Rongeurs

600 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une bactériémie à staphylocoque doré résistant à la méticilline leur est provoquée par injection dans la veine de la queue, avec prélèvements sanguins quotidiens pendant dix jours, pour étudier le rôle protecteur de la protéine cavéoline-1. Le porteur indique que l'aggravation de l'infection conduit à prostration, cyanose et perte de poids, la mise à mort étant alors anticipée. Il reconnaît qu'une étude sur cellules a déjà établi le rôle de la cavéoline-1, mais affirme que la confirmation "doit" passer par un modèle in vivo.

Objectifs

La famille des exotoxines EDIN (A, B et C) de S. aureus compromet la perméabilité vasculaire par induction de tunnels transcellulaires. Des résultats non publiés montrent que cavéoline-1, une protéine fortement exprimée dans les cellules endothéliales, limite la formation et l’élargissement de ces tunnels transencellulaires. La perte d’expression de la cavéoline-1 entraine i) un doublement du nombre des tunnels transcellulaires provoqués par l’EDIN et ii) l’élargissement de ces tunnels. Des études antérieures sur modèle souris ont montré que l’EDIN est responsable d’une plus grande capacité des bactéries à induire une augmentation de la perméabilité vasculaire, associée à une plus forte dissémination de S. aureus dans les tissus par voie hématogène. Basé sur des résultats obtenus in vitro, l’objectif de notre étude est de démontrer que la perte d’expression de la cavéoline-1 chez l’animal est responsable d’une hyper-susceptibilité des animaux à la bactériémie induite par la souche LUG1799 du clone ST80-SARM-IV PVL+ et que ceci est directement lié à l’activité de la toxine EDIN-B. La souche LUG1799 est représentative des souches de S. aureus résistantes à la méticilline, problème majeur en Europe et en France. Nous nous baserons sur des études précédentes pour limiter le nombre d’animaux engagés dans cette étude et par une approche d’analyse statistique pour définir le nombre d’animaux par groupe.

Bénéfices attendus

Des travaux antérieurs ont permis de montrer un lien causal entre la formation des tunnels transendothéliaux induits par l’exotoxine EDIN de S. aureus et la survenue de dysfonctions vasculaires : œdème et hémorragie. De plus un exemple de formation transitoire de tunnels transcellulaires en physiologie est décrit lors de la transmigration des leucocytes à travers l’endothélium. Bien qu'elle ait été longtemps controversée, la première preuve de transcytose de leucocytes au travers des cellules endothéliales a été démontrée in vivo et/ou in vitro pour les monocytes, les neutrophiles, les lymphocytes, grâce à l’imagerie confocale à haute résolution. L'intégrité de la barrière endothéliale est maintenue lors de la diapédèse des leucocytes au travers des cellules endothéliales grâce à la formation d'un anneau d’actine-myosine qui est étroitement ajusté à la taille des leucocytes. Cet anneau stabilise le pore pendant le passage des leucocytes empêchant la fuite de plasma et la formation associée d'œdème. La formation de tunnels transcellulaires de taille régulée est aussi essentielle pour permettre l'écoulement de l'humeur aqueuse. Le dysfonctionnement de ces tunnels transcellulaires affecte la résistance à l'écoulement avec augmentation de la pression intraoculaire, provoquant le glaucome. Les protéines responsables de la régulation de ces tunnels transcellulaires sont largement inconnues. Nous avons identifié le rôle inhibiteur de la cavéoline-1 sur la formation et l’élargissement des tunnels transcellulaires induits par l’EDIN. Cette étude permettra de démontrer le rôle protecteur de la cavéoline-1 lors de la bactériémie induite par une souche clinique de S. aureus ST80-SARM-IV edinB+ et ouvrira à une meilleure compréhension de la régulation des tunnels transcelluaires dans les processus physiologiques et pathophysiologiques.

Procédures

Cette procédure consiste en l’administration de S. aureus par injection intravasculaire dans la veine de la queue avec suivi de la bactériémie par prélèvement sanguin quotidien de 20 microlitres (3 minutes par intervention) durant 10 jours. Cette procédure est néanmoins modérée car conduit à une mise à mort anticipée des animaux lors de l’apparition d’un phénotype caractéristique d’aggravation de la bactériémie.

