Souris
Impact neurodéveloppemental de l’exposition prénatale précoce à la nicotine sur la formation des réseaux moteurs spinaux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Mères et petits sont tous tués à l'issue, pour prélever les moelles épinières et constituer une banque de tissus : 1 464 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Les femelles gestantes boivent une eau additionnée de nicotine du premier au quinzième jour de gestation, puis les souriceaux passent deux fois, nouveau-nés puis juvéniles, soit cinq minutes en chambre de pléthysmographie pour mesurer leur respiration, soit quinze minutes suspendus dans un harnais pour une marche dans l'air ou sur tapis roulant, avec une injection sous-cutanée. Le porteur affirme que les méthodes in vitro et in silico ne peuvent reproduire "la complexité d'un organisme entier". Pour choisir la souris, il retient notamment qu'elle est "un animal docile facile à manipuler, ayant une bonne qualité maternelle".
Objectifs
L’exposition à la nicotine pendant la grossesse, via les thérapies de substitution nicotinique ou les cigarettes électroniques, représente une préoccupation croissante de santé publique, car la nicotine traverse la barrière placentaire et interfère avec le développement neurologique du fœtus. Bien que plusieurs études indiquent que l’exposition prénatale à la nicotine (PNE) induit une hyperactivité locomotrice et perturbe la respiration, les conséquences de la PNE sur la maturation des réseaux de neurones localisés dans la moelle épinière (ME) et impliqués dans la locomotion (ex : marche, …) et la respiration n’ont jamais été étudiées. Une étude précédente de l’équipe montre qu’une exposition prénatale précoce perturbe l'activité et le développement du réseau neuronal dans les ME embryonnaires. Nous faisons l’hypothèse que la présence chronique de nicotine dans la ME des embryons pendant cette période précoce du développement, en activant de façon anormale les neurones de la ME, perturbe le développement des futurs réseaux moteurs. Nous faisons également l’hypothèse que ces perturbations développementales induites par la nicotine entraînent des modifications postnatales de l’activité des neurones altérant in fine les réseaux moteurs de la locomotion et de la respiration après la naissance. Pour répondre à cette question, le projet intègre des approches complémentaires d'enregistrement de l'activité des neurones et d'analyse du comportement afin de détecter les altérations neuronales et les activités locomotrices et respiratoires chez le nouveau-né et le juvénile. Dans ce projet, les souris gestantes et leurs portées seront exposées par l'eau de boisson, à des concentrations de nicotine permettant d’obtenir un niveau plasmatique de nicotine similaire à celui retrouvé dans le sang des femmes.
Bénéfices attendus
Les stratégies de remplacement à base de nicotine sous la forme de patchs ou de cigarettes électroniques sont considérées comme étant une bonne alternative pour la santé des anciens fumeurs. Cependant, chez les femmes enceintes, il est connu que la nicotine peut traverser la barrière placentaire. Nos travaux doivent permettre de mieux connaitre et mieux comprendre à moyen terme les effets délétères de la nicotine sur le développement spinal du foetus à l'origine des troubles locomoteurs et de la respiration observés chez les enfants et à terme de permettre une meilleure prise en charge de ces enfants exposés à la nicotine. Ainsi, ce projet fournira la première analyse des effets de l’exposition prénétale à la nicotine sur les circuits moteurs spinaux, générant des connaissances clés pour comprendre sur le long terme la neurotoxicité développementale de la nicotine et informer les politiques de santé publique. Les premiers résultats du projet seront accessibles dans 3 ans.
Procédures
Les animaux seront exposés à des faibles concentrations de nicotine durant leur développement du 1er au 15ème jour de gestation. Un premier groupe d'animaux sera ensuite placé dans une chambre d’enregistrement pendant 5 minutes pour l’analyse de l’activité respiratoire. Ces animaux seront soumis à cette intervention à deux reprises, une première fois au stade nouveau-né puis une deuxième fois au stade juvénile. Un deuxième groupe d'animaux effectuera un test locomoteur pendant 15 minutes pour l’analyse de l’activité locomotrice et recevront une injection sous-cutanée. Ces animaux seront soumis à cette intervention à deux reprises, une première fois au stade nouveau-né puis une deuxième fois au stade juvénile.
Impact sur les animaux
Durant les expériences de mesure de la respiration (durée de 5 minutes) les nouveau-nés subiront un stress léger du fait de la séparation maternelle. Durant les expériences de marche dans l’air (durée de 15 minutes), les nouveau-nés pourront subir un stress léger lié à une courte séparation maternelle ainsi qu’au fait d’être suspendu dans un harnais et une douleur légère et de courte durée liée à l’injection sous-cutanée. Durant les expériences de marche sur tapis roulant (durée de 15 minutes), les juvéniles pourront subir un stress léger lié au fait d’être suspendu dans un harnais et une douleur légère de courte durée liée à une injection sous-cutanée. Les femelles gestantes seront exposées à la nicotine dans l’eau de boisson qui apporte un goût amer qui sera masqué par l’ajout de saccharine.
Devenir
Les animaux impliqués dans le projet seront euthanasiés pour permettre le prélèvement des moelles épinières pour les enregistrements électrophysiologiques et la constitution d'une banque de tissu pour les analyses cellulaires complémentaires.
Remplacement
Il n’y a à ce jour aucunes méthodes alternatives nous permettant d’aborder notre projet sans passer par l’étude de modèles animaux, que ce soit les approches in vitro, ou in silico, qui ne peuvent pas reproduire ou modéliser la complexité d’un organisme entier et d'étudier l'effet de l’exposition prénatale des toxines sur le développement de l'embryon.
Réduction
Le nombre d’animaux requis a été déterminé à partir d’un calcul de puissance statistique, basé sur la détection d’une différence attendue de 10 % entre les groupes expérimentaux. Compte tenu de la variabilité anticipée des différents paramètres mesurés pour les analyses électrophysiologiques et comportementales, un effectif de 12 animaux par condition expérimentale (âge, sexe et concentration de nicotine) pour les expériences d’électrophysiologie et de comportement est nécessaire. Notre projet est basé sur des méthodes variées qui permettent d'utiliser au maximum tous les animaux d'une même portée. Cela permettra de réduire le nombre de femelles gestantes utilisées. En effet, l’ensemble des moelles épinières de tous les animaux de chaque portée seront prélevées pour constituer une banque de tissus afin de pouvoir mener ultérieurement des analyses complémentaires sans devoir sacrifier d'animaux supplémentaires. Dans le cadre d’une exposition gestationnelle, les animaux issus d’une même portée partagent la même mère et le même environnement intra-utérin et ne constituent donc pas des observations statistiquement indépendantes. La portée est ainsi considérée comme l’unité expérimentale pertinente. En conséquence, le projet privilégie l’augmentation du nombre de portées plutôt que du nombre d’animaux par portée, afin d’optimiser la robustesse statistique tout en respectant le principe de Réduction des 3R. Notre expérience des lignées transgéniques nous permet d’estimer au plus juste la taille des groupes d’individus pour mettre en avant des effets significatifs. Les schémas de reproduction sont planifiés afin d’optimiser la probabilité d’obtenir les génotypes nécessaires et de limiter la production d’animaux non utilisables. Les croisements sont ajustés en fonction des besoins expérimentaux.
Raffinement
Les animaux engagés dans les procédures de mesure de l’activité locomotrice et de l’activité respiratoire seront habitués aux dispositifs expérimentaux autant que possible. Durant ces 2 procédures, les animaux néonataux seront testés dans un environnement chauffé (lampe chauffante) pour prévenir les chutes de température et seront immédiatement remis à leur mère après l'expérimentation. Les procédures mises en place suivent également les normes en matière de raffinement des pratiques expérimentales, par exemple en utilisant une méthode volontaire per os de prise de nicotine par les femelles gestantes, celle-ci se substituant aux méthodes "classiques" d'injections pouvant, quand elles sont réalisées sur le long court entrainer stress ou mal-être chez l'animal. En outre, notre méthode de mesure de l'activité respiratoire in vivo par pléthysmographie corps entier en chambre est substituée aux méthodes classiques utilisant un masque, évitant ainsi une situation pouvant induire mal-être et stress chez l'animal. Toute anomalie ou souffrance évidente sera signalée à l'expérimentateur et aux responsables de projet qui décident de la conduite à tenir en fonction des points limites. L’ajout de saccharine à 1% dans l’eau de boisson permet de contrebalancer le goût de la nicotine. La saccharine est un édulcorant non-métabolisé par l’organisme et n’a donc aucun impact sur le bien-être des animaux. L’administration de saccharine seule constitue donc un groupe contrôle suffisant, permettant de ne pas générer des groupes contrôles supplémentaires.
Choix des espèces
Le choix d'un modèle murin a été motivé en raison de sa pertinence par rapport à la physiopathologie humaine et les méthodologies ont été sélectionnées en accord avec une pratique expérimentale respectueuse du bien-être des animaux. Il a également été motivé par la possibilité d'utiliser une lignée transgénique qui permet d’identifier et localiser les neurones dans la moelle épinière. Le choix de la souris comme modèle expérimental est également motivé par le fait que la souris est un animal docile facile à manipuler, ayant une bonne qualité maternelle, et résistant aux infections d'une façon générale, ce qui est un plus pour la réalisation de ce projet associé à un aspect développemental. En outre, nous disposons aujourd’hui d’un nombre conséquent de données sur ce modèle dans le cadre de nos travaux précédents, ce qui justifie la poursuite de nos travaux sur ce modèle animal. Ce projet vise à étudier les conséquences post-natales de l'administration de nicotine pendant le développement. Les animaux exposés (femelles gestantes) le seront du 1er au 15ème jour de gestation. Les animaux exposés seront étudiés au stade néonatal et au stade juvénile. Une fois les expérimentations terminées, la mère et les petits seront euthanasiés et les tissus prélevés pour analyses complémentaires.
Etude de l’impact d’une kinase sur la dysfonction endothéliale en condition inflammatoire dans le modèle murin (UE 3/4)
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Pour comprendre comment une kinase agit sur l'inflammation et la coagulation dans les vaisseaux, 802 souris vont être utilisées dans ce volet d'un projet réparti sur plusieurs établissements, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Selon les groupes, elles sont irradiées puis greffées de moelle osseuse, infectées par des bactéries dans un protocole de sepsis puis tuées au plus tard 96 heures après, ou soumises sous anesthésie à une thrombose induite au laser, une inflammation provoquée ou la ligature d'un vaisseau abdominal suivie de 48 heures de survie. Une partie porte une version inactive de la kinase. Toutes sont tuées au terme de leur procédure pour prélever tissus et organes, et plus tôt si "l'un des points limites" est atteint, sans que le résumé dise lesquels.
Objectifs
Nous avons identifié que l’inhibition d'une protéine diminuait de façon significative la progression des lésions dans un contexte inflammatoire. Dans le but de mieux comprendre le mode d’action de cette protéine sur la progression de ces lésions, nous allons évaluer son impact sur l’inflammation et la fonction de l’endothélium (cellules qui tapissent l’intérieur d’un vaisseau sanguin) grâce à des modèles précliniques d’infection (sepsis), d’inflammation et de thrombose (activation de l’endothélium avec une cytokine inflammatoire ou un laser).
Bénéfices attendus
Ces expériences permettront d’évaluer, dans un organisme vivant, les effets potentiels de la protéine étudiée sur la formation de caillots sanguins et l’inflammation, ce qui ne peut pas être reproduit en laboratoire sur des cellules isolées. Elles aideront également à déterminer si cette protéine pourrait représenter une cible intéressante pour développer de nouvelles approches thérapeutiques visant à protéger les vaisseaux sanguins contre les dysfonctionnements liés à des processus inflammatoires ou thrombotiques.
Procédures
Trois types d’interventions seront réalisées sur des lots différents d’animaux : 1- Dans le premier ou deuxième établissements utilisateur, des lots d'animaux seront soumis à une irradiation suivie d’une greffe de moelle osseuse (injection des cellules par voie intraveineuse). 2- Dans un troisième établissement utilisateur, des lots d'animaux seront soumis à une infection bactérienne. Une seule prise de sang sera réalisée sur chaque lot à differents temps (au plus tard 96h apres le début de l’infection). Pour cela les souris seront sous anesthésie générale profonde (mélange de Tilétamine, Zolazépam et Xylazine), et seront ensuite euthanasiées. 3- Dans un quatrième établissement utilisateur, les animaux seront hébergés pendant 1 semaine pour acclimatation. 4- Dans le cinquième établissement utilisateur, les animaux seront soumis, sous anesthésie profonde, à un modèle de thrombose (activation des cellules du vaisseau par un laser) ou d’inflammation (activation des cellules du vaisseau par une molécule inflammatoire). Les animaux sont maintenus sous anesthésie tout au long de l’expérience et sont euthanasié à la fin des expérimentations qui durent respectivement 4 heures pour étudier la thrombose et 7 Heures pour étudier l’inflammation locale. Pour étudier la thrombose veineuse, des lots différents d’animaux seront exposés à une chirurgie sous anesthésie avec ligation d’un vaisseau sanguin abdominal (40 minutes). 48 heures après la chirurgie les animaux sont euthanasiés.
