dawley adultes de 10 semaines, d'un poids d'environ 400 g seront utilisés. En effet les animaux utilisés doivent avoir achevé leur développement et leur croissance au niveau osseux pour répondre à l'objectif de l'étude.
Rôles des facteurs de transcription Eomes et T-bet dans le métabolisme des lymphocytes TCD4 dans un contexte d’auto-immunité du système nerveux central
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système nerveux
1 260 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Une encéphalomyélite auto-immune leur est induite pour reproduire la sclérose en plaques, provoquant selon l'échelle décrite une faiblesse de la queue puis une paralysie progressive du train arrière et avant, la mise à mort intervenant au score maximal. Le porteur indique que la perte de poids au-delà de 20 % déclenche l'euthanasie et que les souris sont ensuite tuées par perfusion cardiaque ou au CO2 pour prélever cerveau et moelle épinière. Il affirme que les études in vitro ne reproduiraient pas les voies impliquées et écarte le remplacement pour ce projet.
Objectifs
La Sclérose en Plaques (SEP) est une maladie auto-immune du système nerveux central (SNC) qui représente un problème majeur de santé publique et les approches thérapeutiques utilisées aujourd’hui ne donnent pas entière satisfaction. De plus, la prévalence mondiale de cette pathologie est en perpétuelle augmentation dans les pays développés et en voie de développement. Il est donc important de comprendre la physiopathologie de cette maladie au niveau cellulaire et moléculaire afin de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques. Eomes est une protéine qui se fixe à l’ADN et régule l’expression de nombreux gènes, en particulier dans les cellules du système immunitaire. Par ailleurs, le gène EOMES a été identifié dans des études d’association génétique chez l’Homme comme un gène de prédisposition à la SEP. Ces résultats suggèrent que les lymphocytes T CD4 exprimant Eomes - cellules du système immunitaire - pourraient jouer un rôle délétère dans la SEP. Cependant, le rôle spécifique de cette protéine dans les lymphocytes T CD4 reste mal connu. Des travaux ont permis de démontrer le rôle clef d’Eomes dans la physiopathologie de la SEP. En effet, il a été mis en évidence que la délétion d’Eomes diminue drastiquement la sévérité de la pathologie dans un modèle murin de SEP: l’encéphalomyélite auto-immune expérimentale (EAE). De plus, il a été démontré que les cellules qui expriment Eomes s’accumulent au niveau du SNC et présentent une survie accrue dans les tissus inflammatoires. Ainsi l’objectif de ce projet est d’analyser les rôles d’Eomes mais aussi de T-bet (une protéine de la même famille qu’Eomes) sur la sévérité de la pathologie et de déterminer les mécanismes moléculaires impliqués. Pour cela, nous utiliserons le modèle de l’EAE chez la souris comme modèle expérimental de la SEP. Le choix de ce modèle est basé sur le fait que la majorité des thérapies utilisées actuellement pour la SEP ont été découvertes à l’aide de ce modèle expérimental. De plus, nous utiliserons des souris génétiquement modifiées pour Eomes et T-bet.
Bénéfices attendus
Des travaux menés par plusieurs équipes ont révélé qu’Eomes a un rôle dans le modèle murin de la SEP (EAE) et sur la SEP. En effet, une étude récente a mis en évidence que les patients atteints de forme secondaire progressive de SEP présentaient un nombre accru de cellules immunitaires exprimant Eomes dans le sang et dans le liquide céphalo-rachidien. Ce projet nous permettra donc de comprendre les mécanismes qui permettent aux cellules immunitaires exprimant Eomes (et/ou Tbet) de migrer, proliférer et survivre au sein du SNC au cours de la neuroinflammation. Ces résultats devraient ouvrir la voie pour l’élaboration de nouvelles thérapies visant à bloquer la différenciation ou les fonctions des cellules immunitaires exprimant Eomes et en particulier chez les patients souffrant de forme progressive de SEP chez lesquels une accumulation de cellules immunitairesexprimant Eomes a été démontrée.
Procédures
Perfusion sous anesthésie générale profonde et à dose létale sur 540 animaux avec perte de conscience, analgésie (suppression de la douleur), suppression de tout réflexe et relaxation musculaire de l’animal. L’anesthésie est générale et profonde entre 5 et 10 minutes pour chaque animal après injection intrapéritonéale de 130 mg/kg de kétamine 1000 + 12 mg/kg de Xylazine 2%. La perfusion cardiaque se réalise en 5 minutes pour chaque animal. L’anesthésie générale et profonde à dose létale ainsi que la perfusion cardiaque sont réalisées une seule fois pour l’ensemble des animaux concernés. L’immunisation unique par voie cutanée à la base de la queue et les deux injections en IV de la toxine pertussique sont réalisées sur 720 animaux anesthésiés par inhalation de Vetflurane (2% + mélange air/oxygène) au moyen d’un masque positionné au niveau de la tête des animaux. L’immunisation et les injections de la toxine se réalisent en 10 minutes pour chaque animal.