Impact sur les animaux

Des expériences antérieures ont montré que des souris transgéniques invalidées pour le gène de la cavéoline-1 du même fond génétique que celle que nous élevons (C57BL/6, 12-14 semaines) une fois infectées par voie intravasculaire (veine de la queue) par 103 CFU de Salmonella typhimurium souche SB300 meurent en 7 jours (temps ½) alors que les souris sauvages meurent en 13 jours. Cet effet de susceptibilité à l’infection est à mettre en parallèle avec une translocation accrue des bactéries vers le foie avec formation de larges granulomes et translocation dans la rate, une forte augmentation de marqueurs de la réponse immunitaire (IFN-gamma, IL-6, TNF-alpha) dans le sang et la production de taux élevés de NO dans le sérum. Cette réponse péjorative de marqueurs immunitaires est récapitulée par l’injection de LPS de S. typhimurium. Les souris lors de l’infection meurent plus rapidement du fait d’une réaction immunitaire élevée et translocation de Salmonella plus forte dans les organes essentiels. Aucune étude à ce jour n’a permis de définir si des souris invalidées dans le gène de la cavéoline-1 sont plus susceptibles à des bactériémies induites par des bactéries à Gram-positif, S. aureus étant la plus fréquemment isolée dans la bactériémie à Gram-positif chez l’homme que l’infection soit d’origine nosocomiale ou communautaire. Un ensemble de résultats obtenus in vitro sur cellules primaires endothéliales humaines concordent pour indiquer que la perte d’expression de la cavéoline-1 entraine une augmentation du nombre et du diamètre des tunnels transendothéliaux provoqués par les exotoxines EDIN (A, B et C). Nous chercherons à prouver chez l’animal invalidé pour la cavéoline-1 que lors de la bactériémie à S. aureus produisant l’EDIN-B les animaux montrent des signes d’hyper-susceptibilité à l’infection du fait d’induction de fuites vasculaires. Nous suivrons l’évolution de la bactériémie provoquant un phénotype caractéristique de bactériémie aggravée conduisant à la prostration, immobilité, apathie, des animaux avec hérissement des poils, le tremblement, la cyanose, et perte de poids significative de plus de 20%. Ce suivi des animaux permettra une mise à mort anticipée des souris présentant un phénotype de bactériémie aggravée.

Devenir

Les animaux sont mis à mort à l’issue de chaque procédure.

Remplacement

Une étude de biologie cellulaire conduite sur cellules endothéliale en remplacement d’expériences sur l’animal nous permet d’affirmer que la cavéoline-1 est un gène de susceptibilité à la formation de tunnels transendothéliaux qu’induit l’EDIN. La formation de ces tunnels transendothéliaux corrèle avec l’apparition de fuites vasculaires. Cette approche de remplacement de type biologie cellulaire nous a permis de limiter le nombre de gènes de susceptibilité à l’EDIN à étudier pour ne sélectionner que la cavéoline-1. Le rôle protecteur de la cavéoline-1 dans l’infection bactériémique par une souche de S. aureus produisant l’exotoxine EDIN-B doit être confirmée par une approche in vivo.

Réduction

Pour limiter le nombre d’animaux engagés dans cette étude nous procèderons en étapes successives avec une seule procédure de « suivi d’aggravation de la bactériémie » et nous définirons le nombre d’animaux par groupe grâce à un calcul statistique de puissance. Pour l'étape 1 (établissement de la CFU50) les effectifs ont été calculés sur la base d'expériences précédentes sur d'autres modèles animaux. Pour les étapes 2, 3 et 4 les effectifs ont été calculés sur la base d'une analyse de puissance. Pour approximation, une analyse de puissance d'un test de comparaison de proportions a été réalisée, pour un risque 5%, une puissance de 80%, donnant des effectifs de 30 animaux par groupe. Ceci correspond à une différence entre les groupes variant de 0.13 à 0.35, suffisante pour répondre à la question biologique.

Raffinement

Une surveillance quotidienne des animaux selon la grille d’évaluation de la douleur du stress et inconfort du SBEA, nous permettra de détecter au plus tôt les points limites de souffrance de l’animal. Les points limites seront : des changements de comportement, tels que l'isolement dans le groupe, ainsi que prostration, immobilité, apathie, hérissement des poils, le tremblement, la cyanose, et une perte de poids significative (plus de 20%) seront mis à mort. Dans ces conditions, la mise à mort sera anticipée par dilacération cervicale pour abréger les souffrances de l’animal (technique validée 1A). Des cotons imbibés d’eau et de la nourriture « Dietgel » seront placés dans la cage dans le cas ou certaines souris auraient du mal à se déplacer.

Choix des espèces

Etude comparative de souris transgéniques invalidées dans le gène codant la cavéoline-1 de fond génétique C57BL/6 (B6.Cg-Cav1tm1Mls/J, Jackson via Charles River) versus souris sauvage « littermate ». Les souris C57BL/6 sont sensibles à l’infection intraveineuse par S. aureus (geste technique validé 18A). Nous savons d’expériences précédentes (n° dap160118) que l’injection de doses comprises entre 5x 106 et 5x 108 CFU suivant les souches de S. aureus conduit à un état de prostration, immobilité, apathie avec hérissement des poils, le tremblement, la cyanose, et une perte de poids significative de plus de 20% conduisant à une mise à mort anticipée de 50 % des animaux sur 10 jours. La valeur de CFU50 des souris C57BL/6 à l bactériémie LUG1799 sera déterminée dans l’étape n°1. La souris est l'espèce de choix pour l'étude de l'infection par S. aureus : espèce naturellement colonisée par S. aureus comme l'homme, pathogenèse infectieuse proche de celle de l'homme, espèce permissive à l'infection par S. aureus, littérature abondante. Notre étude portant sur l’infection de type bactériémie sera conduite sur des animaux de 8-16 semaines selon un protocole publié portant sur un modèle de souris invalidées dans le gène codant la cavéoline-1.

200 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des cellules souches humaines leur sont injectées dans les cuisses sous anesthésie pour y former des tératomes, tumeurs servant à vérifier la pluripotence de lignées cellulaires. Le porteur indique que la croissance de ces tumeurs peut gêner la mobilité de l'animal et retient des souris NSG "très immunodéprimées" pour éviter le rejet des cellules humaines. Il présente cette formation de tératomes comme "indispensable" pour démontrer la pluripotence, sans mentionner d'alternative in vitro validée.

