Souris

4 840 souris vont être utilisées, toutes tuées pour analyse de leurs organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de tumeur sous la peau, jusqu'à trois gavages de matières fécales, un traitement antibiotique, jusqu'à quatre injections d'immunothérapie et sept injections bloquant des voies immunitaires, certaines subissant en plus une chirurgie. Les tumeurs peuvent limiter leur mobilité, les antibiotiques provoquer des diarrhées et le tout des pertes de poids. Le porteur affirme que seul un animal "vivant, entier" permet d'étudier ces interactions, les organoïdes ne reproduisant pas selon lui le dialogue entre immunité intestinale et tumeur.

Objectifs

De plus en plus de preuves indiquent que le microbiote intestinal influence fortement l'immunité antitumorale et les réponses cliniques aux immunothérapies dans le traitement du cancer. Notre laboratoire a montré que la dysbiose, une composition altérée du microbiote intestinal, peut réduire l'efficacité des immunothérapies et contribuer à la résistance au traitement contre le cancer. Alors que les interventions microbiennes telles que la transplantation de microbiote fécal (TMF) peuvent restaurer les communautés bactériennes intestinales bénéfiques et améliorer les réponses aux traitements, les mécanismes expliquant l'efficacité des TMF sont encore à étudier. Parmis ceux potentiels, la modulation du métabolisme et de l'immunité post-TMF seront étudiés dans ce projet. Dans ce projet, nous testerons un métabolite mis en évidence dans d'anciens projets, associé à une meilleure efficacité des traitements par immunothérapies post-TMF. Nous étudierons plus en détails les effets immunomodulateurs de ce métabolites, sur sa voie d'action (locale ou systémique) et ses effets sur le thymus.

Bénéfices attendus

En effet, nous avons mis en évidence un métabolite associé à la réponse aux immunothérapies chez les patients, et nous étudierons son effet dans ce projet, en association aux TMF et au traitement par immunothérapie. De plus les modulations immunitaires seront étudiées, et notamment le rôle du thymus. En évaluant la modulation de la réponse immunitaire et du métabolisme de manière microbiote-dépendante, ce projet nous permettra de mieux comprendre les mécanismes de résistance ou la réponse aux immunothérapies chez les patients atteints de cancer. Cette compréhension permettrait aussi de montrer que le métabolite étudié pourrait constituer un biomarqueur de la réponse aux TMF + immunothérapies. De plus, cela pourrait aider à comprendre la réussite ou l’échec de la transplantation de microbiote fécal à contourner la résistance aux ICI, et de pouvoir sélectionner des donneurs. Enfin, cela permettrait d’optimiser l’utilisation des immunothérapies, et d’éclairer les interactions entre l’immunité et le microbiote intestinal, pouvant au final influencer les décisions cliniques.

Procédures

Les interventions prévues seront l'implantation d'une tumeur par injection sous cutanée (une fois, d'une durée de moins d'1 minute), l'administration orale de matières fécales avec une sonde de gavage oral (1 à 3 fois, durée 1 minute), l'administration de traitements d'immunothérapie par injection intrapéritonéale (4 fois maximum, durée 1 minute), l'administration de traitements bloquant certaines voies immunitaires par injection intrapéritonéale (7 fois maximum, durée 1 minute). Dans les procédures 4 et 5, une chirurgie seral réalisée, sous anesthésie générale et les souris seront traités par un anti-douleur (une fois, durée 15-20 minutes). Enfin, des prélèvements de sang seront réalisés, une fois par semaine si 100uL sont prélevés (durée 2-3 minutes). Toutes les injections seront réalisées sous anesthésie locale, par lidocaïne.

Impact sur les animaux

Les animaux pourront subir un stress léger et transitoire lié aux manipulations. Les gavages oraux pourront provoquer un inconfort léger et transitoire pour la souris. Il y a un risque de diarrhée car les souris recevront un traitement antibiotique de courte durée, induisant une déshydratation légère et de courte durée. Il y a aussi un risque de perte de poids modéré post-transplantation de microbiote, post traitement par antibiotique ou post injection de tumeur sous-cutanée. Les injectionspeuvent provoquer des douleurs légères et transitoires et seront faites sous anesthésie locale. Les tumeurs peuvent provoquer une limitation modérée de l'activité et de la mobilité des souris. Les chirurgies comportent un risque de douleur post-opératoire modérée.

Devenir

Toutes les souris seront euthanasiées afin d’analyser les organes post-mortem.

Remplacement

Pour la réalisation de ce projet, l’utilisation d’animaux vivants est indispensable car seul un animal vivant, entier, peut permettre d’étudier dans leur globalité, l’immunité antitumorale, intestinale et périphérique et l’effet de la transplantation de microbiote fécal sur l'immunité et la réponse antitumorale, avec toutes les interactions nécessaires, impossibles à reproduire in vitro ou ex vivo. En effet, l'utilisation d'organoïdes n'est pas possible car les organoïdes reproduisent un tissu ou organe mais ne peuvent reproduire l’interaction du système immunitaire intestinal avec l’environnement tumoral après stimulation par le microbiote. Dans ce projet, nous voulons observer l'effet d'une transplantation de microbiote fécal sur différentes composantes de l'immunité. Seul un organisme entier permet d’étudier cela, avec un système immunitaire et une génétique proche de l'Homme comme la souris.

Réduction

Pour la réalisation de cette étude, nous chercherons à regrouper les expérimentations dans le but de réduire le nombre d’animaux contrôles. Le nombre d’animaux est rigoureusement contrôlé pour optimiser les ressources tout en garantissant des résultats fiables. D'après nos études antérieures et des analyses statistiques, nous avons besoin de 8 animaux par groupe pour obtenir des différences significatives.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans le respect de leur bien-être avec un régime alimentaire normal et de l’eau ad libitum, ainsi qu’un enrichissement adapté. Les animaux seront acclimatés pendant une semaine avant le début de l’expérimentation. La surveillance régulière permettra le suivi du comportement de la souris et l’éventuelle mise en place de mesure d'analgésie si les animaux présentent une souffrance, voire d'euthanasie si les animaux atteignent les points limites. Toutes les injections sous-cutanées, intraveineuses et intrapéritonéales (i.p.) seront faites sous anesthésie locale. Toutes les souris auront un examen clinique quotidien et des pesées régulières (au moins une fois/semaine). Les points limites seront strictement appliqués et des soins seront prodigués en cas de besoin en accord avec le vétérinaire.