Impact sur les animaux
Suite à l'induction de l'Encéphalomyélite Autoimmune Expérimentale active et passive (EAE) et aux transferts adoptifs, les animaux peuvent avoir une activité extrême (grattage ou léchage anormal) et peuvent présenter une nécrose ou une anomalie (écoulement, plaie) au niveau du site d’immunisation. Si c’est le cas, la plaie est nettoyée avec une solution de Bétadine de façon quotidienne. Les signes cliniques de l’EAE apparaissent entre le 6ème et 7ème jour post immunisation et sont évalués quotidiennement sur une échelle de 0 à 5 (ci-après) en fonction du handicap moteur. 0 : aucun signe ; 1 : faiblesse de la queue ; 2 : faiblesse de la queue et difficulté à se remettre sur ses pattes après retournement ; 3 : paralysie du train arrière ; 4 : paralysie du train arrière et perte de tonus du train avant ; 5 : paralysie du train arrière et avant, euthanasie. Ces signes cliniques augmentent jusqu’au pic de la maladie (J14-15), c’est la phase aiguë de l’EAE qui corresponds au stade clinique maximum. Il y a ensuite une phase dite de régulation où le score clinique diminue pour retourner à un stade d’environ 1-2. De J20 à J30, les animaux sont pour la plupart entre un score clinique de 1 et 2. De plus, dès qu'un animal atteindra le stade clinique 3 de l'EAE, afin d’éviter une perte de poids supérieure à 20% du poids initial, du Gel Diet et du Gel Water sont placés sur une petite boîte de Pétri et renouvelés quotidiennement, dans toutes les cages. En effet, des injections de glucose ou modification de l'alimentation ne peuvent pas être envisagées étant donné que le projet vise à identifier les acteurs métaboliques des lymphocytes TCD4 dans un contexte d’auto-immunité du système nerveux central.
Devenir
Les souris 540 des animaux des procédures 1 à 3 sont anesthésiées puis mises à mort par exsanguination après perfusion cardiaque au PBS réalisée sous anesthésie générale profonde à dose létale afin de prélever différents organes : rate, noeuds lymphatiques, cerveau et moelle épinière dans le but de réaliser les études phénotypiques et fonctionnelles in vitro sur les cellules purifiées à partir des organes prélevés (cytometrie de flux et analyses de biologie cellulaire et moléculaire). Les souris donneuses des procédures 2 et 3 ainsi que les souris receveuses des procédures 2 et 3 dont la clinique a été suivie, sont euthanasiées par inhalation au CO2 (souris placées dans un environnement avec plus de 40% de CO2 pendant 7 min), soit 720 souris au total.
Remplacement
Le recours à l’expérimentation animale dans le cadre de cette étude se fait après de nombreuses études in vitro dans des modèles cellulaires. Le principe de remplacement n’est pas applicable à ce projet car les études in vitro ne reproduiraient pas l’ensemble des voies impliquées dans des modèles physiologiques intégrés et par conséquent ne permettent pas l’obtention de résultats scientifiques exploitables et pertinents de la pathologie humaine.
Réduction
Le modèle murin utilisé nous permettra d’optimiser l’utilisation des animaux en combinant le suivi clinique et les analyses fonctionnelle et phénotypique in vitro sur un même animal. Ce design de l’étude permet de réduire le nombre à 10 souris par groupe afin d’acquérir des données fiables et permettre une interprétation sans ambiguïté des résultats. Pour se faire, le test statistique ANOVA sera utilisé pour interpréter les résultats obtenus concernant le suivi clinique et les études fonctionnelle et phénotypique in vitro seront analysées grâce au test de Student.
Raffinement
Le bien-être de l’animal est un facteur de variabilité expérimentale que nous prenons en considération grâce au suivi rapproché quotidien des animaux dès l’initiation du modèle d’EAE. Ce suivi nous permettra d'évaluer l'état général des animaux (prise de nourriture, toilettage, mouvements), l’aide à l’alimentation en cas de besoin, l’enrichissement de leur environnement et le respect de l’aspect social du groupe (pas d’isolement ni de changement de cage). L’expérimentation sera arrêtée et l’animal euthanasié en cas de dégradation trop importante de la santé d’un animal selon les points limites d’arrêt de la procédure définis en accord avec le comité local de suivi du bien-être animal (SBEA) pour limiter la douleur, la souffrance ou l’angoisse de l’animal. Ces points d'arrêt sont les suivant : - aspect général de l'animal (perte de poids supérieure à 20% du poids initial, posture voutée ou prostrée, vocalisation, tremblement, agressivité, anomalie de la respiration, hypo ou hyperthermie) - signes cutanés (nécrose, écoulement, plaie). De plus, les personnes responsables du projet ont été formées à l’utilisation des animaux à des fins scientifiques ; elles garantissent la formation et l’encadrement des autres expérimentateurs impliqués dans les procédures expérimentales. L’apprentissage et la maîtrise des gestes techniques sont reportés dans les livrets de compétences tenus à jour des personnes concernées.
Choix des espèces
L’espèce animale Mus musculus utilisée dans ce projet offre la possibilité de développer de nombreux modèles mimant de multiples pathologies humaines. Par ailleurs, cette espèce présente certains intérêts pratiques décisifs justifiant l’utilisation des souris comme modèles dans ce type de projet : faibles coûts, cycles de reproduction courts, croissance rapide, facilité de transport, facilité de manipulation et une bonne adaptabilité aux conditions expérimentales. De plus, notre projet de recherche est basé sur l’utilisation d’animaux génétiquement modifiés pour les molécules d’intérêt Eomes (délétion dans les lymphocytes T). Aucune autre espèce animale avec ces caractéristiques génotypiques pour ces protéines n’est disponible. Il est également important de souligner que nous disposons chez la souris d’outils précieux (anticorps monoclonaux, plasmides, etc...) qui sont indispensables pour disséquer les mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués. Le projet utilise des animaux âgés d’environ de 8 à 12 semaines correspondant à un système immunitaire fonctionnel.