Objectifs

Etude comparée des capacités de différenciations des lignées de cellules souches ES humaines et d’iPSC reprogrammées dans le cadre des pathologies leucémiques. Plusieurs lignées cellulaires seront à tester. Plusieurs facteurs plus ou moins aléatoires entrent en jeu : la capacité à obtenir des cellules différenciables en quantité suffisante, l'obtention d'échantillons des patients afin d’en déterminer les profils génétiques, profils qui peuvent comporter 1 ou plusieurs mutations, notre capacité à reproduire ces profil génétiques entièrement ou partiellement etc… Actuellement, nous pouvons établir cette liste non exhaustive des différentes lignées cellulaires à tester : - cellules hES transduites par les lentivirus vides ou codant pour différents shARN (TET2, RUNX1, EZH2, ANKRD26, RAD21, ASXL1..) ainsi que pour différents transgénèse cDNA (GATA1s, ANKRD26, CALRwt, CALRmut, JAK2mut, MPLmut..), - cellules iPSC donneur sain - cellules d’IPSC à partir des patients avec les néoplasmes myéloprolifératifs (mutations de JAK2, CALR, MPL) - cellules d’IPSC à partir des patients présentant des thrombopénies avec ou sans prédisposition aux leucémies (RUNX1, FLNA, ANKRD26, ETV6, NBEAL2) - cellules d’IPSC à partir des patients avec les leucémies myélomonocytaires (mutations dans des molécules de signalisation, des régulateurs épigénétiques, des facteurs d’épissage). - cellules d’IPSC génétiquement modifiées par la technologie CRISPR/CAS9 pour des molécules de signalisation, des régulateurs épigénétiques, des facteurs d’épissage.

Bénéfices attendus

Les cellules IPS et hES peuvent servir à reproduire les mécanismes impliqués dans une pathologie hématopoïétique notamment lorsqu’il est difficile d’obtenir des prélèvements de patients. Par exemple, cela permettrait d’étudier l’embryogénèse humaine. A terme, ces techniques pourraient permettre d’obtenir des cellules hématopoïétiques (globules rouges ou plaquettes) en nombres suffisants et immunitairement compatibles avec les patients. Ceci limiterait les risques de rejet (système HLA, rhésus, etc..), pallierait au manque de cellules sanguines pour les transfusions et limiterait les risques de transmission pathologique entre donneur et receveur (maladie du greffon contre l'hôte).

Procédures

Injection intra musculaire au niveau supérieur de la cuisse arrière (biceps cruraux gauche et droit) une fois, durée: 2 minutes incluant la préhension. - Les injections de tératomes se font sous anesthésie gazeuse (isoflurane 3% pendant l'induction et 2% pour le maintient sous anesthésie). Elles sont réalisées avec des seringues à insuline pour éviter tout problème lors de l'injection du matrigel (désolidarisation aiguille/seringue,...).

Impact sur les animaux

L'injection des cellules en intramusculaire peut éventuellement au maximum entrainer des problèmes modérés de mobilité pour l'animal.

Devenir

Les animaux sont mis à mort pour étude des cellules de tératome.

Remplacement

Les cellules induites in vitro seront caractérisées sur le plan moléculaire afin de vérifier qu’elles n’ont pas d’anomalies génétiques importantes comme duplication ou perte de chromosome, si les mutations qui conduisent aux maladies qu’on étudie sont présentes et si ces cellules ont toujours la capacité à se différencier en tous types cellulaires.Des marqueurs spécifiques qui correspondent à l’état de pluripotence avant toute utilisation chez l'animal seront recherchés par séquençage. La confirmation de l'état pluripotent chez l'animal est indispensable pour pouvoir considérer les cellules comme réellement pluripotentes.

Réduction

Afin de limiter l'utilisation d'animaux l'injection des 5 souris se fera en deux étapes décalées dans le temps : dans un premier temps 3 souris seront injectées. Si il y a obtention de 3 tératomes exploitables dans les 3 mois post-injection impartis, nous n'injecterons pas les 2 autres souris. Dans le cas contraire, nous ajouterons 2 souris au premier lot. Pour ramener un taux d'échec moyen par injection de 40% à 20% par souris (échec ou prise trop lente du greffon), nous injecterons les deux cuisses de chaque souris en même temps.

Raffinement

Les injections se font sous anesthésie gazeuse (isoflurane), dans les 2 biceps cruraux afin d'impacter le moins possible la mobilité de l'animal. Elles sont réalisées avec des seringues à insuline pour éviter tout problème lors de l'injection du matrigel (désolidarisation aiguille/seringue,...), limiter le volume mort dans la seringue et ainsi garantir l'injection de la bonne quantité de cellules. Ces seringues sont pré-montées avec des aiguilles très fines limitant ainsi le traumatisme pour l'animal. Des pooints limite très stricts ont été définis et seront appliqués conernant les éventuels impacts de la croissance des tératomes sur la mobilité.

