Rats
Impact du régime cétogène sur une lignée de Rat génétiquement modifiée utilisée comme modèle de troubles cognitifs
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
72 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils sont soumis huit semaines à un régime riche en graisses, à des prélèvements sanguins hebdomadaires à la queue et à une injection d'amphétamine, avant une perfusion terminale sous anesthésie profonde. Le porteur indique que les rats mutants sont aveugles et anosmiques et que l'amphétamine peut provoquer une hyperagitation ou des troubles moteurs transitoires. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ou in silico ne permet d'évaluer l'effet d'une mutation sur les fonctions cognitives.
Objectifs
Le but du projet est de mettre en évidence l'impact bénéfique d'un régime cétogène sur les troubles cognitifs sur un modèle animal intelligent : le Rat. Le régime cétogène existe depuis une centaine d'année et a été longtemps utilisé dans plusieurs indications médicales. Au-delà de la perte de poids, le régime cétogène est utilisé dans le traitement de diverses pathologies : épilepsie, cancers, maladies inflammatoires, etc. Nous disposons d'un modèle animal d'une pathologie mentale et souhaitons analyser l'impact de ce régime sur les troubles de la mémoire observés. Dans ce projet, nous voulons comprendre si les troubles de mémorisation et les altérations des voies de signalisation neuronales (dopaminergiques principalement) présents chez les animaux génétiquement modifiés constatés chez ces animaux, sont impactés ou non par l'état de cétose.
Bénéfices attendus
Ce projet constitue une première approche fondamentale pour déterminer le rôle d'un gène identifié chez l'Homme, dans une population de malades. Nous pourrons accumuler des données permettant de mieux comprendre le rôle du gène et ses interactions avec le métabolisme, dans le cadre d'une cétose. Ce projet nous permettra de comprendre les voies d'action de cette cétose, mise en place par une régime lipidique, et de définir si les mécanismes impliquant gène modifié dans la lignée de Rat étudiée sont sensibles à cet état. Ce projet constitue une première étape dans la compréhension des maladies génétiques humaines impliquant ce gène et dans la mise en place de traitements permettant de réduire les symptômes.
Procédures
Chaque semaine entre 7 et 14 semaines d'âge, les animaux subiront un prélèvement de deux gouttes de sang à la queue sur animaux vigiles. Cela se réalise en quelques minutes. Durant l'une des expériences, les animaux recevront une injection d'une faible dose d'amphétamine, afin de mettre en évidence le fonctionnement des voies dopaminergiques. Ce protocole s'étale sur 2 heures environ En fin de protocole, les animaux seront anesthésiés de manière profonde pour une procédure de perfusion qui entraînera leur décès.
Impact sur les animaux
Les animaux mutants présentent une cécité et une anosmie complète. Néanmoins, ils présentent un état général tout à fait normal, aussi bien au niveau du poids, du toilettage, de l'activité. Durant ce protocole, ils recevront une diète spécifique dont la source principale de calorie est le gras. Le passage dans ce régime entraine rapidement un état cétogène qui est lié à une perte d'appétit et une baisse de poids. Néanmoins, sur la durée de l'étude (8 semaines sous ce régime), aucun risque pour la santé des animaux n'est attendu. La procédure d'amphétamine peut induire un état d'hyperagitation ou au contraire des troubles moteurs compulsifs. Ces effets sont transitoires et un retour à la normale se fait naturellement dans les 2 heures qui suivent l'injection. Par ailleurs, les animaux sont monitorés durant cette période.
Devenir
En fin de protocole, nous effectuerons des prélevements post-mortem pour étudier l'impact du régime et de la mutation au niveau hépatique et central.
Remplacement
Nous ne disposons actuellement d'aucun modèle in vitro ou in silico permettant de déterminer l'impact d'une mutation génétique sur les fonctions cognitives. Seul le modèle animal est suffisamment informatif pour pouvoir poursuivre la recherche dans ce domaine.
Réduction
Les effectifs utilisés dans ce protocole ont été établis par étude de puissance sur les tests concernés. Par ailleurs, nous avons constaté qu'ils convenaient dans les études antérieures. L'ensemble du protocole expérimental a été mis en place pour réduire autant que possible le nombre d'animaux utilisés pour conclure. Nous étudierons plusieurs paramètres dans ce projet : le poids de l'animal, sa glycémie, son niveau de cétogène circulant. Les mêmes groupes d'animaux effectueront plusieurs protocoles expérimentaux afin de limiter le nombre d'animaux employés.
Raffinement
Dans ce projet, nous nous assurerons que le bien-être des animaux sera respecté durant l'ensemble de sa réalisation. En respectant les conditions recommandées d'hébergement, en nous assurant de l'absence de signes de souffrance, de lésions liées à des combats entre animaux. Les rats seront suffisamment jeunes pour être maintenus à deux par cages afin d'éviter un stress d'isolement. Les cages seront changées régulièrement afin d'éviter que le gras du régime cétogène ne favorise des lésions cutanées. Si le cas se présentait ; un traitement local serait administré pour éviter une infection locale. Dans ce cas, nous pourrions êtes amenés à isoler les animaux concernés pour permettre une bonne cicatrisation des plaies. L'ensemble de ce protocole est encadré par un suivi hebdomadaire du bien-être des animaux : suivi du poids, de l'état général, toilettage, posture, vocalisation. Tous ces paramètres permettront de nous assurer de l'absence de souffrance des animaux. Néanmoins, en présence d'une souffrance estimée à l'aide de nos tableaux de scorage
Choix des espèces
Le Rat est une espèce intéressante pour modéliser des pathologies humaines. En effet, il s'élève facilement, présente des comportements élaborés et nous pouvons accéder à des animaux génétiquement modifiés. Nous travaillons avec des animaux jeunes adultes qui présentent déjà les troubles cognitifs observés et sont disponibles auprès de notre partenaire.
Travaux pratiques de formation aux gestes techniques de base chez la souris et le rat dans le cadre de la formation réglementaire à l’expérimentation animale, niveau personnel appliquant les procédures.
- Formation professionnelle
Rats : 10
26 souris et rats vont être utilisés, tous tués le jour même, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils servent à faire pratiquer à des stagiaires la contention et des injections sous-cutanée, intrapéritonéale, intramusculaire et intraveineuse, ainsi qu'un prélèvement sous la mâchoire sous anesthésie. Le porteur indique que la principale nuisance est le stress lié à la maladresse possible des apprenants. Il affirme que l'utilisation d'animaux est "nécessaire" car la formation en conditions réelles permet un meilleur apprentissage.
Objectifs
La réglementation en expérimentation animale impose une formation à toute personne manipulant des modèles animaux. Les formations de concepteurs sont encadrées par l’arrêté du 1er février 2013 relatif à l’acquisition et à la validation des compétences des personnels des établissements utilisateurs, éleveurs et fournisseurs d’animaux utilisés à des fins scientifiques. Le programme de cette formation a été validé par le ministère
Bénéfices attendus
Les apprenants vont apprendre les bons gestes pour travailler sur un rat et une souris, afin de veiller à conserver le bien-être animal.
Procédures
Un grand moment sera consacré à la préhension et la contention, pour rassurer l'animal et avoir les bons gestes pour ne pas le stresser. Pour la souris : Avec la bonne contention; les apprenants pourront étudier comment faire une injection sous-cutanée, une intrapéritonéale et une intramusculaire, ainsi qu'une injection intraveineuse. Le prélèvement submandibulaire leur sera appris sous anesthésie. Pour le rat : Avec la bonne contention; les apprenants pourront étudier comment faire une injection sous-cutanée, une intrapéritonéale et une intramusculaire, ainsi qu'une injection intraveineuse
Impact sur les animaux
les nuisances attendues sont surtout le stress de l'animal, lié à l'initiation des apprenants qui pourraient être maladroits et stressés. Les formateurs seront présents pour veiller au confort de l'animal
Devenir
les animaux seront mis à mort le jour même après la séance de TP, par les formateur. Les animaux recevront une surdose d'anesthésique (kétamine/xylazine)
Remplacement
La CNEA impose une formation à tout usager devant pratiquer des actes sur des animaux. Il est donc nécessaire d’utiliser des animaux pour cet enseignement. La formation en condition réelle permet un meilleur apprentissage.
Réduction
Le nombre d’animaux a été réduit à son minimum. Une seule souris par apprenant sera utilisée et 1 seul rat par binôme sera utilisé.
Raffinement
Les animaux utilisés le seront pour la durée du TP de 4H. De plus les gestes pratiqués seront peu invasifs. Les rongeurs sont auparavant hébergés en groupes sociaux, ils bénéficient d’enrichissement de milieu et d’une période d’acclimatation. Tous les gestes seront encadrés par les formateurs et les points limites sont définis : en cas de stress et/ou souffrance trop importants, la mise à mort de l’animal sera mise en œuvre pour interrompre sa souffrance. Les séances de TP seront encadrées par 3 formateurs expérimentés, se répartissant les stagiaires en petit groupe.
Choix des espèces
Les souris et les rats sont les espèces les plus utilisées dans l’Etablissement utilisateur de l’Université de Bourgogne. Les animaux seront utilisés à l’age de 8 semaines (âge adulte) car c’est à cette âge en général que les équipes de recherche commencent leur expérimentation.
Etude chronique de la performance du Tacrolimus pour la régénération des nerfs périphériques
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
200 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Leur nerf sciatique est sectionné puis suturé, avant l'application locale ou l'injection de tacrolimus pour tester la régénération nerveuse, avec un suivi pouvant aller jusqu'à douze mois. Le porteur indique que la section du nerf peut entraîner l'automutilation de la patte et que le tacrolimus peut provoquer perte de poids, léthargie et diarrhée, les rats perdant 20 % de leur poids étant mis à mort. Il affirme qu'aucune méthode sans animaux ne peut se substituer à ces travaux, les études ex vivo ne reproduisant pas les propriétés d'un "organe entier".