Choix des espèces

Le choix de la souris pour la réalisation de ce projet se justifie par des raisons d’ordres scientifiques, pratiques et éthiques. La génétique est proche de celle de l’Homme et bien connue. La souris est l’animal de laboratoire le plus couramment utilisé par la communauté scientifique internationale et pour les études précliniques, la plus susceptible d’apporter les résultats satisfaisants pour nous au vu des objectifs du projet. La méthodologie envisagée est d’une mise en place relativement aisée sur ce type d’animal et nous avons acquis une pratique expérimentale sur cette espèce. Les modèles de tumeur existants sont issus de lignées cellulaires murines et leur implantation dans la souris est indispensable pour étudier l’immunité, l’effet des traitements sur la réponse antitumorale dans leur globalité et les effets des antibiotiques ou bactéries associées à ces antibiotiques sur le microbiote et l’immunité intestinales. Les animaux seront utilisés au stade adulte, à partir de 6-7 semaines de développement, les cancers cibles touchant l’adulte. De plus, à cet âge-là, les animaux sont matures du point de vue immunologique.

Pour relier la stéatose du foie aux troubles cardiaques, 960 souris sont rendues obèses et diabétiques par un régime suivi pendant 16 à 24 semaines. Elles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et toutes tuées pour prélever leur foie, leur cœur et leur tissu adipeux. S'y ajoutent une injection quotidienne pendant 12 à 24 semaines, deux injections par jour deux fois par semaine pour induire une fibrose du foie, des mises à jeun, des gavages avec risque de lésion de l'œsophage, six prises de sang en deux heures et des explorations cardiaques sous anesthésie. Le porteur indique qu'un traitement agissant sur la voie étudiée est déjà commercialisé contre des maladies auto-immunes et pourrait voir son indication étendue.

Objectifs

La prévalence des maladies métaboliques du foie (MASLD) est en constante augmentation et touche environ un tiers de la population mondiale. Les études de cohortes chez l’Homme ont révélé son lien complexe avec les maladies cardiovasculaires. La MASLD a été associée à un risque accru de cardiopathie métabolique (CM) incluant arythmie, cardiopathie ischémique et insuffisance cardiaque. L'impact de la MASLD sur la CM va au-delà des facteurs de risque traditionnels et prédit de manière indépendante le risque de mortalité cardiovasculaire. Ces observations soulignent la nécessité d'étudier les liens entre la MASLD et la CM pour comprendre comment les troubles métaboliques hépatiques peuvent influencer la pathogénèse de la cardiopathie métabolique.

Bénéfices attendus

Les stéatopathies métaboliques (MASLD) sont en pleine expansion car elles sont très associées au développement de l’obésité et du diabète de type 2. Elles affectent environ 40 pourcent de la population mondiale. La morbi-mortalité cardiovasculaire représente la première cause de décès chez ces patients atteints de MASLD. Ce projet a pour but de comprendre le rôle d'un lipide particulier d’origine hépatique et de ses récepteurs cardiaques dans la physiopathologie de la cardiopathie métabolique. En effet, cet axe pourrait être une cible thérapeutique dans le traitement de ces maladies étant donné que des agonistes de cette voie existent actuellement sur le marché et sont utilisés dans le cadre de maladies auto-immunes et inflammatoire. Ce traitement déjà sur le marché pourrait avoir une extension de son indication pour les patients avec MASLD présentant une cardiopathie métabolique.

Procédures

Les animaux sont soumis à une injection pour l'administration d'un agent viral (sous anesthésie, une fois, quelques minutes) et seront nourris avec des régimes spéciaux (régime induisant une obésité, un foie gras, une inflammation hépatique (animal vigil, en continu pendant 16 à 24 semaines ) ou un traitement injectable pour induire une fibrose hépatique (animal vigil, 2 fois par semaine pendant 12 semaines, 1 minute). Pour les animaux recevant le traitement ou un placebo, une injection par jour sera réalisée pendant 12 à 24 semaines sur animal vigil, 1 min. Pour les souris sous traitement induisant une fibrose hépatique, le nombre d'injections est porté à 2 par jour 2 fois par semaine. Des explorations métaboliques seront réalisées pour explorer la sévérité du diabète (animal vigil, 2 fois car un pour le test de tolérance à l'insuline et un pour le test de tolérance au glucose), 6 prélèvements de sang de faible volume au total sur une période de 2h) ainsi que des analyses cardiaques (sous anesthésie, 2 fois car un pour l'enregistrement du rythme cardiaque à l'électrocardiogramme et un pour l'échographie cardiaque), 10 minutes). En fin de projet, un dernier prélèvement sanguin sera réalisé (animal anesthésié, 1 fois, 1 minute).

Impact sur les animaux

Les effets indésirables notoires seront 1) dans de rares cas, une détresse cardiorespiratoire à l’anesthésie (électrocardiogramme, échocardiographie) 2) les conséquences de la maladie hépatique (insulinorésistance, diabète, obésité) et les conséquences sur le coeur (arythmie, insuffisance cardiaque) 3) le stress et la douleur légère lié à la manipulation et la contention durant les tests métaboliques (tests de tolérance à l'insuline et test de tolérance au glucose), mise à jeun avec la sensation de faim, risque de lésion/irritation oesophagienne lors du gavage 4) le stress et la douleur légère de courte durée liée au prélévement de sang lors des tests métaboliques 5) la douleur ponctuelle liée à l'injection 6) risque de saignement ou d'hématome lors des injections.

Devenir

Une fois les explorations cardiaques réalisées au terme du régime et du traitement, les souris seront euthanasiées par une méthode réglementaire afin de prélever les tissus d’intérêt (tissus adipeux, foie et coeur) en vue d’analyses.

Remplacement

Le projet a pour but de comprendre l’influence du métabolisme hépatique en cas de MASLD sur l’activité cardiaque. Comme nous travaillons sur les modifications à l’échelle de l’organisme, il est nécessaire d’utiliser un modèle expérimental proche de la pathologie ciblée dans notre étude. Toutefois, des biopsies de tissu provenant d'études antérieures seront utilisées pour ne pas reproduire les expériences

Réduction

Le nombre total d’animaux sera de 960 souris. Ce nombre a été calculé grace à un test de puissance afin d'obtenir des résultats statistiquement fiables. Nous chercherons à regrouper les expérimentations dans le but de réduire le nombre d’animaux contrôles. L’étude sera arrêtée si les expériences initiales ne confortent pas l’hypothèse de travail.