Choix des espèces

L'induction de tératomes dans les souris immunodéficientes est considérée comme indispensable pour démontrer la pluripotence des lignées cellulaires obtenues in vitro. Ces essais ont été standardisés pour prouver la formation des 3 feuillets germinaux (endoderme, mesoderme et ectoderme) et donc la pluripotence des cellules souches. Chez la souris, cette induction intramusculaire, est pratique, aisée à réaliser, reproductible et quantifiable. Nous avons choisi les souris NSG car elles sont très immunodéprimées et dépourvues de lymphocytes B, T et NK murins, ce qui permet d’éviter le rejet de greffe des cellules humaines à greffer. En raison de leur déficit immunitaire combiné sévère, les souris NSG ont une capacité de rejet des greffes allogéniques ou de tissus xénogéniques réduites, et sont donc d'excellents hôtes pour les cellules et les tissus d’origine humaine. Animaux injectés entre 6 et 10 semaines, pour des raisons de système immunitaire faible.

1 200 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une mutation de l'oncogène Kras déclenche chez elles des lésions précancéreuses du pancréas, puis elles reçoivent des injections et des gavages répétés de molécules candidates avant un prélèvement terminal de sang et d'organes. Le porteur affirme que ces lésions "ne devraient pas" entraîner de douleur, en s'appuyant sur le diagnostic tardif du cancer chez l'humain. Il sollicite 1 200 souris sur cinq ans tout en indiquant que le projet ne devrait en nécessiter qu'environ 300, et conclut qu'aucun modèle in vitro ne remplace l'"organisme intégré".

Objectifs

L’adénocarcinome du pancréas est un cancer en constante augmentation qui devrait d’ici fin 2022 se classer comme le second cancer le plus mortel. Ce cancer est très difficilement pris en charge et son diagnostic souvent tardif ne laisse que peu d’opportunité de traitement thérapeutique, conduisant les patients à moins de 5% de chance de survie 5 ans après leur diagnostic. Grâce aux analyses génétiques à grande échelle, plusieurs mutations impliquées dans cette pathologie ont déjà été identifiées chez l’Homme. L’initiation des cancers du pancréas est majoritairement associée à l’acquisition de mutations de l’oncogène Kras. Face à ces mutations, les cellules affectées deviennent précancéreuses, elles développent une réponse de protection visant à limiter leur expansion. Ce processus appelé « Sénescence oncogénique induite » ou OIS conduit les cellules précancéreuses à induire des mécanismes visant à limiter leur prolifération, mais également à sécréter de nombreux composés complexes (regroupés sous le terme: SASP) dont le rôle bénéfique ou délétère sur la progression tumorale restent encore mal compris. De nombreuses fonctions sont décrites au large spectre de molécules sécrétées qui compose le « SASP ». Ces molécules sont produites en aval de grandes voies canonique de signalisation (mTOR, JAK (Janus Kinase), Notch, Toll Like Receptor (TLR), …). Leurs actions peuvent être inflammatoiree, favoriser la fibrose ou plus bénéfique pour certaines d’entre elles. Parmi les nouvelles stratégies thérapeutiques anti-cancéreuses, le développement de molécules appelées « sénomorphiques » vise à bloquer spécifiquement les molécules du SASP aux effets délétères tout en conservant l’action des molécules bénéfiques. L’objectif de notre projet vise à évaluer les effets thérapeutiques de 5 candidats molécules capables de bloquer les voies de signalisation qui conduisent à la production de différentes molécules du « SASP » par les cellules précancéreuses pancréatiques. Il consistera à traiter à court terme (2 semaines) ou à long terme (2 mois) de jeunes souris porteuses dans leur pancréas de la mutation KRAS qui est à l’origine des cancers pancréatiques chez l’Homme. Les résultats bénéfiques ou délétères seront ensuite observés sur les lésions développées afin de mieux comprendre le rôle complexe du SASP dans l’initiation des tumeurs pancréatiques.

Bénéfices attendus

Notre projet vise à mieux comprendre l'intérêt du ciblage thérapeutique des cellules sénescentes et des molécules qu’elles secrètent dans le cadre du développement des cancers pancréatiques. Il devrait permettre de mieux comprendre la complexité d'action du SASP dans les pré-lésions pancréatiques et fournir des pistes importantes pour le développement de nouvelles approches thérapeutiques pour les cancers du pancréas

Procédures

Les animaux subiront des injections intrapéritonéales ou des gavages répétés, sur 2 semaines à 2 mois, pour administrer les molécules candidates thérapeutiques. La fréquence d’administration dépendra des molécules concernées (3 injections intrapéritonéales et de 3 à 5 gavages par une canule adapté par semaine). Un prélèvement terminal de sang sera réalisé à la fin des procédures de traitements sur des animaux, il sera cependant réalisé sous anesthésie profonde avant leur mise à mort finale.

Impact sur les animaux

L'activation ciblée de la mutation de Kras dans le pancréas des souris entrainera l'apparition de pré-lésions cancéreuses pancréatiques. Ces lésions bégnines ne devraient toutefois pas entrainer de douleurs (chez l'homme le cancer pancréatiques n'est diagnostiqué que très tardivement par des douleurs). Les animaux subiront des injections intrapéritonéales ou des gavages répétés qui pourraient entrainer un inconfort ou des irritations locales sur lesquels nous seront particulièrement vigilant. Les produits testés pourraient entrainer une réponse inflammatoire.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin des traitements réalisés. Nous procéderons à un prélèvement sanguin final qui servira à réaliser des dosages de molécules secrétées par les pré-lésions cancéreuses. Nous procéderons également à de nombreuses analyses sur les pancréas collectés post-mortem. Des analyses histologiques et moléculaires complémentaires permettront d’exploiter au mieux nos résultats et ainsi limiter la nécessité de répéter nos travaux expérimentaux.

