Souris
Rôle des interneurones de l’amygdale basolatérale dans les comportements émotionnels et anxieux
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système nerveux
Une chirurgie cérébrale d'une heure à deux heures trente, jusqu'à trois mois en habitat isolé pour protéger les implants, jusqu'à cinq jours de rationnement alimentaire : 1 344 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère, toutes tuées à l'issue pour contrôler la chirurgie. La plupart passent six tests comportementaux portant sur l'anxiété, la réaction à des événements positifs ou négatifs et la mémoire d'une situation menaçante, sans que le résumé les nomme. Le but est de comprendre le rôle de cellules régulatrices de l'amygdale dans la peur, une piste thérapeutique en psychiatrie n'étant évoquée qu'au conditionnel. Le porteur justifie le choix de l'espèce par l'existence de lignées de souris permettant de cibler ces cellules et par des tests "bien établis et largement validés chez cette espèce".
Objectifs
L’amygdale est une petite région du cerveau qui joue un rôle central dans nos émotions, en particulier la peur et l’anxiété. Elle nous aide à repérer ce qui est important pour nous — par exemple un danger — et à en garder le souvenir. Elle intervient aussi dans les expériences positives. Dans cette région, certaines cellules transmettent et stockent les informations. À côté d’elles se trouvent d’autres cellules, beaucoup moins nombreuses, qui agissent comme des régulateurs et coordonnent l’activité du réseau. Même si elles sont peu nombreuses, elles sont essentielles au bon fonctionnement de l’ensemble, jouent un rôle spécifique dans les comportements émotionnels et s’activent lors d’événements marquants, qu’ils soient positifs ou négatifs. Nous avons également montré que modifier leur activité au moment où un individu apprend à associer une situation à une menace peut renforcer le souvenir de cette expérience. Ce projet vise à mieux comprendre le rôle de ces cellules dans les réponses émotionnelles et anxieuses. Nous étudierons aussi l’influence d’un grand système de communication du cerveau impliqué dans la réponse aux événements importants, le système cholinergique. Ce système envoie de nombreux signaux vers l’amygdale et peut modifier l’activité des cellules que nous étudions. À terme, ce travail permettra de mieux comprendre comment de petits groupes de cellules du cerveau coordonnent nos réponses émotionnelles et façonnent nos souvenirs liés aux expériences marquantes.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de mieux comprendre comment certaines cellules spécialisées de l’amygdale participent à l’organisation des réponses émotionnelles, comme la peur ou l’anxiété. Nous chercherons à préciser comment ces cellules interagissent entre elles et comment elles influencent l’activité des autres cellules du cerveau lors de situations importantes sur le plan émotionnel. Ces résultats apporteront de nouvelles connaissances sur le fonctionnement des petits réseaux de cellules nerveuses dans l’amygdale. Comme ces types de cellules existent aussi dans d’autres régions du cerveau, les informations obtenues pourront améliorer plus largement notre compréhension du fonctionnement cérébral. À plus long terme, une meilleure connaissance de ces mécanismes pourrait aider à comprendre pourquoi les émotions deviennent excessives ou inadaptées dans certains troubles psychiatriques et contribuer à orienter le développement de nouvelles approches thérapeutiques.
Procédures
Tous les animaux utilisés seront soumis à des chirurgies cérébrales afin de moduler ou d'enregistrer l’activité de nos neurones. Toutes nos chirurgies dureront de 1h à 2h30 selon leur difficulté. Elles seront également toutes conduites sous anesthésie générale. Chaque souris ne sera soumise qu’à une seule chirurgie. Cela concernera toutes les souris du projet. Parmi ces souris, la plupart seront soumises à 6 tests comportementaux différents. Un petit nombre seront soumises, en plus de la chirurgie, à seulement 4 de ces tests comportementaux. De plus, ces souris seront soumises à une injection avant le début des tests. Cette injection sera réalisée un maximum de 7 fois, avec un temps de repos d’au moins 24h entre chaque injection. Enfin, un petit nombre de souris opérées seront soumises à 3 tests permettant d’évaluer les émotions associées à l'activité neuronale.
Impact sur les animaux
- Les chirurgies réalisées sur les animaux sont susceptibles d’occasionner un stress et une douleur de manière aigüe. Cela se traduit habituellement par une perte de poids sur quelques jours. - Une fois certaines chirurgies réalisées, les animaux sont maintenus en habitat isolé afin de garantir l’intégrité des implants, et ce pendant une durée maximum de trois mois. - Un stress accru pourra être observé sur les quelques jours suivant les tests comportementaux. - Les souris seront rationnées en aliment pendant un maximum de 5 jours, ce qui pourra donner lieu à une faible perte de poids.
Devenir
Toutes les souris du projet subissant des chirugies cérébrales, il sera indispensable de contrôler la qualité de ces chirurgies à la fin de chaque procédure pour analyses post-mortem complémentaires. Tous les animaux devront donc être mis à mort, après sédation préalable.
Remplacement
Le présent projet cherche à mieux comprendre le rôle de certains neurones dans le traitement des émotions, qu'il soit normal ou pathologique. Nous nous intéressons à leur rôle au niveau local mais également dans le fonctionnement global du cerveau et dans le comportement émotionnel des individus, c'est pourquoi le modèle animal est indispensable pour répondre à nos objectifs. Toutefois, des enregistrements électriques sur des cellules seules ainsi que des modèles informatiques simulant leurs interactions avec d’autres cellules seront menées en parallèle par nos collaborateurs. Ces travaux apporteront un éclairage précieux pour interpréter nos résultats expérimentaux et viendront compléter nos propres approches tout en limitant au maximum le recours au modèle animal.
Réduction
Le rythme des reproductions sera adapté aux besoins de l’étude afin d’éviter la naissance d’animaux surnuméraires. Le nombre d’animaux utilisé sera réduit à son minimum, en prenant en compte l’effectif nécessaire pour obtenir des résultats significatifs, déterminé grâce à un calculateur de puissance statistique, ainsi que le taux de réussite des procédures, évalué lors de précédentes expérimentations.
Raffinement
Tous les soins seront pris afin de limiter la douleur et le stress des souris au minimum. Le temps de maintien des souris en habitat isolé sera réduit à son minimum, et les souris auront néanmoins accès à des stimuli olfactifs, visuels et auditifs provenant d’autres cages (ventilation collective et cages transparentes). Les souris seront quotidiennement pesées et évaluées pendant un minimum de trois jours après la chirurgie. La douleur sera prise en charge par un traitement analgésique pendant et après la chirurgie , et l'analgésie sera poursuivie au besoin. Si des signes de mal-être sont observés en dehors de la période post-opératoire, les animaux seront placés en observation quotidienne afin d’alléger ce mal-être et de remédier à la cause sous-jacente, selon un arbre décisionnel défini. Tout signe de douleur sera pris en charge médicalement, jusqu’à amélioration de l’état de l’animal ou euthanasie si dépassement des points limites. Afin de diminuer le stress provoqué par les expérimentations, les animaux seront habitués à la manipulation et à la contention manuelle nécessaire à la connexion des différents équipements. Lorsque les paradigmes comportementaux nécessiteront un rationnement alimentaire, les animaux seront quotidiennement pesés à heure fixe afin de garantir que la perte de poids reste dans les limites imposées dans la procédure. Afin de maximiser le taux de réussite des procédures, un soin particulier sera mis dans l’optimisation des protocoles de chirurgies cérébrales.
Choix des espèces
Pour répondre à nos questions scientifiques, nous devons à la fois observer et modifier l’activité de certaines cellules, et étudier les conséquences sur le comportement. Nous évaluerons notamment des comportements liés à l’anxiété, à la réaction face à des événements positifs ou négatifs, ainsi qu’à la mémoire d’une situation menaçante. La souris est le modèle le plus adapté pour cette étude. Il existe des lignées de souris permettant d’identifier et de cibler précisément les types de cellules que nous souhaitons étudier. De plus, les tests comportementaux que nous voulons utiliser sont bien établis et largement validés chez cette espèce. Nous utiliserons de jeunes souris adultes âgées de 12 à 16 semaines. Notre projet ne portant pas sur une période particulière du développement, cet âge permet de travailler sur des animaux matures, ne présentant pas de fragilité spécifique, tout en limitant la durée d’élevage.
Evaluation sous-cutanée de la biocompatibilité et de la dégradation d’hydrogels injectables chez la souris C57BL/6 – MODIFICATION
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
Tuées entre vingt-quatre heures et douze mois après l'intervention, pour que les hydrogels et les tissus qui les entourent soient prélevés, 288 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Sous anesthésie gazeuse, chaque souris reçoit quatre implants sous la peau du dos, par injection ou, pour les formulations non injectables, par une incision refermée d'un point de suture. Le porteur affirme que l'utilisation d'une souris immunocompétente est "essentielle pour visualiser la réponse inflammatoire". Parmi les applications visées, il cite la régénération de l'os et du cartilage, et aussi "les comblements de rides et le remodelage corporel".
Objectifs
L'étude de la littérature et nos études préliminaires in vitro ont montré l’intérêt de l'utilisation d'hydrogels comme nouveaux biomatériaux pour l'ingénierie tissulaire. De nombreuses études soulignent désormais l’importance de développer des matériaux ayant une vitesse de dégradation adaptée, et l’importance de la capacité des cellules à interagir et/ou à remodeler ces matériaux pour régénérer des tissus. L'objectif de ce projet est d'étudier la biocompatibilité de nouvelles associations d'hydrogels pour l’ingénierie tissulaire en conditions physiologiques. Le système immunitaire joue en effet un rôle majeur dans la réponse de l'hôte dans le cadre des biomatériaux complexes. L'utilisation d'un modèle murin nous permettra de visualiser la réponse inflammatoire, paramètre majeur en vue d'une potentielle application chez l'Homme. Un deuxième objectif est d’étudier la vitesse à laquelle les hydrogels sont dégradés en conditions physiologiques.
Bénéfices attendus
Ce projet devrait permettre de comprendre l’influence de différentes formulations d’hydrogels sur les processus inflammatoires qui interviennent suite à l’implantation de ces matériaux, mais également sur les processus mis en jeu pour les dégrader. Ainsi, les résultats de cette étude devraient permettre de choisir des formulations d’hydrogels pertinentes pour des applications précises de médecine régénératrice, telles que la régénération de l’os et du cartilage mais également pour les comblements de rides et le remodelage corporel.
Procédures
Sous anesthésie gazeuse, le dos des souris sera tondu, désinfecté, puis les souris recevront chacune 4 injections/implantations en sous-cutané au niveau dorsal de nos formulations en conditions d’asepsie. Chaque injection sera très rapide, environ 10 secondes. Les souris seront ensuite surveillées jusqu’à leur réveil qui aura lieu environ 5/10 min après le début de l’anesthésie. Elles seront observées quotidiennement les 2 premiers jours suivant l’intervention, puis 2 fois par semaine ensuite par les expérimentateurs en plus de la surveillance quotidienne réalisée par le personnel de l’animalerie, afin de vérifier qu’elles ne présentent pas de signes de douleur ou d’infection au niveau du site d’injection. Les souris seront ensuite mises à mort 24 h, 72 h, 1 semaine, 4 semaines (modification) voir jusqu'à 12 mois après l’intervention. Les hydrogels et leurs tissus environnants seront ensuite explantés pour réaliser des analyses histologiques qui permettront d’évaluer la biocompatibilité et la vitesse de dégradation de ces biomatériaux.
Impact sur les animaux
L’injection sous-cutanée est un acte mini-invasif qui est déjà pratiqué par notre laboratoire depuis plusieurs années, et qui ne cause habituellement pas de douleur chez les animaux. MODIFICATION Une gêne due au point de suture pour les souris ayant reçu une formulation non injectable pourra être ressenti suite à l'intervention. Les souris peuvent également ressentir une gêne dû à l’emplacement des hydrogels au niveau dorsal mais rien qui n’altererait leur alimentation ou leurs déplacements au-delà de la simple gêne.
Devenir
Afin d’évaluer la vitesse de dégradation des matériaux et leur biocompatibilité, il est nécessaire de récupérer les matériaux ainsi que les tissus environnants. Pour cette raison, tous les animaux devront être mis à mort à l’issue de la procédure.