Objectifs
Ce projet permettra de caractériser et de valider in vivo l'intérêt du Tacrolimus (molécule immunosuppressive, avec de potentielles propriétés de régénération des nerfs) sur la régénération des nerfs périphériques après lésion. L'objectif est d'évaluer la réparation du nerf sciatique (après section transversale) chez le rat après suture et (a) application locale (au site de réparation du nerf) d'un gel de fibrine contenant du Tacrolimus ou (b) injection sous-cutanée d'une solution de Tacrolimus. Cette évaluation sera réalisée pendant une période maximale de 12 mois (période de suivi des animaux après chirurgie), et permettra de mettre en évidence l’intérêt d’une délivrance locale et prolongée du Tacrolimus sur la régénération des nerfs.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de valider au niveau préclinique que la délivrance locale prolongée de Tacrolimus a un effet supérieur à son administration sous-cutanée répétée pour la régénération des nerfs périphériques. Ce projet fait partie de l’étape de recherche et validation de produits qui seront implantés dans le corps humain, qui permettra de réduire le risque pour le patient. Il nous est impossible de substituer ces travaux par d’autres méthodes n’utilisant pas d’animaux. Ce projet a donc pour but de mettre en évidence l’intérêt du développement d’un traitement local pour la régénération des nerfs, dans un modèle rongeur de section et réparation du nerf adapté aux cas cliniques.
Procédures
Les animaux seront soumis à une procédure : Après anesthésie et analgésie de l'animal, le nerf sciatique sera sectionné puis réparé par suture épineurale. Ensuite, chaque animal recevra soit (a) une application locale (au site de réparation du nerf) d'un gel de fibrine contenant du Tacrolimus ou (b) une injection sous-cutanée journalière d'une solution de Tacrolimus pendant un mois (injection sous-cutanée ou délivrance du Tacrolimus à l’aide d’une pompe osmotique). La durée de la procédure chirurgicale sera d’environ 30 minutes par animal.
Impact sur les animaux
L’automutilation de la patte lésée est un effet indésirable potentiel résultant de la section du nerf sciatique chez le rat. Néanmoins, l’automutilation apparait à court terme (dans un délai de quelques jours après chirurgie) ainsi que potentiellement à 1 mois après chirurgie (en cas d’absence de sensation de la patte, due à une absence de régénération de l’influx nerveux). Par la suite, l’arrêt de l’automutilation permet la bonne cicatrisation de la patte et donc de garder les animaux jusqu’à la fin de l’étude. Aussi, compte tenu de la forte activité du Tacrolimus, les animaux pourraient manifester des signes de perte de poids, malaise, léthargie et/ou perte de poils, typiquement associés à l'administration systémique de Tacrolimus. De plus, les animaux seront surveillés pour tout signe de diarrhée et de déshydratation. Toutefois, le suivi quotidien des animaux ainsi que la complémentation de leur alimentation permettront de prendre toute disposition afin de palier à de tels événements et de garder les animaux jusqu’à la fin de l’étude.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés par inhalation de CO2 car des prélèvements et analyses sont nécessaires post-mortem. L'absence de battements cardiaques et réflexes sera confirmée puis une dislocation cervicale sera réalisée selon les directives de la SBEA, le vétérinaire référent et l’inspecteur de la DDPP.
Remplacement
Les études ex vivo ne permettent pas de mimer les propriétés biologiques et mécaniques des organes entiers. Par conséquent, ce projet a pour but de valider l’efficacité du Tacrolimus pour la régénération du nerf sciatique et permettra son développement optimal pour la clinique
Réduction
Le nombre d’animaux (200) a été rationnalisé au maximum en tenant compte des analyses statistiques qui seront effectuées. Aussi, le nombre d’animaux par groupe (10) a été défini en se basant sur les études faites en interne, pour lesquelles 10 animaux par groupe ont été/sont considérés. Ce nombre tient compte des mutilations engendrés par l’animal lui-même suite à la chirurgie (perte de sensation dans la patte ; effets secondaires documentés pour toute lignée de rats), ainsi que d’une éventuelle mortalité lors de la chirurgie
Raffinement
Les rongeurs disposeront à volonté d’eau et d’aliments. Tous les animaux seront hébergés en portoirs ventilés et enrichis avec des maisons, des bâtons, du papier, des boules et/ou des os en plastique. La totalité des gestes expérimentaux sera pratiquée par du personnel qualifié. Les animaux recevront un traitement antalgique avant toute procédure chirurgicale qui se fera sous anesthésie générale. À la suite de la procédure chirurgicale, un traitement antalgique systématique sera administré. Les animaux seront observés au minimum une fois par jour afin d’évaluer de potentiels signes de mal-être. Un vétérinaire est joignable tous les jours si besoin. En cas d’atteinte des points limites (variation relative du poids corporel supérieure ou égale à 20% par rapport au poids maximum mesuré ou dégradation de l’état général de l’animal), l’euthanasie de l’animal sera effectuée. Le nombre maximum d’animaux utilisé sera de 200.
Choix des espèces
L'utilisation d'un modèle mammifère est, selon nous, essentielle à cause des différences structurales existantes entre les organes des espèces mammifères et non-mammifères. Les rats sont des modèles animaux classiquement utilisés en expérimentation animale pour évaluer la réparation des nerfs périphériques. De plus, la composition de la matrice extracellulaire des humains et rongeurs est très similaire pour plusieurs organes. Le modèle singe a été automatiquement exclu pour des raisons éthiques. Les animaux qui seront utilisés auront entre 6 et 12 semaines au début de l'étude. Ils seront donc adultes et arrivés à maturité sexuelle. Les animaux seront bagués sur l'oreille dès leur arrivée dans l'animalerie.
Mise en place de la technique de microdialyse chez le rat immuno-déprimé et validation par imagerie. (EU porteur ; EU2/2)
- Recherche fondamentale
- Oncologie
26 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Immunodéprimés et porteurs d'une tumeur cérébrale, ils reçoivent une canule implantée dans le cerveau puis des séances de microdialyse, avant une mise à mort au plus tard cinq jours après la pose, pour mettre au point un suivi de l'inflammation autour de la tumeur. Le porteur reconnaît que l'hébergement en cage individuelle et la contention peuvent stresser les animaux, plusieurs points limites déclenchant une mise à mort anticipée. Il présente la microdialyse comme réduisant le nombre d'animaux et affirme que le développement tumoral ne peut être appréhendé qu'in vivo.
Objectifs
Les glioblastomes sont les cancers du cerveau les plus fréquents et sont généralement agressifs. Le traitement de référence consiste, lorsque cela est possible, à retirer chirurgicalement la tumeur, puis à traiter par radiothérapie (traitement par les rayons X) et chimiothérapie. La radiothérapie occupe une place incontestée après la chirurgie. Malgré un traitement bien conduit, de nombreux patients développent une récidive tumorale locale. La Nanomédecine offre de remarquables perspectives de développement et d'innovation en matière de radiothérapie. Afin d’évaluer le potentiel thérapeutique d’une nanoparticule innovante (en cours de développement clinique), la compréhension approfondie des effets de ce traitement sur la réponse immunitaire et inflammatoire est une étape cruciale qui permettra de maitriser et potentialiser les effets du traitement. Pour cela, il est important de mettre en place une technique d’approche permettant de suivre en direct les marqueurs participant à la réponse immunitaire et inflammatoire. L’identification des marqueurs de l’inflammation se fait traditionnellement par technique d’immunohistochimie (méthode de localisation de marqueurs dans des coupes de tissu, par la détection d'antigènes au moyen d'anticorps) mais cette technique reste invasive puisqu’elle ne se fait que sous une approche « ex vivo » nécessitant la mise à mort de l’animal. Il est donc nécessaire d’utiliser une technique plus pertinente permettant de réduire le nombre d’animaux en effectuant un suivi longitudinal des marqueurs de l’inflammation « in vivo » sans avoir à mettre à mort l’animal. a microdialyse intracérébrale constitue une technique adaptée puisqu’elle permet d’assurer un échantillonnage sur animal vivant. Elle nécessite l’introduction dans le cerveau d’une sonde (passant à travers un guide ou canule) contenant une membrane semi-perméable à l’eau et aux petites molécules. L'atout principal associé à cette technique est qu'elle permet la mesure répétée de molécules dnas l'environnement du cerveau et de la tumeur sans nécessité de biopsie.
Bénéfices attendus
La microdialyse est une technique largement employée en clinique, permettant la surveillance du métabolisme cérébral. Elle permet, par l'intermédiaire d'une sonde implantée dans le cerveau, d' obtenir des échantillons du liquide prése,t dans le cerveau. La maitrise de cette technique d’échantillonnage permettra de mieux appréhender les mécanismes liés au développement de la tumeur et permettra par la suite de pouvoir caractériser les mécanismes d’action des différentes stratégies thérapeutiques menées au sein du laboratoire, notamment au niveau de la réaction inflammatoire. Dans le cas précis du projet européen, la mise en place de ce modèle permettra à terme d’apporter une compréhension approfondie des effets sur la réponse immunitaire qui constitue une étape cruciale pour maitriser et potentialiser les effets thérapeutique d’une nanoparticule innovante pour le traitement du glioblastome.
Procédures
- Implantation de la canule intra-cérébrale (suite à la réalisation de la procédure 1) : présence d'une canule (guide) qui émerge au niveau du crâne et qui reste présente à partir du moment de son implantation jusqu'à la mise à mort de l'animal pour une durée de 5 jours maximum. La chirurgie en elle-même est quant à elle estimée à 1h - Microdialyse intracérébrale (procédure 2) consiste en l'infusion d'un perfusat à travers des tubulures et à travers la sonde dans le but d'én récupérer un dialysat. Cette technique nécessite une équilibration préalable de la sonde antérieure à la récupération du diaysat. Pour la série 1, 5 microdialyses sont prévue de Jn+1 à Jn+5 avec 3h d'équilibration de la sonde au préalable et 2h de collecte des dialysats, ce qui correspond à une durée de 5h/jour soit 25h au total. Pour la série 2, 3 microdialyses sont prévues à J11, J13 et J15 avec de la même façon 3h d'équilibration de la sonde au préalable et 2h de collecte des dialysats correspondant à une durée de 5h/jour soit 15h au total.