Impact sur les animaux
- Les animaux subiront une irradiation sans geste invasif suivi d’une reconstitution de leur moelle osseuse. Les effets indésirables possibles sont une légère baisse de l'alimentation avec légère perte de poids. Les animaux peuvent avoir un léger stress du fait de l'enfermement et du bruit, mais ce stress est de courte duréee. L'irradiation ne procure aucune douleur. - Après l’induction d’une infection (légère à modérée), les effets indésirables attendus dans ce modèle incluent une perte de poids, une diminution de l’activité et de la vitalité. Les souris seront ensuite euthanasiées au plus tard 96h apres le début de l’infection. D’autres expérimentations (modèles de thrombose et d’inflammation) sont conduites sans réveil des animaux. Les souris sont alors maintenues sous anesthésie générale pendant toute la durée des procédures expérimentales. À l’issue des expérimentations, les animaux sont euthanasiés sans reprise de conscience.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure pour collecter les tissus et organes qui seront ensuite analysés. Les animaux seront également euthanasiés si l'un des points limites était atteint.
Remplacement
Le recours au modèle murin est irremplaçable pour le déroulement de ce projet pour deux raisons majeures : (i) la complexité des mécanismes mis en jeu dans un contexte physiopathologique intégré non modélisable par des approches in vitro et (ii) l'utilisation de souris exprimant la protéine d’interet inactive. Ainsi, l’utilisation d’animaux vivants constitue une étape nécessaire pour répondre aux objectifs du projet, aucun modèle de remplacement pertinent n’étant actuellement disponible.
Réduction
Dans un souci d'utilisation d'un nombre minimal d'animaux, le nombre d'animaux annoncé a été calculé au plus juste à l'aide d'outils statistiques. Cependant si une différence significative est obtenue entre deux groupes expérimentaux avant la réalisation de la totalité du lot, nous ne réaliserons pas d'expérimentations supplémentaires. Dans les expérimentations de thrombose, plusieurs types cellulaire et/ou molécules seront visualisés dans les mêmes animaux.
Raffinement
Les souris sont hébergées en groupes de cinq individus, dans des cages ventilées, avec un accès ad libitum à l’eau et à la nourriture. Si une diminution de l’activité est observée, de l’aliment hydraté sera mis à disposition dans la cage afin de faciliter l’accès à la nourriture. Du papier sopalin et des cubes de bois seront également rajoutés comme enrichissement environnemental afin de permettre des comportements naturels de nidification et d’exploration, contribuant ainsi à réduire le stress et à améliorer le bien-être des animaux. Une période d’acclimatation de sept jours est respectée avant le début des expérimentations afin de limiter le stress lié à l’environnement. Les transferts entre deux établissements seront réalisés par un transporteur agréé. Les animaux bénéficient d’une période d’acclimatation d’une semaine avant toute procédure expérimentale dans l’établissement d’accueil.
Choix des espèces
Ce projet vise à améliorer la compréhension des mécanismes impliquant une protéine kinase dans l’inflammation, la thrombose et la dysfonction endothéliale en contexte thrombo-inflammatoire. Ces processus reposent sur des interactions complexes entre la paroi des vaisseaux, les cellules sanguines et le système immunitaire, s’inscrivant dans une réponse physiopathologique intégrée qui ne peut être reproduite de manière pertinente par des approches in vitro ou ex vivo. Le recours à l’expérimentation animale constitue donc l’unique approche permettant d’étudier ces mécanismes dans leur globalité. Le modèle murin est largement reconnu comme le modèle de référence pour les études précliniques de la thrombose et de l’inflammation, en raison de fortes similitudes avec l’Homme, tant au niveau des cellules impliquées que des voies moléculaires mises en jeu. Par ailleurs, l’utilisation de souris génétiquement modifiées ciblant spécifiquement la protéine kinase, sans phénotype dommageable en conditions basales, permet une analyse mécanistique en contexte pathologique. Nous utiliserons des souris de 6 à 8 semaines pour les donneuses de moelle osseuse, et de 12 à 25 semaines pour les expérimentations (âge adulte, système cardiovasculaire mature).
Les récepteurs du glutamate contrôleurs des troubles de l’attention
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Injections intrapéritonéales de composés, chirurgie sous anesthésie générale pour une partie d'entre elles, tests d'attention : 1 264 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, une part d'entre elles étant opérée sous anesthésie et tuée avant tout réveil. Les lignées comprennent des souris présentées comme reproduisant des troubles du spectre autistique ou des déficits de l'attention, ou privées du récepteur au glutamate étudié, et le résumé ne dit ni quels tests comportementaux sont menés ni ce que vise la chirurgie. L'objet déclaré est d'établir si ce récepteur constitue une cible pour de futurs traitements des troubles de l'attention. Le porteur liste douleur postopératoire, perte de poids et "dégradation de l'apparence physique", puis ajoute que "les procédures sont bien supportées par les animaux".
Objectifs
Le glutamate est le transmetteur excitateur le plus abondant dans le cerveau, où il agit via de nombreux récepteurs exprimés sur la surface des neurones. Il existe de nombreux récepteurs différents capables de lier le glutamate. Ceci multiplie les possibilités en termes de réponse et, du point de vue thérapeutique, de ciblage pharmacologique. Nous étudions un des récepteurs du glutamate le plus répandu et conservé du système nerveux central. Ses mutations ou son absence chez les patients ont été impliquées dans divers troubles neurodéveloppementaux caractérisés par un retard cognitif, des crises d'épilepsie, des manifestations du spectre autistique et des déficits de l'attention. Il s’avère que ce récepteur est très fortement exprimé dans une partie du cerveau qui régule les états de vigilance tant chez l’Homme que chez l’animal, en libérant la noradrénaline. Cette région est très sensible aux changements environnementaux inattendus et aux stimuli sensoriels (visuels, auditifs, tactiles). Nous voulons savoir si ce récepteur au glutamate est impliqué dans le contexte des troubles de l’attention. Nous allons tester cette idée in vivo chez l'animal sain et dans des modèles de pathologies neurologiques. Il s’agit de modèles animaux récapitulant des troubles du spectre autistique et de déficits de l'attention, ou dans lesquels le récepteur au glutamate que nous étudions est modifié ou absent. Des nouveaux composés pharmacologiques seront utilisés sur ces modèles afin de moduler l’action du récepteur et tester leurs effets sur les comportements attentionnels et l’activité cérébrale. In fine, ce projet vise à proposer une nouvelle cible potentielle pour le traitement des troubles de l’attention.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à comprendre dans quelle mesure le récepteur au glutamate étudié est impliqué dans les processus attentionnels. A terme, cela devrait nous permettre d'établir s'il s'agît d'une cible potentielle et pertinente dans les troubles de l'attention en particulier, mais aussi pour d'autres pathologies présentant un déficit attentionnel (ex. troubles du spectre autistique, épilepsies infantiles, troubles dépressifs, troubles du sommeil, maladies neurodégénératives) et pour lesquels les traitements sont à ce jour limités ou accompagnés d'effets secondaires lourds.
Procédures
Les animaux participeront à des tests comportementaux qui évaluent leurs capacités d'attention. Une partie des animaux recevront des composés pharmacologiques par injection intra-péritonéale. Une partie des animaux sera soumis à une chirurgie sous anesthésie générale, dont la durée ne dépasse pas 1 heure.
Impact sur les animaux
Les procédures prévoient, selon les groupes, une chirurgie, des injections intrapéritonéales ainsi que des tests comportementaux. Ces actes pourraient induire une nuisance ou des effets indésirables sur les animaux (douleur post-opératoire, perte de poids, dégradation de l'apparence physique). Pour ces raisons les procédures sont classées « modérées ». Cependant, notre expérience montre que les procédures sont bien supportées par les animaux.
Devenir
A la fin des procédures d'analyses comportementales et physiologiques avec ou sans chirurgie, les animaux seront mis à mort afin de prélever les tissus pour analyses cellulaires et moléculaires.
Remplacement
La caractérisation pharmacologique des composés que nous allons utiliser dans le projet a été effectuée dans un premier temps de façon très complète sur des modèles in vitro afin de diminuer le nombre d’animaux utilisés. Par contre, à ce jour il n'existe d'alternative autre que les animaux pour évaluer avec précision le phénotype comportemental qui nous intéresse, notamment l’attention.
Réduction
Le nombre d'animaux nécessaire a été déterminé avec un logiciel pour les calculs statistiques, de manière à allier réduction du nombre d'animaux et validité statistique des expériences. Les animaux utilisés pour les analyses histologiques seront les mêmes que ceux utilisés dans d’autres groupes, ce qui permettra de réduire le nombre d'animaux nécessaires à la réalisation de l'étude. Seules les expériences strictement nécessaires seront réalisées.
Raffinement
Les animaux seront hébergés en groupe et l'environnement sera enrichi (copeaux, morceaux de coton, papier). Afin de diminuer le stress, les souris seront manipulées quotidiennement par les expérimentateurs avant chaque procédure expérimentale. Un suivi régulier sera appliqué dès le début de nos expérimentations. Les chirurgies seront effectuées en suivant les règles d’anesthésie et analgésie. L'état de santé des animaux sera surveillé tout au long de l'expérience. Une grille de score sera mise en place dès l’apparition de signes cliniques (détresse, souffrance, prostration, perte de poids supérieure à 15%, poil ébouriffé) afin d’intervenir immédiatement et de manière appropriée si besoin.
Choix des espèces
Les souris fournissent des excellents modèles de troubles neurologiques, au cœur de notre projet. Elles demeurent aussi un outil indispensable pour déchiffrer le rôle d’acteurs moléculaires, telle que les récepteurs comme dans le cas ci présent, grâce aux modèles génétiques déjà développés. Les autres espèces utilisables ne sont pas envisageables à ce stade de l'étude en vue des contraintes éthiques et/ou d'hébergement requises par ces espèces. De plus la physiologie générale de la souris nous permet de nous rapprocher suffisamment de l'homme pour obtenir des données pertinentes d’un point de vue médical. Les animaux seront utilisés à partir de 8 semaines, ce qui correspond à des animaux jeunes adultes. De plus, effectuer les mesures à partir de 8 semaines nous permettra une comparaison de nos résultats avec ceux de la littérature, car les tests comportementaux sont très majoritairement réalisés sur les animaux à cet âge.
Rôles des microglies dans le développement de la barrière hémato-encéphalique MODIFICATION
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Des souris reçoivent des antibiotiques dans leur eau de boisson dès une semaine avant l'accouplement et pendant toute la gestation, d'autres des injections dans l'abdomen ou des gavages, et des femelles subissent une laparotomie sous anesthésie générale pour un enregistrement de 60 minutes. Le projet, qui étudie le rôle des microglies dans la formation de la barrière hémato-encéphalique, porte sur 4 076 souris exploitées dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré ou menées sous anesthésie sans réveil. Les mères traitées, leurs embryons, les souriceaux et les adultes sont tués en fin de procédure pour prélever leurs organes. Les mères non traitées sont remises à l'accouplement après le sevrage, et le résumé ne dit pas ce qu'elles deviennent ensuite.
Objectifs
Les objectifs du projet sont centrés sur l'étude du rôle des principales cellules immunitaires du cerveau, les microglies dans le développement et le fonctionnement de la barrière hémato-encéphalique (BHE), une structure essentielle qui régule les échanges entre le cerveau et le reste du corps. La BHE joue un rôle clé dans le contrôle des substances et des cellules qui entrent et sortent du cerveau, et des défauts dans son fonctionnement sont impliqués dans diverses pathologies cérébrales, allant des troubles neurodéveloppementaux aux maladies neurodégénératives. Cependant, les mécanismes précis de ces dysfonctionnements et leur implication dans ces maladies demeurent largement incompris. Il est donc primordial de mieux comprendre comment la BHE se développe et interagit avec les cellules cérébrales, tant en conditions physiologiques que pathologiques. Nous voulons explorer : (1) comment les microglies interagissent avec la BHE pendant le développement, (2) leur impact sur la maturation des vaisseaux sanguins et la fermeture de la BHE ; et (3) l’influence de l’environnement maternel sur ces processus. Grâce à des études sur des modèles murins, nous espérons mieux comprendre le rôle des microglies dans la formation de la BHE et leur implication dans certaines maladies cérébrales.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à mieux comprendre comment se forment et fonctionnent certaines structures du cerveau, notamment la barrière hémato-encéphalique (BHE), qui protège le cerveau et contrôle les échanges avec le reste du corps. Les microglies, des cellules qui jouent un rôle clé dans le cerveau, interagissent avec cette barrière dès le développement embryonnaire, mais ces interactions sont encore mal comprises. Des anomalies dans la formation de ces structures sont liées à des pathologies cérébrales, notamment dans les maladies du développement. Ce projet pourrait offrir des bénéfices importants pour notre compréhension de certaines maladies neurologiques, qui représentent un enjeu majeur de santé publique. Des troubles comme l’autisme et la schizophrénie touchent une grande partie de la population et ont des conséquences profondes sur le quotidien des personnes affectées. En comprenant mieux ces mécanismes, ce projet pourrait contribuer à éclairer des processus fondamentaux du développement du cerveau et offrir des pistes pour mieux comprendre certains troubles, ouvrant potentiellement de nouvelles voies pour la prévention et le traitement.