Effets du venin d’abeille et de son dérivé non allergène, le delta venin, sur les déficits engendrés dans un modèle animal pharmacologique de la Maladie de Parkinson chez le rat
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
56 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, puis gardés vivants pour une seconde étude ultérieure. Ils reçoivent une injection d'halopéridol induisant une catalepsie réversible, suivie d'une injection de venin d'abeille ou de son dérivé, pour tester un effet contre l'akinésie dans un modèle pharmacologique de la maladie de Parkinson. Le porteur rappelle qu'un premier essai clinique du venin d'abeille n'a pas amélioré le score moteur des patients et n'a réduit que les doses de L-DOPA. Il affirme que l'étude des performances comportementales rend l'utilisation des animaux "indispensable".
Objectifs
L'objectif du projet est d'évaluer le rôle bénéfique d'un venin d'abeille (Bee Venom, BV), sans son composé allergène la phospholipase A2 (sPLA2), appelé deltaBV, sur les symptômes mesurés dans un modèle pharmacologique de la Maladie de Parkinson (MP) par une approche comportementale. Nos études récentes ont démontré une action bénéfique du BV (alyostat) dans des modèles de la MP chez le rongeur. L'étude préliminaire clinique, quant à elle, n'a pas reporté d'effets bénéfiques marqués. Ces études ont été évaluées positivement par les comités scientifiques des fondations suivantes (Association France Parkinson, Fondation de France, AP-HP) et du CNRS. Notre projet vise donc à tester le delta BV, comparé au BV, afin d'établir les doses efficaces sans induire d'effets secondaires (choc anaphylactique) . Ce projet posera les bases à une étude clinique qui sera menée à plus long-terme chez des patients parkinsoniens. En effet, la première étude clinique menée chez un petit nombre de patients après une injection mensuelle de BV à faible dose pendant 1 an, n'améliore pas le score moteur (UPDRS) mais permet de diminuer les doses thérapeutiques de L-DOPA administrées chez les patients. Au vu du faible effet observé, il serait nécessaire de tester le BV à plus forte dose dans une nouvelle cohorte. Pour cela, le deltaBV, sans la sPLA2 responsable des allergies et récemment synthétisé à Sophia Antipolis à partir du BV (américain), doit être testé au préalable chez l'animal dans un modèle d'akinésie parkinsonienne (défaut d'inititation motrice). Nous comparerons les effets de la forme non allergène , deltaBV, à ceux obtenus avec le BV (américain) dont il est extrait. Cette première étude (présente DAP) dans le modèle d'akinésie induite par l'halopéridol (modèle pharmacologie de la MP) nous permettra de mettre en évidence les doses significativement efficaces pour contrecarrer l'akinésie et de tester dans une deuxième étude (seconde DAP) dans un modèle lésionnel de la maladie avec plusieurs tests moteurs. De plus, l'ensemble des expérimentations sera filmé de sorte qu'il fournira des données pour plusieurs séances de travaux dirigés dans le cycle 2 du Bachelor Universitaire Technologique de Génie Biologie.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus sont multiples : - Reproduction de l'effet bénéfique du BV américain en comparaison avec le BV alyostat - Mise en évidence de l'effet bénéfique du delta BV : pré-requis à une étude ultérieure chez l'homme - Données sur la concentration efficace du BV et deltaBV sur l'akinésie motrice- Collecte de données pour la réalisation d'un TD
Procédures
Pour l'étude sur le modèle pharmacologique, les animaux reçoivent tous une injection ip d'halopéridol suivie d'une injection ip de BV/dBV selon le groupe. Ces deux injections seront réalisées à une demi-heure d'intervalles et ceci une seule fois.
Impact sur les animaux
L'injection d'halopéridol (1 mG/kG, volume injecté 1mL/kG) induit une catalepsie réversible en 12 H. L'injection intrapéritonéale de BV (1/5/5 µG/kG, volume injecté 1mL/kG) ne devrait pas induire de choc anaphyllactique car des études antérieures utilisant les mêmes concentrations d'un BV d'une autre composition n'en avait pas engendré.
Devenir
A la suite du test de catalepsie, les animaux seront hébergés dans l'animalerie par cage de 2 dans un environnement enrichi et seront laissés au repos jusqu'à l'obtention de l'autorisation pour la 2ème étude.
Remplacement
Cette étude concerne les effets du BV et du dBV sur des performances comportementales. L'utilisation des animaux est donc indispensable.
Réduction
Des études précédentes utilisant ce modèle nous ont permis de réaliser des statistiques en amont afin de réduire le nombre d'animaux tout en gardant une significativité de 5%.
Raffinement
Tout au long de cette étude, les animaux seront observés, pesés et manipulés. Ils seront maintenus par 2 dans un environnement enrichi avec eau et nourriture ad lib. Pour éviter le stress lors des injections intrapéritonéales, les animaux seront manipulés durant la semaine précédente.
Choix des espèces
Le rat représente le modèle de choix dans cette pathologie au regard des différents tests comportementaux qu'il peut effectuer. Par ailleurs, la plupart des études portant sur cette neuropathologie repose sur le modèle rat de la MP, ce qui permet de disposer d'une littérature abondante sur laquelle s'appuyer. Enfin, nos travaux antérieurs sur le venin d'abeille ont été réalisés chez le rat, ce qui permet de comparer les résultats issus de nos projets. Le projet vise à établir l'effet bénéfique du BV et du dBV chez le sujet jeune adulte. De façon à pouvoir réutiliser ces rats (coordonnées stéréotaxiques pour induire la lésion), nous utiliserons des animaux d'environ 4 mois.
Formation aux gestes techniques pour l’administration de composés et le prélèvement sanguin chez le rongeur
- Formation professionnelle
Rats : 500
Cochons d'Inde : 100
1 100 rongeurs, soit 500 souris, 500 rats et 100 cochons d'Inde, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils servent à entraîner des expérimentateurs aux gestes d'administration de substances et de prélèvement sanguin, lors de séances de deux à trois heures répétées selon l'habileté de chaque stagiaire. Le porteur reconnaît que des gestes mal maîtrisés par des personnes novices peuvent produire une contention prolongée, du stress et des gestes plus douloureux. Il affirme qu'aucune méthode ne peut remplacer l'animal pour cette formation et qu'un même animal sert à apprendre plusieurs gestes avant d'être tué.
