Rats
Complications du diabète : modèle expérimental de rétinopathie et d’atteinte cornéenne
- Recherche appliquée
- Maladies animales
- Troubles sensoriels
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
Rats : 2220
2 220 souris et 2 220 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le diabète leur est provoqué par injection de streptozotocine, qui détruit le pancréas, pour reproduire une rétinopathie et une atteinte de la cornée, avec examens oculaires sous anesthésie et désépithélisation cornéenne. Le porteur décrit une soif et des urines accrues, une perte de tonus et un poids réduit, les rats malades ne pesant après un mois que 50 à 60 % du poids des rats témoins. L'objectif affiché est de mettre au point un "modèle expérimental" pour tester de futurs traitements, le recours à l'animal étant présenté comme "nécessaire" faute de pouvoir mimer la maladie autrement.
Objectifs
L’objectif du projet est la mise en place, au sein de l’établissement utilisateur, d’un modèle expérimental de rétinopathie diabétique et également d’un modèle de cicatrisation cornéenne chez le rat ou la souris afin de tester l'efficacité de traitements potentiels. La rétinopathie diabétique est une complication du diabète qui atteint l'oeil au niveau de la rétine et serait la première cause de cécité avant 65 ans. Le taux élevé de sucre dans le sang entraine une détérioration des capillaires sanguins de la rétine. Ils perdent leur étanchéité conduisant à des hémorragies et des exsudats, lésant la rétine. La maladie peut évoluer vers une rétinopathie proliférative avec production anormale de nouveaux vaisseaux peu fonctionnels, des décollements de la rétine et des saignements dans le vitré. Un oedème au niveau de la macula, zone de la rétine responsable de la bonne acuité visuelle, peut survenir à tout moment et entrainer la perte de la vision. Le diabète est également responsable d’une dégradation de la cornée, le tissu transparent en avant de l’oeil, il ralentit notamment la cicatrisation cornéenne en cas de blessure, causant l’apparition d’opacités qui altèrent la vision.
Bénéfices attendus
Le bénéfice attendu est de proposer un modèle expérimental pour évaluer l'efficacité de nouveaux traitements des complications du diabète au niveau de la rétine et de la cornée qui sont invalidantes pour les patients et peuvent aboutir à la cécité. La recherche de traitement est en constante évolution, pour intervenir à différents stades de la maladie et preserver au mieux la visions des patients.
Procédures
L’induction du diabète chez les rats et les souris se fait par injection intrapéritoneale de streptozotocine. Le taux de glycémie sera contrôlé sur bandelette une à deux fois dans l'étude par le prélèvement d'une goutte de sang à la queue de l'animal. Les examens ophtalmologiques qui nécessitent l’immobilisation complète de l'animal seront pratiqués sous anesthésie, ce type d'examen ne dure que quelques minutes. Pour la partie sur l'étude de la cicatrisation cornéenne, une désepithelisation cornéenne se fera sous anesthésie générale.
Impact sur les animaux
Les animaux sont rendus diabétiques par injection de streptozotocine. La streptozotocine détruit les cellules du pancréas qui ne produit plus d’insuline et ne peut plus controler la glycémie. L’hyperglycémie altère vaisseaux et nerfs avec une répercussion sur différents organes, comme la neuropathie, les troubles cardiovasculaires, la néphropathie, et la rétinopathie. Les animaux diabétiques ont un besoin de boire et des urines accrus, et perdent du poids. Ils perdent du tonus et prennent un aspect vouté au cours du temps. Les animaux n’ont plus ou peu de gain de poids malgré une consommation d’eau et de nourriture accrue. Au bout d’un mois de diabète, le poids des rats malades représente 50 à 60 % du poids des rats contrôles du même âge, la différence semble moins importante chez la souris serait plutôt autour de 80% du poids des souris contrôles non induites au bout d'un mois de diabète.
Devenir
L'euthanasie des animaux est réalisée en fin d'étude pour analyse des tissus.
Remplacement
Le recours à un modèle animal est nécessaire en raison de la physiologie particulière l'oeil composé de différents tissus (vasculaires, rétinien neuronal, vitréen) en interaction les uns avec les autres. Le développement de la rétinopathie ou de la kératopathie diabétique ne peut être mimé par un modèle alternatif.