Procédures
Injection intrapéritonéale de molécules. La durée de l’injection est estimée à 2 minutes. Administration d’antibiotiques dans l’eau du biberon au moins une semaine avant la mise en accouplement et pendant toute la durée de la gestation. MODIFICATION : Le gavage engendre une gêne passagère non douloureuse ainsi qu’un stress lié à la contention. Une laparotomie sera effectuée sur des femelles sous anesthésie générale pour un enregistrement in vivo de 60 min maximum.
Impact sur les animaux
Lorsqu'un animal doit recevoir une injection dans l'abdomen ou un gavage, il est parfois nécessaire de le maintenir immobile pendant un court instant. Cette manipulation peut provoquer un stress temporaire chez l'animal, qui pourrait perturber son comportement habituel et entraîner des signes d'anxiété. De plus, l'ajout de certains traitements dans l'eau de son biberon peut parfois réduire la quantité d'eau qu'il boit, ce qui pourrait éventuellement affecter son poids. Une laparotomie peut engendrer de la douleur liée à l’incision abdominale, des effets physiologiques tels qu’une dépression respiratoire et cardiovasculaire, une hypothermie, ou un dessèchement des yeux. Ces aspects sont attentivement surveillés pour garantir le bien-être des animaux tout au long des procédures.
Devenir
Toutes les mères traitées ainsi que les embryons, souriceaux et adultes seront euthanasiés en fin de procédures afin de réaliser un prélèvement d’organes.
Remplacement
L’étude du rôle des microglies, des cellules de défense du cerveau, dans la formation et le fonctionnement de la barrière hémato-encéphalique (BHE) pendant le développement prénatal nécessite l’utilisation d’un organisme entier, comme la souris. En effet, cette barrière est influencée par de nombreux signaux provenant du reste du corps. Les systèmes en culture cellulaire (in vitro) ou les modèles réduits (organoïdes) ne peuvent pas reproduire les interactions complexes et les signaux venant de l’ensemble de l’organisme, ce qui ne permet pas d’étudier en profondeur des processus encore mal compris. Dans le cadre de ce projet, nous poursuivons nos recherches précédentes sur la façon dont les différentes cellules du cerveau se développent et interagissent pour former des circuits neuronaux et gliaux complexes. Pour observer ces processus dans leur contexte naturel et complet, un modèle vivant, comme la souris, est essentiel. Ce modèle nous permettra d’étudier comment les microglies et la BHE interagissent et réagissent aux signaux provenant du reste du corps pendant le développement. Toutefois, dès que cela sera possible et avant d'étudier ces mécanismes dans l'organisme vivant, nous testerons certains gènes candidats sur des cellules en culture pour mieux comprendre les mécanismes sous-jacents aux phénotypes que nous observerons, avant de les analyser plus en détail in vivo.
Réduction
Notre projet est conçu pour réduire au maximum le nombre de souris utilisées, tout en garantissant des résultats fiables et précis. Nous avons pris en compte la nécessité d'obtenir plusieurs échantillons pour vérifier que les résultats sont cohérents et reproductibles, tout en limitant les influences des différences biologiques (comme le sexe ou les caractéristiques génétiques) et environnementales (par exemple, les effets de l'interaction avec la mère). Pour garantir la stabilité génétique des souris et lorsque cela est possible, nous réalisons ces croisements de manière à obtenir à la fois des animaux témoins et des mutants issus de la même portée. En optimisant cette approche, nous réduisons la variabilité des résultats, ce qui permet de diminuer le nombre d'animaux nécessaires. Nous avons également optimisé la taille des groupes expérimentaux pour garantir des résultats statistiquement fiables avec un nombre réduit d'animaux. Grâce à notre expérience passée, nous avons déterminé que 8 animaux (4 de chaque sexe) suffisent pour obtenir des résultats significatifs tout en respectant les critères de rigueur scientifique. Cela permet de minimiser l'impact sur les animaux tout en maintenant la robustesse des conclusions. De plus, dans nos différentes expériences, si les premiers tests ne donnent pas de résultats clairs, nous ne réaliserons pas les autres expériences prévues. Cette approche permet d’utiliser moins d’animaux tout en conservant la rigueur de nos recherches. Enfin, après le sevrage des souriceaux, les mères qui n'ont pas été traitées pourront être réutilisées pour de nouveaux accouplements, ce qui contribue également à réduire le nombre total d'animaux nécessaires, tout en respectant les normes éthiques et scientifiques de notre projet.
Raffinement
Les conditions dans lesquelles les souris sont élevées, hébergées et soignées sont soigneusement optimisées pour minimiser au maximum toute douleur, souffrance, stress ou dommage à long terme. Notre priorité est de réduire l'inconfort des animaux. Par exemple, des éléments comme des dômes en carton, du coton et des baguettes en bois seront ajoutés pour permettre aux femelles de construire un nid plus confortable, réduire leur stress et favoriser l'usure naturelle de leurs dents. De plus, en dehors des périodes d'accouplement, les souris seront maintenues en groupes pour favoriser leur bien-être social. Pendant les périodes d’accouplement, les souris sont dès que possible groupées par lot de deux pour ne pas qu’elles soient isolées. Les animaux traités, ou dont la mère a été traitée, seront quotidiennement surveillés jusqu'à leur euthanasie. Si une souris ou un souriceau présente des signes de souffrance ou de stress, l’expérimentateur pourra consulter l'équipe de l'animalerie ou un vétérinaire pour évaluer la situation et, si possible, administrer un traitement approprié. Lors de la chirurgie, les animaux seront sous anesthésie générale, placés sur un tapis chauffant pour éviter l’hypothermie. Afin de prévenir la douleur, ils receveront une injection d’analgésique et d’anesthésique locale, et le site d’incision sera aseptié. Durant tout le long de l’opération, les yeux seront protégés avec un gel ophtalmique. En cas de souffrance grave ne pouvant pas être traitée, l’animal sera immédiatement retiré du projet et euthanasié, sur décision de l’expérimentateur ou du personnel de l’animalerie, si l’expérimentateur n’est pas disponible.
Choix des espèces
Les souris sont des animaux de laboratoire largement utilisées pour étudier le fonctionnement du corps et les effets de ses dysfonctionnements à différents niveaux, que ce soit au niveau du comportement, du fonctionnement physiologique ou des organes. Elles sont également essentielles pour créer des modèles qui nous aident à mieux comprendre certaines maladies humaines. Leur grande similarité génétique avec l'homme, combinée à la possibilité d'utiliser un grand nombre de souris modifiées génétiquement, en fait un excellent choix pour répondre à nos questions de recherche. En outre, leur cycle de reproduction rapide et leur petite taille facilitent leur gestion tout en permettant d’étudier une espèce ayant un développement proche de celui des humains. La courte période de gestation des souris, ainsi que le nombre élevé d’embryons, nous permettent de générer suffisamment d'animaux pour mener plusieurs expériences à partir de quelques parents seulement. Dans le cadre de nos recherches en cours et pour tirer parti des outils génétiques disponibles dans notre laboratoire, nous continuerons à utiliser ce modèle de souris.
Efficacité d’une approche thérapeutique par anticorps en combinaison avec un inhibiteur de RAS dans le cancer du pancréas
- Recherche appliquée
- Cancers
280 souris vont être utilisées, toutes tuées pour prélever leurs tumeurs, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Toutes subissent une opération de 15 minutes sous anesthésie générale dont le résumé ne précise pas l'objet, puis certaines reçoivent pendant 14 semaines au plus un anticorps injecté trois fois par semaine et un traitement oral quotidien, éveillées et contenues. Le projet teste cet anticorps, déjà en essai clinique pour d'autres pathologies selon le porteur, seul ou combiné à un inhibiteur de RAS contre le cancer du pancréas, dont la progression entraîne selon lui des signes de douleur au-delà d'un certain stade. Pour le choix de l'espèce, il décrit les souris comme "très proches de l'homme notamment du point de vue immunologique".
Objectifs
Le cancer du pancréas est la 7ème cause de mortalité attribuable au cancer dans le monde. De nouveaux types de traitement ciblant le système immunitaire se sont montrés efficaces dans d’autres types de cancers mais n’ont pas encore fait leur preuve pour le pancréas. Par ailleurs, de récents essais cliniques ont montré la capacité de nouveaux traitements à améliorer la survie des patients atteints de cancer du pancréas. Cependant, le taux de réponse reste faible et la survie de ces patients sous traitement ne dépasse pas un an. Il y a donc urgence à améliorer les thérapies actuelles. Depuis une dizaine d’années nous avons développé un anticorps reconnaissant spécifiquement une protéine localisée sur la membrane des cellules et connue pour participer au développement de différents cancers. Nous avons montré dans le cancer du pancréas que notre anticorps pouvait réduire la taille des tumeurs, influencer le système immunitaire et améliorer les thérapies ciblant le système immunitaire chez la souris. L’objectif de notre nouveau projet est de valider ces premiers résultats dans nouveau modèle et de tester l’efficacité de notre traitement en comparaison ou en combinaison avec un nouveau traitement prometteur qui améliore la survie des patients atteint d’un cancer du pancréas.
Bénéfices attendus
Le cancer du pancréas sont un grave problème de santé public. Bien que rare, il est pratiquement incurable en l’état actuel et les patients atteints ont une durée de vie très faible. Notre projet est une étape vers la mise en place de nouveaux traitements plus efficaces. Nous pensons que notre anticorps peut améliorer l’efficacité des thérapies ciblant le système immunitaire et/ou en combinaison avec le nouveau traitement ciblant le cancer du pancréas et ainsi améliorer la survie de très nombreux malades dans le futur. Cet anticorps a d’ailleurs déjà passé les tests de toxicité avec succès et est récemment entré en essai clinique pour le traitement d’autres pathologies.
Procédures
Tous les animaux de l’étude seront soumis à une opération chirurgicale sous anesthésie générale d’une durée d’environ 15 minutes. Une fois par semaine, une partie des animaux seront anesthésiés afin de réaliser une mesure de taille tumorale par imagerie qui durera au maximum 10 minutes. Certains animaux recevront un traitement par anticorps 3 fois par semaine par injection, ainsi qu’un traitement oral quotidien. L’administration des traitements sera réalisée sur animaux vigiles, prend environ deux minutes à être réalisée, et dure maximum 14 semaines. Les animaux subiront un prélèvement de sang terminal. Cette procédure est réalisée sur animaux anesthésiés et est réalisé en environ 1 minute.
Impact sur les animaux
Les injections répétées peuvent parfois engendrer une douleur au niveau des sites d’injection. La contention sur animal vigile peut engendrer un stress. Les traitements peuvent induire des effets secondaires modérés, mais sont globalement bien tolérés et ils devraient avoir un effet bénéfique sur la progression de la maladie et ses effets néfastes. La progression tumorale entraine des signes de douleurs et de stress (perte de poids, modification du comportement, etc.) au-delà d’un certain stade.
Devenir
Tous les animaux de ce projet seront mis à mort afin de collecter les tissues (tumeurs) qui seront utilisées pour des analyses ultérieures.
Remplacement
Afin de remplacer les études in vivo, nous avons prévu de procéder à des études in vitro sur lignées cellulaires et ex vivo sur des tissus de patients afin de démontrer la validité de l’approche. Celle-ci nécessite en parallèle une validation dans un modèle physiologique complet sur animal entier avant transposition clinique chez l’humain.
Réduction
Les tailles d’effectifs ont été déterminées à priori grâce à un logiciel dédié afin d’obtenir des résultats statistiquement fiables et robustes. Les données obtenues grâce aux animaux de ce projet seront analysées avec des tests statistiques classiques.
Raffinement
Afin de raffiner au mieux notre méthodologie, le protocole expérimental est planifié en amont. L’environnement des animaux est enrichi avec des tubes de coton pour la nidification et des briques de tremble à ronger. Les animaux seront hébergés en portoirs ventilés, ce qui les protégera des infections. Les animaux seront maintenus en groupe. Des points limites précoces ont été établis afin d’interrompre si nécessaire les procédures permettant de soustraire les animaux à toute douleur ou souffrance. Un tapis chauffant ou une cage thermostatée sera utilisée quand nécessaire. Un gel ophtalmique sera appliqué lorsque nécessaire. Les procédures invasives ou stressantes sont réalisées sous anesthésie générale avec utilisation d’un analgésique. L’analgésique sera utilisé à nouveau en cas de signes de douleur modérés (perte de poids, modification du comportement, etc.). Avant les procédures le nécessitant, au cours de la période d’acclimatation de 7 jours, les souris seront laissées 2-3 jours sans manipulation puis habituées à la contention afin de diminuer le stress lié aux traitements.
Choix des espèces
Les souris sont de petits mammifères très proches de l’homme notamment du point de vue immunologique. Le modèle proposé dans cette étude a contribué dans le passé à établir le potentiel curatif des approches thérapeutiques ciblant le système immunitaire actuellement prescrites chez l’homme. Les animaux seront utilisés à un âge adulte de 8 semaines afin qu’ils présentent un système immunitaire mature. De plus le cancer du pancréas étant un cancer plus fréquent chez l’adulte (âge moyen au diagnostique 70 ans chez l’homme, 74 ans chez la femme), il est préférable d’utiliser des animaux adultes pour ce projet.