Objectifs
L’objectif de ce projet est de former les expérimentateurs aux gestes techniques pour l’administration de composés et le prélèvement sanguin chez le rongeur.
Bénéfices attendus
Le projet permettra de former les nouveaux arrivants dans notre société et de s’assurer qu’ils maîtrisent parfaitement les gestes d’administration de composés et de prélèvements sanguins avant de les laisser travailler en autonomie.
Procédures
Les animaux subiront des administrations d’eau de boisson pour les administrations per os et de liquide physiologique pour toutes les autres voies d’administration. Des prélèvements sanguins seront également réalisés sur tous les animaux en fonction des gestes techniques à apprendre. La durée de cette formation donc des gestes techniques appliqués sur les animaux dépendra de l’habilité de chaque collaborateur. Il semble cohérent de prévoir des séances d’entraînement de 2 à 3 heures environ par jour où tous les gestes à apprendre peuvent être combinés.
Impact sur les animaux
Ce projet est réalisé pour valider ou former de nouveaux collaborateurs aux gestes techniques d’administration de substances et de prélèvements sanguins. Ces personnes pouvant être novices, il est possible que certains gestes techniques encore mal maitrisés produisent une légère nuisance aux animaux (contention un peu longue par rapport à une personne plus habituée, stress de l’expérimentateur ressenti par l’animal, geste un peu plus douloureux car en apprentissage…). Cependant, dans un premier temps, les gestes à apprendre seront réalisés avec un formateur afin de limiter tout stress à l’animal.
Devenir
A l’issue de la procédure, les animaux seront euthanasiés.
Remplacement
Aucune méthode substitutive ne permet actuellement de remplacer l’animal pour réaliser la formation de la réalisation des gestes techniques d’administration ou de prélèvement sanguins en reproduisant toutes les réactions physiologiques de l’animal lors des contentions, des administrations, des prélèvements et lors des anesthésies.
Réduction
Nous avons établi une stratégie d’expérimentation nous permettant dans la mesure du possible, de réduire le stress de l’animal ainsi que la douleur. En effet, la personne sera formée par un autre collaborateur expert dans tous les gestes à apprendre afin de lui enseigner les bonnes techniques de contention, les bons gestes techniques afin de réduire au maximum le stress chez l’animal. De plus, le formateur adaptera la formation en fonction de chaque collaborateur (besoin de plus de temps si besoin pour apprendre la contention, le rapport à l’animal…). Sachant qu’un même animal pourra être utilisé pour apprendre différents gestes techniques, ceci permet de réduire le nombre d’animaux utilisés.
Raffinement
Dès leur arrivée dans la zone d’exploration fonctionnelle, les animaux seront hébergés dans des conditions définies par la directive européenne 2010/63/UE et un enrichissement sera introduit dans l’hébergement des animaux. L’état des animaux sera suivi quotidiennement par du personnel compétent afin de s’assurer de leur bien-être et de l’absence de point limite à savoir prostration, perte de poids, difficulté à se mouvoir, s’alimenter, boire, piloérection, présence de blessure, Si un animal présentait un point limite, il serait isolé dans un premier temps et hydraté et mis en présence de nourriture dans la litière si besoin. Si son état ne s’améliorait pas dans les 48h, les expérimentateurs compétents excluraient l’animal de l’étude et l’euthanasieraient. Toutes les procédures nécessitant une anesthésie des animaux seront réalisées avec des plaques chauffantes thermorégulées afin de maintenir la température corporelle des animaux et d’éviter toute hypothermie.
Choix des espèces
Les rats et les souris sont les animaux les plus utilisés dans notre société pour réaliser des études in vivo. Cependant nous utilisons également des cobayes et une formation à la contention et à la réalisation des gestes techniques peut être nécessaire selon chaque expérimentateur (trice). Nos projets d’études utilisant des animaux adultes, il sera préférable d’apprendre les gestes techniques sur des animaux adultes (de 6 à 8 semaines minimum).
Rôle des récepteurs de la Ryanodine dans la cardiomyopathie induite par le sepsis
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
120 rats vont être utilisés dans des procédures menées sous anesthésie, les animaux étant tués avant tout réveil. Chaque rat est sédaté, intubé et ventilé, puis reçoit une injection intraveineuse de LPS provoquant un choc endotoxinique et une défaillance cardiaque, avant une échographie du coeur puis la mise à mort pour prélever les organes. Le porteur affirme qu'il n'existe aucun traitement de cette cardiomyopathie en médecine humaine et renvoie l'intérêt thérapeutique à une validation ultérieure sur un "gros animal" puis chez l'humain. Il décrit le modèle rat comme "incontournable" et juge les cultures cellulaires non pertinentes.
Objectifs
L'objectif du projet est d'identifier des molécules qui pourraient traiter la cardiomyopathie induite par le sepsis (CMIS) qui est la dysfonction cardiaque causée par une infection sévère. Plusieurs études chez l'animal ont permis de mettre en avant l'implication des voies de l'inflammation, de modifications redox et des troubles de l'homéostasie calcique. Des travaux précédents ont mis en évidence l'existence de dysrégulations des RyR dans la CMIS. Notre objectif est de montrer que certaines molécules pourraient protéger de la CMIS par leur impact sur une régulation des RyR. On s'intéressera particulièrement aux molécules connues pour avoir un impact sur l'homéostasie calcique (notamment via les récepteurs de la ryanodine, RyR) en les évaluant sur un modèle de rat après induction d'un choc septique (ou plus précisément endotoxinique) par injection d'un fragment de bactérie (le LPS d'Escherichia coli).