Remplacement
Des études préliminaires in vitro ont été réalisées pour simuler une dégradation enzymatique des hydrogels. Ces études ont permis de sélectionner un nombre limité de formulations pertinentes pour nos objectifs de contrôle de la dégradabilité. Pour ce qui est de la biocompatibilité, des études in vitro ont également été réalisées pour vérifier la compatibilité des cellules avec les différentes formulations. Le remplacement de l'animal pour cette expérimentation n’est toutefois pas réalisable car les processus inflammatoires et immunitaires sont complexes et font appel à des systèmes non modélisables in vitro.
Réduction
Quatre injections seront réalisées par animal, ce qui limite le nombre nécessaire de souris pour ces expérimentations. La réalisation de ces 4 injections a montré une très bonne tolérance dans les expérimentations précédentes réalisées au sein du laboratoire. Par ailleurs, plusieurs types d’analyses (analyses d’imagerie, histologie, immunohistochimie) seront réalisées sur un même échantillon pour répondre aux deux questions posées par cette étude en même temps, ce qui diminuera aussi le nombre d’animaux nécessaires. Nous réaliserons 8 injections par condition, ce qui nous permet depuis déjà de nombreuses années de mettre en évidence des résultats statistiquement différents, tout en limitant le nombre d’animaux utilisés.
Raffinement
Pour cette étude, nous avons choisi d'injecter les biomatériaux à l'aide d'une aiguille sous anesthésie gazeuse, ce qui permet de limiter le stress qui pourrait être causé par l’injection. De plus, l’injection est un procédé qui permet de limiter l'inflammation du site d'implantation, car c'est un acte mini-invasif. MODIFICATION - Pour les hydrogels non injectables avec une aiguille, une petite incision sera réalisée sous analgésie en pré et post-opératoire pour limiter toute douleur. Après l’intervention, Les souris seront observées par les expérimentateurs quotidiennement 48h après l’intervention, puis deux fois par semaine ensuite pour s'assurer de leur bien-être. Nous avons en effet mis en place des points limites adaptés, une grille de score et un arbre décisionnel nous permettant d’agir si le moindre signe de douleur venait à apparaître.
Choix des espèces
L'utilisation d'un modèle murin immunocompétent est essentielle pour visualiser la réponse inflammatoire, paramètre majeur en vue d'une potentielle application chez l'Homme. Les études seront réalisées avec des souris adultes, c'est-à-dire, âgées de 12 semaines. Cela correspond à de jeunes adultes avec une croissance terminée, une maturation sexuelle et un potentiel de régénération conservé.
Fonction des Retrovirus endogènes dans la tumorigénèse
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Pour savoir si un élément issu d'anciens virus intégrés au génome freine la croissance des tumeurs, 540 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Chacune reçoit une implantation de cellules tumorales, puis, pendant six semaines au plus, deux mesures de la tumeur et deux séances d'imagerie sous anesthésie par semaine, avec épilation de la zone. Le porteur indique que la tumeur peut provoquer une tension de la peau, une baisse de mobilité et une dissémination à d'autres tissus. Les souris sont mises à mort plus tôt en cas de tumeur trop volumineuse, d'ulcération, de perte de poids ou de douleur.
Objectifs
Certains éléments présents dans notre génome proviennent d’anciens virus intégrés au cours de l’évolution. Ces éléments sont généralement inactifs, mais certains peuvent encore produire des molécules capables d’influencer le comportement des cellules. Nos travaux suggèrent que l’un de ces éléments pourrait jouer un rôle protecteur en limitant certaines propriétés des cellules tumorales. L’objectif de ce projet est de déterminer si la restauration de cet élément dans des cellules tumorales modifie leur capacité à former une tumeur et à progresser dans un organisme vivant. Pour cela, des cellules tumorales de souris seront modifiées en laboratoire, puis implantées chez des souris. La croissance des tumeurs sera suivie au cours du temps par des mesures externes et par une méthode d’imagerie permettant de suivre les mêmes animaux de manière répétée. Ce projet permettra de mieux comprendre comment certains éléments anciens d’origine virale présents dans le génome peuvent influencer la progression tumorale et les interactions entre les cellules tumorales et leur environnement.
Bénéfices attendus
Ce projet pourrait permettre de mieux comprendre certains mécanismes biologiques qui influencent la croissance et la progression des tumeurs. En particulier, il vise à déterminer si certains éléments anciens d’origine virale présents dans le génome peuvent contribuer à limiter le développement tumoral. Les résultats attendus pourraient apporter de nouvelles connaissances sur les interactions entre les cellules tumorales et leur environnement dans l’organisme. À plus long terme, ces connaissances pourraient contribuer à identifier de nouvelles pistes de recherche pour mieux comprendre les mécanismes qui freinent ou favorisent la progression des cancers.
Procédures
Tous les animaux recevront une seule implantation de cellules tumorales, réalisée sous anesthésie brève. Cet acte durera environ 5 à 10 minutes par animal, incluant l’anesthésie, l’implantation des cellules et la surveillance immédiate du réveil. La croissance des tumeurs sera ensuite suivie deux fois par semaine pendant 6 semaines maximum. Ce suivi comprendra une mesure externe de la tumeur, d’une durée d’environ 1 à 2 minutes par animal. Les animaux seront également suivis par imagerie deux fois par semaine. Pour cette imagerie, ils recevront un agent permettant de visualiser les cellules tumorales, puis seront placés sous anesthésie brève pendant l’acquisition des images. La durée totale d’une session d’imagerie sera d’environ 30 minutes par animal, incluant l’administration de l’agent d’imagerie, l’anesthésie, l’acquisition des images et la surveillance du réveil. Une épilation locale pourra être réalisée afin d’améliorer la qualité de l’imagerie. Elle sera limitée à la zone nécessaire et ne sera renouvelée qu’en cas de repousse gênant l’acquisition du signal.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables attendus sont liés à l’implantation des cellules tumorales, aux manipulations répétées nécessaires au suivi, aux anesthésies brèves réalisées pour l’imagerie, ainsi qu’au développement de la tumeur. Les animaux pourront présenter une gêne transitoire au moment de l’implantation des cellules ou lors des manipulations. Le suivi par imagerie pourra entraîner un stress modéré lié à la contention, à l’anesthésie et aux manipulations répétées. Une irritation locale de la peau pourra également survenir après l’épilation limitée à la zone à imager. La croissance de la tumeur pourra provoquer une gêne locale, une tension de la peau, une masse palpable, une diminution de la mobilité selon la taille et la localisation de la tumeur, ou plus rarement une altération de l’état général. En cas de progression tumorale importante, une dissémination à d’autres tissus pourrait également contribuer à une dégradation de l’état général. Des critères d’arrêt précoces seront appliqués afin d’éviter toute souffrance excessive.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de l’expérimentation. Cette mise à mort est nécessaire car le projet repose soit sur le suivi complet de la croissance tumorale, soit sur le prélèvement des tumeurs et de certains tissus pour réaliser des analyses biologiques. Ces prélèvements permettront d’étudier les caractéristiques des tumeurs, leur organisation, leur activité moléculaire et leurs interactions avec leur environnement dans l’organisme. Les animaux ne pourront donc pas être réutilisés dans un autre projet. Les animaux seront mis à mort au plus tard 6 semaines après l’implantation des cellules tumorales, ou plus tôt pour les groupes destinés à des prélèvements à des temps définis. Ils seront également mis à mort avant la fin prévue de l’étude si des critères d’arrêt sont atteints, notamment en cas de tumeur trop volumineuse, d’ulcération, de perte de poids, de douleur, de gêne locomotrice ou d’altération importante de l’état général.
Remplacement
Avant d’envisager cette étude chez l’animal, les cellules tumorales sont étudiées en laboratoire afin de caractériser leurs propriétés et de sélectionner les conditions les plus pertinentes. Cependant, les cultures cellulaires ne permettent pas de reproduire toute la complexité d’un organisme vivant. En particulier, elles ne permettent pas d’étudier correctement la croissance d’une tumeur dans un tissu, ses échanges avec les cellules environnantes, son accès aux nutriments, ni ses interactions avec le système immunitaire. Ces éléments sont pourtant essentiels pour comprendre comment une tumeur se développe et progresse dans l’organisme. Il n’existe donc pas, pour cette question, de méthode alternative permettant de remplacer complètement l’utilisation d’animaux. Le recours à la souris est nécessaire pour valider les observations obtenues en laboratoire dans un contexte biologique complet.
Réduction
Le nombre d’animaux a été limité au minimum nécessaire pour obtenir des résultats interprétables, tout en évitant l’utilisation d’effectifs excessifs. Les groupes ont été dimensionnés afin de comparer plusieurs types de cellules tumorales et de tenir compte de la variabilité naturelle de la croissance des tumeurs. La croissance tumorale sera suivie plusieurs fois chez les mêmes animaux, grâce à des mesures externes et à une méthode d’imagerie répétée au cours du temps. Cette approche permet de réduire le nombre d’animaux, car elle évite de constituer de nouveaux groupes uniquement pour suivre l’évolution des tumeurs à chaque étape. Une première série d’animaux permettra de définir les moments les plus pertinents pour les prélèvements biologiques. Cette stratégie évite de multiplier inutilement les temps d’analyse dans la seconde série et limite ainsi le nombre total d’animaux utilisés.
Raffinement
Les animaux seront habitués à la manipulation avant le début de l’expérience afin de réduire leur stress. Les actes susceptibles d’être inconfortables seront réalisés sous anesthésie brève, avec protection systématique des yeux pendant l’anesthésie. Après chaque anesthésie, les animaux seront surveillés jusqu’à récupération d’un comportement normal, puis replacés dans leur cage d’origine. La croissance tumorale sera suivie régulièrement pendant 6 semaines maximum, ou jusqu’à l’atteinte d’un critère d’arrêt. L’état général des animaux, leur poids, leur mobilité, leur alimentation, l’aspect de leur pelage et l’aspect de la tumeur seront contrôlés tout au long de l’étude. Des critères d’arrêt précoces seront appliqués afin d’éviter toute souffrance excessive. En cas de perte de poids modérée ou de diminution de l’alimentation, une aide alimentaire sera mise en place. Si l’état de l’animal se dégrade ou si un critère d’arrêt est atteint, l’animal sera mis à mort.
Choix des espèces
La souris a été choisie car elle permet d’étudier le développement d’une tumeur dans un organisme vivant complet. Ce modèle permet de prendre en compte des éléments qui ne peuvent pas être correctement reproduits en culture cellulaire, comme l’organisation des tissus, les interactions entre la tumeur et les cellules environnantes, l’accès aux nutriments et les interactions avec le système immunitaire. Les cellules utilisées dans ce projet sont des cellules de souris. Les implanter chez des souris permet donc d’étudier leur comportement dans un environnement biologique adapté, sans introduire de différence d’espèce qui pourrait fausser l’interprétation des résultats. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte jeune, à partir de 6 semaines. À cet âge, les souris sont sevrées, suffisamment développées pour permettre des manipulations reproductibles et disposent d’un système immunitaire fonctionnel. L’utilisation d’animaux plus jeunes serait moins adaptée en raison de leur développement encore en cours, de leur plus petite taille et de la difficulté accrue des manipulations répétées. Les animaux seront suivis pendant 6 semaines maximum après l’implantation des cellules tumorales, ou jusqu’à l’atteinte d’un critère d’arrêt.
Optimisation d’approches de thérapie génique pour la maladie de Charcot- Marie-Tooth
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
224 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélever leurs tissus, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Sous brève anesthésie, elles reçoivent une injection de virus AAV dans la région lombaire ou dans la veine de la queue, puis passent trois séries de tests : rotarod et analyse de la démarche pour la locomotion, filament de Von Frey appuyé avec une force croissante sur la patte pour la sensibilité, et des électrodes sous la peau mesurent la conduction nerveuse. Dans la seconde étude, des souris porteuses de mutations reproduisant deux formes de la maladie de Charcot-Marie-Tooth sont suivies jusqu'à six mois ou un an, l'effet thérapeutique restant à démontrer. Le porteur indique que des neurones dérivés de cellules de patients existent, mais affirme qu'ils ne permettent pas d'évaluer la toxicité "à l'échelle d'un organisme entier".