Ciblage de la matrice extracellulaire pour renforcer l’efficacité de la radiothérapie sur les tumeurs cérébrales 1/3
- Formation professionnelle
- Recherche appliquée
- Cancers
Irradiées sous anesthésie, piquées tous les deux jours pendant trois semaines alors qu'elles sont éveillées et imagées jusqu'à seize fois, des souris porteuses de tumeurs greffées sous la peau ou dans le cerveau sont utilisées pour tester deux peptides contre le glioblastome. Ce résumé, numéroté 1/3, annonce 2 607 souris, toutes tuées à la fin de chaque étape pour analyser leurs tissus et leurs tumeurs, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré ou menées sous anesthésie sans réveil. Le projet se répartit sur trois établissements et commence par une formation du personnel à l'injection intracérébrale, jusqu'à six souris par personne. Un résumé numéroté 3/3 reprend le même titre, le même texte et le même effectif de 2 607 souris, et aucun des deux ne dit si ces souris sont comptées une fois ou dans chaque résumé.
Objectifs
Le glioblastome (GBM) est le cancer du cerveau le plus fréquent et le plus dangereux chez l’adulte avec une incidence de 2 à 5 personnes pour 100 000 habitants par an en Europe et aux États-Unis. Malgré les traitements actuels combinant chirurgie, radiothérapie (rayons X) et chimiothérapie, le pronostic reste très défavorable : la survie médiane est d’environ 15 mois et moins de 5% des patients survivent au-delà de 5 ans. Il est donc urgent de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques. Des recherches récentes ont montré que le GBM crée autour de lui un microenvironnement protecteur, riche en différentes protéines de la matrice extracellulaire qui favorise la croissance tumorale et la résistance aux traitements. Notre équipe a développé deux peptides innovants capables de perturber spécifiquement ce microenvironnement. Ces peptides, testés individuellement en laboratoire, ralentissent la croissance tumorale en stimulant la réponse immunitaire et en limitant la formation de nouveaux vaisseaux sanguins nourrissant la tumeur. L’objectif de ce projet est d’évaluer si deux peptides peuvent améliorer l’efficacité de la radiothérapie en rendant les cellules tumorales plus sensibles aux rayons X. Le projet se déroulera dans trois établissements utilisateurs et comprendra quatre étapes : une formation du personnel à l’injection intracérébrale de cellules tumorales chez la souris, réalisée d’abord sur animaux morts puis sur animaux vivants, une validation du rôle d’une protéine spécifique de la matrice extracellulaire dans la progression du GBM ; des tests sur des modèles de tumeurs sous-cutanées chez la souris pour identifier les conditions optimales de traitement combinant peptides et radiothérapie et une validation finale sur des modèles orthotopiques où les tumeurs se développent dans le cerveau. Ce projet permettra de mieux comprendre l’action combinée des peptides et de la radiothérapie, et ouvrira la voie à des stratégies thérapeutiques plus efficaces pour les patients atteints de glioblastome.
Bénéfices attendus
Le glioblastome est une forme de cancer du cerveau très grave et particulièrement résistante aux traitements classiques. Aujourd’hui, même avec les meilleurs soins (opération, rayons X et chimiothérapie), moins de 5% des patients survivent au-delà de 5 ans. Trouver des solutions innovantes est donc une nécessité. Ce projet vise à tester deux molécules inédites, conçues pour s’attaquer à l’environnement protecteur dont profite la tumeur pour se développer et échapper aux défenses du corps. Chacune de ces deux petites molécules a déjà démontré une capacité à freiner différents cancers dans des expériences en laboratoire ou chez l’animal. Mais leur efficacité n’a jamais été étudiée et spécifiquement contre le glioblastome, une tumeur particulièrement agressive. L’un des principaux bénéfices attendus serait donc de montrer que ces traitements, pris séparément, ont aussi un effet contre ce cancer du cerveau. Le projet va également permettre de tester, pour la première fois, ce qui se passe lorsqu’on utilise ces deux molécules ensemble en combinaison avec la radiothérapie. Notre projet s’attache aussi à vérifier la sécurité de ces traitements (pour détecter et limiter tout effet indésirable) et à comprendre où ces molécules circulent dans le corps, afin de s’assurer qu’elles atteignent leur cible sans toucher d’autres organes. Grâce à cette recherche, nous espérons ouvrir la voie à de nouvelles thérapies qui, en combinant traitements innovants et donneront de réelles chances d’améliorer le sort des patients atteints de glioblastome.
Procédures
A) Dans l’Etablissement Utilisateur (EU) 2/3 nous ferons un entrainement à l’injection intracérébrale pour maitriser la technique. B) Dans l’EU1/3 nous ferons une injection de cellules cancéreuses en sous-cutanée pendant 1 minute sous anesthésie générale gazeuse. C) Dans l’EU3/3 nous feront un traitement par radiothérapie pendant 4 minutes après anesthésie générale gazeuse. D) Dans l’EU1/3 ou 2/3 nous ferons des injections d’une minute sur animale vigile tous les 2 jours sur une durée de 3 semaines. E) Dans l’EU2/3 nous ferons une chirurgie de 30 minutes avec une injection d’une minute et suture sous anesthésie générale et locale. F) Dans l’EU3/3 nous ferons une imagerie de 30 minutes sous anesthésie générale pour l’observation de la croissance tumorale. Cette procédure sera réalisée une fois par semaine avec un total de 16 imageries.
Impact sur les animaux
Effets indésirables : 1) Toxicité potentielle des nouveaux traitements : - Analyses de sang hebdomadaires pour surveiller l’état de santé général. - Intervention rapide en cas d’anomalie détectée. 2) Modèle de tumeur cérébrale (orthotopique) : - Lésions au niveau de la tumeur cérébrale. 3) Exposition à la radiothérapie (rayons X) : - Fatigue, perte de poids. Effets bénéfiques potentiels : - Régression ou disparition de la tumeur après traitement.
Devenir
À la fin de chaque étape prévue dans le projet, tous les animaux seront mis à mort dans des conditions strictes de respect du bien-être animal. Cette décision permet de réaliser des analyses approfondies sur leurs tissus et leurs tumeurs. Les informations recueillies grâce à ces prélèvements sont essentielles pour mieux comprendre l’efficacité des traitements testés, leurs effets secondaires éventuels, et guider de futurs progrès dans la lutte contre le cancer du cerveau.
Remplacement
Avant d’envisager des expériences sur des animaux, toutes les possibilités in vitro ont été exploitées pour travailler en laboratoire, à l’aide de cultures cellulaires en 2D et 3D. Ces essais ont démontré que les nouvelles molécules testées peuvent stopper ou ralentir la croissance de cellules cancéreuses. Cependant, une tumeur dans un organisme vivant est bien plus complexe : elle interagit avec de nombreux types de cellules, crée un environnement de soutien spécifique et échappe souvent aux défenses de l’organisme. Aujourd’hui, il est donc indispensable de valider ces résultats dans des conditions plus proches du fonctionnement réel d’un corps vivant. Le modèle utilisé sera la souris, qui permet de reproduire de façon fidèle le développement du cancer et les interactions entre la tumeur, les tissus environnants et le système immunitaire. Cette étape chez l’animal permettra d’évaluer de manière précise la dynamique de croissance tumorale et la réponse réelle aux différentes combinaisons thérapeutiques. Il n’existe à ce jour aucun modèle informatique ou cellulaire qui puisse remplacer ce niveau de complexité biologique. C’est pourquoi le recours à un modèle animal devient nécessaire pour garantir la sécurité et l’efficacité future des traitements.
Réduction
La formation sera d’abord effectuée sur animal mort. De plus, lors de la formation, le nombre de 6 animaux/personne est un nombre maximum pour la validation du geste. Ce projet a été conçu avec le souci constant de limiter au strict nécessaire le nombre d’animaux utilisés. Pour cela, la démarche suivie se déroule en plusieurs étapes successives : À chaque phase, si les premiers résultats sont négatifs ou montrent une toxicité, les essais sont arrêtés pour éviter d’exposer inutilement d’autres animaux à des traitements inadaptés. Ce schéma progressif permet donc de s’assurer que chaque animal participe à une expérimentation qui a du sens, limitant le gaspillage et la souffrance inutile. De plus, la taille des groupes d’animaux a été calculée à l’avance pour être la plus petite possible, tout en offrant des résultats fiables du point de vue scientifique. Les calculs sont réalisés grâce à un logiciel spécialisé, sur la base de critères reconnus, afin de ne pas utiliser plus d’animaux qu’il n’en faut pour tirer de vraies conclusions. Enfin, les données issues de chaque groupe seront analysées avec des méthodes adaptées pour garantir une interprétation correcte et juste.
Raffinement
Pour limiter au maximum le stress et l’inconfort des souris pendant toute l’étude, différentes mesures d’attention et de précaution seront prises : - Période d’acclimatation de deux semaines avant le début des expérimentations pour que les souris s’habituent à leur nouvel environnement. - Nombre de souris par cage limité (4-10 animaux) afin d’assurer leur confort et leur bien-être social. - Accès illimité à l’eau et à la nourriture. - Enrichissement du milieu de vie avec des petits abris et des tubes en carton pour stimuler le comportement naturel des animaux. - Habituation à la manipulation pour réduire le stress avant les procédures. - Utilisation systématique d’une anesthésie générale par inhalation (isoflurane) lors de toute intervention pouvant causer de la douleur ou du stress (injection de cellules, examens). - Surveillance quotidienne de l’état de santé, pesée régulière (3 fois par semaine minimum), et remplissage d’une grille d’observation pour détecter rapidement toute souffrance ou problème. - Contrôle renforcé après chaque série d’injections pour s’assurer que les souris ne souffrent pas d’effets indésirables. - Pour la radiothérapie, les souris seront installées sur un tapis chauffant pour garder une température stable, endormies par anesthésie générale par inhalation pour ne ressentir ni douleur ni stress et un gel sera appliqué sur leurs yeux pour les protéger. Un équipement spécial permettra de délivrer précisément les rayons sur la zone à traiter en protégeant le reste du corps et en évitant d’exposer les tissus sains.
Choix des espèces
La souris a été choisie car elle permet de reproduire fidèlement certains aspects de la maladie humaine, comme la formation de vaisseaux sanguins autour de la tumeur, le fonctionnement du système immunitaire, et d’autres réactions biologiques impossibles à observer dans une simple boîte de culture. C’est l’animal de référence en recherche sur le cancer et il existe de nombreux outils scientifiques pour étudier soigneusement l’effet des traitements chez elle. De plus, la souris permet d’implanter des cellules cancéreuses humaines afin d’observer la croissance de tumeurs à l’endroit exact où elles apparaissent chez l’Homme. Les souris employées dans cette étude commenceront les procédures à l’âge adulte (8 semaines), ce qui évite que les résultats soient faussés par la croissance, la puberté ou, au contraire, par le vieillissement. À ce stade, elles sont dans les meilleures conditions physiques pour supporter les interventions nécessaires à l’expérience. En résumé, l’utilisation de souris adultes permet de garantir que les résultats obtenus seront à la fois fiables et utiles pour imaginer de futurs traitements pour les personnes touchées par le glioblastome, tout en respectant les principes éthiques et scientifiques de la recherche biomédicale.
Rôle de CerS2 dans la modulation de la masse et de la fonction musculaires ainsi que dans l’homéostasie glucidique EU2/2
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système musculosquelettique
Rendues obèses par un régime enrichi en lipides pendant 14 à 16 semaines, 80 souris reçoivent aussi, sous anesthésie, un tatouage d'identification et une injection de vecteurs viraux AAV dans le muscle. Elles sont utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, puis transportées vers un second établissement pour un test terminal avec injection d'insuline, glucose radiomarqué et trois prises de sang pour la moitié d'entre elles. La description des procédures affirme qu'après l'injection les souris "ne subiront ensuite qu'une expérimentation terminale", sans mentionner le régime que le porteur dit susceptible d'"engendrer un inconfort significatif". Toutes sont tuées et nécropsiées à l'issue pour prélever tissus et organes, et le porteur fixe leur nombre d'après ses "habitudes expérimentales".
Objectifs
Les sphingolipides constituent une vaste famille de lipides complexes impliqués dans de nombreux mécanismes physiopathologiques. Les céramides, à la base de leur métabolisme, sont connus pour influencer la sensibilité à l’insuline dans plusieurs tissus, y compris le muscle squelettique. Plus récemment, plusieurs travaux ont démontré que l’inhibition de la synthèse de novo des céramides chez la Souris permet de prévenir le déclin de la masse musculaire et de la performance physique dans plusieurs contextes pathologiques. L’objectif de ce projet est donc d’évaluer l’effet de la réduction des concentrations intramusculaires de ces espèces de céramides sur la masse musculaire et l’homéostasie glucidique et ce chez des animaux adultes jeunes dans le contexte de l’obésité qui favorise le développement de la résistance à l’insuline. Ce projet est multisite sur deux établissements utilisateurs, EU1 et EU2.