Raffinement

Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation. Les animaux sont hébergés avec leurs congénères (l’hébergement individuel est limité au maximum) en portoirs ventilés avec un système d’abreuvement automatique et un accès ad libitum à la nourriture et l’eau (Changement de la litière, jusqu'à deux fois par semaine si nécessaire, en cas de souillure par les urines liée à l'apparition d'un diabète induit par les différents régimes/traitement Nourriture hydratée en fond de cage pour les animaux obèses ou qui perdent du poids). Le milieu est enrichi avec deux enrichissements minimum et les animaux sont vérifiés quotidiennement. Le projet a été mis au point afin de permettre une interprétation fiable des résultats dans le respect du bien-être animal. La douleur et le stress sont limités en apportant des soins adaptés (anesthésie) ainsi qu’une surveillance attentive accompagnée de points limites suffisamment prédictifs et précoces. Les souris sous régime ou traitement fibrotique seront surveillées quotidiennement. La prise de poids est effectuée de manière hebdomadaire. Les points limites sont évalués par un personnel compétent. Lors des anesthésies, application d'un gel olphtalmique pour la protection oculaire, utilisation tapis chauffant (37 degrés celcius) pour limiter l’hypothermie durant l'anesthésie

Choix des espèces

Le modèle murin est utilisé dans ce projet car les modèles génétiques d’obésité et de diabète ont été validés chez la souris. Sa physiologie est connue et il est bien décrit qu'un régime obésogène et ou diabétogène est capable d'induire une insulinorésistance quelques semaines après le régime. Les animaux seront étudiés à partir de 6-8 semaines de vie car atteinte de la maturité sexuelle et les souris sont métaboliquement stables (arrêt de la croissance), et pour la reproductibilité et standardisation des résultats internationaux (les études déjà publiées travaillant sur l'obésité et le diabète utilisent ces souris à partir de ces âges)

1 200 souris vont être utilisées, aucune maintenue en vie, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune subit une plaie chirurgicale de la peau sous anesthésie, avec une douleur estimée modérée pendant environ quatre heures, et certaines sont réanesthésiées deux fois par semaine pendant trois semaines pour changer le pansement, jusqu'à sept anesthésies. Le porteur attend de ce modèle de cicatrisation l'identification de nouveaux acteurs moléculaires, les applications contre les plaies chroniques ou la fibrose restant présentées comme des hypothèses pour de futurs projets. Il indique 12 souris par condition, calculées par un logiciel statistique, sans détailler ce qui conduit au total de 1 200.

Objectifs

Une meilleure compréhension des mécanismes permettant la réparation de la peau est un enjeu de santé publique. L'avancée de nos connaissances dans ce domaine pourrait permettre l’amélioration du traitement d’épisodes cliniques aiguës (brûlure, choc mécanique …) et chroniques (eczéma, psoriasis…) qui touchent une grande partie de la population. Malgré l’importance de ces processus, les mécanismes moléculaires impliqués dans la réparation tissulaire sont encore mal connus. Des données de la littérature montrent que certaines cellules de l’immunité produisent des molécules bénéfiques pour la cicatrisation. En étudiant ces cellules en culture dans le laboratoire, nous avons identifié un mécanisme qui pourrait contrôler la production des molécules bénéfiques pour la cicatrisation. Nous faisons l'hypothèse qu'à travers une étude plus poussée de ce mécanisme, nous pourrons faire progresser significativement notre compréhension globale des mécanismes de la réparation tissulaire et potentiellement identifier des cibles thérapeutiques. Le projet comporte deux objectifs : 1- déterminer si les résultats obtenus en culture sont valides dans une situation de réparation tissulaire physiologique dans l'animal, 2- identifier de nouveaux acteurs moléculaires de la cicatrisation. Pour atteindre ces objectifs, il est nécessaire d’utiliser un modèle de cicatrisation cutanée dans un animal modèle (la souris). Ce modèle reproduit les étapes de cicatrisation tissulaire observée chez l’Homme, et nous permet d'étudier les cellules et molécules d'intérêt dans un environnement complexe plus représentatif d’une situation physiologique. Nous comparerons des souris normales et des souris dans lesquelles les mécanismes étudiés ont été inactivés dans les cellules immunitaires. Ce projet permettra d’identifier de nouveaux acteurs moléculaires impliqués dans le processus de réparation tissulaire.

Bénéfices attendus

Grâce à ce projet, nous pourrons faire avancer de manière conséquente notre connaissance des mécanismes moléculaires qui régissent la réparation des tissues après une lésion. Les nouvelles molécules identifiées pourront être étudiées plus en détails dans de futurs projets, contribuant à l’avancée des connaissances scientifiques. De plus, il est établi que les cellules immunitaires jouent un rôle central dans les pathologies inflammatoires quand leur fonction réparatrice est altérée, par exemple dans les ulcères, les plaies chroniques des patients diabétiques, et les fibroses. De plus, cette fonction réparatrice est également diminuée chez les sujets âgés, sans que l’on en comprenne les mécanismes. Mieux connaître les acteurs moléculaires impliqués dans la réparation tissulaire dans les cellules immunitaires permettra ainsi de formuler de nouvelles hypothèses sur les causes de leur dysfonctionnement dans des conditions pathologiques. Les nouvelles molécules identifiées dans ce projet pourront ainsi représenter de nouveaux candidats pour des approches thérapeutiques afin d’améliorer la régénération tissulaire et d’empêcher la fibrose dans les pathologies inflammatoires chroniques.

Procédures

Chaque animal subira une chirurgie de la peau (une seule fois, 10 min). Chaque animal sera anesthésié le temps de la chirurgie (10 min). Certains animaux seront anesthésiés à nouveau afin d'observer la cicatrisation et de changer le pansement (3 min à chaque fois, 2 fois par semaine, pour une durée maximale de 3 semaines), le nombre maximal d'anesthésie gazeuse sera de 7 fois pour ces animaux.