Objectifs
La maladie de Charcot Marie Tooth (CMT) est une maladie génétique touchant le système nerveux périphérique. Les patients souffrant de CMT présentent une faiblesse et atrophie musculaire prédominante aux membres inférieurs, ce qui entraine une difficulté pour se mouvoir et pour les formes de CMT les plus sévères, la nécessité d'un fauteuil roulant. Contrairement à la maladie de Charcot (ou sclérose latérale amyotrophique), la CMT ne réduit pas l’espérance de vie des patients, mais affecte fortement leur qualité de vie. Cette maladie est incurable et nécessite de trouver des thérapies. Dans le laboratoire nous étudions deux formes de CMT liés à deux gènes mutés différents: la forme CMT2A et la CMT4H . La CMT étant une maladie génétique, il est pertinent de mettre au point des thérapie génique visant à apporter un gène médicament pour corriger le gène muté grâce à virus rendu inoffensif appelé AAV. Cependant, bien que prometteurs pour la mise en place de futurs traitements, nous devons améliorer nos outils AAV et techniques d’injection afin de développer une thérapie ciblée, efficace et plus sûre permettant de cibler soit les motoneurones de la moelle épinière soit les cellules de Schwann des nerfs périphériques et d'éviter le ciblage d'organes tels que le foie qui peut s'avérer toxique. Ce projet vise à tester de nouveaux AAV récemment optimisés pour assurer une bonne expression dans le système nerveux et aucune dans le foie. Une fois ces AAV et modes d’injection optimisés chez des souris sauvages, nous testerons l’effet bénéfique de surexpression de gènes médicaments dans nos modèles CMT.
Bénéfices attendus
L'ensemble de ce projet nous permettra ainsi de mettre au point de nouveaux outils et technologie permettant d’améliorer les approches de thérapie génique actuelles notamment de réduire les risques au moyen de vecteurs viraux plus spécifiques. Enfin ce projet a pour but de déterminer si ces traitements ont un effet bénéfique pour améliorer la pathologie CMT. A plus long terme ces approches pourront être mise en place pour d'autres formes de CMT liées à d'autres gènes mutés.
Procédures
Les animaux seront soumis à : une injection au niveau lombaire ou dans la veine de la queue. Ces interventions sont de courte durée (de l'ordre de 2-5 minutes); des tests de comportement permettant la mesure de la locomotion et de la sensibilité des pattes (maximum 15 minutes par animal pour chaque test) . Chaque test sera réalisé sur deux jours (entrainement et test) en incluant des moments de récupération pour les animaux entre chaque essais ( 5 minutes) et entre chaque test (au moins deux jours). A la fin de l'expérience, les animaux seront euthanasiés.
Impact sur les animaux
Les animaux subiront à l’âge adulte des injections de virus AAV à visée thérapeutique soit par voie intrathécale lombaire soit par voie intraveineuse. Ces deux types d’injections se feront sous courte anesthésie gazeuse (isoflurane, 2-5 minutes maximum) et suite à une injection d'un anti douleur en amont. Les injections seront réalisées au moyen de fines seringues à insuline. En se basant sur notre expérience, ces injections entrainent peu d'effets indésirables et les animaux récupèrent très bien en quelques minutes. Néanmoins, elles peuvent très rarement induire une inflammation locale ou légères irritations et ainsi un léger inconfort qui sera surveillé dans les jours suivants l’intervention selon la grille de score et traitée le cas échéant. Au cours du traitement, les animaux subiront trois tests comportementaux à trois temps (avant, pendant et à la fin du traitement). Les tests permettant de mesurer la locomotion et démarche (rotarod et gait), entrainent peu d’inconfort aux souris. Le test VonFrey, qui a pour but d’analyser la réponse sensitive, entraîne un inconfort de courte durée suite à l’exposition à un filament de 0.5 mm qui vient exercer des forces croissantes sur la patte de la souris. Dans le cas de la mesure des vitesses de conduction nerveuse qui nécessite l’utilisation de petites électrodes que l’on insère en sous cutanée, les souris seront sous anesthésie gazeuse (10 minutes maximum).
Devenir
mise à mort et récupération des tissus
Remplacement
Il est difficile d'accéder aux cellules de patients du système nerveux périphériques (neurones moteurs et sensitifs et cellules de Schwann). Les neurones moteurs et sensitifs de patients peuvent être différentiés à partir de cellules pluripotentes humaines induites et constituer ainsi un modèle humain de la pathologie CMT pour les formes axonales. Néanmoins cela ne permet pas d'évaluer les risques de toxicité à l'échelle d'un organisme entier. Nos données préliminaires ont déjà montré un effet bénéfique d’approches de thérapie génique sur notre modèle in vivo de la CMT2A. Néanmoins notre type d’AAV actuel ne permet pas une spécificité totale du ciblage des motoneurones et nécessite des doses conséquentes. Afin de promouvoir la thérapie génique comme une option thérapeutique valable pour la CMT et son utilisation en clinique chez l’homme, nous avons besoin de développer des outils et des méthodes d’injections avec un profil de sécurité augmenté, ce qui passe par la spécificité de ciblage et la réduction des doses injectées.
Réduction
Le nombre d'animaux a été limité au minimum nécessaire : n= 10 animaux par groupe pour l'étude 1 et n=16 pour l’étude 2 pour mettre en évidence un effet significatif sur des paramètres de locomotion et de sensibilité en se basant sur nos travaux précédents et à l'aide de tests statistiques. Au total nous utiliserons 224 animaux répartis de la manière suivante : 80 animaux pour l’étape 1 nécessaire pour identifier le meilleur outil AAV et mode d'injections, 144 animaux pour établir la preuve de concept de plusieurs AAV thérapeutiques dans la CMT2A et CMT4H pour l’étape 2.
Raffinement
Nous nous assurerons de diminuer le stress des souris en les manipulant en coupe ou en tunnel. Nous optimisons l’enrichissement des animaux au moyen de maison en craft et petites buchettes. Afin d’optimiser le bien-être de nos animaux, nous avons opté pour une méthode d’identification couplée au prélèvement pour génotypage afin de réduire la douleur et le stress des animaux. Toutes les procédures de traitements sont réalisées sous analgésie et anesthésie profonde avec une couverture anti-douleur adaptée pour que l’animal ne ressente aucun signe d’inconfort. Des points limites et une grille de score ont été définis et seront appliqués pour suivre le bien-être des animaux au cours des expériences.
Choix des espèces
La souris reste un des modèles les plus aisés à modifier génétiquement et proche de l'homme (99% des gènes sont homologues). Elle est l'espèce la plus utilisée pour modéliser des maladies neuromusculaires telles que la CMT. Elles développent la plupart du temps des anomalies observées chez l'homme et ont permis de mieux comprendre les mécanismes cellulaires sous-jacents à ces pathologies. Dans notre cas, les lignées utilisées pour la CMT2A et la CMT4H reproduisent une partie des anomalies histologiques et comportementales observés chez ces patients telles qu'une dénervation musculaire (CMT2A), des défauts de myéline (CMT4H) et des défauts locomoteurs tardifs détectés uniquement en conditions de test rotarod et qui ne s’aggravent pas avec le temps. L’espérance de vie des souris n’est pas réduite, également comme observée chez les patients. Pour l’étude 1, les injections seront réalisées sur des souris sauvages âgés de 8 semaines. Les animaux injectés seront mis à mort 1 mois après, ce qui est le temps minimal permettant d’observer l’expression du transgène de l’AAV. Pour l’étude 2, les traitements seront réalisés à 4.5 mois (proche du début des symptômes). La moitié des souris sera suivie jusqu’à 6 mois afin de déterminer l’effet thérapeutique dès le déclenchement des symptômes, l’autre moitié sera suivie jusqu’à un an afin d’évaluer l’effet thérapeutique à long terme.
Evaluation de thérapies anti-cancéreuses sur des modèles de tumeurs greffées dans le pancréas.
- Recherche appliquée
- Cancers
Rats : 300
Tous tués à l'issue, 1 500 rongeurs, 1 200 souris et 300 rats, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour tester des anticancéreux sur des tumeurs greffées dans le pancréas. Une partie subit une irradiation totale du corps avant la chirurgie qui implante la tumeur, puis jusqu'à quatre administrations par jour et des prises de sang répétées à la jugulaire, à la saphène ou à la queue. La tumeur peut provoquer une occlusion intestinale, un envahissement de l'abdomen et de l'ascite, et le gavage, rarement, une détresse respiratoire jusqu'à la mort. Le porteur juge le statut immunodéprimé de ces rongeurs "indispensable" à la greffe de cellules tumorales humaines, et ne donne aucune raison à leur mise à mort, annoncée en une phrase de quatre mots.
Objectifs
Au niveau mondial, il a été constaté une forte augmentation de l’incidence du cancer du fait du vieillissement de la population et de facteurs environnementaux qui se dégradent. Le cancer du pancréas, bien que ne représentant que 2.6% des diagnostics chaque année, est le sixième plus mortel et présente un très fort taux de mortalité (plus de 490 786 décès en 2024 pour environ 531 318 nouveaux cas) selon l’organisation mondiale de la santé (WHO). L’objectif de ce projet est d’utiliser des modèles de cancer pancréatiques, les plus prédictifs possible, en condition orthotopique (présentant l’avantage d’inclure le microenvironnement tumoral aux études) afin de refléter la pathologie cancéreuse humaine et de pouvoir évaluer des nouveaux médicaments pour traiter ces tumeurs pancréatiques chez l’humain. Pour cela, nous étudierons ces nouveaux médicaments, seuls ou en combinaison, dans un contexte pathologique le plus proche possible de l’homme afin d’arriver, avant les essais cliniques chez l’humain, à établir une évaluation de l’efficacité des molécules destinées à traiter les cancers chez l’Homme. Grace à ces modèles de cancer, une évaluation de la pharmacocinétique et de la biodistribution des traitements pourra aussi être réalisée en plus de l’évaluation de l’efficacité antitumorale.
Bénéfices attendus
Le cancer du pancréas est le onzième cancer le plus diagnostiqué mais il est le sixième en termes de mortalité. Cette maladie très meurtrière nécessite donc un développement important de nouvelles stratégies pour la prise en charge des patients. Cela nécessite l’établissement de nouveaux modèles précliniques plus prédictifs afin de pouvoir transposer l’utilisation de ces molécules chez l’homme. Environ 90% des tumeurs pancréatiques présente une mutation dans le gène KRAS. L’essor récent des inhibiteurs de KRAS en clinique ouvre de nouveaux espoirs dans la prise en charge de cette maladie. Cependant, des mécanismes de résistance se développent et nécessitent d’être compris afin d’adopter des stratégies pour surpasser ces phénomènes de résistance. Dans ce contexte, le développement de nouveaux modèles précliniques, tout particulièrement orthotopiques, est incontournable pour le développement de futures molécules en préclinique puis en clinique chez les patients. L’animal représente un système d’essai physiologiquement proche de l’homme, permettant d’évaluer l’efficacité, la toxicité, la pharmacocinétique et la pharmacodynamique de composés afin d’éviter ces essais directement chez l’homme. Les études précliniques sur l’animal permettront d’étudier les mécanismes de résistance après des traitements avec de nouvelles molécules ou des molécules déjà utilisées en clinique et de développer de nouvelles stratégies pour contourner ces phénomènes de résistance. Grâce à ces études dans un environnement adapté, il sera aussi possible de suivre la réaction du système immunitaire de l’hôte face à la progression de la maladie dans le but de stimuler le système immunitaire contre le cancer. Cela pourrait permettre d’évaluer des immunothérapies dans le cancer du pancréas ce qui n’est pour le moment pas une pratique clinique approuvée.
Procédures
Différents types d’interventions sont prévus: • Irradiation totale avant induction tumorale: nécessite le transport des animaux et leur déplacement temporaire (1 à 2 fois par étude ; inférieur à 4h) • Induction tumorale : sous anesthésie générale (1 fois, chirurgie inférieure à 30 min). • Imagerie non invasive (sous anesthésie pour une durée maximale d’1 heure. • Traitements par différentes voies d’administration (limité à 4 administrations par jour) : o Orale sur animaux vigiles (moins d’1 min) o Sous-cutanée sur animal anesthésié (moins de 5 min) ou vigile (moins d’1 min) o Intramusculaire sur animal anesthésié (moins de 5 min) ou vigile (moins d’1 min) o Intrapéritonéale sur animal anesthésié (moins de 5 min) ou vigile (moins d’1 min) o Intraveineuse sur animal anesthésié (moins de 5 min) ou vigile (moins d’1 min) • Prélèvements sanguins effectués par voies : o Jugulaire (3 prélèvements par jugulaire/jours) (moins d’1 min) o Saphène (3 prélèvements par coté sur 24h) (moins d’3 min) o Caudale (2 prélèvements / 24h), (moins d’1 min) • Volume tumoral évalué par palpation des tumeurs nécessitant la contention des animaux (inférieur à 30 secondes) • Prélèvements d’urine réalisés en hébergeant individuellement les animaux moins d’une heure ou par légère pression sur le ventre sous contention.