Bénéfices attendus
Dans nos précédents travaux nous avons mis en évidence l'implication des RyR parmi les mécanismes physiopathologiques de la CMIS. Ceci laisse entrevoir de nouvelles possibilités thérapeutiques qui doivent être validées chez l'animal avant de pouvoir envisager leur utilisation en médecine humaine. La mise en évidence d'une potentielle efficacité sur l'atténuation de la CMIS par une ou plusieurs molécules, en monothéréapie ou en association, permettra son ou leur évaluation sur un modèle de gros animal puis en médecine humaine. Le bénéfice attendu in fine est la mise à disposition de thérapeutique active contre la CMIS, alors qu'il n'en existe aucune disponible en médecine humaine aujourd'hui.
Procédures
Chaque journée d’expérimentation est dédiée à un seul animal. L’individu est sédaté (hypnotique et morphinique), intubé, ventilé, et monitoré en continue (ecg, pression artérielle, échelle de sédation). Un choc endotoxinique (LPS) est ensuite réalisé par injection intraveineuse de LPS afin de générer une CMIS. Une échographie cardiaque est réalisée à la phase initiale puis après 4 heures. L’individu est ensuite euthanasié et les tissus et le matériel biologique destinés aux analyses sont prélevés pour réalisation des analyses biochimiques (immunoprécipitation et Western blot) et analyses fonctionnelles avec la mesure des propriétés biophysiques (bilayer) des canaux calciques, issus de microsomes des tissus. On appliquera cette procédure à 10 groupes de 12 rats, soit 120 animaux au total.
Impact sur les animaux
Décés (les animaux sont euthanasiés en fin d'expérimentation)
Devenir
L'ensemble des animaux de ce projet seront mis à mort. Les organes, tout particulièrement le coeur, seront prélevés pour des analyses immunohistologiques.
Remplacement
Le développement et la caractérisation d'un modèle de rat est incontournable pour l'analyse physiopathologique de la CMIS. Il est important de souligner que les cultures cellulaires de cardiomyocyte, déjà réalisées dans d'autres laboratoires, ne permettent pas d'appréhender l'impact des interactions entre le cœur et les différents organes, le cœur et la ventilation, et les effets des variations de volémie. L'utilisation de méthodes alternatives ou substitutives n'est donc pas pertinente. Le modèle rat après sédation, intubation et ventilation devrait permettre d'obtenir des résultats extrapolables au patient de réanimation.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés pour ce projet a été défini au plus juste pour nous permettre d’atteindre nos objectifs scientifiques et être statistiquement significatif. Nous avons défini une stratégie d'expérimentation que nous espérons la plus optimale possible. Nous réaliserons dans la mesure du possible les exploration electrophysiologique, la mesure de pression, les mesures échographiques et les analyses anatomique, tissulaire, cellulaire, sur les mêmes animaux. Pour définir statistiquement la taille des lots d'animaux à tester, nous nous appuyons sur des travaux publiés, ainsi que sur l'utilisation de logiciel approprié pour l'évaluation statistique du nombre d’animaux requis.
Raffinement
Le suivi de l’évaluation de l’état de santé des animaux sera strictement respecté et effectué quotidiennement avant l'expérimentation et de façon rapprochée, toutes les heures durant l'expérimentation. Des points limites spécifiques ont été définis et le raffinement s’appliquera selon une grille de score pour une prise en charge adaptée des animaux. Cette prise en charge comprend l’utilisation d’analgésique et pour les scores les plus important, la mise à mort.
Choix des espèces
Pour ce projet de recherche le rat wistar est l'espèce retenue. Cette espèce a déjà été utilisée dans la litérature pour étudier la CMIS. D'après d'autres études sur des modèles animaux variés, les mécanismes physiopathologiques de la CMIS semblent être généralisables entre les espèces de mammifères. De plus, un certain nombre d'études réalisées chez l'homme confirment les similitudes physiopathologiques avec les autres espèces de mammifère et notamment les rats. Ainsi, les résultats du modèle rat devraient permettre une extrapolation chez le gros animal et chez l'homme. Afin d'obtenir des résultats représentatifs de notre cohorte clinique et comparable à la littérature existante, les rats seront utilisés à un stade adulte (8-10 semaines).
Evaluation de nouveaux analgésiques dans un modèle de douleur associée à une tumeur osseuse
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
- Système nerveux
584 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Une tumeur osseuse leur est induite par injection de cellules de mélanome dans le tibia, puis des prélèvements de sang sont réalisés sur les animaux vigiles, pour tester de nouveaux analgésiques contre la douleur cancéreuse. Le porteur indique que la tumeur provoque une douleur et que le développement de métastases peut lourdement affecter les souris, mises à mort quand elles atteignent un point limite. Sur le remplacement, il affirme que les alternatives sont limitées voire inexistantes et que la douleur, réaction de l'"organisme entier", rend le recours à la souris "incontournable".
Objectifs
L’objectif de cette étude est de tester l’efficacité de nouvelles molécules à visées thérapeutique développées par nos collaborateurs. Les effets des molécules pouvant toucher l'ensemble de l'organisme et les enjeux thérapeutiques (poursuite de cette étude en phase clinique) rendent indispensable l’utilisation de modèles in vivo. Nous étudierons dans un premier temps l’impact de ces molécules sur l’atténuation de la nociception, leurs conséquences sur l’immunologie de la tumeur et leurs effets sur le système digestif et hépatique. Ceci est basé sur l’utilisation d'un modèle animal murin (C57bl6J) auquel est induit une tumeur osseuse au niveau du tibia par injection intra-tibiale de cellules cancéreuses de mélanome (B16-F10) qui reproduisent en majeure partie les symptômes ainsi que la structure, l'architecture et le fonctionnement biologique de la maladie humaine.