Remplacement

Aucun autre modèle ne permet de reproduire de manière aussi satisfaisante la progression tumorale du cancer du pancréas puisque les tumeurs se développent au niveau du pancréas lui-même. En raison de la nature complexe de la recherche proposée qui vise à évaluer les effets de molécules thérapeutiques au sein de lésions pancréatiques précancéreuses (où des interactions cellulaires complexes prennent place), nous ne pouvons malheureusement pas remplacer l’utilisation de modèles murins par des outils cellulaires ou des approches in vitro. L’effet des molécules que nous proposons de tester ont toutefois été étudié et validé in vitro sur des lignées cellulaires pour confirmer l’intérêt thérapeutique des travaux que nous proposons.

Réduction

Afin de nous conformer à la règle de Réduction, le nombre de souris nécessaire à nos travaux a été réduit au minimum sans compromettre l’interprétation des traitements thérapeutiques testés. 6 à 9 souris par sexe et par groupe devraient nous permettre d’obtenir des conclusions statistiques interprétables entre groupe de traitements. Nous ne réaliserons pas de répétition expérimentale sauf en cas de problèmes techniques qui compromettraient l’interprétation de nos travaux. Signalons enfin que les traitements à court et long terme seront réalisés séquentiellement et que les traitements à long terme ne seront mis en place qu’en d’absence d’effets des traitements à court terme. Bien que nous sollicitions 1200 souris sur 5 ans, ce projet ne devrait donc nécessiter qu’un quart de ces animaux (300) pour atteindre nos objectifs.

Raffinement

Nous mettrons en place une surveillance adaptée et individuelle des animaux afin d’assurer que les animaux expérimentaux ne subissent aucune souffrance inutile. Ce suivi individuel permettra d’identifier l’apparition de signes évocateurs de mal-être ou de souffrance (prostration, perte de poids, irritations liées aux modes d’administrations des traitements réalisés). L’identification de ces signes entraineraient alors une fin d’expérimentation immédiate et une mise à mort des animaux concernés. Le suivi individuel des animaux permettra également de mieux saisir la variabilité des bénéfices thérapeutiques des traitements que nous testerons, ils seront accompagnés de nombreuses analyses des tissues pré-tumoraux post-mortem par des approches histologiques et moléculaires complémentaires qui permettront d’exploiter au mieux nos résultats et ainsi limiter la nécessité de répéter nos travaux expérimentaux.

Choix des espèces

Le modèle murin que nous avons choisi pour réaliser cette étude reproduit parfaitement la pathologie humaine. Il est basé sur l’expression conditionnelle dans le pancréas d’une mutation de l’oncogène Kras qui est retrouvée dans plus de 90% des patients atteints de cancer du pancréas. Il reproduit les lésions pré-cancéreuse (PANINs) qui sont décrites chez l’Homme. Ces animaux permettent de reproduire de manière fidèle la progression tumorale du cancer du pancréas qui prend place chez l’homme en aval des mutations qui affectent ce gène. L’utilisation d’animaux est de plus essentielle pour la réalisation de notre projet car elle requiert l’analyse des effets de molécules thérapeutiques sur un organisme intégré. Les protocoles de traitements mis en place seront réalisés sur des souris âgées de 4 semaines. A cet âge les souris porteuses de mutation Kras ne présentent que de très rares lésions de type PANINs dans lesquelles l'existence de mécanismes de sénescence est déjà bien démontrée.

35 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une inflammation intestinale leur est induite par du DSS, avec gavage, test de perméabilité après huit heures de jeûne et prélèvement de sang derrière l'oeil sous anesthésie avant mise à mort par dislocation cervicale. Le porteur indique que le DSS peut provoquer une perte de poids, une altération des selles et la présence de sang, tout en tablant sur des effets "faibles" aux faibles doses employées. Il s'agit d'une étude pilote visant à caler le modèle avant de tester des stratégies nutritionnelles, l'espèce étant retenue faute d'accès aux biopsies humaines.

Objectifs

L'inflammation est un mécanisme physiopathologique pouvant altérer de manière importante l'intégrité intestinale. L'inflammation aiguë responsable des maladies inflammatoires intestinales (maladie de Crohn, rectocolite hémorragique) se distingue de l'inflammation chronique qui est associée à de nombreuses pathologies chroniques comme l'obésité, le syndrome métabolique, le diabète de type II, les maladies cardiovasculaires et la sarcopénie du sujet âgé. Le développement de l’inflammation intestinale est associé à des altérations majeures des fonctions digestives : augmentation de la perméabilité, anomalies de la couche de mucus protectrice, modifications histologiques significatives comme la profondeur des cryptes, altération de la motricité intestinale, perturbations de l'absorption des nutriments ainsi que des changements importants du microbiote intestinal. La consommation de lipides particuliers induisant des changements bénéfiques du profil et métabolisme lipidiques pourrait contribuer à réduire l’incidence ou les symptômes liés à l’inflammation intestinale et à l’altération de la barrière intestinale. Avant de commencer ces études testant de telles statégies nutritionneles de prévention, il est indispensable de réaliser une première étude pilote pour développer un modèle d’inflammation intestinale chronique induite par ajout de DSS (Dextran Sulfate Sodium) à l’eau de boisson chez la souris. Ce modèle est simple, rapide et reproductible cependant de nombreux facteurs peuvent affecter la susceptibilité au DSS et modifier les résultats. Il est donc nécessaire de caractériser le modèle d’inflammation en tenant compte de la source et du lot de DSS, de la souche de souris, de la dose et de la durée du traitement. Une dose excessive de DSS ou administrée pendant une durée trop longue induirait une réponse inflammatoire aigüe, plus typique de la rectocolite hémorragique ou de la maladie de Crohn. L’objectif est d’induire une inflammation chronique avec des doses inférieures à celles classiquement utilisées pour induire une colite chez la souris. D’après la littérature, la dose 0 ,5% - 1,0% DSS pendant sept à dix jours pourrait induire une inflammation suffisante pour mimer l’inflammation intestinale chronique induite lors d’un régime riche en gras et en sucres. Cependant, l’impact relatif de ces doses et durées sur des paramètres importants scientifiquement comme la perméabilité intestinale et la production de cytokines plasmatiques reste mal décrit.