Impact sur les animaux
Implantation de la canule : chirurgie opératoire classée sévère mais utilisation d'analgésiques pour limiter la souffrance des animaux (cf procédure 1). Hébergement en cage individuelle après l’implantation de la canule (pour éviter que les animaux ne se rongent la partie visible de celle-ci) pouvant conduire à un stress des animaux (limitation des interactions sociales directes) mais atténuation de cet effet indésirable en accolant les cages les unes aux autres qui sont de surcroit transparentes. Cages d’hébergements spéciales (30 cm *30 cm) et système de contention nécessaire à la protection des 2 tubulures (infusion du perfusat et récupération du dialysat)
Devenir
Tous les animaux sont gardés en vie à l'issue de chaque procédure sauf si un des points limites détaillés précédemment est atteint, conduisant alors à la mise à mort de l'animal. Pour réaliser un suivi longitudinal des marqueurs de l’inflammation, les animaux sont gardés en vie après chaque séance de micro-dialyse(procédure 2), sauf atteinte d’un des points limites (volume tumoral, dysfonctionnement moteur, modification comportementale, altération de l’état physiologique de l’animal) ou critère de perte de poids décrit comme précédemment. Cependant, comme mentionné précédemment, tous les rats seront mis à mort maximum 5 jours après la pose de la canule suite à la dernière session de micro-dialyse (soit Jn+5) pour a série 1 ou de la même façon à J15 post-implantation tumorale pour la série 2. Une mise à mort plus précoce sera préconisée dans le cas de problèmes techniques liés à la micro-dialyse (interruption de l’infusion, sonde mal positionnée par rapport à la tumeur)
Remplacement
Le remplacement des expérimentations animales par des méthodes alternatives n’est dans ce contexte clairement pas possible puisque le développement de tumeurs cérébrales dépend de phénomènes biologiques complexes (influence du microenvironnement tumoral, activation des cellules immunitaires, envahissement du tissu cérébral, processus inflammatoires...). De plus, la mise en place d’une tumeur est un phénomène multifactoriel impliquant différents types cellulaires (cellules tumorales, cellules des caisseuw sanguins, tissu cérébral,...). L’ensemble de ces facteurs complexes ne peut être appréhendé qu’in vivo sur un modèle animal. Cependant une expérience préliminaire « in vitro » sera menée pour dans un premier temps estimer les rendements de micro-dialyse ainsi que les temps d’équilibration de la sonde.
Réduction
La technique de micro-dialyse intra-cérébrale est une méthode d’échantillonnage permettant le recueil de molécules produites par l'organisme sans avoir à mettre à mort les animaux pour récupérer l’organe d’étude afin d’en extraire les molécules à doser. Elle offre donc l’opportunité d’utiliser un nombre plus restreint d’animaux dans la mesure où les prélèvements de dialysats peuvent être réitérés au cours du temps : chaque animal sera donc utilisé à plusieurs temps cinétiques, permettant ainsi de limiter le nombre d’animaux impliqués.
Raffinement
Une attention toute particulière sera portée aux animaux d'une part après l'implantation de la tumeur (pesée quotidienne, observation quotidienne du comportement, vérification de l'alimentation et de l'hydratation, désinfection et vérification de la bonne cicatrisation de la plaie) mais d'autre part lors de la chirurgie d'implantation de la canule (analgésie avec réitération, mise en cage individuelle, pesée quotidienne, observation quotidienne du comportement, vérification de l'alimentation et de l'hydratation, désinfection et vérification de la bonne cicatrisation de la plaie). Une vigilance accrue sera accordée au moment de la micro-dialyse, en effet les animaux connectés aux tubulures seront régulièrement observés, d’une part pour vérifier que le prélèvement se déroule correctement mais aussi pour s’assurer que le comportement des animaux n’est pas trop altéré par la contrainte des tubulures. L'atteinte d'un point limite décrit précédemment dans le descriptif des procédures conduira à la mise à mort de l'animal. Une attention toute particulière sera également portée lors du transport des animaux sur le site d’imagerie (5 min de trajet à pieds), notamment par le maintien d'une température optimale (par l'intermédiaire de bouillottes chauffantes placées sous les cages). Ce transport se fera toujours sous conditions éveillées : l’anesthésie sous gazeuse étant rapidement réversible. Les animaux bénéficieront en permanence d'un enrichissement sous forme de feuilles de sopalins et de bâtonnets en bois à ronger.
Choix des espèces
Dans les études menées en oncologie, les modèles animaux utilisés sont majoritairement les modèles murins (souris et rats). Les rats constituent l'espèce de référence compte tenu de leur accessibilité et de leur facilité de manipulation. En outre, le choix de cette espèce se justifie par la nécessité d’obtention de volumes de dialysats suffisamment importants pour les dosages ultérieurs mais aussi par les limitations de résolution offertes par l’imagerie anatomique. Les rats immunodéprimés sont classiquement utilisées dans le cas de greffes de cellules tumorales humaines car du fait leur immunodéficience, il n'y a ainsi pas de rejet du greffon tumoral implanté. Des rats âgés de 6 semaines sont utilisés, à un stade où leur conformation crâniale correspond à celle d'un atlas permettant de cartographier le cerveau de rat.
Développement d’un modèle de résection du nerf alvéolaire inférieur pour tester le potentiel d’innervation et de vascularisation d’un biomatériau dans la régénération osseuse chez le rat.
- Recherche appliquée
- Maladies animales
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
- Système nerveux
280 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Chaque animal subit une chirurgie créant un défaut osseux dans la mandibule avec section du nerf alvéolaire inférieur, suivie de séances d'imagerie sur deux mois, pour tester des biomatériaux de régénération osseuse. Le porteur reconnaît de possibles difficultés de mastication et prévoit une nourriture molle les premiers jours. Il affirme qu'aucune méthode in vitro ne permet d'étudier ensemble formation osseuse, vascularisation et innervation dans la complexité d'un être vivant.
Objectifs
En ingénierie tissulaire pour la réparation osseuse, l’utilisation de scaffolds tridimensionnels a pour but d’offrir une alternative à la greffe pour combler des défauts osseux de taille critique. Ces scaffolds sont principalement des biomatériaux possédant des propriétés d’ostéoinduction et d’ostéoconduction grâce à leur composition. Cependant, les biomatériaux favorisant la vascularisation pour la réparation osseuse sont rares, et ceux prenant en compte le processus d’innervation sont quasiment inexistants. Même si le rôle de la vascularisation dans l’os est connu depuis longtemps, celui de l’innervation n’a été montré que récemment dans des études de dénervation de l’os, ce qui explique le manque de biomatériaux qui prennent en compte ce processus dans la régénération osseuse. Pour pouvoir d’une part confirmer le rôle de l’innervation dans la réparation osseuse ainsi que la formation de nouveaux vaisseaux sanguins, et d’autre part tester le potentiel de régénération osseuse de différents biomatériaux fabriqués au laboratoire, il est donc nécessaire de passer à un modèle de petit animal. La fabrication de ces biomatériaux dans le laboratoire se fait dans le cadre du projet SPARK qui vise au développement de nouvelles matrices tridimensionnelles pour des applications en ingénierie tissulaire osseuse. Ce projet a donc pour but de développer un modèle permettant d’étudier le rôle de l’innervation dans la réparation de l’os et de tester le potentiel de différents biomatériaux dans la régénération osseuse, notamment dans les processus d’innervation et de vascularisation.
Bénéfices attendus
La reconstruction de défauts osseux critiques est l’un des défis majeurs dans le domaine clinique, en particulier dans le cas de lésions osseuses dues à des traumatismes, cancers, ou autres maladies induisant des pertes de tissu osseux telles que les pseudarthroses ou l’ostéoporose. Ce projet a pour but de tester le potentiel de régénération osseuse, de vascularisation et d'innervation de nouveaux biomatériaux pour le comblement osseux. Il pourra ainsi permettre de sélectionner des matériaux intéressants pour la réparation osseuse dans un contexte clinique.
Procédures
Tous les animaux seront soumis à la chirurgie du défaut osseux circulaire dans la mandibule, couplé à la résection du nerf alvéolaire inférieur. Ils seront également tous soumis à la microtomographie aux rayons X aux temps 15 jours, 1 mois et 2 mois. Enfin, après la dernière série d'acquisition d'imagerie aux rayons X, les animaux seront euthanasiés par inhalation de dioxyde de carbone.
Impact sur les animaux
La réalisation du défaut osseux circulaire dans la mandibule de rat pourrait entrainer des difficultés de mastication et donc de nutrition des animaux après la chirurgie. C'est pour cette raison que les animaux recevront de la nourriture molle et enrichie pendant les 2 à 3 premiers jours après la chirurgie.
Devenir
A l'issue de la première procédure (chirurgie du défaut osseux et résection du nerf alvéolaire inférieur), les animaux seront maintenus en vie pour pouvoir réaliser la seconde procédure (imagerie aux rayons X) aux temps 15 jours, 1 mois et 2 mois. A l'issue de la dernière acquisition (2 mois), tous les animaux seront euthanasiés pour pouvoir réaliser ensuite des analyses histologiques et immunohistochimiques au niveau du défaut osseux.
Remplacement
Aucune méthode in vitro ne permet d’étudier simultanément la formation osseuse, la vascularisation et l’innervation induites par des biomatériaux tout en prenant en compte la complexité d’un être vivant (système immunitaire, flux sanguin…).
Réduction
L’utilisation de méthodes d’imagerie in vivo pour le suivi à differents temps de la reconstruction osseuse permet de réduire significativement le nombre d’animaux utilisés pour ces expérimentations. Le nombre d’animaux par groupe est également calculé pour utiliser le moins d’animaux possible tout en permettant d’obtenir des résultats exploitables de manière statistique.
Raffinement
La chirurgie sera effectuée sous anesthésie générale et une analgésie adaptée sera appliquée en post-opératoire pour limiter la douleur. Les conditions de stabulation des animaux seront également adaptées avec isolement des animaux après l’opération pour limiter les risques de réouverture de l’incision. Les rats seront ensuite regroupés 5 jours plus tard de façon à favoriser les interactions sociales importantes pour le bien-être animal. Les conditions d’hébergement et le milieu d’enrichissement seront également pensés pour favoriser le bien-être des animaux (litière avec copeaux, tuyaux pour jouer et se cacher…).
Choix des espèces
Le rat est une espèce adaptée à la première étape de validation chez l’animal de matériaux destinés au traitement de défauts osseux. Sa taille plus grande que la souris permet de réaliser des lésions circulaires de diamètre suffisant dans l’os de la mandibule. Les rats utilisés seront des rats Wistar adultes de 10 à 12 semaines. En effet, ils devront avoir achevé leur croissance pour éliminer le biais induit par le développement sur la régénération osseuse. De plus, la taille plus importante de la mandibule chez les adultes facilitera l’opération.
Alterations des circuits cortico-striataux de l’attention dans l’addiction à la nicotine
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
264 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit une chirurgie d'implantation d'un cathéter veineux puis une chirurgie stéréotaxique posant des électrodes ou des fibres optiques dans le cerveau, pour étudier l'addiction à la nicotine, avant une mise à mort par perfusion intracardiaque d'un fixateur. Le porteur invoque explicitement l'éthique "spéciste" qui interdit ces approches invasives chez l'humain pour justifier le recours au rat. Il conclut que l'addiction, trouble du comportement, ne peut être reproduite ni sur cultures cellulaires ni par modèle in silico.