Réduction
Le nombre d'animaux par groupe est limité pour cependant rester adapté à l'analyse des résultats par des tests statistiques afin de permettre de conclure sur l'efficacité ou non d'un traitement. Une analyse de puissance (placé à 0,8) avec un calcul de l’effectif sera réalisé ce qui permettra d’ajuster et de revoir à la baisse si possible le nombre d’animaux à inclure dans les procédures Des évaluations non invasives de la pathologie sont utilisées tout au long de l'étude pour éviter la mise à mort de l'animal.
Raffinement
Un suivi quotidien des animaux sera effectué afin de minimiser au maximum l’impact des procédures sur leur bien-être. Les animaux seront hébergés en groupe dans des cages d’hébergement contenant nourriture et boisson ad libitum, de l’enrichissement adapté (abri et morceaux de bois à ronger). En raison de la polydipsie et de la polyurie des animaux diabétiques, la litière sera changée plus fréquemment (1 fois par jour), et un biberon supplémentaire sera ajouté. Les examens non invasifs pour évaluer la pathologie sont semblables à ceux pratiqués chez l'homme en cabinet ophtalmologique ou en cabinet vétérinaire. Les examens de l'oeil qui requièrent un immobilisme de l'animal pourront être réalisés sous anesthésie pour son confort. Des points limites adaptés, suffisamment prédictifs et précoces permettent de limiter une éventuelle douleur à son minimum. Ce projet a été soumis pour évaluation à un comité d’éthique et sera suivi par la structure en charge du bien-être animal de l‘établissement.
Choix des espèces
Ce modèle est bien décrit sur ces espèces dans la littérature et l’apparition des signes cliniques recherchés de la rétinopathie est rapide selon les articles de la bibliographie. Bien que différentes souches de rat pigmenté ou albinos soient utilisées dans la littérature, les rats Brown Norway semblent avoir une sensibilité supérieure et plus durable dans le temps à la perméabilisation vasculaire rétinienne en réponse au diabète, et les souris C57bl6 semblent repondre le mieux à l'induction par la streptozotocine. Nous choisirons ces souches, mais n’excluons pas de modifier ce choix en fonction des résultats, des échanges avec collaborateurs extérieurs ou nouvelles données de la bibliographie, les rats Wistar, Sprague Dawley et long Evans sont également largement utilisés dans la bibliographie. De même pour l’étude de la cornée diabétique la souris pigmentée ou le rat albinos sont utilisés. Les animaux, rats et souris, seront de jeunes adultes à leur arrivée dans notre animalerie, âgés de 6 semaines minimum à l'induction du diabètes conformément aux publications de référence qui servent de base à ce modèle. Ils entrent en étude après une période d’acclimatation d'un minimum de 3 jours.
Effets de différentes souches probiotiques productrices d’un métabolite d’intérêt sur l’hypersensibilité viscérale liée au stress chez le rat : approfondissement des mécanismes d’action mis en jeu.
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
1680 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à sévère, 720 relevant de la gravité sévère. Des rates Wistar subissent l'implantation chirurgicale d'électrodes, une distension colorectale douloureuse sous contention de 45 minutes et un stress d'immobilisation de deux heures, pour tester cinq souches probiotiques contre la douleur du syndrome de l'intestin irritable. Le porteur indique qu'un saignement anal peut survenir pendant la distension, auquel cas la procédure est arrêtée. Il affirme que la complexité du syndrome ne peut être reproduite sur des modèles in vitro.