Bénéfices attendus

L’intestin joue plusieurs fonctions essentielles à l’intégrité de l’organisme et au maintien d’une santé optimale. L’inflammation est un mécanisme physiopathologique pouvant altérer de manière importante l’intégrité intestinale comme dans la maladie de Crohn, la rectocolite hémorragique ou les maladies inflammatoires chroniques de l’intestin (MICI). Le taux de MICI dans le monde est passé d’environ 4 millions en 1990 à environ 7 millions en 2017. Le développement d’un modèle d’inflammation intestinale modérée induit par le DSS chez la souris permettra d’étudier ultérieurement différentes stratégies nutritionnelles pour limiter cette inflammation soit de façon préventive soit de façon corrective.

Procédures

Toutes les souris seront gavées oralement une seule fois au cours du test de perméabilité intestinale. Après un jeûne réduit à 4h sur litière propre, les souris recevront une injection sous-cutanée de solution saline pour favoriser la production d’urine et seront gavées oralement avec une solution de lactulose, mannitol, sucralose puis placées individuellement dans une cage vide. L'urine sera collectée directement dans la cage à l’aide d’une pipette tout au long des 4h suivant le gavage. A la fin du test, les souris seront regroupées dans les cages comme précédemment. La durée totale de l’intervention (jeûne compris) sera de 8h. Le dernier jour de l’étude, toutes les souris auront une anesthésie locale au niveau de l’œil par une goutte de tétracaïne 1min avant anesthésie générale par inhalation isoflurane 3% suivie d’un prélèvement de sang en rétroorbital (500µl) avant leur mise à mort par dislocation cervicale.

Impact sur les animaux

L’induction d’une inflammation par le traitement au DSS peut induire après quelques jours et en fonction de la dose administrée une perte de poids significative, une altération de la consistence des selles et la présence de trace de sang dans les selles. Ces modifications physiologiques peuvent donc être responsables d’une douleur ou d’un stress de l’animal provoquant alors des comportements anormaux. Au regard des faibles doses de DSS utilisées, inférieures ou égales à 1%, les effets devraient être faibles et limités aux derniers jours du protocole.

Devenir

Toutes les souris seront mises à mort à la fin des procédures. En effet, nous devons collecter du sang pour mesurer les marqueurs sanguins de l'inflammation tels que les cytokines. Nous devons aussi prélever les organes inflammés comme le côlon, l'intestin grêle pour mesurer leur poids et leur taille et étudier leur histologie. On ne peut donc pas obtenir ces mesures sans la mise à mort des souris.

Remplacement

Il est trop invasif d’étudier les désordres intestinaux inflammatoires humains à travers des biopsies, des coloscopies qui ne sont pas autorisées dans le cadre de la recherche. Il est donc important d’étudier les inflammations intestinales dans un contexte où l’ensemble du système organique peut être étudié et les données obtenues de ces études transposables à l’homme. La physiologie des souris, en particulier l’inflammation intestinale et systémique est similaire aux humains. Le développement d’un modèle d’inflammation intestinale modérée induit au DSS chez la souris devrait permettre d’accroitre nos connaissances sur l’inflammation et de mettre en place par la suite des stratégies nutritionnelles pour la diminuer ou la prévenir.

Réduction

Il est désormais clairement établi que le sexe joue un rôle non négligeable dans divers facteurs physiologiques, métaboliques et comportementaux chez la souris. Les données de la littérature ont montré que les souris mâles sont plus prédisposées à développer une inflammation intestinale et des altérations dues au DSS que les souris femelles. L’étude pilote se fera uniquement sur des souris mâles afin de maximiser les chances d’observer une inflammation modérée. Des calculs de puissance avec Rstudio ont été réalisé avec l’objectif de réduire la quantité d’animaux. La puissance a été défini à 0,8, le niveau de significativité à 0,05 et la taille de l’effet à 0,6 (un effet important au niveau du traitement au DSS est attendu). La Après avoir défini le nombre de groupes étudiés, Rstudio détermine le nombre nécessaire de souris par groupe pour avoir des résultats significativement élevés. Pour cette étude pilote avec le traitement au DSS, 7 souris par groupe sont requises selon les calculs d’analyse de puissance (5 groupes, 7 souris par groupe = un total de 35 souris).