Impact sur les animaux
En cas d’irradiation, le transport peut engendrer un stress modéré pendant quelques heures (moins de 4h). La greffe tumorale peut engendrer une douleur et un stress modérés sur 1-2j. Lors de l’induction tumorale, un risque de phase septique à la réalisation des sutures est possible pouvant entrainer des douleurs abdominales et un stress pendant 3-4 jours. L’évolution de la tumeur peut entraîner une douleur généralement modérée (d’intensité variable selon chaque individu), une gêne, une occlusion intestinale, un envahissement de la cavité abdominale, de l’ascite et une perte de poids. Au cours d’une étude, les animaux seront manipulés. Les mesures de poids et de volume tumoral peuvent entraîner un faible stress qui diminue avec l’habituation. Le jour de la randomisation, les animaux seront potentiellement mis avec de nouveaux congénères. Cela peut engendrer un stress de 1-2j. Des effets locaux liés aux voies d’administration des traitements par piqûre peuvent survenir. Selon la voie utilisée, ce peut être : irritation / inflammation / œdème / rougeur / sensibilité / douleur transitoire / hématome ou plus rarement nécrose / une ulcération. Lors d’un gavage oral, une irritation de la cavité buccale, de l’œsophage ou de l’estomac, peut être observée. L’intensité de ces effets dépend de la dose administrée, du composé et de la fréquence. Les administrations répétées peuvent entraîner un stress cumulatif, généralement limité à la durée de la phase expérimentale. Le gavage oral peut provoquer un stress aigu temporaire et, rarement, une détresse respiratoire voir le décès de l’animal. Les administrations répétées peuvent majorer ce stress sur plusieurs jours à plusieurs semaines. Les prélèvements sanguins, peuvent induire une gêne ou une douleur légère de courte durée au point de prélèvement. Des prélèvements répétés peuvent entraîner un stress cumulatif et un impact physiologique limité. Les prélèvements d’urine et de fèces sont considérés comme peu invasifs et associés à un stress modéré lié à l’isolement temporaire. Les prélèvements terminaux réalisés sous anesthésie comportent un risque anesthésique ponctuel limité à la durée de l’intervention. Les procédures seront réalisées dans des conditions contrôlées, avec une surveillance adaptée, l’application de points limites précoces et des mesures visant à réduire la douleur, la détresse et toute souffrance inutile.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés.
Remplacement
Les méthodes alternatives ne permettent pas, à ce jour, de prévoir l’efficacité in vivo de potentiels candidats-médicaments, car les étapes nécessaires au développement d’un médicament, pour lesquelles il est nécessaire d’étudier les interactions du médicament dans un contexte global, ne peuvent pas être étudiées dans un système alternatif (in vitro par exemple). Des méthodes alternatives de reconstruction d’organes ou de tumeurs en 3D sont utilisées mais ne sont pas suffisantes.
Réduction
Dans chaque étude, les animaux seront répartis en groupes expérimentaux selon le(s) critère(s) défini(s) (volume tumoral et/ou poids). Le nombre de groupes contrôles sera ajusté à la question scientifique posée et des paramètres étudiés. Les variations de ces paramètres et de la mortalité entre les groupes contrôles et traités seront comparées pour évaluer les composés testés. La validité scientifique nécessite d’utiliser un nombre minimum d’animaux par groupe pour que les tests statistiques soient valides et représentatifs d’éventuelles variations inter-individuelles. Il est estimé que 40 études seront réalisées sur 5 ans. Le nombre d’animaux par groupe est choisi sur la base des précédentes études réalisées dans nos laboratoires pour les modèles connus (en général 6 à 10 animaux) afin de sélectionner le nombre d’animaux minimum pour observer des différences significatives sur les paramètres d’intérêt (en général mortalité et volume tumoral). Pour réduire le nombre d’animaux utilisés dans ces procédures, il sera toujours proposé d’utiliser des biomarqueurs et des techniques faiblement invasives d’imagerie chez le petit animal pour remplacer des analyses terminales en cours d’étude.
Raffinement
Les animaux seront pesés minimum 2 fois par semaine. Le volume tumoral sera estimé, minimum 2 fois par semaine par palpation ou 1 fois par semaine par imagerie. Ces fréquences seront adaptées en fonction de l’état général des animaux. Un gel nutritif sera placé au fond de toutes les cages dès que la perte de poids sera supérieure à 10%. De l’enrichissement sera utilisé dans toutes les cages. La greffe de tumeur sera réalisée sous anesthésie générale gazeuse avec administration préalable d’un analgésique opiacé. L’implantation de la greffe nécessitera l’incision de la peau, la chirurgie sera réalisée de façon aseptique et les animaux recevront une injection d’anti inflammatoire non stéroïdien en préopératoire ainsi que le lendemain, des soins opératoires (maintien de la température), surveillance post opératoire et soins post opératoires adaptés si nécessaires. Toutes les procédures invasives et la plupart des procédures peu invasives, seront réalisées sous anesthésie générale par des techniciens formés dont les compétences ont été validées. Les administrations/prélèvements seront réalisés sous anesthésie sauf si la contention génère moins de stress (prélèvement d’urine) ou si l’anesthésie n’est pas possible (administration orale). Les administrations douloureuses (intramusculaire et intradermique) seront réalisées avec analgésie préalable (opiacés). Ces administrations/prélèvements seront effectués en suivant les recommandations vétérinaires et du comité d’éthique. Les principaux points limites concernent l’état général de l’animal et sont listés en détail dans les procédures. Si l’un des signes cliniques liés aux points limites est observé, l’animal sera mis en observation et un traitement sera mis en place si possible. Il sera toujours proposé d’utiliser des biomarqueurs et des techniques faiblement invasives d’imagerie permettant d’atteindre l’objectif de l’étude plus tôt et de sortir l’animal de la procédure.
Choix des espèces
Les petits rongeurs, (souris et rats) ont été choisis en raison de leurs caractéristiques physiologiques bien documentées et de leur utilisation largement reconnue en recherche préclinique. De plus ce sont les seules espèces animales disponibles pour l’expérimentation présentant un statut immunodéprimé (avec des mutations spontanées ou génétiquement modifiées) indispensable à l’implantation de cellules tumorales humaines dans le cadre de la recherche en oncologie. Également, diverses souches de souris et rats immunocompétents sont disponibles pour l’établissement de modèles tumoraux syngéniques. Les rats et les souris autorisent une variété de techniques d’administration, de prélèvement et de chirurgie présentant des analogies avec ce qui peut être réalisé en recherche clinique chez l’humain. Les animaux utilisés dans le cadre de ce projet seront des animaux adultes ou ayant atteint un stade de développement compatible avec les procédures expérimentales, avec une première manipulation réalisée à partir de 7 semaines d’âge. Des animaux adultes seront utilisés afin qu’ils aient leur poids et leur morphologie adulte pour faciliter l’induction tumorale. Les animaux adultes pourront mieux supporter les effets de la chirurgie, les effets secondaires des composés à tester et les effets du développement tumoral.
Effets de l’alimentation paternelle sur les pathologies de la grossesse, la santé de la mère et celle de la descendance, chez la souris 1/2
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
- Troubles urogénitaux
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système urogénital
Pour savoir si l'alimentation d'un père obèse nuit à la grossesse et à la santé de sa descendance, 2 344 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, toutes tuées à l'issue pour prélever leurs organes. Des mâles sont nourris jusqu'à 120 jours d'un régime riche en graisses et en sucres qui leur fait prendre 20 à 25 % de poids et les rend résistants à l'insuline, et des femelles gestantes sont immobilisées chaque jour de la gestation et anesthésiées jusqu'à trois fois. Certaines souris passent jusqu'à deux fois seize jours isolées, dont huit en cage métabolique, et subissent un jeûne de 24 heures. Le porteur annonce des points limites "stricts et spécifiques au projet" sans en décrire un seul.
Objectifs
Certaines pathologies de la grossesse ont des conséquences immédiates sur la santé de la mère et de l’enfant, mais aussi à long terme sur leur santé métabolique, cardiaque et/ou neurologique. Des études récentes suggèrent que l’obésité paternelle peut modifier le contenu des spermatozoïdes. Ces modifications pourraient être transmises à l’embryon et favoriser l’apparition de complications pendant la grossesse, avec un impact sur la santé de la mère et des enfants. Ce projet vise à comprendre comment l’alimentation du père peut affecter la qualité de ses spermatozoïdes, la grossesse et la santé des mères et des enfants, à court et long terme. Il se déroulera dans 2 établissements utilisateurs.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de mieux comprendre les mécanismes par lesquels l’obésité du père augmente le risque de complications pendant la grossesse, et peut affecter la santé des mères et des enfants à court et long terme. Il permettra peut-être d’identifier des marqueurs dans le sperme, le placenta et l’embryon/fœtus, associés à des issues défavorables de la grossesse. Ces résultats pourraient contribuer à améliorer la santé maternelle et infantile, en développant des stratégies de prévention pour les familles à risque, voire des cibles thérapeutiques. L’obésité etant un problème de santé publique mondial, ce projet aura des répercussions importantes
Procédures
Interventions réalisées dans l'EU1: - Prélèvement sur animaux une seule fois (durée 10 secondes) - Prélèvements sanguins sur animaux 3 à 6 fois (durée 10 secondes par prélèvement). - Deux injections sur animaux (durée de chaque injection 30 secondes maximum). Interventions réalisées dans l'EU2: - Anesthésie des femelles gestantes. Fréquence : 3 fois sur toute la grossesse (durée 5 minutes). - Contention d’animaux (durée 10 minutes maximum), 5 fois avant la gestation puis tous les jours pendant la gestation. - Contention d’animaux (durée : 2 minutes). Fréquence : toutes les 2 semaines pendant 17 semaines, ou mensuellement pendant 6 mois. - Anesthésie. Fréquence : maximum 3 fois. (durée : 20 minutes par session). – Une injection. (durée 30 secondes maximum). - Mesure du métabolisme énergétique en cage individuelle. Fréquence maximum : 2 fois. (durée : 8 jours consécutifs, précédés d’une semaine d’individualisation). –Mise à jeun. Fréquence : 1 fois. (durée maximale 24h). Interventions réalisées dans EU1 et EU2 : – Mise sous régime riche en lipides et glucides. (durée maximale : 120 jours).- Gavage sur animaux, une à deux fois (durée 30 secondes). - Injection sur animaux une ou deux fois (durée 30 secondes).
Impact sur les animaux
Les injections, les prélèvements, l’administration orale, les prélèvements sanguins et l’anesthésie générale causent un stress et une douleur légère de courte durée. La contention, lors de la mesure de la tension artérielle et lors de l'imagerie, ainsi que le transfert des animaux d’un établissement à l’autre causent un stress de courte durée. L’anesthésie peut causer une hypothermie et une désorientation au réveil de courte durée. La mise sous régime riche en lipides et glucides entraîne prise de poids (20–25 %) et une hyperglycémie à jeun, une intolérance au glucose et une résistance à l’insuline. L'ingestion de glucose et l'injection d'insuline entraînent respectivement une hyperglycémie et une hypoglycémie qui sont transitoires sur une période de 2h. L’individualisation cause un stress modéré lié à l’hébergement individuel (2 x 16 jours maximum) de type comportemental par absence de contacts tactiles.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à l'issu de la dernière procédure pour collecte d'organes et analyses
Remplacement
Pour certaines études biochimiques et moléculaires, des lignées cellulaires seront utilisées. Dans le cadre de ce projet, il n’est pas possible de contourner l’utilisation de modèles animaux car il n'existe pas à ce jour d’approches alternatives permettant d’étudier l’impact de régimes alimentaires sur la reproduction masculine. L’impact du régime alimentaire paternel sur la grossesse ne peut également se faire que grâce à l’utilisation d’un modèle animal mammifère, comme la souris, pour que les résultats soient transférables à l’espèce humaine. D'une manière générale, les pathologies de la grossesse sont difficiles à étudier chez l’humain car il est éthiquement impossible d’exposer des femmes enceintes à des traitements expérimentaux.