Objectifs
Notre projet vise à évaluer l’efficacité de 5 souches probiotiques pour le traitement et/ou la prévention du syndrome de l’intestin irritable (SII). Nous évaluerons ainsi les effets d’un traitement de 5 ou 10 jours avec ces souches productrices d’un métabolite d’intérêt sur la douleur viscérale en condition de stress chez le rat et déterminerons la persistance de l’effet antidouleur de ces souches après un arrêt du traitement (période de « wash out ») de durée variable selon les souches testées. Nous comparerons les effets des souches à une souche non productrice ainsi qu’à un mutant de chacune de ces souches ne produisant plus le métabolite afin de démontrer l’importance de celui-ci et de comprendre les mécanismes mis en jeu dans la modulation de la douleur. De manière complémentaire, l’effet de l’ensemble de ces souches sera évalué après un seul jour de traitement. Outre l’évaluation de la sensibilité viscérale chez les animaux traités, des prélèvements seront effectués 5 jours ou 10 jours après gavage des animaux en conditions basales ou de stress aigu et avec ou non période de « wash out », afin d’identifier les molécules potentiellement actives et ainsi décrypter les mécanismes d’action mis en jeu
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d’évaluer la durée de traitement nécessaire et suffisante ainsi que la persistance de l’effet antidouleur après arrêt du traitement des souches d’intérêt, apportant de nouvelles réponses sur les mécanismes impliqués dans les effets observés. A terme, ces explorations permettront de proposer de nouvelles pistes de traitement des symptômes douloureux des patients SII associés à un profil anxieux et/ou stressé développant des manifestations digestives douloureuses.
Procédures
Tous les animaux de ce projet reçoivent un traitement par gavage. Les animaux pour l’évaluation de la sensibilité viscérale sont soumis à une procédure chirurgicale durant 20 min sous anesthésie générale (implantation d’électrodes intramusculaires). Après une période de convalescence et de repos puis de traitement, les crampes abdominales vont être enregistrées pendant une phase de distension colorectale durant 20 minutes. Cet enregistrement se fait en condition basale puis le lendemain en condition de stress aigu (maintien des pattes avant le long du corps de l’animal pendant 2 heures). Pendant les phases d’enregistrement, les animaux sont placés dans des tunnels de contention (45 min ). Pour l’étude de l’effet « wash out », une période de repos/ arrêt du traitement est appliquée. Puis un deuxième enregistrement de crampes abdominales pendant la distension colorectale avant et après un stress aigu est réalisé. Pour l’étude des mécanismes d’action mis en jeu dans les effets anti-douleur des souches testées, une prise de sang est réalisée à la queue au milieu du traitement. Un stress de contrainte est réalisé à la fin du traitement et après la période de « wash out ». Les animaux sont ensuite anesthésiés et euthanasiés pour effectuer les prélèvements nécessaires.
Impact sur les animaux
La douleur liée au gavage est évitée en utilisant une sonde à bout arrondi adaptée à la taille de l’animal et en réalisant un geste rapide et bien maitrisé. Pour la mesure de viscérosensibilité, les douleurs liées à la chirurgie sont prises en charge (analgésie pré et post-opératoire /anesthésie). La déshydratation et l’hypothermie sont prévenue par une injection post opératoire de sérum physiologique à chaque animal et par un maintien au chaud pendant les phases chirurgicales, de réveil et de convalescence. Le stress lié à la manipulation des animaux est évité en prévoyant de phases d’habituation aux différentes manipulations et de repos. La douleur ressentie pendant les phases d’enregistrement des crampes abdominales (indice de douleur) due à la distension colorectale est progressive et dure 20 minutes. La douleur n’est plus ressentie après l’arrêt de la procédure car les enregistrements reviennent à un niveau équivalent à celui de départ. Il n’y a pas de dommages observés sur les animaux mais un effet indésirable possible pendant ou après la distension est un saignement au niveau anal. Dans ce cas la procédure est arrêtée immédiatement.
Devenir
Tous les animaux sont euthanasiés à la fin de chaque procédure. La procédure 1 étant une procédure sévère, les animaux ne peuvent pas être gardés en vie à la fin de la procédure ou participer à une autre étude. Les animaux de la procédure 2 sont euthanasiés pour effectuer des prélèvements
Remplacement
L’utilisation du modèle rat se justifie par le nombre important d’études bibliographiques et d’outils méthodologiques utilisant ce modèle pour étudier la pathologie du SII qui de par sa complexité ne peut être reproduite sur des modèles in vitro.