Impact sur les animaux

Les animaux subiront une chirurgie de la peau (une seule fois), avec une douleur modérée d'une durée moyenne. Les nuisances attendues sont : stress de l'anesthésie (légère et rapide, 10 min), risque d'hypothermie (légère et rapide, 10 min) et douleur liée à une blessure cutanée (modérée et de moyenne durée, environ 4 heures). Pour les animaux qui seront suivis au cours du temps, le pansement sera changé sous anesthésie 2 fois par semaine, les nuisances attendues sont : stress de l'anesthésie (légère et rapide, 3 min), risque d'hypothermie (légère et rapide, 3 min).

Devenir

Aucun animal maintenu en vie. Les animaux sont mis à mort à la fin du suivi ou pour des analyses post-mortem.

Remplacement

Des données de la littérature montrent que les macrophages, chez l’Homme comme chez la souris, produisent des molécules bénéfiques pour la réparation tissulaire. Des expériences pilotes in vitro ont identifié des mécanismes moléculaires pouvant contrôler la production de ces molécules bénéfiques. Il est nécessaire de confirmer ces résultats dans un modèle in vivo. Il n’existe pas de méthode alternative pour réaliser ce travail qui nécessite l’analyse de tissus entiers. La peau est un tissu complexe qui comporte de nombreuses cellules qui interagissent afin de maintenir un équilibre. La dynamique du tissu cutané, des cellules immunitaires qu’il abrite ainsi que les interactions et le recrutement potentiel de cellules d’autres organes sont des conditions qui ne peuvent pas être adéquatement reproduites in vitro. De plus, le système immunitaire est un système dynamique dont les acteurs évoluent entre différentes localisations au sein de l’organisme selon des flux très précis. Enfin, certaines populations cellulaires du système immunitaire se spécialisent particulièrement en fonction de leur localisation, en particulier les macrophages. Ainsi, les macrophages de la peau ont certainement des propriétés différentes de celles de tout autre organe. Ni les modélisations mathématiques, ni les systèmes in vitro ne permettent de reproduire cela, ceci nous oblige donc à utiliser des animaux afin de comprendre les interactions cellulaires nécessaires pour la cicatrisation cutanée. Des expériences in vivo sont donc nécessaires pour compléter les découvertes obtenues in vitro. De plus, l’utilisation de modèle animal reste indispensable pour pouvoir aborder la phase d’application de nos découvertes en clinique.

Réduction

Le nombre de souris à utiliser a été calculé à l’aide d'un logiciel statistique, pour obéir aux minima nécessaires à des analyses statistiques valides, condition nécessaire pour une interprétation biologique des résultats. Le nombre de souris par condition est de 12 afin que les résultats obtenus puissent présenter une puissance statistique suffisante. Pour analyser le rôle de nos molécules d'intérêt dans la cicatrisation in vivo, nous analyserons dans un premier temps la cicatrisation de la plaie au cours du temps. Si nous mettons en évidence une différence significative entre souris déficientes et contrôles, nous poursuivrons les analyses. Dans le cas contraire, le projet s'arrêtera.

Raffinement

Les animaux seront maintenus dans des groupes de plusieurs individus dans un environnement enrichi. Dans le cadre de ce modèle de blessure cutanée, les animaux sont anesthésiés par un agent anesthésiant inhalable et un analgésique est administré aux animaux lors de la chirurgie. Les animaux sont placés sur un tapis chauffant pendant la chirurgie et le réveil afin d'éviter l'hypothermie. Des pansements adaptés sont utilisés (compresse stérile, pansement semi-occlusif et bandage de contention). Les animaux sont surveillés tous les jours pour l’état général, afin d’assurer leur bien-être et pour surveiller les éventuels signes de douleur, de souffrance ou de stress. Des soins post-opératoires spécifiques seront mis en place si nécessaire, tels que l'injection de solution réhydratante en cas de déshydratation ou traitement par antispetiques en cas d'infection de la plaie. Les animaux seront pesés et évalués deux fois par semaine grâce à une grille de score pour mesurer de façon objective la souffrance des animaux.

Choix des espèces

La souris est le modèle de choix car la physiologie de la souris est proche de celle de l’homme. D’autre part les mécanismes immunitaires sont bien caractérisés chez la souris, ce qui en fait un modèle particulièrement adapté pour étudier les cellules immunitaires. La connaissance complète du génome murin permet d’utiliser de nombreux outils bien caractérisés (telles que des souris déficientes pour les molécules d’intérêt ou des techniques d’analyse d’expression de gènes), ce qui sera particulièrement pertinent dans le cadre de ce projet. Les souris seront utilisées à l'âge adulte (de 8 à 12 semaines) afin que les souris aient fini leur croissance, et que les résultats ne soient pas affectés à cause de modifications dues à un âge trop avancé des animaux

Isolées en cage individuelle pendant deux semaines à l'adolescence, soumises à un stress aigu de six minutes, à des injections dans l'abdomen et à des incisions de la queue pour prélever du sang, 512 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Toutes sont tuées pour prélever leur cerveau. Certaines subissent deux chirurgies crâniennes, une à quatre semaines de vie et une cinq semaines plus tard, d'environ 35 et 40 minutes, pour implanter des dispositifs d'enregistrement neuronal. L'objectif est de savoir si l'isolement social pendant l'adolescence prédispose à l'anxiété à l'âge adulte, et le porteur écrit que les trois tests comportementaux, qu'il ne nomme pas, reposent sur des comportements innés et sont donc "sans effet indésirable attendu".

Objectifs

Il a été suggéré que l'isolement social durant la période adolescente constitue un facteur de risque au développement de troubles anxieux à l'âge adulte. Néanmoins la compréhension des mécanismes impliqués reste très parcellaire en raison de la nature observatoire et corrélationelle des études épidémiologiques disponibles à ce jour. Sur la base de ces observations, notre projet a pour objectif de mettre en place un modèle murin d'isolement social durant l'adolescence, d'en analyser les conséquences comportementales à long-terme en se concentrant sur le profil émotionnel, et de relier les potentiels dysfonctionnements comportementaux à une altération du développement de l'hippocampe, une structure clé pour le contrôle des états émotionnels. La réalisation de ce projet se déroulera dans 2 établissements utilisateurs (EU).

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettra de comprendre les déficits comportementaux associés à la privation sociale durant l'adolescence, et d'en aborder certains mécanismes. La compréhension de ces mécanismes devrait nous permettre à moyen terme de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques ciblant spécifiquement ces mécanismes, mais aussi de développer des interventions préventives visant à réduire les effects néfastes de l'isolement sur la santé mentale.