Bénéfices attendus
Ce projet devrait nous apporter de nouvelles connaissances théoriques sur la physiologie des muscles squelettiques et plus précisément sur l'importance de certains lipides sur la dégradation de certaines fonctions musculaires dans le contexte de l’obésité et/ou du vieillissement. La compréhension du rôle de ces espèces de sphingolipides dans le muscle squelettique dans le contexte précité nous permettra d’envisager de nouvelles stratégies dans la prévention de la perte de la sensibilité à l’insuline.
Procédures
Dans le premier établissement utilisateur (EU1/2), les animaux seront individuellement identifiés par tatouage sous anesthésie (moins d’une minute). Ensuite, ils recevront une injection par voie intramusculaire (env. 30 sec). Cette procédure sera réalisée une seule fois sur animaux anesthésiés et ayant reçu un antalgique ce qui diminuera grandement la douleur, avec une procédure de réveil adaptée. Les animaux ne subiront ensuite qu’une expérimentation terminale nécessitant une injection (env. 30 sec), effectuée par un expérimentateur maîtrisant le geste. Dans le second établissement utilisateur (EU2/2) et pour la moitié des animaux, l’expérimentation terminale nécessite le prélèvement de sang à 3 reprises durant le test (moins d’une minute).
Impact sur les animaux
Plusieurs nuisances ou effets indésirables allant de l’inconfort à des douleurs légères sur de courtes durées pourraient être observés au cours de la vie des animaux. Un inconfort, une mobilité légèrement réduite et une légère douleur pourraient être constatés suite à leur identification par tatouage. Le régime enrichi en lipides pendant 14 à 16 semaines, en créant une obésité associée éventuellement à une insulino-résistance, pourrait engendrer un inconfort significatif pour l'animal. Un inconfort et/ou un stress pourrait intervenir lors des pesées de suivi. Les injections intramusculaires pourraient entrainer des douleurs et une mobilité réduite pendant quelques minutes. Un stress et une légère douleur liée à la contention et aux injections par voie intrapéritonéale pourrait survenir lors des expérimentations terminales (test de transport de glucose et injection d’insuline). Les prélèvements répétés de sang (3 prélèvements) lors du test terminal de flux de glucose radiomarqué peut provoquer du stress, des douleurs légères, œdèmes et gonflements. Enfin le transport d’un établissement utilisateur à l’autre dans les cages d’origine des animaux peut entraîner de l’inconfort et/ou du stress même si la distance est restreinte et qu’il sera réalisé selon des procédures établies et bien éprouvées.
Devenir
A l'issue des procédures, tous les animaux seront nécropsiés, des tissus et organes collectés pour des analyses histologiques, d'expressions génique et/ou protéique.
Remplacement
Des expériences préliminaires sur des cultures cellulaires issues de muscles squelettiques ont déjà été réalisées et ont montré l'importance de l'intérêt porté aux lipides intramusculaires. Cependant, pour faire le lien entre les quantités de certaines espèces lipidiques, ici les céramides, et la masse musculaire, ainsi que l'homéostasie glucidique, l'animal en tant que modèle intégré est indispensable.
Réduction
Pour déterminer le nombre d'animaux nécessaires et suffisants nous nous sommes essentiellement basés sur nos habitudes expérimentales et sur les variabilités inter-individuelles régulièrement constatées. En effet, un calcul de puissance est difficile à mettre en œuvre étant donné le nombre de tests inclus dans la même procédure. Les tests statistiques qui seront mis en œuvre seront des tests non paramétriques utilisés soit pour comparer des variables quantitatives uniques entre deux temps des procédures pour un même animal, ou pour comparer des variables quantitatives uniques entre deux groupes d'animaux, et encore pour comparer des variables quantitatives continues entre plusieurs groupes d'animaux. D'autre part, grâce à l'utilisation d'un appareil permettant de mesurer la répartition des masses maigre et grasse, nous pouvons réaliser un suivi longitudinal de ces paramètres sans euthanasier les animaux. Enfin, récemment a été mis en place au sein de notre Institut un fichier de partage des tissus ou organes collectés lors des nécropsies, nous pensons proposer les tissus autres que nos tissus d'intérêt aux autres équipes de recherche du centre.
Raffinement
A l’arrivée des animaux en zootechnie, ils seront répartis en cages de 4 à 5 individus et acclimatés à minima 5 jours. Les animaux seront hébergés par fratrie dans des cages sur portoirs ventilés en respectant le nombre d'animaux indiqué dans le Directive Européenne 2010/63/UE. De l'enrichissement type feuille de papier, bâtonnet en bois ou igloo seront systématiquement ajoutés en accord avec la SBEA du site. Un suivi quotidien sera réalisé soit par les zootechniciens soit par les expérimentateurs en charge du projet. La pesée hebdomadaire permet une habituation à l'Homme ce qui diminue le stress des animaux et indirectement la variabilité inter-individuelle dans les réponses mesurées ; ce paramètre permet également de se rendre compte de l’état de l’animal. Si des lésions cutanées apparaissent suite à des bagarres, une pommade sera appliquée. 30 minutes avant l’injection des AAV, les animaux recevront une injection sous-cutanée d’antalgique. Le réveil de l'animal, après anesthésie et injection des AAVs, se fera dans une cage posée sur tapis chauffant. Du collyre sera appliqué sur les yeux de l’animal. Une vérification de l’absence d’œdème ou de rougeur au point d’injection des AAV sera effectuée dans les 48 heures post-injection. Si le cas se présentait nous consulterions le vétérinaire référent afin de soigner les animaux ; l’utilisation d’une crème type Cortanmycétine ou Meloxicam sont envisagés. Des critères d’arrêt stricts sont mis en place et détaillés dans une grille de scoring en annexe. Les animaux seront suivis toute leur vie avec une grille de scoring permettant d’évaluer, par l’attribution de points, l’état de santé de chaque animal. En fonction du score obtenus, le RMO sera capable de déterminer si des points limites adaptés à chaque procédure sont atteints et les actions à réaliser pour soulager ou mettre fin aux souffrances relevées. Pour l’expérimentation terminale dans l’EU 2/2, les animaux seront transportés entre les deux établissements suivant une procédure de transport déclarée lors de l’agrément de l’établissement (cheminement et conditions de transport validés par signature d’une charte de transport). Les cages d’origine des animaux incluant des enrichissements type igloos ou tunnels sont placées dans des valises de transport adaptées à 2 cages permettant un isolement de la lumière et des conditions météorologiques extérieures. Le trajet se fait à pied (inférieur à 5 min), est prédéterminé et évite la rencontre avec le public.
Choix des espèces
L'espèce Mus musculus (souris), mammifère proche d'Homo sapiens, est le modèle animal expérimental le plus étudié dans la littérature notamment pour les études physiologiques et métaboliques, ce qui permet de meilleures comparaisons et une certaine pertinence des résultats. Des animaux adultes jeunes (8 semaines lors de leur arrivée dans le service de zootechnie et 7-8 mois en fin de protocole) seront utilisés, ce qui correspond à un âge Humain compris entre jeune adulte et adulte d’âge moyen. En effet, nous souhaitons analyser divers paramètres et facteurs (cf description du projet et procédures) sur des animaux jeunes rendus obèses par un régime nutritionnel approprié pour lesquels une insulino-résistance peut se développer. Les animaux seront hébergés entre 8 semaines et 7 mois, ce qui correspond à un âge Humain compris entre jeune adulte et adulte d’âge moyen. La mise en régime obésogène débutera à 3 mois, afin d’induire une obésité et une insulino-résistance chez la souris adulte.
Mise en place d’un traitement pharmacologique pour corriger les altérations cognitives d’une souris modèle de déficience intellectuelle d’origine génétique
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Six à huit essais de nage d'une minute par jour, pendant dix à douze jours, attendent une partie des 724 souris de ce projet dans la piscine de Morris, en plus de l'open-field, du labyrinthe en croix et d'un test de reconnaissance d'objets. Toutes reçoivent des injections quotidiennes dans l'abdomen pendant cinq jours à six semaines, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, puis sont tuées pour l'analyse de leur cerveau. Ces souris, privées par invalidation génétique du gène en cause dans le syndrome de Coffin-Lowry, sont utilisées pour tester un traitement des déficits cognitifs, dès 14 jours de vie pour les plus jeunes. Le porteur précise que ce traitement est déjà administré en recherche clinique à des adultes et à des enfants.
Objectifs
Nous étudions une souris modèle du syndrome de Coffin Lowry. Cette pathologie est due à des mutations d'un gène et conduit à une déficience intellectuelle modérée à sévère chez l’Homme. Il n’existe à ce jour aucun traitement. Pour ce projet, nous utilisons des souris invalidées pour le gène responsable. Notre projet a pour premier objectif de mettre au point un traitement pharmacologique pour corriger les altérations comportementales et cognitives de la souris modèle du syndrome de Coffin Lowry. Notre second objectif sera de tester si ce traitement pharmacologique délivré au plus tôt au cours de la période postnatale, permet d’éviter le retard de développement cérébral et de prévenir l’apparition des altérations cognitives. Enfin, nous combinerons le traitement pharmacologique à un enrichissement environnemental dans le but de corriger les altérations à plus long terme.
Bénéfices attendus
A ce jour, il n’existe pas de traitement pour les patients atteints syndrome de Coffin-Lowry. Compte tenu de la sévérité des altérations cognitives, la qualité de vie pour ces patients et leurs familles est profondément impacté. Au niveau expérimental chez la souris modèle, la description des altérations moléculaires nous permet aujourd’hui d’envisager de développer des stratégies thérapeutiques basées sur la délivrance d’agents pharmacologiques. Les traitements proposés ont déjà été testés chez d'autres souris modèles et s’avèrent bénéfiques sur certains comportements. Pour information, le traitement proposé est déjà utilisé dans la recherche clinique chez des patients, adultes et enfants, c’est pourquoi nous souhaitons commencer nos expérimentations avec ce candidat médicament. Dans ce contexte, notre projet testera pour la 1ère fois si ce traitement permet aussi de réduire, voire restaurer les altérations cognitives chez la souris modèle du Syndrome de Coffin Lowry.
Procédures
Pour le projet, tous les animaux recevront des injections quotidiennes du traitement ou de solution saline en intrapéritonéale. Après différents délais, ces souris seront mises à mort afin d'analyser leurs cerveaux. Une partie des animaux effectuera en plus des tâches comportementales. La locomotion et l’exploration sera évaluée dans une boite appelée open-field (durée 10 minutes) ou dans un labyrinthe en croix ((durée 10 minutes), ce qui ne génère aucune nuisance. La mémoire de reconnaissance s’effectue dans l’openfield préalablement exploré dans lequel on ajoute des objets à explorer. Pour ce test, les souris sont placées dans cet openfield pendant 10 minutes, 1 à 2 fois par jour pendant 5 jours maximum. La mémoire spatiale sera évaluée avec le test de la piscine de Morris qui génère un léger stress en début de protocole. Le protocole a une durée de 10-12 jours, à raison de 6-8 essais par jour (2 blocs de 3-4 essais successifs). Chaque essai comprend 1 minute de nage et 1 minute de repos sur une plateforme.
Impact sur les animaux
Pour ce projet, les souris recevront des injections quotidiennes en intra-péritonéale pendant 5 jours à 6 semaines, selon les procédures expérimentales. Les tests comportementaux pourraient générer une légère réactivité émotionnelle chez les animaux en tout début de test.
Devenir
à l'issue de chaque procédure, les animaux sont euthanasiés afin d'étudier leur cerveau.
Remplacement
Notre projet de recherche consiste à évaluer les bénéfices d’un traitement visant à réduire / compenser les altérations comportementales et cognitives associées à la déficience intellectuelle (retard d’apprentissage, déficits de mémoire). Bien que certaines cascades moléculaires peuvent être décrites sur des cultures neuronales en conditions basales, il est ensuite absolument nécessaire de valider les bénéfices du traitement sur les processus cognitifs chez un animal vivant qui se comporte dans différentes tâches comportementales.
Réduction
Le nombre d’animaux correspond au minimum nécessaire pour une démonstration convaincante des principes scientifiques étudiés sur la base d’arguments statistiques valides. Sur la base des études publiées et de notre expérience, 4-8 souris par groupe expérimental pour les analyses biochimiques et analyses cérébrales, et 8-15 souris par groupe pour les études de comportement sont nécessaires. Des tests de puissance de nos analyses statistiques seront effectués au cours de nos analyses (à partir de n=4), afin de détecter si des comparaisons suffisamment fiables sont dejà atteintes sans avoir à aller, pour chaque expérience, jusqu'à l'effectif maximum envisagé. Si cette valeur est atteinte, il ne sera pas nécessaire d’augmenter les effectifs jusqu'a à 8 pour les analyses cérébrales ou jusqu'à 15 pour les analyses comportementales. De plus, afin de réduire encore le nombre d’animaux nécessaires, les mêmes souris seront réutilisées dans plusieurs tests successifs, les premiers tests d’exploration ne durant que 10 minutes par jour et par souris.