Réduction
Le nombre de souches bactériennes sélectionnées (5) a été fixé suite aux essais de criblage réalisés par les partenaires du projet sur un panel de 152 souches vis-à-vis de leur capacité de production de la molécule d’intérêt in vitro. Le nombre d’animaux utilisés dans chaque groupe expérimental a été optimisé en tenant compte de la variabilité interindividuelle en se basant sur les études précédentes utilisant le même modèle. Ces effectifs, n=12 pour les études de viscérosensibilité et n=8 pour les prélèvements de sang et d’organes, sont suffisants pour atteindre une validité statistique. La possibilité d’utiliser les mêmes animaux a été étudiée mais n’a pas été retenue. En effet, les deux procédures décrites ici doivent-être menées de façon distincte pour permettre d’obtenir des résultats pertinents et robustes.
Raffinement
Les animaux utilisés seront des animaux sains provenant d’un élevage agréé. Ils seront hébergés dans des conditions normalisées et suivis quotidiennement pour leur apporter tous les soins nécessaires et assurer leur bien-être. Leur milieu sera enrichi en buchettes de peuplier pour satisfaire leur besoin de ronger. Toutes les mesures ont été prises pour réduire l’inconfort (période d’adaptation, habituation, récupération) et prévenir toute douleur ou anxiété susceptible d’être subie par les animaux (anesthésie/ analgésie, soins post opératoire, détection de toute anomalie ou apparition de mal être). Si malgré les mesures prises, une souffrance était constatée la procédure serait arrêtée.
Choix des espèces
Le modèle de stress aigu chez le rat est largement validé par la communauté scientifique pour étudier la physiopathologie du SII. Ce modèle permet de reproduire les caractéristiques décrites chez les patients SII : douleur viscérale, augmentation de la perméabilité intestinale, micro-inflammation intestinale. Les animaux seront des rats Wistar femelles adultes de 200g à 220g. L’utilisation d’animaux adultes est nécessaire pour évaluer les effets des souches probiotiques sur une barrière intestinale parfaitement mature, sachant qu’en condition périnatale la barrière intestinale présente des caractéristiques biologiques complètement différentes de celles observés chez l’animal adulte.
- Recherche appliquée
- Cancers
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
- Recherche fondamentale
- Oncologie
1 978 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance allant de léger à modéré, une partie sous anesthésie sans réveil. Un glioblastome leur est implanté dans le cerveau par stéréotaxie, avec suivi par IRM et injections répétées d'un peptide seul ou couplé à des nanocapsules de paclitaxel, une perte de poids supérieure à 20 % déclenchant la mise à mort. Le porteur revendique une combinaison d'études permettant de "raffiner" les doses et de réduire les lots suivants. Il affirme qu'il est "indispensable" de passer par un modèle animal reproduisant le glioblastome avant tout essai chez l'humain.
Objectifs
Le glioblastome (GBM) est le cancer cérébral le plus fréquent et le plus agressif, avec 200 000 décès par an dans le monde, une survie médiane de 14 mois et aucun traitement curatif. Le traitement actuel consiste en une exérèse chirurgicale suivie par le protocole de Stupp (radiothérapie et chimiothérapie avec le témozolomide). Des travaux publiés ont montré l’action anti-mitotique du peptide NFL-TBS.40-63 dans des cellules de GBM (rats, souris, humain). Ce peptide inhibe la prolifération et la viabilité des cellules souches et différenciées de GBM. Chez des rats porteurs d’un GBM orthotopique (F98), des injections intraveineuses répétées de ce peptide (15 mg/kg, une injection par jour pendant 5 jours) diminue de 53,5% la taille de la tumeur et améliore leur survie par rapport aux animaux non traités (résultats non publiés). Sur ce même modèle tumoral, la barrière hémato-encéphalique est lésée et permet le passage de molécules comme ce peptide (APAFIS N°2901) (résultats non publiés). De plus, adsorbé à la surface de nanocapsules lipidiques (LNCs), ce peptide augmente leur internalisation dans des cellules murines de GBM (GL261) comparativement aux LNCs seules. In vivo, une seule injection intratumorale de LNCs couplées au peptide et chargées en paclitaxel (0,8 mg/kg) diminue de manière plus efficace le volume tumoral de souris portant un GBM murin comparativement aux LNCs chargées en paclitaxel et non couplées au peptide (75% contre 60%, respectivement). Une société de biotechnologies en santé travaille sur les formulations du peptide seul (GC01) et combiné aux LNCs-paclitaxel (GC04) pour en faire de futurs candidats-médicaments pour le GBM. Leur développement pharmaceutique a permis de les formuler pour une utilisation clinique (formulations validées in vitro sur des cellules de GBM, notamment les cellules F98 utilisées dans ce projet) (résultats non publiés). Le but de ces travaux avancés de recherches pré-cliniques non réglementaires est d’étudier la tolérance et l’efficacité de GC01 et GC04 après administrations répétées chez des rats sains ou porteurs de GBM en déterminant la voie d’administration la plus adaptée (intraveineuse IV, intrapéritonéale IP ou sous-cutanée SC) dans un modèle physiopathologique proche de celui observé chez l’Homme afin de développer un traitement contre le GBM et prévenir les rechutes chez les patients.