Objectifs
Le but de ce projet est d’étudier les altérations des circuits neuronaux de l’attention dans le développement de l’addiction à la nicotine. Nous avons précédemment montré que des différences dans les capacités attentionnelles des rats prédisent leur prédisposition à développer une addiction à la nicotine. De plus, le développement de l'addiction à la nicotine entraine des modifications de l'activité neuronale du cortex préfrontal (PFC), une structure fortement impliquée dans l’attention. Dans ce projet, nous chercherons tout d’abord à d'identifier les altérations des circuits neuronaux cortico-striataux de l’attention lors du développement de l’addiction à la nicotine (Prodécures 1 et 2). Pour cela, nous mesurerons l’activité des circuits neuronaux lors du d’une tâche attentionnelle avant et après addiction à la nicotine en utilisant des techniques électrophysiologiques (Procédure 1) et photométriques in vivo (Procédure 2). Puis, nous chercherons à modifier l'activité de ces voies neuronales afin de restaurer les capacités attentionnelles et diminuer la consommation de nicotine (Procédure 3) en utilisant des techniques d’optogénétiques in vivo.
Bénéfices attendus
Ces expériences fourniront des informations uniques sur la façon dont l'attention et les processus neuronaux associés aux PFC sont altérés à différents stades de la dépendance à la nicotine et ainsi d'étudier les variabilités individuelles de ces capacités attentionnelles dans la vulnérabilité à développer une addiction à la nicotine. De façon plus générale, ces expériences permettront également une meilleure compréhension des mécanismes neurobiologiques sous-tendant les capacités attentionnelles et leurs dysfonctionnement.
Procédures
Tous les animaux (n =264) seront tout d'abord soumis à une chirurgie intaveineuse pour l'implantation d'un catthéter intraveineux. Ce type de chirurgie est effectué en conditions aseptiques, sur couverture chauffante et dure en moyenne 30 min. Les animaux seront ensuite soumis à une chirugie stéréotaxique soit pour l'implantation des électrodes pour les enregistrements électrophysiologiques (n = 48), soit pour l'implantation de fibres optiques (n= 168) ou photometriques pour les manipulation optiques ou les enregistrements de photométrie (n = 48). Ce type de chirurgie est effectué en conditions aseptiques, sur couverture chauffante et dure en moyenne 1h pour l'implantation des électrodes et 45 min pour l'implantation des fibres.
Impact sur les animaux
Ces animaux sont soumis à différentes procédures successives dont le degré maximal de gravité ne dépasse pas le degré modéré. Les nuisances attendues sont celles associées à la chirurgie intraveineuse et à la chirurgie stéréotaxique, bien que toutes les précautions soient prises pour réduire la douleur ou les infections (anesthésie, analgésie anti-inflammatoire, des conditions aseptiques, suivi post-opératoire ...).
Devenir
A la fin des expériences, il est nécessaire de vérifier l'emplacement des électrodes (Procédure 1, Exp 1), des fibres photométriques (Procédure 1, Exp 2), et optiques (Procédure 2, Exp 3). Ceci nécessite une fixation du tissu cérébral par perfusion intracardiaque d’un agent fixant (formaldéhyde, 3,6%) des animaux des expériences 1, 2 et 3. Cette procédure est réalisée sous analgésie (carprofène, dose 5 mg/kg, s.c., 15 min avant) et anesthésie profonde (mélange de kétamine 110 mg/kg et de xylazine 15 mg/kg, i.v.) afin de limiter au maximum la douleur et la souffrance des animaux.
Remplacement
Ce projet recourt exclusivement à l’utilisation du rat de laboratoire (Rattus Norvegicus, jeunes adultes, mâles), vivant en groupe dans un environnement enrichi. Ce recours à l’animal peut se justifier pour plusieurs raisons éthiques : 1) l’éthique « spéciste » actuelle interdit l’utilisation d’approches neurobiologiques invasives chez l’homme, rendant ainsi inaccessible l’étude directe des processus de causalité neurobiologique dans notre espèce (sauf, bien sûr, lorsque ceux-ci sont non-invasifs) ; 2) il n’existe pas encore de modèles mathématique ou in silico valides et réalistes permettant d’étudier ces processus causaux ; 3) l’addiction, contrairement à la dépendance physique, est un trouble du comportement et, en tant que telle, ne peut pas être récapitulée sur des lignées cellulaires (humaine ou animale) ou tout autre modèle in vitro cellulaire ou subcellulaire.
Réduction
Un effectif de 14 rats par groupe est un compromis rationnel, compte tenu de l’exigence éthique de réduction du nombre d’animaux et des contraintes expérimentales propres au projet. En effet, pour que nos expériences soient concluantes au plan statistique, il faut obtenir un effectif final minimum de 11-12 individus. Etant donné que le pourcentage d’attrition est estimé à 20% en fin d’expérience, il faut démarrer l’expérience avec un groupe de 14 rats. Enfin, les résultats seront analysés grâce à des tests statistiques paramétriques, principalement des analyses de variance, avec comparaisons inter-groupes et mesures répétées, suivies de tests a posteriori (HSD Tuckey). Le seuil de significativité statistique sera fixé à p < 0.05.
Raffinement
Les animaux sont logés par groupe de 2 dans des cages munies d’un environnement enrichi afin de limiter le stress et l’ennui. Toutes les chirurgies sont réalisées sous analgésie (carprofène, dose 5mg/kg, sous-cutanée, 15min avant le début de la chirurgie) et anesthésie chimique (Kétamine 110mg/kg +Xylazine 15mg/kg, intrapéritonéale) ou gazeuse (isoflurane), sont effectuées en conditions aseptiques, sur couverture chauffante et durent entre 30min-1h. En fin de chirurgie, l'animal reçoit une injection intraveineuse d'antibiotique (0.2ml) ainsi qu’une injection sous-cutanée de NaCl, pour favoriser la réhydratation. Il est ensuite placé dans une cage de réveil sur une couverture chauffante jusqu’au réveil (i.e., remise sur pattes et locomotion) avec libre accès à l'eau et à la nourriture. Après le réveil complet, l'animal est relogé dans sa cage de stabulation avec son congénère pendant une période de récupération de 7-10 jours durant laquelle les animaux sont sous surveillance quotidienne afin de pouvoir détecter le plus rapidement possible les éventuels signes d'inconfort, de stress ou de douleur et de pouvoir y remédier rapidement. Avant le début des expériences, les animaux sont manipulés tous les jours et habitués aux cages expérimentales (pendant 2 jours consécutifs à raison de 2h/jour) afin de limiter le niveau de stress et d’anxiété des animaux. Plusieurs critères sont pris en compte pour quantifier le niveau de souffrance de l’animal et décider de procéder à sa mise à mort. Ces critères incluent une perte excessive de poids, une diminution de la température corporelle, une dégradation de l’apparence physique (manque de soin, pelage sale) et une altération anormale du comportement (hyper ou hypoactivité, agressivité défensive, repli sur soi), ces performances comportementales. Ces manifestations éventuelles sont donc suivies quotidiennement par des méthodes non invasives (inspection et manipulation quotidiennes ; pesée régulière [3 fois par semaine]). Si une perte de poids corporel supérieure à 20% est observée en 48 heures, l'animal sera alors mis à mort, sachant que dans tous les cas, il y a aussi d’autres points limites listés ci-dessus qui sont atteints (cf. méthodes de mise à mort). Toutes les procédures sont effectuées par du personnel formé.
Choix des espèces
Le choix du rat de laboratoire constitue une sorte de compromis phylogénétique. Cette espèce est suffisamment proche de l’homme d’un point de vue phylogénétique (même classe [Mammalia], divergence de leur ancêtre commun il y a environ 100 MYA) pour servir de modèle animal valide des phénomènes d’addiction par rapport à d’autres espèces moins sensibles éthiquement (e.g., invertébrés) et en même temps suffisamment éloignée par rapport à d’autres espèces plus sensibles (e.g., primates non-humains). Les espèces invertébrées (e.g., C. Elegans, D. Melanogaster, A. Californica) peuvent être utilisées pour élucider les mécanismes neuronaux ou génétiques de certains effets comportementaux de la nicotine mais l’organisation nerveuse et comportementale de ces espèces est beaucoup trop éloignée de celle de l’homme pour constituer des modèles animaux valides dans le domaine des addictions. Un tel travail ne pourrait être effectué par une approche in vitro ou in silico. Chez l'Homme, les troubles de l'attention sont une pathologie qui se manifeste tôt dans la vie d'un individu et qui a des répercussions importantes tout au long de la vie adule de l'individu. Dans ce projet, les animaux utilisés seront de jeunes adultes en fin d’adolescence en début d’expérience (i.e., âge moyen 2 mois et demi). Cette période du développement correspond à la période de plus grande vulnérabilité au développement de troubles attentionnels et à l'addiction aux drogues.
Mise au point d’un nouveau modèle préclinique mimant la maladie d’Alzheimer chez le rat diabétique
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système nerveux
80 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Chaque animal subit une chirurgie stéréotaxique implantant une pompe qui diffuse des oligomères amyloïdes dans le cerveau, puis des tests métaboliques répétés avec prélèvements sanguins, pour créer un modèle croisant maladie d'Alzheimer et diabète. Le porteur indique qu'une perte de poids de plus de 20 % entraîne le retrait de l'animal et son observation avant toute décision de mise à mort. Il affirme qu'il est "impossible" de remplacer ces rats par des systèmes in vitro ou in silico, la valeur du modèle tenant selon lui à un diabète spontané proche de l'humain.