Réduction
Les effectifs sont déterminés et les résultats analysés avec des tests statistiques adaptés. Les procédures ont été consciencieusement élaborés afin d’utiliser le moins d’animaux possible tout en permettant d’obtenir des résultats statistiquement satisfaisants.
Raffinement
Les animaux sont maintenus dans des groupes de plusieurs individus dans un environnement enrichi. Lors de l'anesthésie, les animaux seront maintenus sur un tapis chauffant pour éviter l’hypothermie. L’état général des animaux sera suivi quotidiennement par le personnel qualifié de l'animalerie. Tout état anormal sera communiqué aux responsables du projet. Des points limites stricts et spécifiques au projet ont été mis en place.
Choix des espèces
La souris est un modèle de choix pour étudier la physiologie, grâce à sa population homogène et à ses similitudes avec la physiologie humaine, ce qui permet une extrapolation des résultats obtenus. Elle est largement utilisée pour simuler des pathologies humaines et mener des études précliniques. La conservation génétique entre la souris et l’homme en fait un modèle privilégié pour étudier la reproduction et le métabolisme. L'utilisation de souris transgéniques permettra de modéliser les complications de la grossesse en produisant certains symptômes (i.e. hypertension gestationnelle et protéinurie) qui ne sont pas fréquemment observés chez la souris. Des souris femelles et mâles à différents temps de développement et à l’âge adulte seront nécessaires à cette étude, afin de comprendre les effets à court et long terme d’un régime paternel obésogène.
Démonstration de l’existence in vivo du modèle de transport Sushi-go-round-MODIFICATION
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
196 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, et toutes celles opérées sont tuées pour prélever leur cerveau. Avant quatre jours de vie, les souriceaux reçoivent une injection de virus dans le cerveau, séparés de leur mère jusqu'à deux heures, puis une seconde injection cérébrale de trente à quarante-cinq minutes entre 24 et 28 jours. Le projet vise à démontrer chez un mammifère un mode de transport des vésicules dans les neurones, surnommé "Sushi-go-round", et ses retombées sur les maladies du système nerveux restent au conditionnel. Le porteur désigne le "cannibalisme maternel" comme le "plus gros problème" de ses procédures, et le résumé ne dit pas ce que deviennent les mères.
Objectifs
Comment les cellules du cerveau (les neurones) peuvent-elles réagir si rapidement aux signaux, alors qu'il faut parfois des minutes, voire des heures, pour que les molécules voyagent d’une cellule à l’autre? Grâce à l’utilisation de techniques in vitro et à la modélisation mathématique, nous avons découvert un nouveau mode de transport cellulaire expliquant comment le signal se transmet de façon rapide et efficace le long des connections cérébrales. Ces résultats, obtenus in vitro sur culture cellulaire de neurones, nécessitent maintenant d’être validés in vivo afin de démontrer la pertinence physiologique de ce nouveau mécanisme dans le cerveau de mammifère. Pour cela, nous proposons d’exprimer une molécule fluorescente dans le cerveau de souris adultes qui sera transportée le long des connections cérébrales. Nous bloquerons ensuite le mécanisme de transport en injectant un inhibiteur que nous avons identifié. Nous analyserons ensuite la localisation de la molécule fluorescente après fixation des tranches de cerveau. Si le nouveau mode de transport que nous avons découvert existe in vivo, nous devrions observer une accumulation de la molécule fluorescente au niveau des points de contact avec les neurones cibles. Ces travaux permettront ainsi de démontrer comment les neurones gèrent leur communication pour la transmission rapide et efficace du signal à travers le cerveau.
Bénéfices attendus
Le transport des vésicules dans les neurones est un processus essentiel qui permet de déplacer des protéines importantes du corps cellulaire vers les zones de communication entre les neurones, appelées synapses. Dans une étude précédente, nous avons découvert un nouveau mode de transport que nous avons surnommé "Sushi-go-round", qui joue un rôle dans la régulation de ces communications. Ce projet va nous permettre de prouver l'exitence de ce mode de transport chez les mammifères, ce qui nous aidera à mieux comprendre comment les neurones communiquent et s'adaptent. Ces découvertes pourraient avoir des implications majeures en neurosciences, en nous aidant à mieux saisir le fonctionnement du cerveau et en ouvrant de nouvelles voies pour comprendre les maladies qui affectent le système nerveux.
Procédures
Dans cette étude, des souris, qui n'ont même pas encore quatre jours de vie, vont recevoir une injection de virus dans une zone du cerveau. Cette opération dure entre 10 et 20 minutes. Pendant ce temps, les souriceaux seront séparés de leur mère pour un maximum de deux heures. Ensuite, quand ils seront âgés entre 24 et 28 jours (après sevrage), ils subiront une autre injection dans une autre partie précise de leur cerveau. Cette deuxième opération prendra un peu plus de temps, entre 30 et 45 minutes. Après un temps défini dans l’étape 0 du projet, les animaux seront mis à mort pour récupérer les cerveaux pour analyse.
Impact sur les animaux
- stress : Les souris nouveau-nés (P0-P4) et leurs mères seront séparés momentanément (120min maximum) donc cela engendrera du stress. -anesthésie : risque de déshydratation, dépression cardio-vasculaire et respiratoire, hypothermie. Après l’injection des nouveaux nés, un suivi de l’animal sera mis en place tous les jours pendant une semaine pour vérifier l’apparition de signes de souffrance (peau de couleur bleutée, vocalisation, changement de la respiration abdominale). Concernant les animaux sous chirurgie, un suivi postopératoire sera également mis en place pendant les 4h de traitement (Agité ou très immobile, vocalisation ou automutilation, Augmentation de la fréquence et de la respiration abdominale), jusqu’à leur mise à mort. Un traitement analgésique en sous cutané sera utilisé en présence de signes de souffrance.
Devenir
Tous les animaux ayant subis une chirurgie seront mis à mort pour les prélèvements.
Remplacement
Ce projet s'inscrit dans la continuité d'une recherche précédente qui a été réalisée dans notre laboratoire, où nous avons découvert un nouveau moyen par lequel les cellules nerveuses peuvent communiquer rapidement entre elles. . Ces résultats proviennent d’analyse à partir de culture de cellules de souris. Maintenant, nous devons vérifier si ce même processus se produit dans un organisme vivant, la souris. C'est pourquoi nous ne pouvons pas nous passer de ce modèle animal pour nos prochaines étapes de recherche.
Réduction
Pour réaliser nos expériences, nous devons déterminer combien de souris nous avons besoin. Cette décision est basée sur des études précédentes, ce qui nous aide à garantir que nos résultats seront fiables et reproductibles. Nous avons prévu d'utiliser 15 souris par groupe pour certaines analyses, en incluant à la fois des mâles et des femelles. Pour une autre partie de notre étude, qui concerne l'activité électrique des neurones, nous utiliserons 10 souris par groupe. De plus, afin de réduire le nombre de souris nécessaires tout en assurant que nos résultats soient cohérents, nous allons d'abord tester les paramètres d'injection des virus. Cela nous permettra d'optimiser nos méthodes avant de commencer les expériences principales.
Raffinement
Lors de la chirurgie, les souriceaux sont anesthésiés et ils reçoivent une injection d'analgésique. Nous veillons à ce que les animaux soient en contact avec de la litière provenant de leur cage d'origine afin qu'ils soient en présence d'odeurs familières. Le plus gros problème rencontré dans nos procédures est le cannibalisme maternel. Afin de diminuer au maximum ce phénomène, nous mettons en place plusieurs actions : 1- seules les femelles qui ne présentent pas de signes de stress sont utilisées 2- nous favorisons l'utilisation de femelles non primipares 3- une grande quantité de matériel de nidification est fournie 4- les femelles ne sont manipulées qu'avec des tunnels 5- deux à trois fois par semaine pendant la gestation, nous fournissons quelques friandises ou du gel nourrissant aux femelles afin qu'elles associent notre intervention à quelque chose de positif. La croissance pondérale est le principal marqueur de bonne santé chez les nouveau-nés puisqu'elle indique que l'individu arrive à se nourrir et que la mère s'occupe bien de lui. Ainsi tout individu qui présente une croissance pondérale altérée est, selon le degré, suivi de plus près (point limite) ou euthanasié (point d'arrêt).
Choix des espèces
Compte tenu du degré de similarité anatomique et cellulaire important entre le cerveau de souris et le cerveau humain, la souris est un modèle de choix pour étudier le rôle du transport axonal. Nous utiliserons des souris C57/BL6J. Les injections seront réalisées à deux stades de développements : 1/ Cerveau immature : injection de virus avant les 4 jours de vie du souriceaux 2/ Cerveau mature : injection après 21 à 24 jours de latence (après expression du virus) d'un inhibiteur du transport, pour visualiser l'accumulation de vésicules ( petites sacs) au niveau des prolongements des cellules nerveuses qui se trouve dans la zone du cerveau qui relie les deux hémisphères.
Efficacité de biothérapies administrées par les voies aériennes dans un modèle murin de transmission du virus Influenza
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
3 060 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à sévère, toutes tuées à l'issue, et celles infectées par la grippe traversent la maladie sans antalgique ni anti-inflammatoire, ces traitements étant, selon le porteur, "susceptibles de modifier la réponse inflammatoire". Le virus est inoculé par le nez sous anesthésie à une partie d'entre elles, qui doivent le transmettre à d'autres souris, et 1 200 reçoivent une biothérapie par voie nasale, trachéale ou intraveineuse. L'infection peut provoquer une perte de poids, une prostration et une gêne respiratoire. Une souris est tuée par dislocation cervicale sous anesthésie quand elle perd plus de 25 % de son poids ou atteint le score clinique maximal de 7, qui inclut des difficultés respiratoires.
Objectifs
Les infections respiratoires sont responsables de plus de trois millions de décès chaque année dans le monde. Les infections d'origine virale constituent un défi majeur en raison de la dérive génétique continue des virus, qui favorise l'émergence de nouveaux variants et réduit progressivement l'efficacité des traitements antiviraux et des vaccins disponibles. À l'heure actuelle, la majorité des biothérapies est administrée par voie intraveineuse (i.v.). Cette voie d'administration est toutefois peu adaptée au traitement des infections pulmonaires, les biomédicaments diffusant faiblement vers le territoire respiratoire après administration systémique. Seule une faible fraction des molécules administrées par voie intraveineuse atteint les poumons. Depuis plusieurs années, les travaux précliniques menés au CEPR démontrent l'intérêt de l'administration par inhalation pour améliorer l'index thérapeutique de ces biothérapies. Cette voie est déjà largement utilisée en pratique clinique pour l'administration de bronchodilatateurs et de corticoïdes dans le traitement des pathologies respiratoires. L'administration de biothérapies par inhalation permet un ciblage direct du médicament au niveau pulmonaire sous forme d'aérosol. Dans le contexte des infections respiratoires, cette approche devrait permettre une action plus rapide, une concentration élevée du médicament au plus près du site de réplication virale et une limitation de l'exposition systémique, réduisant ainsi le risque d'effets indésirables. Les travaux du CEPR ont montré que le procédé d'aérosolisation, associé à l'utilisation de nébuliseurs adaptés et de formulations spécifiques, permettait d'administrer des biothérapies tout en préservant leurs propriétés physicochimiques et biologiques. Ils ont également démontré qu'une biothérapie dirigée contre des bactéries ou des virus responsables de pneumonies atteignait les poumons en quantité significativement supérieure après administration par inhalation qu'après administration intraveineuse, avec une amélioration concomitante de son efficacité thérapeutique. Dans ce contexte, le présent projet a pour objectifs : 1_développer et optimiser un modèle murin robuste de transmission du virus influenza. 2_utiliser ce modèle pour évaluer différentes stratégies thérapeutiques et caractériser les réponses immunitaires associées
Bénéfices attendus
Ce projet, fondé sur des données précliniques solides, vise à développer des stratégies thérapeutiques inhalées destinées à limiter la dissémination des agents pathogènes respiratoires et à mieux comprendre les mécanismes immunitaires associés à leur efficacité. Les connaissances acquises, combinées à celles générées par les autres volets du programme Inhealation, constitueront une base scientifique pour le développement de futures études translationnelles et la conception d'essais cliniques. Le développement d'un modèle murin reproductible de transmission du virus influenza constituera également un outil préclinique permettant d'évaluer de futures stratégies thérapeutiques ou vaccinales destinées à limiter la transmission des virus respiratoires. Les approches évaluées dans ce projet ciblent les infections respiratoires virales touchant les voies aériennes supérieures et/ou inférieures, notamment celles associées à des pneumonies. Ces infections représentent un enjeu majeur de santé publique en raison de leur fréquence, de leur impact en termes de morbidité et de mortalité, ainsi que des coûts humains, sociaux et économiques qui leur sont associés. L'administration inhalée de biothérapies pourrait constituer une stratégie permettant d'améliorer leur efficacité locale tout en limitant l'exposition systémique. Au-delà du virus influenza, les connaissances acquises sur les modalités d'administration, les réponses immunitaires induites et les mécanismes de protection pourront être transposées à d'autres infections respiratoires, notamment celles causées par le virus respiratoire syncytial ou le SARS-CoV-2. Les biothérapies sont déjà utilisées en clinique dans de nombreuses indications. Ce projet vise à optimiser leur administration dans le traitement des infections respiratoires en privilégiant la voie inhalée, qui permet un dépôt direct du médicament au niveau du site d'infection. Cette stratégie pourrait améliorer l'efficacité des traitements tout en contribuant à limiter la transmission des virus respiratoires. Enfin, l'administration par inhalation présente l'avantage d'être une approche non invasive permettant de délivrer rapidement les biothérapies directement au niveau des voies respiratoires, principal site de réplication des virus ciblé.