Raffinement

Les souris seront mises en cage par groupes de 3 ou 4 afin d’éviter le stress lié à l’isolement. Pendant toute la durée des traitements, les animaux auront un accès à volonté à l’eau et à la nourriture sauf lors du test de perméabilité intestinale. Pour le prélèvement de sang en rétroorbital, les souris auront une anesthésie locale au niveau de l’oeil suivie d’une anesthésie générale. Durant le protocole, les souris feront l’objet d’une surveillance quotidienne pour déceler un potentiel mal-être. L’aspect du pelage, le comportement, la perte de poids comparé au poids initial, la consistence des selles et la présence de trace de sang dans les selles seront évalués et récoltés sur une feuille d’observation. Les différents gestes expérimentaux réalisés dans ce projet n’ont jamais démontré de souffrance, d’angoisse ou de douleur chez la souris nécessitant une prise en charge spécifique. Au cours du test de perméabilité intestinale, les gavages peuvent irriter l’oesophage des animaux. Pour minimiser cet effet potentiel, une sonde de gavage coudée au bout arrondi sera utilisée par un personnel expérimenté qui vérifiera l’état de la canule et le comportement de l’animal.

Choix des espèces

Les travaux effectués dans ce domaine (dans la communauté scientifique en générale mais également au sein du laboratoire) sont majoritairement réalisés chez la souris permettant ainsi la discussion et la comparaison des résultats entre eux. De plus, la régulation du métabolisme lipidique chez la souris est proche de celle de l’Homme. Pour les etudes sur l’inflammation induite au DSS, les souches de souris les plus utilisées sont les souris C57BL/6J et BALB /c. Cependant, les souris BALB /c sont plus résistantes au DSS que les souris C57BL/6J, donc l’utilisation de souris BALB /c nécessiterait d’utiliser des doses plus fortes de DSS et/ou sur des temps plus longs. Ainsi, la souris C57BL/6J est le modèle le plus pertinent pour ce projet. De plus, elle est reconnue comme souche de référence pour les études métaboliques. Les souris seront commandées à 10 semaines de vie et le protocole débutera à 11 semaines de vie après une semaine d’acclimatation. Ce protocole doit être réalisé sur des animaux jeunes adultes pour que les effets des traitements ne soient pas liés à la croissance ou au vieillissement des animaux. Suite à cette étude pilote, les effets préventifs d’un traitement de 4 semaines avec des lipides polaires sur l’inflammation intestinale seront étudiés sur des souris agées de 6 semaines. C’est pourquoi, nous réalisons l’étude pilote avec des souris agées de 10 semaines.

720 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une fibrose pulmonaire leur est provoquée par injection dans la trachée après dissection de la peau, suivie d'injections répétées visant à faire varier l'expression d'un facteur de croissance, pour en évaluer le rôle protecteur. Le porteur indique que l'induction de la fibrose peut provoquer des difficultés respiratoires et une perte de poids, avec mise à mort si les points limites sont atteints. Il affirme qu'il n'existe "pas de méthodes alternatives pour modéliser la réponse d'un organe entier" et retient la souris pour ses outils génétiques.

Objectifs

La fibrose pulmonaire idiopathique (FPI) est une maladie chronique grave, entrainant la mort en 3 à 5 ans. La cause et les mécanismes qui sous-tendent le développement et l’évolution de cette maladie sont inconnus. Elle se manifeste par une perte d’élasticité du tissu de soutien pulmonaire, résultant en une altération des échanges entre les alvéoles contenant l’oxygène et les vaisseaux sanguins. Le poumon devient progressivement trop abimé pour assurer l'oxygénation du sang et le patient développe une insuffisance respiratoire chronique conduisant au décès. Les médicaments disponibles sont uniquement capables d’en ralentir la progression avec une efficacité faible sur les symptômes et des effets indésirables importants. Une meilleure compréhension des mécanismes entrainant la maladie est donc cruciale afin de développer de nouveaux traitements. Certains facteurs de croissances impliqués dans le développement pulmonaire au cours de l'embryogénèse semblent être impliqués dans la maladie. Ces facteurs de croissance sont impliqués dans les différentes étapes du développement pulmonaire normal, ainsi que dans les processus de réparation tissulaire physiologiques. Certains de ces facteurs de croissance vont favoriser le developpement de la fibrose pulmonaire, alors que d’autres vont être protecteurs. Nous nous intéressons en particuler à l’un d’entre eux, dont le rôle anti-fibrosant a été est démontré dans le foie, le rein ou le myocarde, et est questionné dans la fibrose pulmonaire. Ce facteur est synthétisé par le foie avant d'être libéré dans la circulation sanguine puis aux organes cibles. Notre hypothèse que ce facteur joue un rôle protecteur dans le développement de la fibrose pulmonaire. Le modèle murin est pertinent du fait de son système respiratoire très similaire à celui de l’Homme. De plus, les souris offrent la possibilité de travailler sur des organismes génétiquement modifiés et de cibler le rôle d’une molécule en particulier dans le poumon.