Objectifs
Le diabète de type 2 (DT2) et la maladie d’Alzheimer (MA) sont deux pathologies dégénératives, liées à l’âge, et dont la prévalence mondiale suit une progression alarmante à cause du vieillissement de la population. Leur fardeau socio-économique est destiné à s’alourdir surtout en l’absence d’un traitement curatif. De nombreuses études épidémiologiques ont montré que le DT2 est associé à un doublement du risque de développer une démence ou la MA. Réciproquement, l’intolérance au glucose et le DT2 sont fréquents chez les patients atteints de la MA. Néanmoins, malgré les progrès de la recherche dans ce domaine, la relation entre le DT2 et la MA reste encore mal comprise. De ce fait, comprendre les mécanismes moléculaires associant le DT2 et la MA est un enjeu majeur de la recherche, afin d’identifier des cibles thérapeutiques communes permettant de modifier le déclenchement et la progression de ces deux pathologies.Pour élucider le lien entre ces deux maladies, nous allons créer deux modèles précliniques de MA en injectant dans le cerveau du rat Goto-Kakizaki (GK), un modèle spontané du DT2, et du rat Wistar (WT) non diabétique des oligomères du peptide β-amyloïde (Aβ). Nous appellerons ces modèles « GK-Alz » et « WT-Alz ». Pour chacun de ces deux modèles un groupe contrôle, qui ne recevra pas les oligomères , sera rajouté. En effet dans la pathologie humaine, l'une des caractéristiques majeure est l'agréagation des oligomères Aβ pour former des plaques entre les neurones. Nous étudierons si un DT2 préexistant va éventuellement accélérer la formation de ces plaques et aggraver la neurotoxicité des oligomères Aβ grâce à des analyses histologiques et biochimiques sur le cerveau et le pancréas. Réciproquement, nous étudierons si l’induction de la MA va impacter négativement l' homéostasie glucidique de nos modèles animaux, en effectuant des tests métaboliques in vivo . Ce projet nécessitera l'utilisation de 80 rats et sera mené sur 3 ans.
Bénéfices attendus
Ce projet nous permettra d'avoir une meilleure compréhension des mécanismes impliqués dans la mise en place de la MA, de mettre en évidence les impacts du diabète sur la MA et d'offrir de nouvelles perspectives dans la prévention de son développement . Ce projet nous aidera à étudier la réponse physiopathologique à l’administration des oligomères Aβ et son évolution à différents moments du cycle de vie (avec l’évolution du diabète et le vieillissement du rat) .
Procédures
Les animaux subiront une procédure chirurgicale ,par stéréotaxie, pour l'implantation de la canule équipant la minipompe osmotique. Les 80 rats de l'étude seront implantés. Cette chirurgie dure 60 minutes. Des prélèvements de sang seront effectués sur les 48 animaux restants dans le cadre de tests métaboliques IPGTT et IPITT( à l'âge de 7.5 mois soit 1.5 mois aprés l'implantation des pompes Alzet.) et lors du suivi de la glycémie (entre 6 et 7.5 mois). Chacun de ces tests dure 2h. Pour l'IPGTT des prélèvements de sang de 30 microlitres aux temps 0, 15 30 et 90 minutes sont réalisés afin de mesurer la glycémie et l'insulinémie. Pour IPITT une goutte de sang (5 microlitres) sera prélevée pour lecture de la glycémie sur lecteur Accuchek aux temps T0 T15 T30 T60 T90 et T120. Entre le test IPITT et IPGTT se déroule une semaine pour la récupération.
Impact sur les animaux
Les animaux sont isolés en cage individuelle suite à l'implantation en sous curtanée d’une minipompe osmotique Alzet® reliée à une canule implantée en ICV. L'injection en intrapéritonéal dans le cadre des IPGTT et ITT est à l'origine d'une petite douleur liée à la piqure. Une éventuelle hypoglycémie peut arriver dans le cadre de l'ITT, mais cela est trés rare chez le rat. Les anomalies cérébrales entrainées par le peptide Aβ pourraient induire une intolérance au glucose chez les rats wistar et aggraver le diabète des GK.
Devenir
A la fin de la procédure 1 de chirurgie, réalisée à l'âge de 6 mois, les 80 rats sont maintenus en vie. A la fin des 2 semaines de perfusion 8 rats de chaque groupes seront mis à mort pour valider le modèle. A l'âge de 7.5 mois les autres animaux( 48 rats) subissent les tests métaboliques, à l'issue desquels ils sont mis à mort.
Remplacement
L’étude de la réponse physiopathologique à l’administration des oligomères Aβ et son évolution à différents moments du cycle de vie (avec l’évolution du diabète et le vieillissement du rat) ne peut être réalisée que sur animaux vivants, et l’avantage du rat GK réside dans le fait que c’est un modèle de DT2 sans manipulation génétique et mimant la chronologie d’évolution du diabète humain. Ainsi, sur le plan scientifique, il est impossible de remplacer ces animaux par des systèmes ex vivo, in vitro ou in silico.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés est réduit au minimum grâce à l’utilisation de tests statistiques montrant au mieux la différence entre les groupes.
Raffinement
Afin de raffiner toutes les procédures et réduire au mieux l’apparition, d'une éventuelle douleur, d’angoisse et de stress chez les animaux, nous prendrons toutes les précautions nécessaires (recours à l’analgésie, l’anesthésie, maintien de l’enrichissement (morceau de bois et sopalin), habituation, récupération). Des points limites d’évaluation de la douleur seront déterminés portant sur l'apparence physique( manque de toilettage, poils ebouriffés, dos arrondi) le comportement (modification de la prise alimentaire, prostatration) les modifications de poids. Une perte de poids de plus de 20% entrainera le retrait de l’animal de la procédure et son observation avant toute décision de mise à mort. Le choix du protocole expérimental impliquant les 4 groupes d'animaux, nous permet d'assurer une fiabilité à cette étude. Pour les rats diabétiques GK une litière adaptée sera mise dans les cages et renouvelée 2 fois par semaine pour éviter l'inconfort des animaux.
Choix des espèces
Le rat est une espèce animale pertinente dans le cas de notre étude parce que du point de vue comportement, le rat est un apprenant rapide et intelligent, et les processus physiologiques sont similaires chez le rat et chez l’Homme. De plus, le rat est suffisamment grand pour des mesures physiologiques pratiques et pour des manipulations neurochirurgicales/stéréotaxiques. Enfin le modèle animal sur lequel nous conduisons nos recherches sur le diabète est le rat.
Imagerie spécifique des propriétés de la myéline par IRM de transfert d’aimantation inhomogène quantitatif (qihMT)
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Rats : 70
440 souris et rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à sévère, dont 250 en gravité sévère. Ils servent de modèles de démyélinisation, génétiques ou induits par la cuprizone, passent des examens d'IRM, puis leur système nerveux central est prélevé par perfusion intracardiaque de fixateur suivie de décapitation. Le porteur met au point une technique d'IRM censée être spécifique de la myéline, à valider par comparaison histologique. Les retombées cliniques annoncées restent conditionnées à la réussite du projet.
Objectifs
Introduction : La myélinisation des axones est une composante fondamentale du fonctionnement du système nerveux central (SNC), puisque qu’elle assure d’une part l’isolation axonale et permet d’autre part la propagation efficace du signal électrique le long des fibres nerveuses. Ainsi, pouvoir accéder in vivo à l’intégrité de la myéline permettrait une meilleure compréhension du développement du SNC chez le sujet sain, ainsi qu’une meilleure caractérisation des pathologies neurologiques de la substance blanche (e.g. Sclérose en Plaques). Aucune technique IRM actuelle n’est réellement spécifique de la myéline et plusieurs facteurs confondants limitent ou empêchent les diagnostics précis. Les techniques basées sur le transfert d’aimantation offrent pourtant des potentialités très intéressantes. Récemment, nous avons développé une nouvelle technique dérivée du transfert d’aimantation, le transfert d’aimantation inhomogène (ihMT), dont la sélectivité du signal pour la myéline s'avère remarquable. Les objectifs majeurs de ce projet sont de développer une technique ihMT quantitative (qihMT) et de valider ses métriques quantitatives comme marqueurs spécifiques des différentes propriétés de la myéline (organisation, composition, structure, dynamique) dans des modèles pathologiques (e.g. modèle d’encéphalomyélite auto-immune expérimentale (EAE), modèle de démyélinisation cuprizone, modèles de dysmyélinisation) et dans le suivi de la maturation cérébrale.
Bénéfices attendus
En cas de réussite, ce projet aura pour vocation de fournir un outil non-invasif quantitatif dont les métriques seront spécifiques des différentes propriétés de la myéline (structure, composition, fonction). Cet outil permettra un diagnostic in vivo plus précis ainsi qu’une levée des limitations des techniques actuelles. De plus, grâce à la transversalité de l’IRM, le protocole validé sur petit animal pourra être appliqué à l’homme sur la base des résultats obtenus en préclinique.
Procédures
A la fin des analyses IRM, le système nerveux central des animaux controles/modèles (nombre total de 440) sera être prélevé pour analyses histologiques par des techniques de référence d'imagerie de la myéline afin de valider les données qihMT. Le système nerveux central des animaux sera prélevé selon le protocole de perfusion intracardiaque suivant (durée 30 minutes): Administration analgésique Buprénorphine (buprecare, 0.3mg/ml) à la dose de 0.1mg/kg. La buprénorphine aura été préalablement dilué (X20) avec une solution de NaCl 0,9 %. Le volume injecté pour une souris de 25 g est de 160 microlitre. Injection d’euthasol en ip à la dose de 140mg/kg. L’euthasol aura été préalablement dilué (X40) avec une solution de NaCl 0,9 %. Le volume injecté pour une souris de 25 g est de 350 microl (seringue de 0,3 ou 0,5 ml, aiguille de 29 G) L'animal aura sa cage thoracique ouverte en vue d'effectuer une perfusion intracardiaque de 20 ml de PBS - Héparine 100U/ml puis de 50 ml de PFA 4%. A la fin de la perfusion, l'animal sera décapité et son cerveau sera prélevé puis post-fixé dans du PFA 4% à 4°C pendant 24 h.
Impact sur les animaux
Des nuisances temporaires de stress, liées à l'environnement relativement bruyant des IRM est attendu pour tous les animaux lorsqu'ils seront sortis de l'armoire de stabulation pour l'examen IRM (2heures). Une perte de poids temporaire (-5% pendant 1 semaine) due au changement de régime alimentaire est attendu pour les souris du modèle cuprizone.
Devenir
L'issue de chacune des procédures 1-6 cloturera un point particulier du projet global sur l'imagerie quantitative de la myéline. Les 440 animaux nécessaires à l'ensemble des procédures seront donc euthanasiés par perfusion intracardiaque (mise à mort décrite en 3.3.3 et demande de dérogation en 3.3.4) permettant le prélèvement de leur système nerveux central.