Procédures

1) Hébergement individuel: il sera d'une durée de 2 semaines et sera réalisé dans l'Etablissement utilisateur 1 (EU1). 2) Injections intrapéritonéales: elles sont au nombre de 3 à l'âge de 4 semaines et 5 à l'âge de 10 semaines. La durée moyenne d'une injection, préhension de la souris inclue est de 30-40 secondes. Les injections seront réalisées dans l'EU1. 3) Stress aigu d'une durée de 6 min ou hébergement individuel d'une durée de 24 h. Ces interventions sont réalisées dans l'EU1 et concernent des animaux différents. 4) Tests comportementaux: ils sont au nombre de 3, et durent de 5 à 10 min chacun. Ils sont réalisés dans l'EU1 ou l'EU2. 5) Prélèvements sanguins: ils sont au nombre de 4 , et durent moins de 3 min, préhension de l'animal inclue. Ils sont réalisés dans l'EU1 sur des animaux n'ayant subi aucun test au préalable. 6) Chirurgie: sur animal adulte une chirurgie de 60 min environ est pratiquée; sur animal adolescent 2 chirurgies sont pratiquées, une à 4 semaines d'une durée moyenne de 35 min et une au moins 5 semaines plus tard d'une durée de 40 min environ. Les chirurgies sont réalisées dans l'EU1.

Impact sur les animaux

1) L'hebergement individuel peut induire un état de stress de degré modéré puisque de courte durée. 2) Les injections intrapéritonéales peuvent engendrer un léger inconfort. 3) Le stress aigu sera à l'origine d'un incomfort passager, sans conséquences à long terme. 4) Les tests comportementaux sont basés sur les comportements innés des animaux et sont donc sans effet indésirable attendu. 5) Les prélèvements sanguins nécessitent une légère incision de la queue, ce qui peut entrainer une gêne et une légère douleur très locale et de très courte durée avec un risque très faible d'une hypovolémie / anémie en cas de saignement non maitrisé, ce que nous n'avons jamais observé par le passé. De plus, un saignement non maitrisé pourrait entrainer une hypovolémie / anémie, ce que nous n'avons jamais observé par le passé. 6) Les procédures chirurgicales, comme l'implantation de dispositifs pour l'enregistrement neuronal, comportent un risque de complications telles que des infections ou des réactions inflammatoires. Elles peuvent également générer de la détresse et du stress ainsi que de la douleur postopératoire d’un degré de gravité modéré, qui sera minoré par les antalgiques administrés.

Devenir

Les souris sont toutes euthanasiées en vue de prélever le cerveau pour analyse.

Remplacement

L’étude de comportements, notamment sociaux et relatifs aux emotions, ne peut être réalisée que sur animaux vivants ce qui rend impossible leur remplacement par des modèles in vitro ou in silico.

Réduction

Nous prévoyons d’utiliser le nombre minimal de souris nécessaire pour obtenir des analyses statistiques fiables et cohérentes. Pour les études comportementales, afin de réduire au maximum le nombre d'animaux utilisés, nous effectuerons lorsque cela est possible sans biaiser les résultats de l'experience plusieurs test sur les mêmes animaux.

Raffinement

Pour réduire la souffrance imposée par le protocole, les règles suivantes seront appliquées pour le bien-être des animaux: 1- En amont des tests comportementaux, toutes les souris seront habituées à l'expérimentateur par des pesées hebdomadaires. Elles seront acclimatées aux pièces de test pendant une durée d'au moins 45 min avant le démarrage des tests, et surveillées pendant au moins 30 min à l'issue des tests afin de détecter l'apparition d'une anomalie comportementale (stéréotypie, prostration, grooming excessif…). 2- Avant les chirurgies, un analgésique sera administré en sous-cutané, à titre préventif afin d’éviter la souffrance post-opératoire. 3- Les chirurgies se feront sous anesthésie générale. Durant la chirurgie, la température de l’animal sera contrôlée par une sonde durant la chirurgie, et maintenue grâce à un tapis chauffant. Un gel ophtalmique sera appliqué sur les yeux pour prévenir la déshydratation oculaire. Un analgésique sera injecté avant la chirurgie ainsi que 24h après. 4- Après la chirurgie, de la nourriture humidifiée sera mise à disposition au sol de la cage. L’état de l’animal et la bonne cicatrisation de l’incision dans la peau de la tête seront contrôlés quotidiennement pendant la semaine suivant la chirurgie. Des points limites ont été établis pour chaque critère avec un arbre de décision. Si l’animal perd du poids, de la nourriture enrichie humide sera fournie. Si la plaie ne cicatrise pas correctement, elle sera désinfectée et surveillée. Si la souris est en souffrance, un analgésique sera injecté. Si les anomalies persistent, le vétérinaire sera contacté afin de prendre les mesures les plus adaptées pour le bien-être de l’animal.

Choix des espèces

La neurogenèse dans le cerveau adulte, qui est notre candidat mécanistique pour expliquer les effets de l'isolement social, a été largement étudiée chez les rongeurs, lesquels représentent un modèle pertinent en raison de la similitude de leurs réponses physiologiques au stress avec celles des humains. Ils permettent ainsi une exploration intégrée des effets comportementaux, neurobiologiques et génétiques du stress. Par conséquent, la souris a été choisie comme modèle principal dans ce projet car 1) il est en continuité avec les études publiées sur des modèles équivalents , et 2) il permet l'utilisation d'outils transgeniques pour valider les hypothèses que nous pourrons formuler à l'issue des études. Les animaux seront utilisés à partir du sevrage puisque notre modèle a pour objectif d'étudier l'impact de l'isolement social à l'adolescence (P21-P35) sur la vulnérabilité / résilience à développer des troubles anxieux à l'âge adulte.

Des prises de sang toutes les six minutes pendant deux heures, deux séances d'IRM de deux heures et deux semaines d'isolement en cage individuelle après la pose chirurgicale d'une pompe sous la peau : 72 souris de 12 à 14 mois vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour analyser leur cerveau. Ces souris portent des mutations qui reproduisent des traits de la maladie d'Alzheimer et perdent progressivement leurs capacités cognitives. Le projet évalue si une hormone de la reproduction délivrée en continu restaure leurs connexions cérébrales, piste ouverte par des résultats obtenus chez des personnes porteuses d'une trisomie 21. Le porteur affirme qu'aucune alternative non animale ne permet de mesurer en même temps performances cognitives, connectivité cérébrale et effets secondaires.