Raffinement
Limiter la souffrance des animaux, s’assurer de leur bien-être et de leur santé, fait partie de nos préoccupations majeures et conditionne véritablement le bon déroulement de nos études, et la fiabilité de nos résultats. En effet, nos études comportementales doivent, pour les animaux, impérativement s’effectuer en l’absence de stress, anxiété et douleur afin d’être viables. Ainsi, avant de les soumettre aux premières injections ou aux tâches comportementales, l’expérimentateur manipule les souris pour limiter stress et anxiété et les habituer à sa présence. Afin de s’assurer que l’administration du traitement n’altère en rien la santé et le bien-être des souris, la mise en place de points limites permettra de réduire de potentielles souffrances. Pour cela, une grille d’évaluation sera utilisée.
Choix des espèces
Il n’y a pas d’autre modèle animal présentant des mutations équivalentes dans le gène ciblé pour ce projet. Le modèle murin inclus dans notre projet est déjà élevé au laboratoire et permettra de mener de manière rigoureuse notre étude. Les études passées ont montré que ces souris sont des modèles reproduisant des déficits cognitifs associés à la pathologie humaine (retard d’apprentissage, déficit de mémoire). Dans notre projet, une partie des expérimentations seront effectuées à l’âge adulte (>56 jours) afin de montrer les effets potentiellement bénéfiques de notre traitement sur des fonctions cognitives altérées. L’autre partie des expérimentations sera effectuée chez des souris juvéniles (de 14 à 35 jours). En agissant au cours de cette période de développement, nous souhaitons corriger au plus tôt le retard de développement cérébral et éventuellement éviter les altérations cognitives à plus long terme.
Modèle murin pour l’étude de la Dipeptidyl Peptidase 3 dans le cancer et la chimiothérapie
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système cardiaque
Tuées à la fin du protocole pour l'analyse de leurs organes et tissus, 396 souris mâles et femelles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit une greffe de cellules de cancer du sein sous la peau, puis six jours d'injections de chimiothérapie par anthracyclines, avec cinq semaines d'échographies cardiaques hebdomadaires sous anesthésie et des prises de sang dans le sinus derrière l'œil. Le porteur indique que la tumeur "pourrait être douloureuse" et que la chimiothérapie peut causer des douleurs, et les souris qui restent au-delà des points limites sont "exclues de l'expérience", sans autre précision sur leur sort. Pour justifier le choix de l'espèce, il cite l'homologie avec l'humain et des souris "relativement peu coûteuses à élever".
Objectifs
Depuis longtemps la cardio-toxicité des agents chimiothérapiques est établie chez l'Homme, cependant la chronologie et les facteurs aggravant de la maladie ne sont pas connus. Aussi, aucune stratification des patients n’est réalisable en amont du traitement car les mécanismes précis de cette cardiotoxicité restent complexes et imparfaitement étudiés. L’objectif du projet est de déterminer l’impact de notre protéine, une protéine fréquemment surexprimée dans différents cancers, sur le devenir des animaux traités aux anthracyclines , un des traitement de base du cancer du sein. Ce qui nous intéresse tout particulièrement sera la capacité du coeur à se contracter lorsque nous initierons le traitement.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus de ce projet sont multiples : 1. De valider l’hypothèse que les effets toxiques de la tumeur sur le coeur pré-traitement sont médiés par la protéine retrouvé dans la circulation 2. De confirmer l’intérêt d’utiliser la protéine dans la circulation comme biomarqueur prédictif de cardiotoxicité associée à la chimiothérapie 3. De prévenir la cardiotoxicité associée aux anthracyclines par l’utilisation d'un anticorps dirigé contre notre protéine.
Procédures
Pose de bague d'identification à l'oreille: 1 fois au moment du sevrage à 21 jours. Biopsie de 2mm à l'oreille au moment du sevrage à 21 jours. Anesthésies par voie intrapéritonéales: 1/semaine pendant 5 semaines, durée 15 minute. Prélèvements rétroorbitaires sur animaux anesthésiés: 1/ deux semaines pendant 5 semaines, durée 2 min. Injection rétro-orbitaires 1 fois à la 4ème semaine, durée 1 min. Injection sous cutané 1 fois en début de protocole, durée 2 min.
Impact sur les animaux
Concernant la méthode de prélèvement pour le génotypage : inconfort ponctuel lors de la pose de la bague auriculaire et du prélèvement de tissu (2mm à l'oreille). A la suite de l’injection sous-cutanée des cellules cancéreuses, les souris développeront une tumeur, et cette croissance de la tumeur pourrait être douloureuse. La chimiothérapie utilisée peut elle aussi engendrer des douleurs pour l’animal.
Devenir
L'euthanasie de tout les animaux à la fin de la procédure permettra une analyse histologique des organes d'intérêts, ainsi qu'une analyse protéique et génétique de divers tissus selon les groupes d'appartenance des animaux.
Remplacement
Les expérimentations in vitro ne permettent pas de représenter la complexité d’un organisme vivant. L'effet d'un traitement sur une monocouche de cellules cancéreuses in vitro nous permet de montrer l'efficacité de ce traitement sur ce type cellulaire mais le traitement devra être étudié in vivo pour être sûr de son efficacité dans un organisme vivant complexe qui contient une multitude de tissus et organes qui peuvent être touchés.
Réduction
Nous avons effectué un calcul nous permettant d’avoir le nombre précis de souris nécessaire à l’étude. En utilisant les résultats d’une précédente étude de notre laboratoire sur un projet relativement similaire, nous sommes arrivés au chiffre de 12 souris par groupe en début de protocole. Enfin, le suivi par échographie cardiaque permet également une réduction du nombre d'animaux car cette technique permet un suivi longitudinal sur le même animal sans mise à mort à des temps intermédiaires.
Raffinement
Les animaux disposeront d’une période d'acclimatation de 5 jours et seront observés quotidiennement par le personnel qualifié de l'animalerie ainsi que par l'expérimentateur. Différents points limites seront particulièrement surveillés et seront notifiés dans un cahier de suivi des animaux. Les animaux âgés de 12 à 18 semaines recevront une injection sous cutanée de 100 microlitres de cellules cancéreuses du sein. A cette occasion, ils seront surveillés de manière visuelle (fréquence respiratoire) pendant 1h après injection. Deux semaines après l'injection de la tumeur, les animaux, mâles et femelles, recevront une injection intrapéritonéale de chimiothérapie tous les jours pendant 6 jours, laquelle peut engendrer des douleurs et donc une analgésie adaptée sera administrée en cas de besoin. Chaque semaine pendant 5 semaines, l’échocardiographie et le prélèvement sanguin (fait une semaine sur deux en l'occurence pour éviter un excès de prélèvement de sang) seront faits l’un après l’autre pour limiter le nombre d’anesthésie hebdomadaire. Nous évaluerons la fonction cardiaque par échographie sous anesthésie générale, puis nous ferons des prélèvements sanguins via le sinus rétro-orbitaire, environ 100 microlitres à chaque prélèvement, 5 min après l'application d'un anesthésique locale. Une pommade ophtalmique afin de réhydrater l'oeil de l'animal sera utilisée post prélèvement. La même procédure aura lieue pour l'injection de notre médicament candidat. Différents points limites seront particulièrement surveillés tels que la perte de poids, le comportement, l’apparence physique et la gêne pour sedéplacer. En cas d’atteinte des points limites, les souris concernées auront alors un suivi adapté avec analgésie quotidienne, nourriture en gelée dans la cage, et si les points limite persistent, elles seront alors exclues de l'expérience.
Choix des espèces
La souris est utilisée en sciences expérimentales pour plusieurs raisons essentielles. Tout d’abord les souris partagent une grande homologie génétique et physiologique avec les humains, ce qui permet de mieux comprendre les processus biologiques et les maladies chez l’humain. Ensuite, les souris se reproduisent rapidement et sont relativement peu coûteuses à élever, ce qui permet d'obtenir rapidement des cohortes expérimentales. Troisièmement, les souris peuvent être facilement génétiquement modifiées pour étudier l'impact de gènes spécifiques sur les processus biologiques, offrant ainsi des informations précieuses sur la fonction des gènes. Pour notre étude, nous avons choisis des souris mâles et femelles C57Bl/6. Ces souris sont utilisées fréquemment dans la recherche en cancérologie et en cardiologie pour leur robustesse, leur survie malgré de forte dose de chimiothérapies, leur facilité de manipulation génétique, et d’après des recherches bibliographiques la croissance tumorale est la même pour les deux sexes, ce qui nous permettrait donc de comparer les effets du PCZ selon le sexe. Les animaux seront agés de 12 à 18 semaines dans un but de prendre des souris adultes, car le cancer du sein est une maladie fortement liée à l'âge. Prendre des animaux plus jeunes risquerait de masquer certaines observations, et ne serait pas cliniquement relevant lorsque nous voudrions transposer les résultats à l'homme. Prendre des animaux plus agés risquerait d'augmenter la probabilité de morts liés aux traitements, ainsi que la survenue de comorbitidés ou d'autres tumeurs spontanées chez nos souris. Par ailleurs, le cancer du sein triple négatif touche particulièrement les jeunes femmes, donc nous avons choisis des souris dans la première moitié de leur vie.
Cartographie 3D de l’Innervation du système reproducteur féminin chez la souris en condition physiologique et dans les cancers de l’endomètre.
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système nerveux
Pour dresser un atlas en trois dimensions des nerfs de l'utérus, 447 souris femelles vont être utilisées, toutes tuées par dislocation cervicale pour prélever leurs organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à sévère. Selon les groupes, elles subissent une ablation des ovaires suivie d'injections dans l'abdomen, une ouverture de l'abdomen, ou des séries de cinq injections à 24 heures d'intervalle. Toutes les souris de deux lignées génétiquement modifiées développent des hyperplasies atypiques ou des adénocarcinomes de l'endomètre vers 10 à 11 semaines, la seconde après une injection de tamoxifène à cinq semaines. Le porteur affirme que les chirurgies abdominales "sont bien tolérées". Il annonce des points limites "les plus précoces possibles", renvoyés à une grille en annexe que le résumé ne reproduit pas, et rien n'indique quelle procédure porte la gravité sévère déclarée.
Objectifs
Le système nerveux périphérique (SNP) présente une remarquable capacité d’adaptation structurelle et fonctionnelle face à des stimuli variés. L’utérus en est un exemple frappant : son innervation se remodèle rapidement durant le cycle reproductif et la grossesse, sous l’influence des hormones. Notre hypothèse est que la plasticité et l’activité du SNP régulent la fonction utérine, notamment via des interactions neuronales avec les glandes utérines. L’utérus se compose d’une couche musculaire externe (myomètre) et d’une muqueuse interne (endomètre) dans laquelle sont présentes les glandes uterines. Les méthodes histologiques 2D classiques rendent difficile l’étude de l’organisation des fibres nerveuses endométriales, principalement associées aux vaisseaux sanguins et parfois en contact avec l’épithélium glandulaire. Cet épithélium subit une dégénérescence et une régénération cycliques, sous contrôle hormonal. Après la conception, les glandes utérines grossissent et sécrètent des facteurs essentiels au développement embryonnaire. L’ablation de l’innervation sympathique utérine perturberait ce développement, suggérant un rôle clé du SNP dans la morphogenèse et la fonction des glandes endométriales, bien que les mécanismes restent à préciser. Notre projet vise à élucider les interactions entre les réseaux neuronaux et les organes reproducteurs féminins. Le projet a trois objectifs : 1-Construire un atlas cellulaire 3D de l’utérus de souris, incluant son innervation à différentes étapes du cycle œstral et après fécondation. 2- caractériser les schémas d’innervation du SNP (fibres autonomes et sensorielles) et en évaluer leur implication en condition physiologie sur la morphogenèse des glandes utérines après ablation des fibres nerveuses. 3-Caractériser la distribution des fibres nerveuses et leur implication dans la genèse des tumeurs et la croissance tumorale dans des modèles de cancer de l’utérus.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à établir la première cartographie tridimensionnelle à haute résolution des réseaux nerveux innervant l’utérus de la souris, tant en conditions physiologiques que lors du développement de cancers de l’endomètre. Les cartes 3D obtenues formeront un atlas de référence accessible à l’ensemble de la communauté scientifique. Elles permettront de dépasser les limites des analyses bidimensionnelles actuelles en précisant la distribution et les cibles des différentes populations de fibres nerveuses au sein de l’endomètre. Une attention particulière sera portée aux interactions fonctionnelles entre ces nerfs et les glandes utérines, aussi bien pendant le cycle de l’œstrus qu’après la fécondation, lors de l’implantation des embryons. En révélant le rôle méconnu du système nerveux périphérique dans le fonctionnement physiologique de l’utérus et dans la formation des cancers, ce projet ouvrira la voie à de nouvelles stratégies thérapeutiques pour le traitement des cancers chez la femme et la prise en charge des troubles de l’infertilité.
Procédures
Les nuisances attendues concernent d'une part la réalisation des injections intrapéritonéales et d'autre part, les chirurgies abdominales. Les nuisances liées à la chirurgie abdominale sont bien tolérées et n'ont que peu d'impact sur les animaux grâce aux soins post-opératoires. Procedures 1: Deux injections IP par animal. Procédure 2 : ovarectomie et 9 jours après 3 injections IP à 24h d'intervalle. Procédure 3 : 5 Injections IP a 24h d'intervalle. Procedure 4 Laparatomie. Procedure 5 : 5 Injections IP à 24h d'intervalle. Procédure 6: 1 injection IP à 5 semaines. Procédure 7: 1 injection iP à 5 semaines puis 5 Injections IP a 24h d'intervalle à l7 semaines.