Procédures
_Infection par voie intranasale : sous anesthésie générale, 1560, 760 ou 1160 animaux, 1 fois _Administration des biothérapies par voie intranasale petit volume: sous anesthésie générale, 300 animaux, 1 fois __Administration des biothérapies par voie intranasale grand volume: sous anesthésie générale, 300 animaux, 1 fois _Administration des biothérapies par voie oro-trachéale : sous anesthésie générale, 300 animaux, 1 fois _Administration des des biothérapies par voie intraveineuse : sous anesthésie générale, 300 animaux, 1 fois
Impact sur les animaux
Des données préliminaires obtenues au laboratoire ont permis d'identifier des doses de biothérapies ne présentant pas de toxicité apparente chez la souris. Les expérimentations prévues seront donc réalisées uniquement avec ces doses. L'infection expérimentale par le virus influenza est susceptible d'entraîner une altération transitoire de l'état général des animaux, caractérisée notamment par une perte de poids, une diminution de l'activité, un pelage ébouriffé, une réduction de la prise alimentaire ou hydrique ainsi qu'une gêne respiratoire liée à l'inflammation des voies aériennes. L'intensité de ces signes cliniques dépendra de l'évolution de l'infection. L'administration d'antalgiques ou d'anti-inflammatoires ne pourra pas être envisagée au cours de l'évolution de la maladie, ces traitements étant susceptibles de modifier la réponse inflammatoire et immunitaire induite par l'infection ainsi que l'évaluation de l'efficacité des stratégies thérapeutiques étudiées. Les animaux feront l'objet d'une surveillance clinique quotidienne, voire biquotidienne si leur état le justifie. Les paramètres suivants seront évalués : (i) perte de poids, (ii) altération de l'état général et des comportements physiologiques (prostration, diminution ou absence de prise alimentaire et hydrique, pelage ébouriffé), et (iii) apparition de signes cliniques évocateurs d'une aggravation de l'infection (yeux mi-clos, difficultés respiratoires, sibilances ou autres signes de détresse). Ces observations seront intégrées à un score clinique standardisé compris entre 0 et 7. Des points limites précoces ont été définis afin de prévenir toute souffrance excessive. Tout animal présentant une perte de poids supérieure à 25 % de son poids initial ou atteignant un score clinique de 7 sera immédiatement euthanasié par dislocation cervicale après anesthésie générale à l'isoflurane (4 %).
Devenir
Les objectifs de ce projet sont (i) de développer et valider un modèle murin de transmission du virus influenza et (ii) de caractériser les réponses immunitaires induites par des biothérapies inhalées afin d'améliorer leur développement préclinique et leur transposition vers la clinique. Dans la première procédure, les animaux seront euthanasiés afin d'évaluer les paramètres nécessaires à la caractérisation du modèle de transmission, notamment la charge virale dans les voies respiratoires et les tissus cibles. Dans la seconde procédure, l'euthanasie permettra la réalisation de prélèvements terminaux (lavages nasaux et broncho-alvéolaires, poumons, ganglions drainants, rate et autres tissus d'intérêt) indispensables à l'étude de la charge virale, des populations immunitaires et des médiateurs de l'inflammation. Par ailleurs, les animaux auront été infectés expérimentalement par le virus influenza et ne pourront, pour des raisons sanitaires et scientifiques, être réutilisés ou replacés. En conséquence, l'ensemble des animaux sera euthanasié à l'issue de chaque procédure afin de permettre la réalisation des analyses prévues et d'atteindre les objectifs du projet.
Remplacement
À ce jour, aucune méthode in vitro ou ex vivo ne permet de reproduire l'ensemble des mécanismes impliqués dans les infections respiratoires virales, notamment les interactions complexes entre le virus, les différents compartiments du système immunitaire et les tissus de l'appareil respiratoire. Un des objectifs principaux de ce projet est d'étudier la transmission naturelle d'un virus respiratoire entre individus. À ce jour, aucun modèle alternatif ne permet de reproduire ce phénomène biologique complexe., ne peuvent pas être modélisés de manière pertinente à l'aide de systèmes cellulaires. Par ailleurs, ce projet vise à évaluer l'efficacité de biothérapies administrées directement dans les voies aériennes. L'étude de leur distribution pulmonaire, de leur activité biologique, de leur impact sur la transmission virale ainsi que des réponses immunitaires locales et systémiques qu'elles induisent nécessite l'utilisation d'un organisme entier. Le modèle murin d'infection par le virus influenza est largement décrit et validé dans la littérature comme modèle préclinique des infections respiratoires virales. Il permet de reproduire les principales caractéristiques de l'infection ainsi que les réponses immunitaires associées. Enfin, la disponibilité de nombreux outils génétiques et immunologiques chez la souris constitue un atout majeur pour caractériser les mécanismes impliqués dans la protection induite par les biothérapies et les immunomodulateurs
Réduction
Le nombre d'animaux utilisés est optimisé en réalisant un maximum d'analyses sur chaque animal. Les prélèvements permettront notamment d'évaluer les populations immunitaires, les cytokines, l'expression génique, l'histologie ainsi que la charge virale, maximisant ainsi les informations obtenues à partir de chaque individu. Le modèle murin d'infection par le virus influenza est maîtrisé par l'équipe et le porteur du projet, ce qui limite les phases de mise au point expérimentale. De plus, de nombreuses données préliminaires sont déjà disponibles, permettant de restreindre le nombre de souches virales, de doses de biothérapies et de temps d'analyse à évaluer. Les expériences sont organisées de manière à mutualiser les groupes témoins lorsque cela est scientifiquement justifié, afin d'éviter toute répétition inutile. Une première procédure est spécifiquement dédiée au développement et à l'optimisation du modèle de transmission. Cette étape permettra de sélectionner les conditions expérimentales les plus pertinentes avant l'évaluation des biothérapies et contribuera ainsi à réduire le nombre d'animaux nécessaires aux études d'efficacité. Les effectifs ont été déterminés à partir de calculs de puissance statistique (voir Annexe). Pour la procédure 1, la différence attendue de charge virale entre les souris index et les souris contact est estimée à 4,5 avec un écart-type de 1,9 (données de la littérature). Pour la procédure 2, la différence attendue entre les souris traitées et les souris non traitées est estimée à 1,5 avec un écart-type de 0,9 (données de la littérature). Dans les deux cas, en considérant un risque α de 5 % et une puissance statistique minimale de 80 %, la taille d'échantillon calculée est de cinq animaux par groupe. E nfin, un lot limité d'animaux est prévu pour le tutorat des intervenants afin de garantir la maîtrise des gestes techniques avant la réalisation des procédures expérimentales. Cette formation, assurée par le Dr Thomas Sécher, membre de la Structure chargée du Bien-Être Animal (SCBEA) et tuteur validé par la PSTA, contribue à limiter les échecs expérimentaux et la répétition de manipulations.
Raffinement
Les animaux seront hébergés en groupes sociaux dans des cages enrichies (papier absorbant et fragments de boîtes à œufs), conformément aux recommandations en vigueur. Une période d'acclimatation sera respectée avant le début des expérimentations afin de limiter le stress lié au changement d'environnement. Les procédures expérimentales seront réalisées par du personnel qualifié ou en cours de formation sous tutorat, afin de garantir la maîtrise des gestes techniques et de limiter le stress ainsi que les manipulations inutiles. Notamment, les administrations par voie respiratoire seront réalisées sous anesthésie générale à l'isoflurane afin de limiter le stress des animaux et de garantir la qualité du geste technique. Tout au long des expérimentations, les animaux feront l'objet d'une surveillance clinique pluriquotidienne assurée conjointement par les animaliers et les expérimentateurs, permettant de détecter précocement toute altération de leur état de santé et l'atteinte des points limites définis dans les procédures expérimentales (section 4.2). Une vigilance particulière sera maintenue durant les quatorze jours suivant l'infection, période correspondant au développement des signes cliniques. Afin de limiter les conséquences de l'infection sur l'état général des animaux, de la nourriture humidifiée (gel alimentaire) sera mise à disposition de manière préventive directement dans les cages afin de faciliter l'accès à l'eau et à l'alimentation des animaux présentant une diminution de leur mobilité ou de leur prise alimentaire. Tout animal atteignant un point limite sera immédiatement pris en charge conformément aux critères d'arrêt définis dans le projet.
Choix des espèces
La souris (Balb/cJRj) constitue le modèle préclinique de référence pour l'étude des infections expérimentales par le virus influenza. Elle permet de reproduire les principales caractéristiques de l'infection respiratoire ainsi que les réponses immunitaires induites au niveau des voies aériennes. De plus, des modèles murins de transmission du virus influenza sont largement décrits dans la littérature (Edenborough et al. J Virol, 2012 / Price et al. J Virol, 2014) et constituent une approche pertinente pour étudier les mécanismes impliqués dans la dissémination virale et leur inhibition par des stratégies thérapeutiques. L'utilisation d'un modèle animal est indispensable pour ce projet. Les réponses immunitaires des voies respiratoires reposent sur des interactions complexes entre les différents compartiments anatomiques (cavités nasales, voies aériennes et poumons), les cellules immunitaires innées et adaptatives, ainsi que le contexte inflammatoire induit par l'infection. Ces mécanismes ne peuvent pas être reproduits de manière satisfaisante par des approches in vitro ou ex vivo. En outre, l'évaluation de la transmission virale entre individus ainsi que de son inhibition par des biothérapies nécessite un organisme entier. La souris offre également un large éventail d'outils expérimentaux permettant une caractérisation fine des mécanismes immunitaires impliqués dans la protection contre la transmission virale. Les techniques disponibles au laboratoire (cytométrie en flux, microscopie confocale, analyses multiplex des cytokines, biologie moléculaire et histologie), ainsi que l'accès à de nombreux modèles transgéniques si nécessaire, permettent d'exploiter pleinement les prélèvements réalisés sur chaque animal et de maximiser les informations obtenues.
Impact des fongicides sur le neurodéveloppement avant sevrage
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Exposés aux fongicides dans l'utérus puis par le lait maternel, les souriceaux de ce projet sont tués à 21 jours d'âge, encore allaités. 108 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, sans que le résumé distingue les mères des petits. Les femelles gestantes sont gavées une fois par jour pendant sept semaines, avec un risque d'irritation de l'œsophage, puis subissent une prise de sang à l'éveil. Toutes sont tuées pour analyser leurs tissus, une partie par une "chirurgie terminale sous anesthésie profonde" dont le résumé ne décrit pas le geste.