Objectifs

La maladie d’Alzheimer (MA) est la démence la plus fréquente chez les personnes âgées. Sa prévalence augmente exponentiellement après 65 ans et elle touche 23% de la population après 80 ans. Compte tenu du vieillissement démographique, le nombre de personnes touchées pourrait doubler d’ici à 2050. Les mécanismes de neurodégénérescence évolutive de la MA ne sont pas encore clairement compris, néanmoins on sait que les phénomènes d’agrégation de protéines caractéristiques de la maladie sont responsables de modifications/pertes de connectivité entre différentes structures du cerveau avec des conséquences fonctionnelles. Il parait donc essentiel de comprendre et tenter de rétablir les connexions cérébrales dans cette maladie. Dans un modèle de souris mimant la MA, des troubles de la mémoire caractéristiques de la maladie évoluent progressivement entre 3 et 12 mois de vie. Une étude récente en Imagerie par Résonance Magnétique (IRM) a révélé que, dès 5 mois, ces souris présentent des modifications de la structure et de la fonction du cerveau. Par ailleurs, une diminution de la sécrétion d’une hormone, l’hormone principale de la reproduction (gonadotropin-releasing hormone) a été observée à l’âge de 12 mois chez ces animaux, période où les déficits cognitifs sont bien marqués. Récemment, il a été démontré que chez des patients atteints de trisomie 21, rétablir la libération pulsatile de GnRH à l’aide de pompe, améliore les connexions cérébrales ainsi que la cognition. Dans notre modèle de souris, ce traitement a permis de restaurer la mémoire à un niveau similaire à celui des animaux sains. L’objectif de ce projet est d’étudier par IRM l’effet d’un traitement hormonal de GnRH sur la structure et le fonctionnement du cerveau d’un modèle de souris génétiquement modifiée mimant la maladie d’Alzheimer. Ce projet se déroulera dans deux établissements utilisateurs (EU) différents EU1 et EU2. Plus précisément, nous chercherons à : • caractériser les modifications cérébrales de ces souris en lien avec la maladie d’Alzheimer, afin d’avoir une référence pour évaluer les effets du traitement ; • étudier l’impact du traitement sur la structure et le fonctionnement du cerveau, pour vérifier s’il améliore ces paramètres. Pour cela, nous réaliserons des images cérébrales par IRM avant et après le traitement hormonal afin d’observer d’éventuels changements dans l’anatomie et les connexions du cerveau.

Bénéfices attendus

Près de 70 millions de personnes dans le monde sont atteintes de la maladie d'Alzheimer, et aucun traitement réellement efficace n'existe à ce jour. Les thérapies actuelles, notamment celles visant à éliminer certaines protéines impliquées dans la maladie, n'ont montré que des effets limités. Face à cette situation, les professionnels de santé disposent de peu d’options pour soulager les patients, tandis que leurs proches doivent faire face à une évolution inexorable de la maladie. Un traitement hormonal, déjà testé avec succès dans une autre maladie neurologique (la trisomie 21), pourrait offrir une nouvelle piste. En étudiant son effet sur un modèle de souris, nous espérons mieux comprendre son impact sur le cerveau et ouvrir la voie à un essai clinique chez l’humain. L’objectif est de développer une approche qui améliore la qualité de vie des patients et offre un nouvel espoir aux familles concernées.

Procédures

Afin d’évaluer la perte cognitive (anxiété/locomotion), la mémoire spatiale à court terme et la discrimination d’odeurs, des tests comportementaux (maximum trois tests, espacés d’au moins deux jours) seront réalisés dans l’EU2 chez les souris, tous les deux mois à partir de l’âge de 4 mois. La durée maximale d’un test est de 15 minutes. À l’âge de 12 à 14 mois, les souris seront transférées sur le site de l’EU1. Les interventions ci-dessous se dérouleront dans l’EU1. Les animaux seront soumis à une chirurgie courte sous anesthésie générale de 25 minutes pour implanter une petite pompe pour délivrer le traitement . Après la chirurgie les animaux seront placés dans des cages individuelles pendant deux semaines . Les souris subiront deux sessions d’IRM, espacées de 15 jours : une avant et une après le traitement. Le passage en IRM est prévu pour une durée moyenne de deux heures, sous anesthésie. Entre les deux sessions d’IRM, les animaux seront soumis à des tests comportementaux visant à évaluer différentes fonctions cognitives et motrices. Ces tests seront réalisés dans un environnement calme, après une période d’habituation de 30 minutes pour limiter le stress. Chaque souris passera 2 tests, espacés d’au moins deux jours pour éviter toute surcharge.. Afin de s’assurer de l’efficacité du traitement, les animaux subiront 4 jours après le début du traitement, des prélèvements de sang toutes les 6 minutes pendant 2h Les surfaces et équipements seront nettoyés entre chaque passage pour éviter toute influence extérieure. Deux prélèvements vaginaux seront effectués après la première et la deuxième IRM. La durée du prélèvement vaginal est de 3 secondes.

Impact sur les animaux

La chirurgie nécessaire à l’implantation de la pompe sous la peau pour délivrer le traitement peut générer de la douleur chez l’animal. Les lavements vaginaux sont non douloureux mais peuvent être inconfortables pour la souris. Les prises de sang peuvent générer une douleur ponctuelle au moment de la piqure. L’hébergement en cage individuelle peut provoquer un stress. Les tests de comportement consistant à déterminer l’activité locomotrice, l’anxiété et le stress des souris ou les performances cognitives peuvent entraîner une augmentation temporaire du stress. Une légère réduction de l’activité spontanée peut être observée après certaines manipulations, mais celle-ci reste transitoire. Les sessions d’IRM, bien que réalisées sous anesthésie pour éviter tout inconfort, nécessitent une récupération progressive de l’animal après l’examen. Toute manipulation des animaux peut provoquer du stress, de la fatigue et de l’inconfort. Notre modèle de souris mime la maladie d’Alzheimer avec une perte des fonctions cognitives progressives, à partir de 3 mois et maximale à 12 mois.