Remplacement
La spécificité des métriques quantitatives de la technique qihMT pour la myéline doit être démontrée in vivo afin de valider l'IRM ihMT comme marqueur spécifique utilisable dans des protocoles cliniques. Cette démonstration ne pourra être effectuée que sur la base de mesures réalisées à différents points temporels sur des animaux contrôles et modèles caractérisés d’altération/développement de la myéline. Ces mesures seront ensuite corrélées à des analyses histologiques. Ces aspects ne peuvent être conduits chez le patient du fait de l’impossibilité de réaliser une étude histologique sur un même échantillon préalablement exploré in vivo par IRM. Néanmoins, une stratégie de remplacement sera effectuée. Ainsi, à chaque fois que cela sera possible, notamment lors des ajustements de premier niveau (debuggage des séquences IRM, optimisation, tests...), des fantômes (composés chimiques ayant des caractéristiques similaires à la myéline, e.g. systemes de lipides lamellaires synthétiques) seront utilisés en lieu et place des animaux.
Réduction
Les examens IRM seront réalisés de sorte que plusieurs paramètres IRM puissent être ajustés au cours d’une même session et sur des mêmes animaux. La durée des examens n’excèdera néanmoins pas 2h par animal (durée standard d’investigation multimodale IRM sur petit animal). Un suivi longitudinal par exploration IRM non invasive sera effectué sur tous les modèles investigués, réduisant ainsi de manière drastique le nombre d’animaux utilisés.
Raffinement
Le bien-être des animaux est assuré par les animaliers. La stabulation des animaux sera réalisée au sein de notre unité, dans des armoires dédiées à raison de 5 souris / cage et 2 rats / cage pour les animaux contrôles. Après un examen IRM, chaque animal sera placé dans une cage individuelle avec accès facilité à la nourriture/boisson puis replacé dans sa cage une heure après. Les cages de stabulation souris du CRMBM sont dotées d’un environnement enrichi (roues, tunnels... pour la stimulation des animaux). Les procédures expérimentales de chirurgies sont réalisées sous anesthésie générale (anesthésie volatile Isoflurane 3% dans l’oxygene pur et ventilation assistée ou mélange kétamine (100mg/kg de poids)/xylazine (10mg/kg de poids)) et des analgésiques sont administrés (injection intramusculaire de Buprenorphine, 0.1mg/kg).
Choix des espèces
Justification de l’utilisation de souris : Existence de différents modèles génétiques caractérisés de pathologies affectant la myéline chez la souris : modèles Shiverer et Twitcher (modèles génétiques des leucodystrophies, caractérisées par une dysmyélinisation du SNC résultant d’un déficit en galactocérébrosides pour Twitcher ou en Myelin Base Protein (MBP) pour Shiverer), modèle cuprizone et EAE (miment certains effets de la sclérose en plaques par une démyélinisation locale et par des lésions axonales entrainant un déficit cognitif et une incapacité progressive, et effets inflammatoires). Justification de l’utilisation des rats : L’interêt du rat est de disposer de structures de système nerveux central plus grosses que celles de la souris et donc d’un signal IRM plus conséquent. Investigation possible grace au diamètre plus grand du scanner 7T. L’IRM étant une technique très peu sensible, le critère de rapport signal sur bruit élevé est primordial afin de limiter le temps d’examen. Pour toutes les études (hors maturation cérébrale), les animaux seront âgés de >10 semaines correspondant au début de l’âge adulte afin de s’assurer d’un niveau de maturation du système nerveux central maximal. Pour l’étude de la maturation cérébrale, les animaux seront utilisés à différents stades du développement (de D6, jusqu’à >10 semaines).
Acquisition et maintien des compétences techniques en expérimentation animale.
- Formation professionnelle
- Recherche appliquée
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
Rats : 300
400 souris et rats vont être utilisés, tués à l'issue, dans des procédures déclarées de gravité légère. Ils servent non à produire des connaissances mais à entraîner le personnel aux gestes techniques, gavage, injections par plusieurs voies et prélèvements de sang, chaque animal subissant un geste par jour. Le porteur reconnaît qu'une fausse route lors du gavage ou une instillation peut provoquer la mort de l'animal. Il présente cette formation comme un moyen d'améliorer le bien-être des animaux non-humains et écarte tout remplacement, l'objectif étant l'entraînement lui-même.
Objectifs
La bonne réalisation d’un projet scientifique utilisant des animaux de laboratoire requiert que le personnel appliquant les procédures expérimentales soit parfaitement formé aux gestes techniques nécessaires à l’atteinte des objectifs dudit projet. Cela passe obligatoirement par l’acquisition et le maintien du niveau de maîtrise de ces gestes, en particulier pour les nouveaux arrivants (stagiaires, doctorants, post-doctorants, techniciens, chercheurs…). Ainsi, la bonne formation du personnel permet d’une part d’améliorer le bien-être des animaux en prévenant les gestes mal effectués et d’autre part d’éviter de refaire des expérimentations en raison du manque de reproductibilité des résultats scientifiques et donc de limiter le nombre d’animaux utilisés. Au regard de la réglementtaion, un établissement utilisateur doit s’assurer de la bonne formation de son personnel et du maintien de son expertise dans la réalisation de gestes techniques par la mise en place d’un tutorat. Même si cet apprentissage peut-être réalisé à l’extérieur de l’établissement dans le cadre de la formation continue, il est très rare que la personne formée applique directement les gestes appris dans un protocole sans les revalider au sein de son laboratoire. Ceci nécessite donc d’utiliser au sein d’un établissement des animaux de laboratoire dédiés à la formation et au maintien des compétences du personnel. Au lieu de les intégrer dans des projets individuels, il est plus judicieux de les regrouper au sein d’un même projet supervisé par le responsable de la formation et du suivi des compétences qui permettra de rationaliser le nombre d’animaux utilisés.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de former les personnes impliquées dans la mise en oeuvre des procédures. Il contribuera ainsi à améliorer leurs compétences techniques favorisera la réalisation de gestes sûrs et améliorera le bien-être des animaux en limitant leur stress ou leur inconfort.
Procédures
Les animaux seront utilisés pour la formation du personnel à différents gestes techniques nécessaires à l'adminitration de substances (gavage; application cutanée; instillations nasale et intratrachéale; injections intrapéritonéale, sous-cutanée, intramuculaire et intraveineuse) ou aux prélèvements sanguins (veine caudale et aorte abdominale). Pour un animal donné, une seule de ces techniques sera réalisée par jour et un temps d'attente de 48 h sera respecté entre deux gestes. Chaque geste ne prendra que quelques minutes tout au plus.
Impact sur les animaux
Les nuisances subies par les animaux sont principalement dues aux voies d'administration même si le plus grand soin sera pris pour que les administrations de subtances soient réalisées en limitant au maximum l'inconfort des animaux. Si des effets indésirables étaient observés, ils seraient la conséquence d'un geste mal réalisé. Pour le gavage, une fausse route pourrait conduire à la mort de l'animal due à l'entrée de sérum physiologique ou huile dans le poumon. Pour les instillations endotrachéales, l'administration du sérum physiologique pourrait conduire dans de rares cas à un arrêt respiratoire. De toutes les manières, dès l'apparition de signes de souffrance non réversibles, les animaux seront mis à mort.
Devenir
A l'issue de chaque procédure, les animaux peuvent soit être utilisés dans une autre procédure en respectant un délai de 48 h entre deux gestes, soit être mis à mort car le nombre cumulé de procédures apparait suffisamment important pour un même animal. En raison du degré de gravité des procédures (légère), il est considéré que les animaux peuvent être utilisés dans d'autres procédures du même projet sans préjudice notable pour leur bien-être.
Remplacement
Difficilement applicable à ce projet puisqu’il vise à garantir le niveau de compétence du personnel dans la réalisation des gestes en expérimentation animale.
Réduction
Diminution du nombre d’animaux utilisés dans les projets par la rationalisation des animaux utilisés pour l’apprentissage des gestes techniques et la diminution des erreurs expérimentales conduisant à refaire des expérimentations sur animaux.
Raffinement
La réalisation d'expérimentations sur animaux nécessite que les personnes amenées à les réaliser maîtrisent les gestes techniques requis à l'administration de subtsances ou à la collecte des tissus et les réalisent dans les règles de l'art. Cela est nécessaire pour limiter l'inconfort et le stress des animaux lors des expérimentations. Par ailleurs, le partage d'expériences entre les expérimentateurs et les tuteurs permet d'améliorer les pratiques et par conséquent le bien être des animaux.
Choix des espèces
Le rat et la souris sont les deux espèces les plus couramment utilisées dans les études de toxicologie et sont les modèles sélectionnés dans les lignes directrices de l’OCDE portant sur les essais in vivo de toxicité des produits chimiques. La compréhension des effets toxiques chez l’animal de laboratoire et chez l’homme de nombreuses substances chimiques retrouvées en milieu professionnel est encore parcellaire. En raison de la complexité des processus physiologiques mis en oeuvre, les études chez l’animal de laboratoire ne peuvent pas encore être substituées par des études sur des cultures de cellules. Par ailleurs, afin d’améliorer le bien-être des animaux et la reproductibilité des résultats, il est nécessaire de prévenir les gestes mal réalisés en formant le personnel et en assurant le maintien de son niveau d’expertise dans les modèles expérimentaux de Toxicologie utilisés au sein de l'établissement, en l'occurence des rats et de souris.
Imagerie nucléaire par Tomographie par Emission de Positon (TEP)
- Recherche appliquée
- Diagnostic des maladies
Rats : 520
1 820 souris et rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures déclarées de gravité légère. Chaque animal reçoit sous anesthésie une injection intraveineuse de radiotraceur, suivie d'une imagerie TEP de vingt minutes à deux heures, avant mise à mort par dislocation cervicale, surdose anesthésique ou perfusion intracardiaque de fixateur. Le projet développe des candidats-imagerie et des candidats-médicaments pour diverses pathologies. Le porteur justifie le recours à l'animal par l'impossibilité réglementaire de mener ces recherches chez l'humain sain et par l'absence d'alternative.
Objectifs
Nous poursuivons 2 objectifs scientifiques et technologiques principaux: i) le développement de nouveaux candidats-imagerie afin d’améliorer la détection et le suivi des pathologie, ii) amener des candidats-médicaments aux phases précliniques de validation ce qui apporterait de nouvelles possibilités de traitements contre différentes pathologies.
Bénéfices attendus
Un des problèmes majeurs de nombreuses pathologies, parmi lesquelles les cancers, est le diagnostic tardif ce qui rend leur traitement difficile. Parallèlement à la recherche de nouveaux traitements, la recherche en imagerie médicale permet de détecter l’apparition de pathologies plus précocement, plus précisément et/ou plus spécifiquement, contribuant ainsi à un meilleur diagnostic des pathologies, à évaluer l’éligibilité des patients à une thérapie donné, et/ou à un meilleur suivi de l’évolution.