Objectifs
Ce projet cherche à comprendre comment l’exposition à des fongicides (utilisés dans le milieu agricole) pendant la grossesse pourrait affecter le développement du cerveau des descendants et les différents organes des mères. Pour cela, nous utiliserons des femelles gestantes et leurs descendants et nous étudierons les modifications biologiques observées dans les zones du cerveau concernées lors du développement sous l’exposition aux fongicides durant la lactation.
Bénéfices attendus
L'objectif est de comprendre comment l'exposition à ces fongicides peut causer des problèmes de développement cérébrale dans un modèle murin qui reproduit/mime fidèlement les effets potentiels chez l'Homme. Ces résultats pourraient permettre d'améliorer les tests de sécurité avant que ces fongicides ne soient commercialisés.
Procédures
Des femelles gestantes seront soumises à des gavages pendant 7 semaines (30 secondes par gavage 1 fois par jour). Dans le cadre de cette procédure, un prélèvement de sang sera réalisé en fin de procédure avant l’euthanasie. Ce geste dure environ une minute. Certains animaux subiront une chirurgie terminale sous anesthésie profonde sans réveil : Réalisée une seule fois en fin de protocole. Durée totale de la procédure de l'injection d'anesthésique au prélèvement des tissus : environ 30 minutes par animal.
Impact sur les animaux
Le gavage par contention peut entrainer un léger stress et une irritation de l'œsophage. Le prélèvement sanguin sera réalisé sur un animal vigile, ce qui pourrait induire un stress. L'anesthésie générale réalisée en vue de la chirurgie terminale sans réveil peut induire un stress passager et une hypothermie de courte durée avant la perte de conscience. À l'issue de l'étude une partie des animaux sont mis à mort par chirurgie terminale sous anesthésie profonde.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés en fin de procédure afin de collecter les tissus pour des analyses histologiques et moléculaires.
Remplacement
Le projet vise à évaluer l'impact d'une exposition périnatale à un fongicide sur le développement embryonnaire et neurodéveloppemental. Ceci n'est modélisable que dans un organisme complet à même d'exprimer l'ensemble des fonctions physiologiques de régulations. Il n'existe actuellement pas de méthode alternative pour modéliser les analyses effectuées dans ce projet. Bien que des études aient été réalisées au préalable dans d’autres modèles animaux (poisson zèbre, xénope, ver C. elegans), le modèle murin est idéal pour étudier l’impact d’un fongicide sur le neurodéveloppement chez les mammifères en raison de leur similarité biologique avec l’humain et de leur développement rapide.
Réduction
Le nombre d'animaux par groupe expérimental a été déterminé au fur et à mesure de notre expérience. Nous avons ainsi effectué des analyses permettant de déterminer la puissance statistique des paramètres mesurés et avons conclu que cet effectif de 10 par groupe constitue un bon compromis entre puissance d'analyse et réduction du nombre d'animaux utilisés. Durant cette étude, nous allons générer des données qui seront analysées à l'aide de tests statistiques.
Raffinement
Afin d'améliorer le bien-être animal au cours de notre étude, les besoins physiologiques des animaux seront respectés (nourriture ad libitum, cages propres, nids d'enrichissement, stabulation en groupe), ce qui permettra de réduire le stress et de limiter au maximum la souffrance animale. Une surveillance quotidienne de l'état des animaux, deux pesées hebdomadaires pour les animaux expérimentaux ainsi que la mise en place d'un suivi régulier de l'état général des animaux, seront mis en place afin de s'assurer de la bonne santé de ceux-ci. Des points limites adaptés ainsi qu'un arbre décisionnel d'arrêt des souffrances a été mis en place. Dans la cadre d’un prélèvement de sang, les dispositions suivantes seront prises pour améliorer la récupération : un temps de récupération sur plaque chauffante, une injection de NaCl 0,9% (sérum physiologique) chauffé à la température de 37°C du volume équivalent au volume de sang prélevé sera réalisée.
Choix des espèces
Les souris sont un modèle idéal pour étudier l’impact d’un fongicide sur le neurodéveloppement en raison de leur similarité biologique avec l’humain et de leur développement rapide. Leur homogénéité génétique permet des résultats fiables, et leur utilisation facilite le contrôle des expositions à différentes phases critiques. De plus, elles offrent des réponses physiologiques pertinentes pour évaluer la toxicité. Les animaux seront traités lors de la gestation et de la lactation via la mère. Les souris issues de cette gestation seront prélevées à 21 jours d'âges. A cette phase, les animaux sont toujours exposés aux fongicides via la lactation.
Etude de l’effet d’activateurs du canal sodique musculaire sensible au voltage sur la faiblesse musculaire
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
72 souris, mutantes pour le canal sodique musculaire ou témoins, vont être utilisées dans des procédures menées sous anesthésie, toutes tuées avant tout réveil. Après une injection d'analgésique à l'éveil, chacune est anesthésiée, incisée aux deux pattes arrière et injectée dans un muscle de chaque patte avec des peptides tirés de venins, puis maintenue endormie trente minutes avant d'être tuée pour disséquer ces muscles. La force se mesure ensuite sur muscle isolé, en vue de molécules candidates contre des myopathies congénitales. Le porteur juge "nécessaire de les injecter en intramusculaire avant la mise à mort" parce que ces peptides, trop gros, pénètrent mal dans un muscle déjà disséqué.
Objectifs
L'objectif du projet est de tester si 3 molécules peptidiques issues de venins d’animaux et synthétisées en laboratoire, augmentent la force développée par des muscles squelettiques isolés de souris (protocoles dits « ex vivo »). Nous avons montré que ces molécules augmentent l'activité du canal sodique musculaire dans des cellules en culture. Or, l'activité de ce canal régule l'intensité de la force développée par les muscles : plus il est actif, plus la force musculaire est importante. Nous souhaitons déterminer si ces 3 molécules sont capables d’augmenter la force musculaire. Malheureusement, les molécules peptidiques pénètrent très peu dans le muscle lorsqu'elles sont mises dans le milieu dans lequel un muscle disséqué baigne, ceci à cause de leur grande taille. Il est donc nécessaire de les injecter en intramusculaire avant la mise à mort de l’animal pour améliorer leur diffusion intramusculaire et réduire le risque de faux négatifs lorsque nous devons mesurer la force développée par un muscle isolé de souris en présence de ces molécules.
Bénéfices attendus
Le canal sodique musculaire est une protéine indispensable à la contraction musculaire chez les mammifères. Une forte réduction de son activité d’origine génétique cause chez l'homme des myopathies congénitales avec perte de force (faiblesse) musculaire invalidante voire mortelle à la naissance de type myopathique. Aucun traitement n'existe pour améliorer ces myopathies. Nous avons établi une lignée de souris mutée pour ce canal. Les muscles des souris avec moitié moins de canal sodique sont faibles comparés aux muscles de souris contrôles lorsqu’on mesure la force qu’ils développent ex vivo. Réaliser ce projet déterminera si les 3 molécules peptidiques identifiées, qui activent le canal sodique dans des cellules, sont capables d’améliorer la faiblesse des muscles de souris ayant moitié moins de canal sodique comparés aux muscles de souris contrôles. Nous espérons ainsi identifier des molécules thérapeutiques candidates contre les myopathies causées par une forte réduction d’activité du canal sodique musculaire.
Procédures
Une procédure chirurgicale sans réveil d'1h30 est prévue. Chaque animal aura une injection sous-cutanée d'un analgésique à l’état vigile (5 min). Il sera anesthésié 30 min après cette injection (anesthésie gazeuse, 10 min induction). Une incision de la peau des 2 pattes arrière et une injection intramusculaire dans un muscle de chaque patte arrière seront effectuées sous anesthésie (15 minutes). L'animal sera maintenu anesthésié pendant 30 min après l’injection intramusculaire puis mis à mort pour dissection des muscles injectés.
Impact sur les animaux
L’injection sous-cutanée d'un analgésique à l’état vigile peut engendrer un stress. L'injection intramusculaire et les molécules injectées peuvent avoir des effets douloureux locaux. Les molécules injectées pourraient avoir des effets sur le système cardiaque ou respiratoire si elles pénètrent dans la circulation générale sanguine en trop grande quantité.
Devenir
Nous devons mettre à mort les animaux pour disséquer les muscles injectés et mesurer la force qu'ils développent en réponse à des stimulations électriques directement appliquées sur le muscle.
Remplacement
Nous étudions l'effet des molécules peptidiques testées sur le canal sodique musculaire dans des cultures cellulaires pour remplacer les animaux. Ces études nous permettent de déterminer quelles sont les molécules les plus intéressantes à étudier. Différentes doses par molécule sont étudiées en culture, ce qui nous permet de définir une dose à utiliser in vivo et donc de réduire le nombre d'animaux à utiliser. Néammoins, ces modèles cellulaires ne sont pas des cellules musculaires, et ne peuvent pas se contracter. Des modèles de culture de cellules musculaires existent, mais ils correspondent à des cellules musculaires en début de développement qui se contractent de manière anarchique et non contrôlée contrairement aux cellules musculaires adultes fonctionnelles. L'organisation des cellules musculaires in vitro ne reproduit pas aujourd'hui l'alignement des cellules musculaires composant un muscle. Leur contraction asynchrone ne permet pas de développer une force suffisamment robuste pour être mesurée de manière reproductible. Enfin, les modèles musculaires en culture expriment en forte quantité un second canal sodique sensible au voltage dont la présence faussera les résultats observés. C'est la raison pour laquelle nous avons recours aux animaux afin de déterminer l'effet des molécules peptidiques sélectionnées sur la force développée par un muscle squelettique adulte.
Réduction
L'injection intramusculaire permet d'optimiser la diffusion intramusculaire des molécules peptidiques étudiées. Cela permet de réduire le nombre d'animaux requis pour palier une grande variabilité des résultats, voire le risque de faux-négatifs et donc de mises à mort inutiles, si nous placons les molécules dans le milieu dans lequel baigne le muscle isolé. Nous avons utilisé un outil informatique pour calculer le nombre d'animaux nécessaires pour voir un effet. Les effectifs ont été ramenés au minimum tout en permettant d'avoir un effet statistique significatif.
Raffinement
Une période d'acclimatation de 2 semaines sera respectée à l’arrivée des animaux. Un analgésique sera injecté afin de contrecarrer la douleur liée à l'incision de la peau et à l'injection intramusculaire et celle éventuellement liée à l’action biologique des molécules peptidiques. L'injection intramusculaire et la faible quantité de molécules injectée réduisent fortement les risques liés à une diffusion dans la circulation générale. L'animal anesthésié sera placé sur un tapis chauffant. Le rythme respiratoire et l'absence de mouvements ou d'hémorragie seront contrôlés tout au long de l'anesthésie gazeuse.
Choix des espèces
La souris est utilisée car c'est le mammifère pour lequel les outils de modification du génome, les protocoles d'anesthésie, d'injection intramusculaire et de mesure de force développée par les muscles isolés sont les mieux établis, ce qui permet au mieux de respecter les 3R. Nous utiliserons des souris d'une lignée génétiquement modifiée pour le canal sodique musculaire que nous avons développée pour cet objectif. L'utilisation de cette lignée est essentielle pour envisager un développement à visée thérapeutique pour les myopathies congénitales humaines. Des adultes agés de 2,5 à 6 mois seront utilisés car à ces âges les muscles ont une taille suffisante pour réaliser des expériences robustes. C'est à ces âges que nous avons montré une perte de force des muscles isolés d'animaux mutants pour le canal sodique. Des mâles seront utilisés pour tester les 3 molécules, nos résultats précédents montrant que la faiblesse liée au canal sodique musculaire est plus marquée pour ce sexe. Des femelles seront utilisées uniquement pour la molécule identifiée comme étant la plus efficace chez les mâles afin de confirmer qu'elle est également efficace pour ce sexe tout en réduisant le nombre d'animaux utilisés.
Amélioration de traitement anticancéreux chez la souris
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Après deux injections, dont celle de cellules de lymphome qui envahissent la rate et les ganglions, des souris sont pesées trois fois par semaine et prélevées de sang chaque semaine pendant cent jours au plus, certaines recevant en plus une injection quotidienne pendant quatorze jours. Au total, 6 660 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour prélever leurs organes, et la maladie peut réduire leur activité et leur mobilité pendant une à deux semaines. Le projet cherche à savoir si la façon dont les cellules cancéreuses produisent leur énergie influe sur la réponse aux cellules CAR-T, avec des retombées pour les patients au conditionnel. Les lots décrits totalisent 5 580 souris, et le résumé ne dit rien des 1 080 autres.