Bénéfices attendus
Une société de biotechnologies en santé travaille actuellement sur des formulations du peptide seul (GC01) et combiné aux LNCs chargées en paclitaxel (GC04) pour en faire de futurs candidats-médicaments dans le traitement du GBM. Ces nouvelles formulations ont été préalablement testées et validées in vitro sur des cellules de GBM (notamment sur les cellules F98 qui seront utilisées dans ce projet) (résultats non publiés). Le but de ces travaux avancés de recherche pré-clinique non réglementaire est donc d’étudier in vivo la tolérance et l’efficacité de GC04 et de valider le maintien de l’activité de GC01 après administrations répétées chez des rats sains ou porteurs de GBM tout en déterminant la voie d’administration la plus adaptée pour ces traitements (intraveineuse IV, intrapéritonéale IP ou sous-cutanée SC) dans un modèle physiopathologique le plus proche possible de celui observé chez l’Homme, dans le but de développer un traitement contre le GBM et prévenir les rechutes chez les patients opérables ou non. Ces travaux avancés de recherche pré-clinique non réglementaire ont pour but de valider l’innocuité des traitements et leur efficacité et ainsi, confirmer leur intérêt thérapeutique. Si l’intérêt thérapeutique est attesté et la posologie déterminée, ces travaux pourront servir de base pour la mise en place d’essais pré-cliniques règlementaires avant la mise en place d’essais cliniques.
Procédures
Dans l’étude 1, les animaux subiront deux types d’intervention, des injections IV ou IP ou SC sur une période de 5 semaines (1 à 2 injections, qui durent quelques minutes, par jour pendant 5 jours suivies de 2 jours de repos, sur 5 cycles) et un prélèvement par ponction cardiaque (1 fois puisque cette intervention sera suivie par la mise à mort des animaux). Dans l’étude 2, les animaux subiront trois types d’intervention, l’implantation tumorale par stéréotaxie qui dure quelques heures, le suivi de la croissante tumorale par IRM (3 IRM de suivi qui dureront quelques heures et qui seront espacées de plusieurs semaines) et des injections IV ou IP ou SC sur une période de 5 semaines (1 à 2 injections, qui durent quelques minutes, par jour pendant 5 jours suivies de 2 jours de repos, sur 5 cycles). Dans l’étude 3, les animaux subiront deux types d’intervention, une injection unique IV ou IP ou SC qui durera quelques minutes et des prélèvements répétés de sang au niveau de la veine caudale et de la veine jugulaire (5 à 7 prélèvements maximum, qui dureront quelques minutes chacun et qui seront espacés de plusieurs minutes à plusieurs heures). Dans l’étude 4, les animaux subiront trois types d’intervention, l’implantation tumorale par stéréotaxie qui dure quelques heures, le suivi de la croissante tumorale par IRM (1 IRM de suivi qui durera quelques heures) et des injections IV ou IP ou SC (1 à 2 injections, qui durent quelques minutes, par jour pendant 5 jours) ou une injection unique IV, qui dure quelques minutes, ou une injection intra-tumorale qui durera quelques heures.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables des candidats médicaments seront évalués lors de l’étude 1 qui a pour but d’évaluer l’innocuité des traitements et de définir ainsi les doses maximales répétées tolérées (MTRD) ou les doses sans effet nocif observables (NOAEL). GC04 étant composé d’un anticancéreux (le paclitaxel), des effets indésirables communément retrouvés après injection de ce type de composé pourraient être observés (modification de la formulation sanguine, perte de poids, faiblesse, etc.). Les effets indésirables peuvent être également liés à l’acte chirurgical et la croissance tumorale (hyperpression intracrânienne, œdème, etc.) ainsi qu’à l’injection des traitements (rougeur, inflammation, etc.).