Procédures
Les animaux reçoivent, sous anesthésie une injection intraveineuse de maximum 100μL de radiotraceur (5-10MBq selon les radiotraceurs) en solution isotonique stérile et apyrogène. Le volume injecté sera expérience dépendant en fonction de l'efficacité du radiomarquage. Si des injections sont réalisées plusieurs fois sur un même animal, une période de récupération d'au minimum 48H est alors envisagée. A noter qu’une personne habilitée (partie prenante de la collaboration) à travailler avec des radioéléments sera en charge des animaux, des injections jusqu’aux manipulations pré- et post-imagerie. 0 minutes à 2 heures (selon le traceur utilisé) après injection, l’acquisition en imagerie sous caméra microTEP/CT est réalisée pour une durée de 20 à 120 minutes, sous anesthésie. La caméra est équipée d’un système de monitoring cardiaque et respiratoire ainsi que d’un système de chauffage permettant de corriger la diminution de température corporelle induite par l’anesthésie. L'animal fait l'objet d'une surveillance visuelle pendant toute la durée de l'examen. En fin de procédure l’animal est réveillé, placé dans une pièce de stabulation post-examen, chauffé, avec eau et nourriture ad libitum.
Impact sur les animaux
L’imagerie TEP est une procédure non douloureuse réalisée sur animal anesthésié. Tous les animaux seront examinées et surveillées avant, durant et après l’imagerie. Pendant l’examen, un support chauffant permet de lutter contre l’hypothermie due à l’anesthésie et la respiration est suivie. Les seules sources de stress sont l’induction anesthésique, l'injection du radiotraceur et le réveil. Le protocole sera arrêté si l’animal présente des difficultés à respirer (augmentation de la fréquence respiratoire visible au niveau des flancs), si l’animal est prostré ou en retrait, ou s’il présente une perte de poids supérieure ou égale à 20% du poids de départ. Les animaux sont suivis quotidiennement, week-end compris, pour s'assurer de leur bien-être et de l'absence de souffrance. Nous effectuerons un contrôle préalable de l’état physiologique des animaux avant de les inclure dans la procédure expérimentale.
Devenir
Les animaux ne nécessitant pas d'étude immunohistochimiques seront mis à mort à la fin de la procédure d'imagerie soit par dislocation cervical soit par surdose anesthésique. Les animaux nécessitant des études immunohistochimiques seront mis à mort à la fin de la procédure d'imagerie par perfusion intracardiaque de paraformaldéhyde sous anesthésie profonde.
Remplacement
Le recours à l’expérimentation animale se justifie par l’impossibilité réglementaire de conduire ce type de recherche chez l’homme sain, et le choix de l’espèce par le besoin d’un modèle animal déjà documenté, en l'absence d'alternative possible.
Réduction
Pour notre étude d’une durée totale de 5 ans, nous envisageons d’utiliser au maximum 1300 souris (Mus musculus) et 520 rats (Rattus norvegicus). Ce nombre total d’animaux sera déterminé au plus juste, mais il nous faudra dans le même temps disposer de suffisamment d’échantillons pour obtenir des résultats statistiquement exploitables et fiables avec des tests statistiques Paramétrique ou non (définis en fonction de la taille de l’échantillon et de l’évaluation de la normalité de la distribution).
Raffinement
Le personnel impliqué est formé et qualifié à l’expérimentation animale (niveaux 1 et 2). Les animaux seront commandés chez un fournisseur agréé et seront livrés directement à l’animalerie de CERIMED au minimum une semaine avant la première procédure expérimentale. Les animaux sont suivis quotidiennement, week-end compris, pour s'assurer de leur bien-être et de l'absence de souffrance. Nous effectuerons un contrôle préalable de l’état physiologique des animaux avant de les inclure dans la procédure expérimentale. Suivant la grille d'évaluation de la souffrance (annexe), si le score est élevé (15 à 20), la mise à mort sera réalisée sans délais. Dans ce protocole, le comportement et le poids des animaux seront observés régulièrement. En fonction des scores obtenus grâce à la grille d'évaluation de la douleur, l'analgésie sera réalisée par administration de paracétamol (200mg/kg, voie orale ou Carprofène à 20mg/kg, ou de buprénorphine voie s.c. 0.05 mg/kg)).
Choix des espèces
Les études biomédicales font appel à des modèles animaux qui visent à mimer au plus près les processus physiologiques et pathologiques rencontrés chez l’humain. Les rongeurs sont des animaux de choix à double titre : d’une part par les facilités d’élevage et de stabulation en animalerie, d’autre part en raison de l’avènement des techniques de manipulations génétiques chez la souris Les animaux seront utilisés au stade adulte, à six - huit semaines, car c’est le protocole communément utilisé dans la littérature. Après réception, les animaux sont hébergés au minimum pendant une semaine avant le début du protocole.
Effets d’un régime supplémenté en vitamine D et en acides gras Oméga-3 dans la prévention des altérations ostéo-articulaires associées à l’obésité chez le rat
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système musculosquelettique
80 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures déclarées de gravité légère. Ils sont soumis à un régime obésogène puis à un gavage quotidien pendant quatorze semaines, à des prélèvements de sang et à un test de tolérance au glucose, avant euthanasie par exsanguination pour prélèvement d'organes. Le porteur teste l'effet d'une supplémentation en vitamine D et oméga-3 sur les atteintes articulaires liées à l'obésité, avec des applications renvoyées à terme à l'humain, aux chiens et aux chats. Il affirme qu'aucune méthode in silico ou in vitro ne peut remplacer l'observation du développement des lésions.
Objectifs
L’obésité est une affection très répandue aussi bien chez l’Homme que chez les animaux de compagnie. Cette maladie correspond à un déséquilibre entre les apports et les dépenses énergétiques de l’individu et se caractérise par un excès de masse grasse corporelle et une altération de la qualité de vie conduisant à de nombreuses complications. Des altérations ostéo-articulaires résultent de la surcharge pondérale et de l’inflammation associées à cette obésité. La prise en charge des complications ostéo-articulaires, comme l’arthrose, passe souvent par l’utilisation de médicaments visant seulement à soulager les douleurs engendrées. Très peu de composés sont destinés à limiter la propagation des lésions, à l’exception de traitements chirurgicaux lourds et coûteux. Malgré une prévalence élevée de l’obésité, aussi bien chez les animaux de compagnie que chez l’Homme, et des nombreuses complications ostéo-articulaires qui en découlent, l’association d’un traitement à la vitamine D avec une supplémentation en acides gras Oméga-3 n’a jamais fait l’objet de travaux expérimentaux visant la prévention tertiaire des anomalies ostéo-articulaires liées à l’obésité. L’action préventive de la vitamine D et des acides gras Oméga-3 sera évaluée sur un modèle de rat Wistar soumis à un régime riche en gras. La vitamine D3 (cholécalciférol) sera incorporée dans l’alimentation (15 000 UI/kg). Les acides gras DHA et EPA seront administrés par voie orale (gavage). Ces traitements dureront 14 semaines et débuteront après une période de 14 semaines où ils seront soumis au régime seul. Tous les animaux seront hébergés dès leur réception dans l’animalerie Rongeurs du groupe II d’Oniris et subiront une période d’acclimatation de 7 jours avant le début des procédures. L’aliment et l’eau seront fournis ad libidum. Les rats seront âgés de 6-7 semaines au commencement de l’étude.
Bénéfices attendus
Ce projet pourrait permettre de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques afin de limiter et/ou prévenir les complications ostéo-articulaires associées à l’obésité chez le rat. À terme, l'étude pourrait déboucher sur de potentielles applications chez l'Homme ou chez les animaux de compagnie tels que les chiens et les chats. Ce projet pourrait également donner l'opportunité de mieux comprendre les mécanismes qui régissent la pathogenèse de l'arthrose. De plus, il pourrait mettre en lumière de nouveaux bénéfices de l'utilisation de la vitamine D et/ou des acides gras Oméga-3. Enfin, ces travaux pourraient permettre d'éclaircir le lien entre le microbiote et l'obésité ou les complications ostéo-articulaires et ainsi amener de nouveaux questionnements sur son rôle.
Procédures
Les animaux seront soumis à différentes interventions. Un gavage (environ 30 secondes par rat) sera effectué quotidiennement pendant les 14 dernières semaines du protocole expérimental. Le prélèvement de sang (environ 20 minutes par rat), le catwalk (environ 30 minutes par rat), le prélèvement de fèces (environ 1h par rat) et le test de tolérance au glucose (1h30 par rat) seront effectués en début, milieu et fin de protocole (0, 14, 28 semaines). Les animaux seront également soumis à des prélèvements d'organes (après 28 semaines) après leur anesthésie par injection intra-péritonéale du mélange kétamine (60 mg/kg) / médétomidine (150 μg/kg) puis euthanasie par exsanguination au niveau de l'aorte abdominale. Ces interventions concernent les 64 animaux sur une durée totale de 28 semaines.
Impact sur les animaux
Aucune nuisance ou effet indésirable n'est attendu sur les animaux du groupe avec le régime contrôle. Les animaux soumis au régime HFD vont développer une obésité avec des complications métaboliques et ostéoarticulaires qui seront l'objet de l'étude. Les traitements mis en oeuvre ont comme objectif d'atténuer les complications générées par l'obésité.
Devenir
Tous les animaux des lots étudiés sont concernés par l’euthanasie. Cette dernière est pratiquée par exsanguination au niveau de l’aorte abdominale après anesthésie par injection intra-péritonéale du mélange kétamine (60 mg/kg) / médétomidine (150 μg/kg). L'euthanasie est justifiée par les prélèvements d'organes qui serviront aux analyses histologiques, biochimiques et moélculaires.
Remplacement
Le remplacement des animaux n’est pas possible pour répondre aux questions du présent projet en raison de l’absence de méthodes alternatives (in silico ou in vitro) pour explorer un développement naturel des lésions ostéo-articulaires liées à l’obésité et des potentiels effets bénéfiques du traitement.
Réduction
De manière à respecter la règle de réduction, le nombre d’animaux par groupe a été réduit au minimum permettant d’anticiper les différences interindividuelles. Le nombre de 10 rats par groupe est nécessaire et suffisant pour obtenir des résultats reproductibles et exploitables et réaliser une analyse descriptive. Le nombre d'animaux a été calculé sur BiostaTGV en prenant l'estimation de la variation du taux de leptine avec ou sans traitement (delta de 35 avec écart-type de 24 à 5% d'erreur de première espèce et 0,93 de puissance) et donne 10 animaux par groupe expérimental.