Bénéfices attendus
In fine ce projet a pour but de sélectionner un ou plusieurs candidates permettant une analgésie similaire ou supérieure aux analgésiques déjà présents dans notre pharmacopée avec des effets indésirables moindres sur le reste de l'organisme.
Procédures
Toutes les souris subieront une injection intra-tibiale sous anesthésie générale et des prélèvement de 60µL de sang seront réalisés à la queue des animaux vigiles sur les lots experimentaux numéros 1 & 2
Impact sur les animaux
Les premières nuisances attendues seront post-opératoires, nous pouvons nous attendre à : - Des difficultés à se mouvoir, ainsi nous faciliterons l’accès de la nourriture et de l’eau les jours suivant l'opération - Certains animaux pourront se couper les points de suture trop tôt, la plaie sera alors désinfectée sous anesthésie et le point de suture refait. Par la suite une nuisance peut apparaitre dû au développement de la tumeur qui engendrera une douleur - La taille de la tumeur sera surveillée à l'aide d'un pied à coulisse et par système d'imagerie in-vivo. - La sensibilité des souris sera suivit tous les 2 jours (Lundi, Mercredi, Vendredi). Le développement de métastase pourra lourdement affecter la santé des souris, un suivis quotidien (week-end compris) sera effectué, et l'animal sera euthanasié s'il présente un point critique.
Devenir
à la fin du projet tous les animaux seront sacrifiés, afin de récupérer les organes pour réaliser les tests.
Remplacement
Les méthodes alternatives, permettant une évaluation de l’efficacité d’une molécule sur la douleur sont limitées voire inexistantes. Ainsi, ces limitations rendent incontournable le recours à l’expérimentation animale afin de valider de nouvelles cibles thérapeutiques pour le traitement de la douleur chronique chez les personnes atteintes de cancer. De plus, la douleur et l'inflammation sont des réactions intégrées de l'organisme entier impossible à reproduire in vitro dans leur intégralité.
Réduction
Dans ce modèle, les animaux seront suivis régulièrement au cours du temps par des techniques non invasives comme le suivi du poids, la posture, la consistance des fèces et de façon plus spécifique par l'analyse des scores cliniques sur la mobilité des souris, la taille de la tumeur à l'aide d'un pied à coulisse et d'imagerie in vivo et la sensibilité des souris. L’utilisation de ces techniques non-invasives permet d’observer au cours du temps un seul animal, là où l’information devait être obtenue par euthanasie et autopsie de multiples individus à chaque stade d’une étude, permettant ainsi de réduire sensiblement le nombre d’animaux. Une étude rétrospective sera néanmoins effectuée à la fin de chaque expérience pour déterminer les possibilités de diminution du nombre d'animaux et/ou d'amélioration des procédures pour diminuer la souffrance animale.
Raffinement
Durant toute la période d’expérimentation, l’état général des animaux sera observé quotidiennement. Pour chaque procédure des points limites ont été définis pour limiter la douleur, la souffrance ou l’angoisse de l’animal et l'animal sera euthanasié s’il présente un de ces points limites d’arrêt de la procédure
Choix des espèces
Pour réaliser cette étude nous utiliserons un modèle murin de tumeur osseuse induit par le transfert intra-tibial de cellules cancéreuses de mélanome. Le choix de ce modèle s’est fait pour les raisons suivantes : La douleur et l'inflammation sont des réactions qui mettent en jeux de nombreux mécanismes biologiques interagissant entre eux dans l'organisme entier, ce qui les rendent impossible à reproduire in vitro dans leur intégralité. C'est pour cela que nous avons choisi un modele mammifère suffisamment proche du notre afin de pouvoir extrapoler plus tard les résultats de nos recherches. Le modèle reproduit les caractéristiques cliniques et histopathologiques de la maladie humaine (les symptomes ainsi que la structure, l'architecture et le fonctionnement biologique de la maladie humaine.) Le nombre d’outils et les connaissances disponibles chez la souris en font aussi un choix judicieux, ainsi, tous les outils pour faire nos analyses (décrites précédemment) sont disponibles dans ce modèle. L’utilisation d’un seul modèle animal suffira pour cette première étape préclinique. Nous utiliserons des souris âgées d’au moins 8 semaines car nous souhaitons utiliser des animaux adultes et matures. De plus, c'est l'âge utilisé classiquement dans la littérature pour ces modèles.
Etude du vieillissement vasculaire d’un point de vue des médiateurs lipidiques
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
240 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Âgées d'une semaine à vingt-quatre mois, elles subissent des prélèvements de sang deux fois par mois et des injections intrapéritonéales, pour étudier le vieillissement des vaisseaux sanguins. Le porteur présente les manipulations lors des prises de sang et des injections comme les seuls effets indésirables. Les rubriques réduction et raffinement reprennent mot pour mot le texte de la rubrique remplacement, sans mesure propre à chacune, avant mise à mort de toutes les souris pour analyser leurs tissus.