Devenir
A l’issue de toutes les procédures, pour toutes les études décrites, les animaux seront tous mis à mort par inhalation de CO2 pour prélèvements de sang et/ou d’organes afin de réaliser des études post-mortem, ou seront mis à mort suite à l’atteinte de points limites spécifiques et établis selon un tableau de score (par animal) qui permettra d’évaluer l’état général des animaux (une perte de poids supérieure à 20%, par rapport au poids mesuré en début de protocole, ou un score égal ou supérieur à 12 points impliquera la mise à mort de l’animal avant la fin de la procédure ou de l’étude).
Remplacement
L’utilisation de GC01 et GC04 en thérapeutique étant à visée humaine, il est nécessaire de réaliser des études précliniques, comme ici des études toxicologiques et d’efficacité pour démontrer et valider sans aucune ambiguïté leur innocuité et efficacité avant de passer à des essais cliniques chez l’Homme. Ces traitements visent les femmes et les hommes, c’est pourquoi il est important de démontrer leur innocuité chez les deux sexes. Des travaux menés sur des cultures de cellules tumorales et saines ont déjà été réalisées pour valider les molécules et formulations testées. Pour compléter l’étude, il est indispensable de passer sur un modèle animal mimant les conditions de développement du GBM avant de pouvoir tester les molécules sur des patients atteints de ce cancer.
Réduction
La combinaison des deux premières études (études 1 et 2) permettra de raffiner la posologie et le mode d’administration, et ainsi de réduire le nombre de lot d’animaux à tester dans les études suivantes (études 3 et 4). Le nombre d’animaux mâles pourra également être réduit au strict minimum en fonction des résultats obtenus chez les femelles. De plus, lors de l’étude de toxicité, une seule dose à la fois sera testée. Ainsi, si la plus haute dose n’est pas toxique, les doses plus basses ne seront pas systématiquement testées. Le nombre d’animaux choisi par groupe est suffisant pour garantir des données précises, représentatives de l’espèce, et statistiquement exploitables. Il n’est pas utile d’avoir plus d’animaux, mais il est préférable de ne pas en utiliser moins, au risque d’être confronté à des variations entre des animaux d’un même groupe. Pour les études 1 (toxicité) et 4 (biodistribution), des comparaisons multiples (ANOVA) et des comparaisons appariées (Bonferroni’s correction) vont être effectués entre les différents groupes, notamment entre les groupes contrôles et les groupes traités. Pour l’étude 2 (efficacité), les analyses statistiques seront réalisées grâce au test Log-Rank après représentation des données sous forme de courbes type Kaplan-Meier, afin d’évaluer de potentielles différences significatives entre les différents traitements.