Objectifs
Le lymphome est un cancer du sang agressif et fréquent dans les pays industrialisés. Cette maladie est très hétérogène, ce qui explique qu’environ 40 % des patients ne répondent pas durablement au traitement de référence. Pour certains de ces patients, une thérapie innovante peut être proposée : la thérapie par cellules CAR-T. Cette thérapie est un traitement révolutionnaire contre le cancer qui consiste à modifier génétiquement les propres cellules immunitaires du patient pour les transformer en « super-soldats » capables de repérer et de détruire les cellules cancéreuses. Malgré l’efficacité remarquable de cette thérapie chez certains patients atteints de lymphome, environ la moitié d’entre eux ne répondent pas ou rechutent rapidement, notamment au cours de la première année. Il est donc essentiel de mieux comprendre les mécanismes qui déterminent l’efficacité de cette thérapie afin d’identifier de nouvelles stratégies permettant d’améliorer la réponse au traitement. Les cellules de lymphome peuvent utiliser différentes sources d’énergie pour se multiplier. L’objectif de ce projet est de déterminer si la manière dont les cellules cancéreuses produisent leur énergie influence leur sensibilité au traitement.
Bénéfices attendus
À terme, ces travaux pourraient contribuer à mieux identifier les patients susceptibles de répondre aux traitements et à développer de nouvelles stratégies permettant d’améliorer l’efficacité de cette thérapie chez les patients résistants.
Procédures
Les interventions suivantes seront réalisées sur des animaux vigiles : Lots 1 à 3 : 2 340 souris : deux injections (1 minute chacune), trois pesées par semaine pendant une durée maximale de 100 jours (1 minute par pesée) et un prélèvement sanguin par semaine (1 minute). Lot 4 : 360 souris : mise à disposition ad libitum d’un régime alimentaire pendant une durée maximale de 100 jours, associée à deux injections (1 minute chacune), trois pesées par semaine pendant une durée maximale de 100 jours (1 minute par pesée) et un prélèvement sanguin par semaine (1 minute). Lot 5 : 2 880 souris : : deux injections (1 minute chacune), trois pesées par semaine pendant une durée maximale de 100 jours (1 minute par pesée) et un prélèvement sanguin par semaine (1 minute). Une injection par jour pendant 14 jours et l’administration d’un traitement dans l’eau de boisson à volonté pendant 5 semaines.
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues sont les suivantes : 1/ un stress transitoire et un inconfort léger liés aux contentions, auxquels peuvent s’ajouter, selon les procédures, les manipulations nécessaires à l’administration des traitements ; 2/ les effets liés au développement de la tumeur : après leur injection, les cellules tumorales se multiplient principalement dans la rate et les ganglions lymphatiques, qui jouent un rôle important dans le fonctionnement du système immunitaire. La progression tumorale va entraîner une gêne légère à modérée et, à un stade plus avancé de la maladie, une diminution de l’activité ainsi qu’une mobilité réduite. Ces effets sont attendus environ 3 à 4 semaines après l’injection des cellules tumorales et peuvent persister pendant 1 à 2 semaines.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin des procédures afin de prélever les organes et de réaliser les analyses in vitro nécessaires à l’obtention des résultats scientifiques.
Remplacement
Notre projet évalue l’importance de la source de production de l’énergie par la cellule tumorale sur la réponse au traitement. Des études in vitro ont été menées en amont afin d’identifier et de sélectionner les mécanismes métaboliques les plus pertinents à étudier. Le métabolisme tumoral au sein de son environnement est profondément différent de celui observé in vitro et il n’existe pas à ce jour d’autre alternative à l’utilisation des souris pour l’étude in vivo des mécanismes métaboliques impliqués dans l’échappement des cellules tumorales aux thérapies proposées.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés a été réduit au strict minimum, tout en restant suffisant pour obtenir des résultats fiables. Nous avons utilisé un outil informatique, basé sur nos premières données, pour calculer le nombre d’animaux réellement nécessaires. Après la fin des expériences, nous recueillerons également plusieurs organes et tissus afin de réaliser un maximum d’analyses complémentaires avec les mêmes animaux. Enfin, le projet est organisé par étapes. En fonction des résultats obtenus au laboratoire et chez l’animal, certaines expériences pourront ne pas être réalisées si elles ne sont plus nécessaires.
Raffinement
Nous avons établi des critères d’arrêt précis, précoces et adaptés pour détecter le lymphome suffisamment tôt afin de limiter toute souffrance animale, tout en conservant une exploitation optimale des résultats scientifiques. Nous serons particulièrement attentifs à toute modification du comportement et de l’aspect physique des animaux.
Choix des espèces
La souris est une espèce animale relativement proche de l’homme, et est le modèle de choix utilisé par la communauté scientifique pour étudier les acteurs moléculaires et cellulaires impliqués dans le cancer. De plus, la souris présente plusieurs avantages comme un cycle de vie relativement court, une natalité importante et un modèle facile à élever. En absence de système pouvant reproduire in vitro la réaction immunitaire et le dialogue entre les différents médiateurs cellulaires, il n’existe pas de méthode alternative à l’expérimentation animale pour mener à bien ce projet. Les souris auront entre 5 et 20 semaines car c’est durant cette période qu’il y a la meilleure prise de tumeur.
Étude des fonctions de modifications du squelette cellulaire et leur implication dans les pathologies-MODIFICATION
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Troubles urogénitaux
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système gastrointestinal
- Système nerveux
- Système respiratoire
- Système urogénital
Une souris qui montre une perte de poids, une blessure ou de "mauvaises relations sociales" est soignée, isolée ou mise à mort, sur la base d'une surveillance deux fois par semaine au minimum. 5 209 souris issues de lignées génétiquement modifiées vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures menées pour une part sous anesthésie sans réveil, pour une autre d'un niveau de souffrance sévère. Une des lignées présente des troubles de la coordination des mouvements, l'état des lignées à créer reste inconnu selon le porteur, des souris sont gardées jusqu'à 24 mois, et leur comportement moteur est testé pendant deux jours sans que les tests soient nommés. Le résumé ne décrit comme nuisance qu'une ouverture du thorax sous anesthésie, sans réveil, et ne dit rien de ce qui vaut à une partie des souris le niveau sévère.
Objectifs
Ce projet a pour but d’analyser les rôles et les fonctions de différents aspects de la régulation du squelette cellulaire : d’un côté ses composantes propres, de l’autre les éléments qui interagissent avec lui, au niveau de l’organisme entier, la souris. Cette étude a pour ambition d’analyser les relations entre ces différents aspects et d’établir comment ils coopèrent dans la régulation de fonctions du squelette des cellules, le cytosquelette. Le cytosquelette étant impliqués dans de nombreuses fonctions cellulaires, sa régulation est susceptible d’avoir des effets sur de nombreux processus cellulaires, qui, perturbées, pourrait avoir des répercussions sur la bonne survie de l’organisme entier. Ainsi, comprendre la régulation du cytosquelette et pouvoir l’influencer, permettra d’élucider son impact sur le maintien de la survie cellulaire et, comment sa dérégulation participe au développement de maladies. A terme, ce projet permettra de développer les moyens de dépistage et de nouvelles thérapies ciblant les maladies reliées à la dérégulation du cytosquelette. Le cytosquelette est présent dans toutes les cellules, ou il exerce des rôles très divers : il donne aux cellules leur forme, participe au mouvement des cellules et au transport intracellulaire, rend possible la division cellulaire et le déplacement de spermatozoïdes lors de la fécondation. Le cytosquelette interagit avec de nombreuses protéines qui contrôlent ses fonctions. Une des hypothèses suggère que le choix des éléments utilisés pour construire le squelette cellulaire et les modification de ces éléments constituent un code, qui définit ses propriétés et influence les interactions avec les autres protéines spécifiant ainsi ses fonctions. Le présent projet est une continuation d’un projet précèdent, qui a permis de démontrer le rôle essentiel de la régulation du cytosquelette dans la survie des neurones et dans la fertilité. Nous proposons maintenant d’étendre notre analyse à d’autres modèles murins de ce code de cytosquelette.
Bénéfices attendus
Cette étude permettra de mieux comprendre les rôles des mécanismes de régulation du cytosquelette. Étant donné que le cytosquelette a des fonctions essentielles dans toutes les cellules, cela suggère que sa régulation pourrait être impliquée dans le développement normal de l’organisme. Inversement, les défauts de cette régulation pourraient être à l’origine de maladies telles que les neurodégénérescence, cancer ou infertilité. Cette étude vise à éclaircir le mode d’action de ces mécanismes de régulation du cytosquelette et de développer les moyens de dépistage et les traitements des pathologies liées à sa dérégulation. La modification proposée permettra d’acquérir des connaissances supplémentaires sur l’effet du cytosquelette sur la fonction neuronale.
Procédures
Une partie des animaux est soumise à une analyse phénotypique (analyse de l’état clinique des animaux) pendant leur vie. Le comportement moteur de certains autres animaux d’intérêt sera ensuite analysé (duré de test : 2 jours), les animaux seront ensuite mis à mort pour permettre les analyses histologiques.
Impact sur les animaux
Une des souches murines utilisée dans ce projet a été décrite comme ataxique, c'est à dire qui présente des problèmes de coordination de mouvements. Pour les nouveaux modèles qui seront générés dans le cadre de cette étude, la condition des animaux n’est pas connue à l’avance. Les nuisances subies par les animaux seront celles liées à une thoracotomie sous anesthésie générale profonde. Les nuisances s'arrêteront en fin de chirurgie (procédure sans réveil).
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort pour analyses de leurs organes
Remplacement
Après les premières étapes d'analyse des enzymes, impliquant la culture cellulaire (expression d’enzymes dans les lignées cellulaires et observation de leurs activités), le projet a pour but maintenant de comprendre la fonction de ces enzymes et leur mécanisme d’action au niveau de l'organisme vivant intégré et autonome, la souris.
Réduction
Les animaux générés lors de ce projet seront utilisés à la fois pour l’analyse phénotypique et pour l'analyse de leurs organes, permettant de réduire le nombre total d’animaux. Le nombre d’animaux nécessaires à la bonne exécution de ce projet sera suffisant pour obtenir les résultats statistiquement significatifs. Les croisements seront optimisés pour produire les animaux d'intérêt. Les animaux contrôles proviendront des mêmes portées que les animaux d’intérêt.
Raffinement
Les animaux seront surveillés deux fois par semaine minimum. Tout signe de mal-être, tel que la perte de poids, blessure, mauvaises relations sociales sera détecté et l‘animal sera soigné et soit isolé, soit mis à mort. Les soins peuvent inclure l’application d’une crème désinfectante (blessure) ou d’un complément nutritif (perte de poids). Une grille de score est mise en place pour le suivi clinique des animaux.
Choix des espèces
La souris est le modèle de choix pour les expériences menées en biologie du développement, de cancer et de la neurodégénérescence. Les modèles génétiquement modifiés des éléments de cytosquelette, protéines interagissant avec le cytosquelette et les enzymes impliquées dans la régulation du cytosquelette permettent de définir leurs rôles dans ces différentes maladies. Du fait de la parenté biologique avec l’Homme, les modèles murins sont d’excellents modèles de différentes pathologies. Les analyses seront effectuées à 6 différents âges : nouveau-né, 1 mois (animal jeune), 4 mois (animal adulte), 12 mois (animal âgé) et 18 et 24 mois (animaux très âgés). En effet, les niveaux de modifications changent au cours du développement de l’organisme. De plus, certains mutants devront être analysés très âgés, vu que l’on veut observer la dégénérescence liée à l’âge chez ces animaux. Les analyses de certaines lignées (à phénotype non-dommageable uniquement) nécessiteront la génération d’embryons au stade embryonnaire E14.5 ou E17.5 (soit 14,5 jours-post fécondation ou 17,5 jours post-fécondation) E14.5 ou E17.5. En effet à partir d’embryons de ces âges (en jour post-fécondation) il est possible de cultiver les cellules primaires nécessaires pour l’étude de mécanismes cellulaires impliqués.