Objectifs
Dans ce projet, nous souhaitons 1/ caractériser l’endothélium vasculaire vieillissant 2/ explorer le rôle de médiateurs lipidiques sur le vieillissement vasculaire. Le vieillissement de la population est un enjeu majeur du XXIe siècle. Il s’accompagne d’une augmentation de la fréquence de maladies telles que le cancer et les maladies cardiovasculaires. Ces dernières sont la principale cause de mortalité dans le monde, majoritairement causé par un dysfonctionnement du système vasculaire (vaisseau sanguin et lymphatique) et du système d’hémostase (thrombose, coagulation et fibrinolyse). Cette étude sera menée selon plusieurs axes : Axe 1. Evaluation du vieillissement vasculaire Dans cet axe, une étude pilote sera menée pour la mise au point des immunomarquages de sénescence et de caractérisation. Pour ce faire, un groupe de 5 souris wt (C57BL6) dites jeune (1 semaine à 1mois) et un groupe de 5 souris wt (C57BL6) dites âgées (12 ou 24 mois) seront utilisées (n=10).
Bénéfices attendus
Ces travaux permettront d’apporter de la connaissance sur le vieillissement vasculaire ainsi que l’impact de la physiologie plaquettaire et de l’endothélium, inconnu à ce jour et peu réalisable sur les humains à la vue de la diversité du système vasculaire. En effet, il est irréalisable d’obtenir sur le même individu des biopsies endothéliales (veines, artères et capillaires), à cause des méthodes invasives et des conséquences délétères (hémorragies). Par ailleurs, le second axe permettra de déterminer un composé diminuant ou stoppant le vieillissement vasculaire. Ces travaux serviront à l’ensemble de la population en général et pourront servir de tremplin pour de nouvelle thérapie innovante, des brevets. éral et pourront servir de tremplin pour de nouvelle thérapie innovante, des brevets.
Procédures
Prélèvements sanguins sur animeaux vigiles, 2 fois par mois. La durée de la prise de sang est de maximum 2minutes Les injections en intraperitoneale durent maximum 1minute.
Impact sur les animaux
Les seuls effets indésirables que les animaux peuvent ressentir seront liés aux manipulations lors des prises de sang et injections. Ces 2 gestes seront effectués par du personnel compétent.
Devenir
Au cour de l'étude, les souris feront l'objet d'un suivi quotidien et de prise de sang bi mensuel. Al fin de l'etude, tous les animaux seront mis à mort afin de faire une etude des tissus murins.
Remplacement
Pour ce type de projet, il n’existe actuellement aucune méthode alternative à l’expérimentation animale. L'usage de médiateurs lipidiques nécessite une évaluation de l'efficacité et des risques sur un modèle biologique vivant avant translation à l'homme. Nous sommes actuellement en train d’évaluer in vitro la sénescence sur différents endothélium primaire humain ainsi que leurs récepteurs aux médiateurs lipidiques. Cette approche in vitro participe également à réduire le nombre d’animaux dans le cadre de ce projet de recherche.
Réduction
Pour ce type de projet, il n’existe actuellement aucune méthode alternative à l’expérimentation animale. L'usage de médiateurs lipidiques nécessite une évaluation de l'efficacité et des risques sur un modèle biologique vivant avant translation à l'homme. Nous sommes actuellement en train d’évaluer in vitro la sénescence sur différents endothélium primaire humain ainsi que leurs récepteurs aux médiateurs lipidiques. Cette approche in vitro participe également à réduire le nombre d’animaux dans le cadre de ce projet de recherche.
Raffinement
Pour ce type de projet, il n’existe actuellement aucune méthode alternative à l’expérimentation animale. L'usage de médiateurs lipidiques nécessite une évaluation de l'efficacité et des risques sur un modèle biologique vivant avant translation à l'homme. Nous sommes actuellement en train d’évaluer in vitro la sénescence sur différents endothélium primaire humain ainsi que leurs récepteurs aux médiateurs lipidiques. Cette approche in vitro participe également à réduire le nombre d’animaux dans le cadre de ce projet de recherche.
Choix des espèces
Le modèle murin est le modèle de référence pour l’évaluation de l’impact physiopathologique du vieillissement. Il n’existe pas de méthodes alternatives in vitro pour étudier notre hypothèse de travail. Qui plus est, plusieurs de nos analyses reposent techniquement sur la cytométrie en flux, méthodologie qui requière un nombre conséquent de cellules issues d’organes immunitaires. Ce type d’expériences rend impossible l’utilisation d’organismes comme le poisson zèbre ou la drosophile. Bien qu’il existe certaines différences entre l’immunologie murine et humaine, d’innombrables découvertes faites chez la souris s’avèrent transposables chez l’humain. Ce modèle est donc adapté à l’étude de dérégulations hémostatiques humaines. Les souris utilisées seront de 1 semaine à 24 mois. Les souriceaux a une semaine de vie presentent un arbre vasculaire incomplet au niveau des retines et permet d'avoir un temps de reference "jeune". Les vaisseaux sanguins cerebrales sont matures chez les souriceaux de 1 semaine. Pour notre étude, nous avons besoin de souris jeunes (1 semaine à 1mois) et souris vieillissante de 3 à 24mois. Ces dernieres ont un stade de developpement complet.
Effets de la stimulation non invasive sur le cervelet en développement, et dans des modeles de pathologie
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système nerveux
2 700 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour tester une stimulation magnétique du cerveau après une hypoxie. Selon les procédures, elles subissent une privation d'oxygène de quarante minutes à six semaines, quatorze jours de stimulation magnétique et des tests comportementaux, sous sédation profonde. Le porteur décrit des inconforts transitoires liés à l'hypoxie, à la stimulation et aux injections, et affirme que le cervelet ne peut être étudié hors d'un système nerveux entier. La plupart des souris sont mises à mort pour prélever le cerveau, tandis que 180 femelles ayant servi de mères sont renvoyées à l'élevage pour être réutilisées.