Raffinement
Les animaux sont reçus 2 à 4 semaines avant de débuter les expérimentations afin qu’ils s’acclimatent à leur nouvel environnement et à la contention. Selon l’Arrêté du 01/02/2013 fixant les conditions d’agrément, d’aménagement et de fonctionnement des établissements utilisateurs, éleveurs ou fournisseurs d’animaux utilisés à des fins scientifiques, le nombre de rats maximum par cage sera défini en fonction de leur poids (et âge) et du type de cage (surface adaptée). Par exemple, 7 rats femelles de 200-300g pourront être hébergées dans des cages de 1820 cm2. Aucune alimentation spécifique (à part nourriture et eau suffisantes), ni enrichissement particulier des cages (à part la présence d’une cabane) n’est nécessaire pour mener ces études. La douleur et l’angoisse de chaque animal seront évaluées par un suivi quotidien de leur poids, de leur bien-être, d’un changement dans leur comportement, de l’apparition de signes cliniques de souffrance (posture, poils hérissés et sales, tremblements, prostration, difficultés de se déplacer, aucune réponse aux stimuli …). Plusieurs personnes seront impliquées dans ce suivi. Afin d’évaluer de façon raffiner la souffrance/douleur des animaux tout au long de l’expérimentation, un système de score sous forme de tableau sera mis en place et annoté régulièrement pour chaque animal et pour chaque paramètre contrôlé (apparence physique, comportement, hydratation et prise de poids). Un score de 0 à 4 sera établi pour chaque paramètre contrôlé, 0 correspondant à un paramètre normal et 4 correspondant à un paramètre anormal fortement prédictif d’une souffrance ou d’une douleur. Dans le cas où un animal présenterait un ou des signes de souffrance, pour un score inférieur à 12 points (points limites prédictifs et précoces adaptés), de la buprénorphine (0,05 mg/kg) serait administrée (en sous-cutanée) toutes les 4h en journée (3 injections maximum par jour), pendant plusieurs jours, jusqu’à ce que ces signes disparaissent. Une perte de poids supérieure à 20%, par rapport au poids mesuré en début de protocole, ou un score égal ou supérieur à 12 points (critère d’arrêt) impliquera la mise à mort de l’animal. Plusieurs personnes seront impliquées dans ce suivi, mais la décision finale sera prise dans les 24h par le porteur de projet.
Choix des espèces
Au début de l’expérimentation, les rats Fischer adultes seront âgés de 9-10 semaines. A leur arrivée à l’animalerie, les rats fournis seront âgés de 6-7 semaines. Pendant les 2 à 3 semaines de stabulation, les animaux s’acclimateront à leur nouvel environnement et seront manipulés par les expérimentateurs quotidiennement pour les habituer à la contention et ainsi réduire leur stress lors des études. Le choix de l’âge en début de projet a été dicté par la procédure de chirurgie (la taille de l’animal doit être suffisante pour être adaptée au cadre de stéréotaxie utilisé dans l’animalerie), mais aussi par les précédents travaux réalisés dans le laboratoire. Les animaux seront des femelles et des mâles. Il est important de vérifier l’efficacité anti-tumorale de GC01 et GC04 sur les deux sexes puisque ce traitement est destiné à la fois aux femmes et aux hommes. Ces études seront d’abord réalisées sur des rats Fisher femelles adultes, qui ont déjà été utilisées dans de précédentes études menées sur GC01. Selon les résultats (étude 1 et 2), les doses à injecter chez les rats mâles pourront être modulées pour ainsi réduire au strict minimum le nombre de lots d’animaux mâles à utiliser (réduction).
Évaluation des potentiels effets curatifs et protecteurs d’un mélange nutritionnel contre le développement de l’insulinorésistance et du diabète de type 2 chez le rat
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
- Troubles gastrointestinaux
120 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Ils sont soumis à un régime hypercalorique pour induire une obésité, puis à un gavage quotidien pendant quatorze semaines, des prélèvements de sang et de fèces, un test de tolérance au glucose et un prélèvement d'organes final après anesthésie et exsanguination par l'aorte, pour tester un mélange de berbérine et d'extraits de pomme et de citrus. Les retombées annoncées pour la santé humaine restent hypothétiques face à l'obésité et aux complications métaboliques provoquées chez les animaux. Le porteur affirme qu'aucune méthode in vitro ou in silico ne peut remplacer le "modèle animal intégré" et conclut à l'impossibilité du remplacement.
Objectifs
Cette procédure aura pour objet d’explorer l’effet curatif synergique de la berbérine et des extraits de pomme et de citrus sur l’apparition de l’insulino-résistance et du diabète sucré chez le rat. Cet effet pourrait résulter d’une action multiple impliquant d’une part, les effecteurs de perte de poids (augmentation de la dépense énergétique, diminution de l’absorption de nutriments et diminution de l’appétit), et d’autre part, la mise en jeu sur le long terme d’actions anti-inflammatoire et régulatrice du métabolisme, incluant le microbiote intestinal.