Devenir

À l’issue du protocole, toutes les souris seront mises à mort afin de procéder à des analyses anatomiques et histologiques. Ces analyses sont indispensables pour compléter les données d’imagerie et vérifier les effets du traitement à un niveau cellulaire et tissulaire. L’examen des structures cérébrales permettra d’évaluer d’éventuelles modifications induites par le traitement, telles que des changements dans l’intégrité des tissus ou la connectivité entre différentes régions du cerveau. De plus, des analyses histologiques permettront d’étudier des marqueurs spécifiques impliqués dans la maladie, afin de mieux comprendre les mécanismes d’action du traitement et d’évaluer son potentiel pour une application clinique future.

Remplacement

Nous étudions les effets d’un traitement sur la structure et le fonctionnement du cerveau chez un modèle préclinique de souris afin d’évaluer son efficacité et sa sécurité avant d’envisager des études cliniques chez l’humain. À ce jour, il n’existe pas d’alternatives non animales permettant de mesurer simultanément les performances cognitives, la connectivité cérébrale et d’éventuels effets secondaires du traitement. Les approches in silico ou in vitro, bien qu’utiles pour certaines analyses moléculaires et cellulaires, ne permettent pas d’étudier l’effet global du traitement sur un organisme vivant. L’utilisation d’un modèle animal est donc nécessaire pour évaluer l’impact du traitement sur les fonctions cérébrales, identifier d’éventuels effets indésirables et déterminer les conditions optimales d’administration. Ces données sont essentielles pour mieux comprendre les mécanismes d’action du traitement et appuyer son éventuelle application clinique.

Réduction

Notre recherche vise à explorer des processus physiologiques et physiopathologiques de l’anatomie cérébrale et de sa fonctionnalité en réponse à l’administration du traitement hormonal. Nous avons déterminé le nombre d’animaux nécessaire et suffisant en fonction des nécessités expérimentales pour réaliser des statistiques significatives. Nous avons choisi une méthode permettant de faire un suivi au cours du temps. Ainsi, les mêmes souris sont utilisées pour la première IRM, pour le traitement et pour l’observation des effets du traitement après la seconde IRM. De plus, l’IRM est une méthode qui permet de regarder de nombreux paramètres sur un même animal : la structure et le fonctionnement du cerveau et tous les paramètres cérébraux qui pourraient être modulés avec le traitement. Cela permet de réduire considérablement le nombre d’animaux et le nombre d’expériences à réaliser pour obtenir ces informations si nous n’avions pas recours à l’IRM.

Raffinement

Les animaux seront habitués dès leur plus jeune âge à être manipulés par le même chercheur qui ne changera pas au cours du protocole. Ils seront manipulés par cette personne pour s’habituer à lui et à son odeur. Cela permet de limiter le stress de la souris lorsqu’elle commence le protocole. Les souris devront être transportées entre deux animalerie où le projet se réalise. Un raffinement sera apporté lors du transport. Un temps de 15 jours sera laissé pour leur permettre de s’habituer à la nouvelle animalerie et se remettre du stress généré par le transport. Les animaux seront hébergés dans une animalerie agréée conventionnelle, en groupe jusqu’à la chirurgie puis placés dans des cages individuelles. Les animaux seront de nouveau manipulés par le chercheur pour se réhabituer à lui dans la nouvelle animalerie. Une première IRM sera réalisée par une personne qualifiée et spécialiste de la pratique de cet examen chez la souris. L’IRM n’est ni invasive, ni douloureuse et se déroulera sous simple anesthésie générale. Les souris subiront ensuite une chirurgie courte pour implanter les pompes sous cutanées permettant de délivrer le traitement. La chirurgie se fera sous anesthésie générale avec application d’un antiseptique sur la plaie pour éviter tout risque d’infection. Pour la prise en charge de la douleur, une analgésie sera assurée 30 minutes avant la procédure. Une ré-administration pourra être effectuée si nécessaire, selon l’évaluation clinique des animaux. Si des signes de douleurs persistants se manifestent, l’animal sera sorti du protocole. Mise en place de points limites précoces. La seconde IRM se pratiquera dans les mêmes conditions que la première. La mise à mort sera effectuée par un chercheur habitué à réaliser cette intervention et après injection d’un analgésique et sous anesthésie

Choix des espèces

Le protocole d’étude du traitement hormonal (GnRH) a été mis au point chez la souris, nous gardons cette espèce pour obtenir une répétabilité du protocole dans des conditions identiques. Le traitement est étudié chez un modèle génétiquement modifié qui permet d’obtenir un phénotype mimant des traits pathologiques de la maladie d’Alzheimer (MA), pathologie pour laquelle nous étudions le traitement. L’utilisation de souris génétiquement modifiées est donc indispensable à l’étude du traitement en phase pré-clinique. Les animaux utilisés sont des adultes de 3 à 15 mois ; en effet l’étude de l’hormone GnRH dans ce modèle de souris nécessite d’utiliser des animaux adultes qui commencent à développer des altérations cognitives marquées autour de l’âge de 12 mois et ces troubles persistent jusqu’à la fin de la vie de l’animal. Nous avons déjà des données préliminaires dans cette tranche d’âge et pour pouvoir comparer les données il est nécessaire de respecter cette limite d’âge.

Chacune des 960 souris de ce projet finit le crâne incisé sous anesthésie profonde, sans réveil, pour une observation au microscope pouvant durer trois heures. Les procédures sont déclarées d'un niveau de souffrance modéré et aucune souris ne reste en vie. Avant cette chirurgie terminale, certaines reçoivent chaque semaine pendant trois semaines un agent qui provoque une fibrose de la moelle osseuse, ou une chimiothérapie, ou dix injections quotidiennes destinées à inactiver un gène. Le porteur situe le bénéfice immédiat du côté de la connaissance de ces vaisseaux et renvoie les retombées pour les patients, meilleure prise de greffe ou freinage des métastases, à un horizon lointain.