Bénéfices attendus

Nous utiliserons des modèles de fibrose pulmonaire établis chez la souris, impliquant une injection au niveau de la trachée sous anesthésie générale de différentes molécules favorisant le développement de la fibrose pulmonaire. Dans une première série d'expériences, nous étudierons l’expression du facteur de croissance d’intérêt et de ses récepteurs au cours du développement de la fibrose pulmonaire induite par voie pharmacologique. Puis nous évaluerons l’effet d’une surexpression du facteur de croissance sur le développement de la fibrose pulmonaire induite par voie pharmacologique. La surexpression du facteur sera obtenue par injection sous-cutanée d’un médicament validé dans le traitement de la stéatose hépatique. Nous étudierons également l’impact sur le développement de la fibrose de l’absence d’expression de ce facteur, spécifiquement obtenue chez des souris transgéniques, déficiente pour son gène, et n’exprimant donc pas cette molécule. Les souris seront euthanasiées à la fin de la procédure après anesthésie profonde. Plusieurs prélèvements seront ensuite effectués afin de répondre précisément à la question du rôle joué par ce facteur de croissance dans le développement de la fibrose pulmonaire. Si l'effet protecteur de cette molécule était démontré chez la souris, cela ouvrirait la porte à de nouvelles perspectives thérapeutiques. Un analogue de ce facteur a déjà montré son efficacité dans le traitement de la stéatose hépatique avec un profil de tolérance acceptable chez l'homme et est utilisé dans cette indication.

Procédures

En début de procédure, les souris recevront, sous anesthésie générale, une injection unique d'une molécule induisant la fibrose pulmonaire. Cette molécule sera injectée directement au niveau de la trachée chez les souris endormies, après dissection de la peau et des tissus sous cutanés : la visualisation directe de la trachée permet une meilleure chance de succès de la procédure. Après injection, la lésion sera suturée par un ou deux points de suture : la souris recevra un antalgique au cours de la procédure, et qui pourra être répétéé. Les souris recevront ensuite en cours de procédure 1 à 4 injections au maximum d'un analogue pharmacologique du facteur de croissance par voie sous cutanée, sur animaux vigile du fait du caractère peu traumatique et rapide du geste à effectuer. D'autres groupes de souris recevront une injection unique par voie intraveineuse dans la veine de la queue d'une molécule permettant également de surexprimer le facteur de croissance. Cette injection sera faite sous anesthésie générale. A l'issue de la procédure, les souris seront euthanasiées après anesthésie profonde. Après anesthésie profonde, plusieurs prélèvements seront effectués. Un prélèvement de sang sera réalisé ainsi que le prélèvement des poumons afin de définir le rôle de ce facteur de croissance dans le développement de la fibrose pulmonaire.

Impact sur les animaux

L'induction de la fibrose pulmonaire chez les animaux peut déclencher des difficultés respiratoires et une possible altération de l'état général avec perte de poids. Une surveillance quotidienne des animaux est effectuée par l'expérimentateur (exploration de l'aspect physique et motricité), ainsi que par le personnel de l'animalerie. Une surveillance au moins 3 fois par semaine minimum des animaux est effectuée par l'expérimentateur selon la grille d'évaluation des points limites (mesure de poids, exploration de l'aspect physique et motricité, etc.). La fréquence de surveillance des animaux pourra être augmentée selon l'état général des animaux et leur poids. Nos expériences permettront de déterminer si le facteur de croissance cible protège les souris du développement de la fibrose pulmonaire.

Devenir

L'ensemble des animaux seront euthanasiés en fin de procédures (surdosage en anesthésiques). Les prélèvements (LBA, poumons, sang, foie) seront effectués après euthanasie de l'animal. Les animaux ne subiront qu'une seule procédure au cours de leur vie.

Remplacement

Le modèle murin est pertinent du fait de la petite taille de l’animal, et de son système respiratoire très similaire à celui de l’Homme. De plus, les souris offrent la possibilité de travailler sur des organismes génétiquement modifiés et de cibler le rôle d’une molécule en particulier dans le poumon. A ce jour, il n’existe pas de méthodes alternatives pour modéliser la réponse d’un organe entier dans le cas du développement de la fibrose pulmonaire.

Réduction

Nous avont réduit le nombre de souris utilisées au minimum nécessaire et suffisant pour valider scientifiquement notre étude du point de vue de l'analyse statistique, tout en tenant compte du risque de mortalité si les points limites sont atteints.

Raffinement

Nous veillerons à ce qu'il n'y ait pas d'animaux isolés dans les cages durant les expériences afin de préserver les groupes sociaux. Les animaux seront anesthésiés lors des procédures; ainsi que des antalgiques. L'enrichissement consistera en la mise en place de coton dans les cages, et d'une nourriture facile à ingérer en cours de protocole. Les souris auront un accès permanent à de la nourriture et de la boisson. Une surveillance visuelle quotidienne des animaux est effectuée par l'expérimentateur (exploration de l'aspect physique et motricité), ainsi que par le personnel de l'animalerie. Une surveillance clinique au moins 3 fois par semaine des animaux est effectuée par l'expérimentateur selon la grille d'évaluation en annexe 2 (mesure de poids, exploration de l'aspect physique et motricité, etc.). La fréquence de surveillance des animaux pourra être augmentée selon l'état général des animaux et leur poids.

Choix des espèces

Le modèle souris est pertinent du fait de son temps de gestation court et de par son système respiratoire, proche de celui de l’Homme. Les modèles de fibroses pulmonaires chez la souris sont largement décrits dans la littérature scientifique. Les souris offrent la possibilité de travailler sur des organismes génétiquement modifiés et de cibler le rôle d’une molécule en particulier dans le poumon. A ce jour, il n’existe pas de méthodes alternatives pour modéliser la réponse d’un organe entier dans le cas du développement de la fibrose pulmonaire. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte, entre 8 et 12 semaines.