Raffinement
- Un hébergement qui respecte les recommandations en vigueur, une animalerie contrôlée (température, hygrométrie) et un enrichissement des cages (des tunnels, des morceaux de bois, du Sizzle dry Kraft pour occuper chaque individu dans la cage). - Manipulation douce régulière des animaux pour habituation à l'expérimentateur. - Un suivi régulier des animaux par le personnel animalier (observation quotidienne de l’état général et du comportement, pesées hebdomadaires). - Définition des points limites et une grille de scoring de la souffrance et/ou de la douleur chez tous les animaux soumis aux différents traitements prévus dans le projet. - Optimisation des protocoles expérimentaux pour chaque procédure afin d’obtenir le maximum d’informations et ainsi une meilleure analyse des résultats obtenus.
Choix des espèces
L’obésité est une pathologie systémique caractérisée par des altérations multi-organiques et une inflammation de bas-grade qui peuvent déclencher des problèmes ostéo-articulaires comme étudié ici. La souche de rat Wistar est communément utilisée, selon la bibliographie, pour étudier les modifications métaboliques et ostéo-articulaires et répond très bien à l'utilisation d'un régime obésogène. L’utilisation de ce modèle permettra d’étudier la capacité de nos produits testés à prévenir le développement des problèmes ostéo-articulaires et son impact sur l'obésité. Les animaux sont utilisés à l’âge de 6-7 semaines.
Optimisation chez le rat (Rattus norvegicus) du produit d’intérêt FTP-101 dans le traitement des maladies de la contraction musculaire
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
654 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures classées de souffrance légère. Ils reçoivent une injection intramusculaire d'un myorelaxant candidat, puis sont soumis au test du "digit abduction score", où l'animal, tenu par le torse, est lâché en chute simulée pour observer l'écartement de ses doigts de pied. Le porteur décrit ce test comme "bref, indolore et peu stressant" et annonce des retombées pour les patients atteints de dystonie ou de spasticité. Il indique avoir tenté de réutiliser les animaux lors d'un projet précédent sans succès, ce qui le conduit à tous les tuer.
Objectifs
Nous démontrerons les bénéfices de nos produits face aux produits de référence utilisé en clinique. Ce projet expérimental d’optimisation concerne le produit d’intérêt FTP-101 identifié suite à nos travaux exploratoires. Cette étude a pour objectif d’optimiser les paramètres d’utilisation du candidat Lead (en particulier la formulation et la cinétique d’injection). Dans cette étude, le produit sera injecté localement aux rats, dans les membres postérieurs pour un suivi du « digit abduction score » (DAS). Cette procédure (injection et test DAS) est brève, indolore, et peu stressante pour les animaux. Notre produit sera comparé au traitement actuel de référence. La voie de développement choisie (d’abord la formulation, la dose, la cinétique d’injection puis la vérification de stabilité de la molécule) pour ce Lead suivra le même principe que celle utilisée pour le Lead FTP-501 à travers différentes demandes d’autorisation de projets (déjà validées par le CEEA)
Bénéfices attendus
Les troubles du mouvement sont des maladies neuromusculaires, qui handicapent durablement les patients et ont donc un impact sociétal important. La dystonie, par exemple, est un trouble qui se caractérise par des contractions musculaires involontaires, pouvant entrainer des mouvements répétitifs ou des postures figées. La spasticité musculaire, quant à elle, est considérée comme une sur-contraction inhabituelle et involontaire du ou des muscles. Ce trouble du système nerveux central résulte en une crispation et une rigidité accrue du muscle touché. Le traitement de ces maladies implique généralement la prescription de traitements administrés oralement : le baclofène, les benzodiazépines, le dantrolène… Ces traitements systémiques comportent cependant tous des effets secondaires conséquents. Alternativement, l’injection intramusculaire de certains produits directement dans le muscle affecté peut soulager ces malades : le phénol ou la toxine botulique. Cette approche présente des avantages devant celles présentées précédemment, notamment concernant les effets secondaires. Cette approche doit encore être optimisée : les patients et soignants attendent des myorelaxants offrant encore moins d’effets secondaires, capables d’être efficaces rapidement après l’injection, et dont les effets seraient durables. L’objectif de notre projet global est de mettre en évidence les effets bénéfiques de l’utilisation locale de différents produits myorelaxants novateurs à effet rapide et durable, sur la contraction musculaire pour les patients souffrant de troubles du mouvement comme la dystonie et la spasticité. Au cours d’une étude princeps, nous avons pu identifier au moins 5 produits présentant une activité myorelaxante d’intérêt ; ensuite, grâce aux différents projets déposés, nous avons avancé notre premier Lead (FTP-501) quasiment au terme de son développement préclinique. Chacun des produits identifiés au cours de l’étude princeps semble avoir des caractéristiques pharmacologiques différentes : certains induisent une myorelaxation très rapide (le cas de FTP-101 ici), et d’autres offrent un effet durable par exemple (le cas du premier Lead FTP-501). Or, selon la maladie neuromusculaire, le besoin clinique est différent, et donc chaque caractéristique est plus ou moins critique. Nous visons ainsi le développement de plusieurs produits, car nous envisageons la possibilité de positionner chacun des produits finaux pour le traitement de différentes maladies neuromusculaires.
Procédures
Les rats seront soumis à l’évaluation du digit abduction score (DAS) après injection intramusculaire des composés. Le DAS correspond à l’évaluation après injection, pour chaque animal, de la capacité à écarter leurs doigts de pied lorsque l’animal est soumis à une simulation de chute (ce reflexe est déclenché pour amortir un choc de réception). Le rat est maintenu par le torse par l’expérimentateur. L’expérimentateur lève alors le bras en l’air (le rat ayant sa face ventrale faisant face au sol), et le redescend relativement rapidement, pour simuler une chute ; il arrête bien sûr son geste avant le contact avec le support (par exemple, la paillasse). L’expérimentateur tourne alors l’animal afin d’observer les doigts de la patte postérieure, attribuant un score. Les degrés de DAS seront enregistrés sur une échelle allant de 0 à 4 (Voir schéma en annexe). La réponse DAS sera mesurée à 5, 15, 30 minutes, 1, 2,4, 8 et 24 heures après injection puis toutes les 24 heures tant qu’un DAS>0 est mesuré.
Impact sur les animaux
Dans le cadre de cette procédure, aucun signe clinique ni effets secondaires n’est attendu ici suite à l’injection des composés, d’après nos résultats obtenus dans l’étude princeps et la littérature. En effet lors de notre précédent projet, aucun signe clinique de type infection ou inflammation suite à l’injection n’a été observé. Dans le cadre de nos procédures, les nuisances attendus sont : le stress des animaux dû à la contention pour l’injection et le test du DAS ; une douleur à liée à l’injection i.m. Il est important de noter qu’une étude histo-pathologique sur la toxicité locale suite à une injection i.m. de notre composé a été préalablement réalisée et a permis de vérifier que notre composé ne modifie en rien la structure musculaire et qu’aucune lésion n’est présente.
Devenir
Tous les animaux des différentes procédures seront euthanasiés. En effet, il n’est malheureusement pas possible de les réutiliser dans une nouvelle série d’expériences. Nous avons testé cette possibilité lors du premier projet (APAFiS 18558), malheureusement sans succès. Il est possible que les animaux ayant subi une série d’expériences (suivi d’une période de repos) se soient accoutumés au test DAS, et répondent différemment des animaux naïfs ; le poids plus important des animaux ré-utilisés peut également impacter négativement la réponse au test DAS.
Remplacement
Le remplacement ne peut pas être assuré dans cette étape du programme de travail, car la pertinence des modèles cellulaires de coculture est aujourd’hui encore débattue, et de tels modèles ne prennent de toute façon pas en compte le paramètre de diffusion (qui est essentiel lorsqu’on s’intéresse au profil pharmacodynamique des composés). Le test DAS nous permet au contraire de mesurer l’activité myorelaxante tout en prenant en compte ce paramètre.
Réduction
Pour la réduction, les études précédemment réalisées nous ont donné un certain recul sur la taille des groupes nécessaire pour obtenir des résultats statistiquement significatifs (test de kruskal wallis); Nous utiliserons donc le nombre minimal d’animaux par groupe permettant d’arriver à une conclusion. Soit 6 animaux par groupe.
Raffinement
Concernant le raffinement, les animaux seront hébergés en groupe de 2 avec enrichissement du milieu, et surveillés quotidiennement permettant un suivi clinique de chaque animal. Ainsi, des points limites sont mis en place durant tout ce projet permettant de définir des critères d’arrêt si nécessaire . Nos études précédentes nous ont permis un raffinement du modèle DAS chez le rat : l’injection intramusculaire dans le membre inférieur est réalisée sous contention par un expérimentateur entraîné, et les mesures de DAS sont brèves, indolores et peu stressantes pour les animaux. Au cours de cette étude, nous souhaitons continuer à limiter au maximum le stress des animaux.
Choix des espèces
La comparaison de la rapidité d’action entre notre molécule et les traitements sur le marché ne pourra se faire que sur un modèle : i) exprimant les cibles moléculaires d’intérêt à la jonction neuromusculaire, et ii) dans lequel il existe une limite de diffusion dans les tissus. En effet, la cinétique des molécules après injection intra-musculaire est fortement dépendante de la capacité à diffuser dans le muscle, un tissu très compartimenté comportant plusieurs membranes internes. Or, bien qu’il existe des modèles in vitro qui permettent d’étudier la jonction neuromusculaire, la pertinence de ces modèles pour mimer la fonctionnalité de la jonction est débattue, et ils ne récapitulent pas les problématiques de diffusion qui se jouent in vivo. Le test DAS chez le rongeur, déjà éprouvé lors de notre étude princeps, est au contraire un test reconnu pour sa pertinence pour étudier les myorelaxants. Rats femelles Sprague Dawley femelles âgées de 6 semaines en début d’expérimentation (200g) et 10-12 semaines maximum en fin d’expérimentation (300g). Des animaux juvéniles seront choisis pour leur capacité à exhiber un réflexe lors des tests DAS. Les animaux âgés peuvent effectivement répondre de manière moins spontanée aux stimulations. Ils sont également plus légers, donc plus facile à stimuler