Impact sur les animaux
Ce projet utilise deux types de souris transgéniques modèles d’hyperplasies atypiques complexes (Ltf-iCre+/-; Pten fl/fl,) et d’adénocarcinome endométrial (CAG-Cre-ERT+/-; Pten fl/fl). Les souris Ltf-iCre+/-; Pten fl/fl développent des hyperplasies de l’épithélium glandulaire de l’utérus à partir de 11 semaines avec peu de progression vers des lésions envahissant l’endomètre même après 6 mois.
Devenir
Tous les animaux en fin de procédure sont mis à mort par dislocation cervicale pour prélèvement d’organes.
Remplacement
Il n’existe actuellement aucune alternative non animale permettant de répondre aux objectifs de ce projet. Celui-ci vise à décrire pour la première fois l’innervation de l’utérus et le rôle de cette innervation dans la régulation des fonctions physiologiques et dans l’apparition des cancers. Seuls les modèles animaux permettent de saisir la complexité des interactions entre le système nerveux et les organes périphériques ; dans le cas de l'utérus, cela inclut la régulation hormonale. En effet, les modèles non animaux actuellement disponibles (cultures bidimensionnelles, sphéroïdes tumoraux, organoïdes ou les systèmes micro fluidiques) ne permettent pas la formation de réseaux nerveux matures et fonctionnels, ni la reconstitution de l’innervation d’un organe entier et l’interaction complexes avec les diffèrent compartiments des organes (ici endomètre/myomètre).
Réduction
Le nombre d’animaux nécessaires à cette étude a été réduit en optimisant l’utilisation de chaque organe prélevé, analysé simultanément pour plusieurs marqueurs (jusqu’à trois par échantillon). Les combinaisons d’anticorps restent toutefois limitées par la compatibilité des espèces. Afin d’optimiser davantage les marquages et de réduire encore le nombre d’animaux utilisés, nous testons actuellement des anticorps primaires directement couplés à des fluorochromes, évitant ainsi le recours à des anticorps secondaires d’espèces différentes. Lorsque cela est possibles chaque utérus sera divisé en deux et chaque corne utérine servira pour un marquage diffèrent. L’estimation du nombre d’animaux repose sur une approche de type « ressource equation» visant à obtenir un nombre de degrés de liberté résiduels compatible avec des analyses robustes tout en limitant le nombre d’animaux utilisés
Raffinement
Les souris font l'objet d'une surveillance quotidienne et sont hébergées par groupes de trois dans leurs cages. Lorsque des souris sont sélectionnées pour des expériences, les groupes sont reconstitués de manière à ce qu'aucune souris ne se retrouve jamais isolée. Les animaux développant des tumeurs ne sont générés que pour les besoins strictement nécessaires à l’expérimentation. Une attention particulière sera portée à la détection des signes cliniques de douleur. Lors de chirurgie ou de procédures expérimentales susceptibles d’induire une souffrance, le rythme des visites est augmenté (2 à 3 visites par jour). Dès l’apparition de tels signes, les seuils de points limites prédéfinis seront strictement respectés. Pour les interventions chirurgicales (ovariectomie et injection de fast Blue), les animaux seront anesthésiés sous anesthesie gazeuse et maintenus sur tapis chauffant. Ils seront ensuite placés dans la salle de réveil, toujours sur des tapis chauffants, et surveillés jusqu'à ce qu'ils aient complètement repris conscience. L'intervention sera réalisée dans une salle dédiée. Nous sommes attentifs à limiter le stress (souris maintenues en groupe, avec enrichissement de l’environnement), les souris ayant subi une injection ou une chirurgie seront placées en milieu enrichi (coton, dôme) dans une zone de stabulation dédiée à la post-expérimentation, avec moins de bruit et de passages, et seront observées quotidiennement par un animalier et l’expérimentateur. Nous insistons sur la formation et l’expérience des personnes pratiquant les injections et la chirurgie. La maîtrise de ces gestes réduit d’une part le temps de contention, diminuant ainsi les effets stress chez les animaux, et garantissent la bonne tolérance de la procédure et une meilleure reproductibilité auprès des animaux. Nous établissons les points limites les plus précoces possibles en fonction de l’objectif de l’expérimentation (voir grille score en annexe).
Choix des espèces
Les rongeurs et en particulier la souris (Mus musculus) est très largement utilisée en biologie de la reproduction car elle présente un cycle de l’estrus court (4 à 7 jours) qui est comme chez l’Humain sous le contrôle d’une régulation hormonale complexe. Les modèles murins transgéniques de cancer de l’utérus sont largement établis et ont démontré leur capacité à récapituler les principales étapes de la progression de la maladie chez l’humain. Les travaux antérieurs de l’équipe ont montré sur d’autres types de cancers que les tumeurs développées dans des modèles murins transgéniques constituent des systèmes pertinents pour l’étude du remodelage des réseaux nerveux dans le contexte tumoral. Ces modèles sont en outre fréquemment utilisés dans des études précliniques d’évaluation thérapeutique, ce qui en fait un choix pertinent et validé pour répondre aux objectifs de ce projet. Le prélèvement des utérus sera réalisé chez des souris femelles C57BL6 de 10-12 semaines ce qui correspond à un stade où les souris ont atteint leur maturité sexuelle et présentent un cycle œstral bien établi. Les souris Ltf-iCre+/-; Pten fl/fl, développe des hyperplasies atypiques complexes à partir de 8 semaines et ces lésions sont observées dans 100% des animaux à partir de 11 semaines. Les utérus seront prélevés à ce stade. Une cohorte de ces animaux sera analysée à des âges plus précoces (7 semaines) afin de caractériser le modèle et de déterminer le stade d’apparition des hyperplasies. Les souris CAG-Cre-ERT+/-; Pten fl/fl qui suite à une injection de tamoxifène à 5 semaines (juste après le sevrage) développent des adénocarcinomes endométriaux à partir de 8 semaines et ces lésions sont observées dans 100% des animaux à partir de 10-11 semaines. Les utérus seront prélevés à ce stade. Une cohorte de ces animaux sera analysée à des âges plus précoces (7 semaines) afin de caractériser le modèle et de déterminer le stade d’apparition des tumeurs.
Ciblage du métabolisme du fer pour sensibiliser le PDAC aux thérapies
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Greffées de cellules de cancer du pancréas sous la peau ou directement dans le pancréas, au cours d'une opération d'environ 25 minutes, 725 souris seront toutes tuées, dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère. Pendant quatre semaines, elles reçoivent chaque jour une injection de médicament et passent une fois par semaine sous anesthésie pour une imagerie optique, une partie d'entre elles étant des souris NSG que le porteur décrit comme "sévèrement immunodéficientes". Le projet vise à rendre ces tumeurs plus sensibles à une molécule ciblant le métabolisme du fer, avec des retombées énoncées au conditionnel. Tout le projet est déclaré en souffrance sévère, alors que le porteur décrit la croissance tumorale comme source d'un "léger inconfort lors de la locomotion" et mentionne une "résection des tumeurs" absente de la liste des procédures.
Objectifs
Le cancer du pancréas est l’un des cancers les plus agressifs et les plus difficiles à traiter. L’une des raisons est que les cellules cancéreuses peuvent résister aux mécanismes naturels qui conduisent normalement à leur mort. Ces tumeurs ont également un besoin important de certains nutriments, en particulier le fer, qui favorisent leur croissance et leur production d’énergie. Cependant, cette dépendance au fer peut aussi les rendre vulnérables à des traitements spécifiques qui ciblent l’équilibre du fer dans les cellules. L’objectif de ce projet est de mieux comprendre comment les cellules du cancer du pancréas survivent et de déterminer si la modification de certains processus internes peut rendre ces traitements plus efficaces pour provoquer leur mort. Nous utiliserons deux types de modèles murins de cancer du pancréas : 1. Dans le premier modèle, les tumeurs seront développées sous la peau des souris. Cette méthode permet de mesurer facilement la croissance tumorale et d’évaluer l’efficacité du traitement. 2. Dans le second modèle, les tumeurs seront implantées directement dans le pancréas. Ce modèle se rapproche davantage du cancer du pancréas humain et permet de mieux comprendre le comportement des tumeurs dans un environnement naturel. Dans les deux cas, nous comparerons la croissance des tumeurs et leur réponse au traitement dans différentes conditions. Dans l’ensemble, ce projet vise à améliorer notre compréhension du cancer du pancréas et à contribuer au développement de traitements plus efficaces à l’avenir.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à mieux comprendre certains mécanismes impliqués dans la mort des cellules cancéreuses dans le cancer du pancréas. En confirmant ces mécanismes chez l’animal, cette étude pourrait permettre d’identifier de nouveaux indicateurs ou approches pour améliorer les traitements. Ces résultats pourraient contribuer à développer de nouvelles stratégies thérapeutiques combinées, afin de rendre les traitements plus efficaces. Plus largement, ce projet vise à améliorer la prise en charge du cancer du pancréas en contribuant au développement de traitements plus adaptés aux patients.
Procédures
Dans cette étude, les souris subiront deux types de procédures pour étudier le cancer du pancréas. Dans la première, des cellules tumorales seront injectées sous la peau une seule fois par souris. Cette procédure est très courte, environ une minute, et les souris seront endormies sous anesthésie. Dans la seconde, les cellules tumorales seront transplantées directement dans le pancréas. Cette opération se fera une seule fois et durera environ 25 minutes, incluant l’anesthésie, l’intervention chirurgicale et le réveil des souris. Pendant quatre semaines, les souris recevront chaque jour une injection d’un médicament qui agit sur les cellules tumorales pour les tuer. Chaque injection dure environ une à deux minutes. Pour suivre l’évolution de la maladie, les souris seront examinées une fois par semaine à l’aide d’une technique d’imagerie optique. Cette méthode est non invasive, mais nécessite une anesthésie légère. Une substance spéciale est administrée avant l’examen pour rendre les tumeurs visibles, et chaque séance dure environ six à dix minutes par souris.
Impact sur les animaux
Les atteintes subies par les animaux comprennent : • Pendant la chirurgie : Procédures chirurgicales pour l’implantation et la résection des tumeurs ; chirurgie comportant un risque d’infection au niveau du site d’incision ; effets indésirables de l’anesthésie gazeuse (diminution de la température corporelle, dépression respiratoire) ; douleur associée à l’injection de cellules tumorales dans le pancréas. • Après la chirurgie : Injection pour administration de médicaments; complications postopératoires potentielles (rupture de suture, infection de la plaie). • Pendant le développement tumoral et métastatique : Développement tumoral pouvant s’accompagner d’un léger inconfort lors de la locomotion en raison du volume tumoral et, plus rarement, d’une perte de poids ; développement métastatique pouvant affecter le bon fonctionnement des organes envahis ; procédures régulières telles que la mesure du poids corporel, la manipulation lors des mesures du volume tumoral et l’anesthésie associée à l’imagerie optique (hebdomadaire), constituant une source potentielle de stress à court terme ; injections IP répétées du traitement pendant une durée maximale de 4 semaines et les effets indésirables associés, constituant une nuisance modérée ; souris NSG, sévèrement immunodéficientes et sensibles aux infections par un large éventail de pathogènes normaux, opportunistes et commensaux.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin des procédures afin de caractériser ex vivo le développement tumoral et métastatique selon les conditions expérimentales.
Remplacement
L’utilisation d’animaux est essentielle pour ce projet, qui vise à améliorer l’efficacité des médicaments ciblant la ferroptose (IKE) par la manipulation génétique de régulateurs clés du métabolisme cellulaire. Afin de réduire l’utilisation d’animaux, toutes les expériences feront d’abord l’objet d’une caractérisation approfondie in vitro à l’aide de lignées cellulaires cultivées et de systèmes protéiques purifiés. Toutefois, des aspects critiques de nos résultats doivent être validés in vivo afin de prendre en compte l’influence du métabolisme de l’organisme entier, du microenvironnement tumoral et de la pharmacodynamique des médicaments, des facteurs qui ne peuvent pas être reproduits avec précision in vitro. Ces paramètres ne peuvent être évalués de manière fiable que dans des modèles animaux de cancer du pancréas.
Réduction
Ce projet de 5 ans implique un maximum de 725 souris; toutefois, les études seront menées par étapes successives avec des critères précis permettant de décider de la poursuite ou de l’arrêt des expériences. Une phase initiale évaluera l’intérêt de cibler certains mécanismes biologiques impliqués dans le développement et la résistance aux traitements du cancer du pancréas dans un modèle de souris dépourvues de système immunitaire fonctionnel. Seules les approches ayant démontré un intérêt lors de cette première phase seront poursuivies afin d’étudier, de manière séquentielle, l’influence du système immunitaire et des tissus sains entourant la tumeur sur le développement de la maladie, tout en utilisant le nombre minimal d’animaux nécessaire. Pour toutes les études, une planification rigoureuse sera réalisée et des mesures seront prises pour minimiser à la fois le nombre d’animaux utilisés et la sévérité des procédures. Le nombre de souris nécessaires a été déterminé à l’aide de méthodes statistiques permettant d’obtenir des résultats fiables tout en limitant l’utilisation d’animaux. Enfin, afin de réduire davantage le nombre de souris utilisées, nous emploierons une technique d’imagerie permettant de suivre l’évolution des tumeurs chez les animaux vivants de manière non invasive et répétée, réduisant ainsi le recours à des procédures supplémentaires.