Bénéfices attendus
Les résultats générés par les techniques in vitro ou ex-vivo ne permettent pas d'avoir des résultats suffisamment fiables puisque le diabète (lié à l’obésité) est une maladie systémique caractérisée par des altérations mutiorganiques (une intolérance au glucose, un stress oxydatif, un dysfonctionnement endothélial, anomalies des fonctions cardio-vasculaire et rénale). Il est donc impossible de créer l'environnement à facettes multiples de cette pathologie et le recours au modèle animal intégré est donc plus adapté à la problématique de ce projet. De plus, les produits évalués dans ce projet ont une action systémique, l’étude du lien entre le microbiote et la physiopathologie du diabète n’est possible que par une approche expérimentale in vivo et il n'existe pas de moyens alternatifs permettant de l'étudier dans un contexte qui doit tenir compte de la physiologie globale de l'animal.
Procédures
Les animaux seront soumis à différentes interventions. Un gavage (environ 30 secondes par rat) sera effectué quotidiennement pendant les 14 dernières semaines du protocole expérimental. Le prélèvement de sang (environ 20 minutes par rat), le catwalk (environ 30 minutes par rat), le prélèvement de fèces (environ 1h par rat) et le test de tolérance au glucose (1h30 par rat) seront effectués en début, milieu et fin de protocole (0, 14, 28 semaines). Les animaux seront également soumis à des prélèvements d'organes (après 28 semaines) après leur anesthésie par injection intra-péritonéale du mélange kétamine (60 mg/kg) / médétomidine (150 μg/kg) puis euthanasie par exsanguination au niveau de l'aorteabdominale.Ces interventions concernent les 120 animaux sur une durée totale de 28 semaines.
Impact sur les animaux
Aucune nuisance ou effet indésirable n'est attendu sur les animaux du groupe avec le régime contrôle. Les animaux soumis au régime HFD vont développer une obésité avec des complications métaboliques qui est l'objet de l'étude. Les traitements mis en oeuvre ont comme objectif d'atténuer les complications générées par l'obésité.
Devenir
Tous les animaux des lots étudiés sont concernés par l’euthanasie. Cette dernière est pratiquée par exsanguination au niveau de l’aorte abdominale après anesthésie par injection intra-péritonéale du mélange kétamine (60 mg/kg) /médétomidine (150 μg/kg). L'euthanasie est justifiée par les prélèvements d'organes qui serviront aux analyses histologiques, biochimiques et moléculaires.
Remplacement
Le remplacement des animaux n’est pas possible pour répondre aux questions du présent projet en raison de l’absence de méthodes alternatives (in-silico et in-vitro).
Réduction
De manière à respecter la règle de réduction, le nombre d’animaux par groupe a été réduit au minimum permettant d’anticiper les différences interindividuelles. Le nombre de 12 rats est nécessaire et suffisant pour réaliser une analyse descriptive. Ce nombre est basé sur notre expérience précédente de mise en œuvre de protocoles de pharmacologie expérimentale lors desquels nous avions obtenus des résultats reproductibles et exploitables.
Raffinement
- Un hébergement qui respecte les recommandations en vigueur, une animalerie contrôlée (température, hygrométrie) et un enrichissement des cages (mise à disposition de carrés de coton, des tunnels, des morceaux de bois, du Sizzle dry Kraft pour occuper chaque individu dans la cage). - Un suivi régulier des animaux par le personnel animalier (observation quotidienne de l’état général et du comportement, pesées hebdomadaires) - La définition de points limites et une grille de scoring de la souffrance et/ou de la douleur chez tous les animaux soumis aux différents traitements prévus dans le projet. - L’optimisation des protocoles expérimentaux pour chaque procédure afin d’obtenir le maximum d’informations et ainsi une meilleure analyse des résultats obtenus.
Choix des espèces
L'exposition des rats Wistar à un régime hypercalorique permettra d'étudier la capacité du mélange nutritionnel testé à prévenir le développement de la résistance à l’insuline, de l’hyperglycémie chronique et les perturbations cardiovasculaire associées. Incluant également l’étude du lien entre les perturbations cardio-vasculaires et la modification du microbiote intestinal. Les animaux sont utilisés à l’âge de 6-7 semaines.