Objectifs
Notre projet testera les effets neurologiques de la stimulation cérébrale non invasive pour améliorer les déficits fonctionnels. Ces connaissances permettront d'optimiser des protocoles de stimulation et trouver des traitements potentiels. Nous analyserons les effets de différents patrons de stimulation magnétique répétée à faible intensité (LIrTMS), qui modifient la plasticité neuronale et améliorent le comportement chez les animaux pathologiques. Les fonctions cérébrales seront évaluées avec des tests de comportement, et les modifications structurales et fonctionnelles chez les mêmes animaux pour minimiser le nombre d’animaux utilisé. Ce traitement peut changer la signalisation cellulaire, modifier des réseaux neuronaux, et provoquer une réparation post-lésionnelle dans le cerveau.
Bénéfices attendus
Nous cherchons des protocoles pour traiter une pathologie commune chez l’Homme, l’hypoxie cérébrale. Nous étudierons le cervelet parce qu’il est particulièrement sensible à l’hypoxie; sa structure, sa fonction et son développement sont très bien décrits; son dommage lors du développement est associé avec les maladies neurodéveloppementales; et il est touché par le vieillissement.
Procédures
4 interventions au maximum. Procédure 1 : 40 minutes d’hypoxie ; 10 minutes/jour x 14 jours simulation magnétique ; tests de comportement un maximum de 30 minutes/jour, un maximum de 12 jours ; analgésie et sédation profonde 1 fois, 15 minutes Procédure 2 : hypoxie 6h/jour x 10 jours ; 10 minutes/jour x 14 jours simulation magnétique ; tests de comportement un maximum de 30 minutes/jour, un maximum de 14 jours ; analgésie et sédation profonde 1 fois, 15 minutes Procédure 3 : hébergement en cages hypoxie pendant 6 semaines, hypoxie intermittente 6h/jour ; 10 minutes/jour x 14 jours simulation magnétique ; tests de comportement un maximum de 60 minutes dans 1 journée ; analgésie et sédation profonde 1 fois, 15 minutes
Impact sur les animaux
Les interventions individuellement induisent une douleur en deca de la douleur engendrée par une simple injection faite selon le bon pratique vétérinaire. La succession de ces interventions nous emmène à demander l’autorisation du projet avec degré de gravité modérée. Les effets indésirables possible sont : inconfort transitoire en début d’hypoxie ; inconfort lors de la stimulation; inconfort lors des tests de comportement ; inconfort lors de l’injection d’anesthésiants et analgésiants. La surveillance quotidienne permet de s’assurer du bien être des animaux et lorsqu’un point limite (comme décrit) est atteint, les responsables du projet sont avertis et prennent une décision sur le devenir de l’animal, en lien avec la structure du bien être animal, et le vétérinaire référent.
Devenir
Nos études sont designés pour obtenir un maximum d'information biologique et comportemental d'un nombre minimum de souris. La plupart des souris sujet à l'hypoxie et la stimulation non invasive est testé en comportement puis perfusé, et les cerveaux des autres sont prélévé pour les études moléculaires. 180 souris femelles, les mères des portées des nouveaux-nés impliqués, seront remis dans l’animalerie, pour qu’elles soient re-utilisées pour l’élevage et diminuer donc le nombre total d’animaux.
Remplacement
Comme toute structure du système nerveux central, les connexions complexes entre les neurones ne peuvent pas être entièrement remplacé par des méthodes de culture ni des modèles mathématiques. Les déficits de comportement dus à une mutation associée avec les troubles autistique, ou à la suite d'une hypoxie perinatale, et l'amélioration de ces déficits ne peuvent être étudiés hors contexte de l'ensemble du système nerveux et donc avec des animaux vivants.
Réduction
2700 animaux total seront impliqués dans cette étude de 4 années. Nous avons calculé le nombre d'animaux nécessaire pour les trois procédures, pour diminuer le nombre d'animaux utilisé. Les tests de comportement nécessitent normalement 10 animaux par groupe, et les études d'expression génique nécessitent 5 animaux par groupe.Un calcul de puissance a été fait pour déterminer ces nombres d'animaux.
Raffinement
Avant le début des interventions, nous habituons les animaux au contact humain en pratiquant du « handling » quotidien pendant une semaine ; ceci diminue leur peur et leur angoisse. Pendant la stimulation non invasive (LIrTMS) les animaux ne montrent aucun signe d’angoisse. Les animaux sont hébergés en portoirs ventilés avec un système d’abreuvement automatique et un accès ad libitum à la nourriture. Les conditions de température et d’hygrométrie sont contrôlées et monitorées. Le cycle d’éclairage est de 12h par jour (6h-18h). Les animaux sont hébergés avec leurs congénères (6 par cage maximum) et l’isolement est évité au maximum. Le milieu est enrichi avec au choix : lanières de papier Kraft, maisons en carton, tunnel en carton ou carré de coton compacté. Les points limites sont définis pour chaque procédure, en cas de dérèglement physiologique ou souffrance de l’animal. Tout acte invasive est fait uniquement après administration des médicaments analgésique ou anésthetiques adaptés.
Choix des espèces
La souris est très utilisée pour des expériences sur le système nerveux car cette espèce partage un nombre de propriétés biologiques avec l'Homme. Sa petite taille et l'existence des lignées de souris transgénique facilitent les aspects pratiques de l'expérimentation. Il existe de protocoles standardisés du comportement, ce qui permet de mieux comparer les résultats obtenus par différentes équipes de recherche. La majorité des animaux seront utilisés pendant les premier mois de développement postnatal, les âges clés pendant le développement du cerveau. Les ages ont été choisi pour être équivalentes au 1) le 3ème trimestre de gestation chez l’Homme ; 2) jeune adulte ; ou 3) adulte agé.