Raffinement
L’hébergement est effectué conformément à la réglementation en vigueur, sous le contrôle d’un vétérinaire et avec l’aide d’un personnel technique qualifié. Les animaux feront donc l’objet d’une surveillance quotidienne par du personnel compétent afin de détecter précocement toute altération du bien-être animal. L’apparition de signes d’inconfort ou de souffrance éventuelle conduira à la mise en œuvre de l’action appropriée (par exemple l’administration d’un analgésique) en fonction d’une grille d’évaluation du bien-être. Les greffes, les prélèvements et l’imagerie seront réalisés sous anesthésie gazeuse et sur tapis chauffant afin de réduire au strict minimum le stress et la souffrance des animaux. Une analgésie peropératoire sera appliquée lors des interventions chirurgicales. Enfin, le suivi du développement tumoral sera effectué par des mesures cinétiques utilisant des méthodes non invasives: des mesures au pied à coulisse, ou des acquisitions de bioluminescence par imagerie optique sous anesthésie gazeuse.
Choix des espèces
Nous utiliserons la souris, modèle de référence dans la recherche sur le cancer du pancréas. Les caractéristiques morphologiques et génétiques des tumeurs reproduisent étroitement la maladie humaine. Les souris offrent également plusieurs avantages : développement rapide, portées nombreuses, et facilité de soins et d’élevage. Conformément à la littérature, pour les expériences de transplantation, les cellules seront implantées chez des souris «jeunes adultes » âgées de 5 à 8 semaines.
Ciblage de la matrice extracellulaire pour renforcer l’efficacité de la radiothérapie sur les tumeurs cérébrales 3/3
- Formation professionnelle
- Recherche appliquée
- Cancers
Porteuses de glioblastomes greffés sous la peau ou dans le cerveau, des souris sont utilisées pour tester deux peptides associés à la radiothérapie. Ce résumé, numéroté 3/3, annonce 2 607 souris, toutes tuées, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, une partie étant menée sous anesthésie sans réveil. Elles subissent une chirurgie de 30 minutes pour l'injection intracérébrale de cellules tumorales, des injections tous les deux jours pendant trois semaines alors qu'elles sont éveillées, une irradiation et jusqu'à seize séances d'imagerie hebdomadaires sous anesthésie, avec fatigue, perte de poids et lésions cérébrales annoncées. Le porteur range la "Régression ou disparition de la tumeur" parmi les effets bénéfiques pour les souris, qui sont toutes tuées à la fin de chaque étape pour analyser leurs tissus.
Objectifs
Le glioblastome (GBM) est le cancer du cerveau le plus fréquent et le plus dangereux chez l’adulte avec une incidence de 2 à 5 personnes pour 100 000 habitants par an en Europe et aux États-Unis. Malgré les traitements actuels combinant chirurgie, radiothérapie (rayons X) et chimiothérapie, le pronostic reste très défavorable : la survie médiane est d’environ 15 mois et moins de 5% des patients survivent au-delà de 5 ans. Il est donc urgent de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques. Des recherches récentes ont montré que le GBM crée autour de lui un microenvironnement protecteur, riche en différentes protéines de la matrice extracellulaire qui favorise la croissance tumorale et la résistance aux traitements. Notre équipe a développé deux peptides innovants capables de perturber spécifiquement ce microenvironnement. Ces peptides, testés individuellement en laboratoire, ralentissent la croissance tumorale en stimulant la réponse immunitaire et en limitant la formation de nouveaux vaisseaux sanguins nourrissant la tumeur. L’objectif de ce projet est d’évaluer si deux peptides peuvent améliorer l’efficacité de la radiothérapie en rendant les cellules tumorales plus sensibles aux rayons X. Le projet se déroulera dans trois établissements utilisateurs et comprendra quatre étapes : une formation du personnel à l’injection intracérébrale de cellules tumorales chez la souris, réalisée d’abord sur animaux morts puis sur animaux vivants, une validation du rôle d’une protéine spécifique de la matrice extracellulaire dans la progression du GBM ; des tests sur des modèles de tumeurs sous-cutanées chez la souris pour identifier les conditions optimales de traitement combinant peptides et radiothérapie et une validation finale sur des modèles orthotopiques où les tumeurs se développent dans le cerveau. Ce projet permettra de mieux comprendre l’action combinée des peptides et de la radiothérapie, et ouvrira la voie à des stratégies thérapeutiques plus efficaces pour les patients atteints de glioblastome.
Bénéfices attendus
Le glioblastome est une forme de cancer du cerveau très grave et particulièrement résistante aux traitements classiques. Aujourd’hui, même avec les meilleurs soins (opération, rayons X et chimiothérapie), moins de 5% des patients survivent au-delà de 5 ans. Trouver des solutions innovantes est donc une nécessité. Ce projet vise à tester deux molécules inédites, conçues pour s’attaquer à l’environnement protecteur dont profite la tumeur pour se développer et échapper aux défenses du corps. Chacune de ces deux petites molécules a déjà démontré une capacité à freiner différents cancers dans des expériences en laboratoire ou chez l’animal. Mais leur efficacité n’a jamais été étudiée et spécifiquement contre le glioblastome, une tumeur particulièrement agressive. L’un des principaux bénéfices attendus serait donc de montrer que ces traitements, pris séparément, ont aussi un effet contre ce cancer du cerveau. Le projet va également permettre de tester, pour la première fois, ce qui se passe lorsqu’on utilise ces deux molécules ensemble en combinaison avec la radiothérapie. Notre projet s’attache aussi à vérifier la sécurité de ces traitements (pour détecter et limiter tout effet indésirable) et à comprendre où ces molécules circulent dans le corps, afin de s’assurer qu’elles atteignent leur cible sans toucher d’autres organes. Grâce à cette recherche, nous espérons ouvrir la voie à de nouvelles thérapies qui, en combinant traitements innovants et donneront de réelles chances d’améliorer le sort des patients atteints de glioblastome.
Procédures
A) Dans l’Etablissement Utilisateur (EU) 2/3 nous ferons un entrainement à l’injection intracérébrale pour maitriser la technique. B) Dans l’EU1/3 nous ferons une injection de cellules cancéreuses en sous-cutanée pendant 1 minute sous anesthésie générale gazeuse. C) Dans l’EU3/3 nous feront un traitement par radiothérapie pendant 4 minutes après anesthésie générale gazeuse. D) Dans l’EU1/3 ou 2/3 nous ferons des injections d’une minute sur animale vigile tous les 2 jours sur une durée de 3 semaines. E) Dans l’EU2/3 nous ferons une chirurgie de 30 minutes avec une injection d’une minute et suture sous anesthésie générale et locale. F) Dans l’EU3/3 nous ferons une imagerie de 30 minutes sous anesthésie générale pour l’observation de la croissance tumorale. Cette procédure sera réalisée une fois par semaine avec un total de 16 imageries.
Impact sur les animaux
Effets indésirables : 1) Toxicité potentielle des nouveaux traitements : - Analyses de sang hebdomadaires pour surveiller l’état de santé général. - Intervention rapide en cas d’anomalie détectée. 2) Modèle de tumeur cérébrale (orthotopique) : - Lésions au niveau de la tumeur cérébrale. 3) Exposition à la radiothérapie (rayons X) : - Fatigue, perte de poids. Effets bénéfiques potentiels : - Régression ou disparition de la tumeur après traitement.
Devenir
À la fin de chaque étape prévue dans le projet, tous les animaux seront mis à mort dans des conditions strictes de respect du bien-être animal. Cette décision permet de réaliser des analyses approfondies sur leurs tissus et leurs tumeurs. Les informations recueillies grâce à ces prélèvements sont essentielles pour mieux comprendre l’efficacité des traitements testés, leurs effets secondaires éventuels, et guider de futurs progrès dans la lutte contre le cancer du cerveau.
Remplacement
Avant d’envisager des expériences sur des animaux, toutes les possibilités in vitro ont été exploitées pour travailler en laboratoire, à l’aide de cultures cellulaires en 2D et 3D. Ces essais ont démontré que les nouvelles molécules testées peuvent stopper ou ralentir la croissance de cellules cancéreuses. Cependant, une tumeur dans un organisme vivant est bien plus complexe : elle interagit avec de nombreux types de cellules, crée un environnement de soutien spécifique et échappe souvent aux défenses de l’organisme. Aujourd’hui, il est donc indispensable de valider ces résultats dans des conditions plus proches du fonctionnement réel d’un corps vivant. Le modèle utilisé sera la souris, qui permet de reproduire de façon fidèle le développement du cancer et les interactions entre la tumeur, les tissus environnants et le système immunitaire. Cette étape chez l’animal permettra d’évaluer de manière précise la dynamique de croissance tumorale et la réponse réelle aux différentes combinaisons thérapeutiques. Il n’existe à ce jour aucun modèle informatique ou cellulaire qui puisse remplacer ce niveau de complexité biologique. C’est pourquoi le recours à un modèle animal devient nécessaire pour garantir la sécurité et l’efficacité future des traitements.
Réduction
La formation sera d’abord effectuée sur animal mort. De plus, lors de la formation, le nombre de 6 animaux/personne est un nombre maximum pour la validation du geste. Ce projet a été conçu avec le souci constant de limiter au strict nécessaire le nombre d’animaux utilisés. Pour cela, la démarche suivie se déroule en plusieurs étapes successives : À chaque phase, si les premiers résultats sont négatifs ou montrent une toxicité, les essais sont arrêtés pour éviter d’exposer inutilement d’autres animaux à des traitements inadaptés. Ce schéma progressif permet donc de s’assurer que chaque animal participe à une expérimentation qui a du sens, limitant le gaspillage et la souffrance inutile. De plus, la taille des groupes d’animaux a été calculée à l’avance pour être la plus petite possible, tout en offrant des résultats fiables du point de vue scientifique. Les calculs sont réalisés grâce à un logiciel spécialisé, sur la base de critères reconnus, afin de ne pas utiliser plus d’animaux qu’il n’en faut pour tirer de vraies conclusions. Enfin, les données issues de chaque groupe seront analysées avec des méthodes adaptées pour garantir une interprétation correcte et juste.
Raffinement
Pour limiter au maximum le stress et l’inconfort des souris pendant toute l’étude, différentes mesures d’attention et de précaution seront prises : - Période d’acclimatation de deux semaines avant le début des expérimentations pour que les souris s’habituent à leur nouvel environnement. - Nombre de souris par cage limité (4-10 animaux) afin d’assurer leur confort et leur bien-être social. - Accès illimité à l’eau et à la nourriture. - Enrichissement du milieu de vie avec des petits abris et des tubes en carton pour stimuler le comportement naturel des animaux. - Habituation à la manipulation pour réduire le stress avant les procédures. - Utilisation systématique d’une anesthésie générale par inhalation (isoflurane) lors de toute intervention pouvant causer de la douleur ou du stress (injection de cellules, examens). - Surveillance quotidienne de l’état de santé, pesée régulière (3 fois par semaine minimum), et remplissage d’une grille d’observation pour détecter rapidement toute souffrance ou problème. - Contrôle renforcé après chaque série d’injections pour s’assurer que les souris ne souffrent pas d’effets indésirables. - Pour la radiothérapie, les souris seront installées sur un tapis chauffant pour garder une température stable, endormies par anesthésie générale par inhalation pour ne ressentir ni douleur ni stress et un gel sera appliqué sur leurs yeux pour les protéger. Un équipement spécial permettra de délivrer précisément les rayons sur la zone à traiter en protégeant le reste du corps et en évitant d’exposer les tissus sains.
Choix des espèces
La souris a été choisie car elle permet de reproduire fidèlement certains aspects de la maladie humaine, comme la formation de vaisseaux sanguins autour de la tumeur, le fonctionnement du système immunitaire, et d’autres réactions biologiques impossibles à observer dans une simple boîte de culture. C’est l’animal de référence en recherche sur le cancer et il existe de nombreux outils scientifiques pour étudier soigneusement l’effet des traitements chez elle. De plus, la souris permet d’implanter des cellules cancéreuses humaines afin d’observer la croissance de tumeurs à l’endroit exact où elles apparaissent chez l’Homme. Les souris employées dans cette étude commenceront les procédures à l’âge adulte (8 semaines), ce qui évite que les résultats soient faussés par la croissance, la puberté ou, au contraire, par le vieillissement. À ce stade, elles sont dans les meilleures conditions physiques pour supporter les interventions nécessaires à l’expérience. En résumé, l’utilisation de souris adultes permet de garantir que les résultats obtenus seront à la fois fiables et utiles pour imaginer de futurs traitements pour les personnes touchées par le glioblastome, tout en respectant les principes éthiques et scientifiques de la recherche biomédicale.