Objectifs

Nous nous intéressons à la barrière sang-moelle osseuse formée par les vaisseaux sanguins dans la moelle osseuse. Ces vaisseaux sont le site unique d’entrée dans la circulation de toutes les cellules sanguines et le site d'entrée dans la moelle lors des greffes de cellules souches. Comment les cellules de ces vaisseaux maintiennent leur fonction de barrière tout en étant perpétuellement sujettes aux cellules qui les traversent est peu étudié. Il est particulièrement important d’entreprendre ces études car différentes maladies modifient les propriétés de la moelle et sont susceptibles de modifier la fonction de barrière de ces vaisseaux. Nous avons déjà mis en évidence que dans des modèles de maladies de moelle osseuse, mimant les cancers de la moelle (myélofibrose) ou la chimiothérapie, ces vaisseaux sont modifiés, avec modifications de l’expression de différentes protéines. Les objectifs globaux du projet sont d’évaluer si et comment ces conditions pathologiques que l'on retrouve chez l'homme (myélofibrose, chimiothérapie) impactent la fonction de perméabilité des vaisseaux aux molécules et aux cellules. Nous étudierons cet aspect chez la souris à l’état de base et après avoir induit la myélofibrose ou la chimiothérapie. La perméabilité aux molécules sera évaluée par la mise en place de modèles d’injection de colorant puis observation par microscopie intravitale . Pour étudier le rôle des protéines d'intérêt, nous disposons de souris génétiquement modifiées pour ces protéines et chercherons à évaluer la perméabilité de leurs vaisseaux par comparaison avec les souris contrôles appropriées.

Bénéfices attendus

A l’heure actuelle, très peu de choses sont connues sur la biologie des vaisseaux de moelle osseuse, du fait de leur rareté et de la difficulté de les isoler et de les cultiver. Ce projet permettra de mettre en lumière le comportement de ces vaisseaux, comprendre comment ils tolèrent le passage incessant des cellules sanguines matures dans la circulation tout en maintenant leur rôle de barrière sanguine. Les bénéfices à court terme sont de comprendre les mécanismes qui régulent cette barrière. Les bénéfices à long terme visent 1) les patients développant une myélofibrose ou traités par chimiothérapie, avec la possibilité de pouvoir favoriser ou freiner l'entrée des cellules sanguines dans la circulation; 2) l’extravasation de cellules dans la moelle: en comprenant le comportement de cette barrière, on pourra envisager de la moduler pour par ex. accélérer/améliorer la prise de greffe de cellules souches hématopoiétiques, ou à l’inverse freiner l’entrée de cellules tumorales circulantes qui provoquent des métastases dans la moelle osseuse.

Procédures

Induction de la myélofibrose: injections d'un agent stimulant la production de plaquette, 1 fois par semaine pendant 3 semaines, sur animaux vigiles (3 secondes). Traitement chimiothérapeutique: injection unique sur souris vigile (3 secondes). Inactivation d'un gène: injections sur souris vigile (temps d'injection 5 secondes), une fois par jour pendant 10 jours consécutifs. Anesthésie profonde pour chirurgie terminale et observation de la fluorescence : analgésique: injection unique sur souris vigile (sc 3 secondes), anesthésiant: injection unique sur souris vigile ( 3 secondes), pas de réveil jusqu'à la fin de la procédure chirurgicale et de l'observation. La chirurgie par elle-même dure 15 minutes. L'observation par microscopie se fait en température thermostatée à 37°C, pendant 3h au maximum.

Impact sur les animaux

Injection des médicaments sur souris vigile: nécessite la contention de l'animal, ce qui entraine un stress et une douleur légère de courte durée au point d'injection. Chirurgie: déshydratation liée à l'anesthésie

Devenir

L'imagerie intravitale nécessite une chirurgie et l'incision de la peau du crâne, ainsi que l'injection systémique de colorants et marqueurs vasculaires. Nous optons pour une procédure terminale 1) pour éviter toute souffrance au réveil liée à la suture des tissus; 2) les souris ne sont pas réutilisables dans d'autres expériences du fait de possibles interférences/artéfacts liés aux injections des produits.

Remplacement

Ce projet repose sur un mécanisme complexe faisant intervenir non seulement les cellules endothéliales en tant que telles mais également le contexte physiologique ou pathologique (propriétés biochimiques et mécaniques du tissu médullaire, flux sanguin , réseau microvasculaire extrêmement dense, myélofibrose, myélosuppression,…), et sur animal vivant. De ce fait, ces expériences sont irremplaçables, il n'existe pas encore de modèle au point permettant de recréer toutes cette complexité. En outre, nous utilisons des modèles de souris inactivées pour des gènes ou mimant une mutation humaine.

Réduction

Les méthodes pour visualiser la perméabilité vasculaire sont bien décrites dans la littérature et nous nous y réfèrerons concernant les doses à injecter, donc nous ne prévoyons pas d'étude pilote. Le nombre d’animaux sera réduit au minimum par l’emploi de méthodes statistiques adaptées et d'après notre expérience passée utilisant cette technique, et par la possibilité de pouvoir observer sous le microscopes différents champs pour une même souris.

Raffinement

Le stress et la douleur de tous les animaux utilisés dans ce projet sont pris en compte et sera minimisé : - Par l’hébergement dans des cages en fonction des groupes sociaux. Ces cages seront munies de particules de bois et enrichies avec des carrés de cellulose, bâtonnets de coton, frisure de papier, ce qui leur permet d’organiser leur environnement selon leurs besoins. Les animaux sont entre 2 et 3 par cage afin d’éviter le stress causé par l’isolement. Après chaque injection, on leur apportera à leur réveil de la nourriture apétente en gel, comme forme de "récompense". - - Par l'utilisation de dispositifs de contention non stressant pour l'animal. -Par une anesthésie et une analgésie de l’animal avant l’injection de certains traitements. - Par l’installation de l’animal sur une plaque chauffée à 38°C afin lutter contre l’hypothermie pendant tous les gestes sur animaux anesthésiés. Pendant toutes les expérimentations, les animaux sont surveillés par du personnel entrainé pour vérifier l’absence de signe de douleur grâce à des points limites spécifiques établis pour chaque procédure. Ces points limites, s'ils sont atteints, permettront de soustraire l’animal aux procédures expérimentales et ainsi limiter sa souffrance.

Choix des espèces

La moelle osseuse de la souris reproduit la complexité de celle de l'homme. L'os du crâne de la souris est très fin et donc translucide, ce qui nous permet de visualiser les vaisseaux sanguins de la moelle par fluorescence directement à travers l'os intact, sans avoir recours à une chirurgie lourde. Nous disposons de souris génétiquement modifiées pour nos gènes d'intérêt. Les souris seront observée au stade jeune adulte (8-18 semaines) car la vascularisation de la moelle se modifie avec le vieillissement.

Une vingtaine de prises de sang à la queue, des injections dans le sinus situé derrière l'œil, un gavage de glucose et trois injections dans l'abdomen attendent chacune des 96 souris de ce protocole. Génétiquement modifiées pour accumuler le cholestérol, elles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et toutes tuées. Le porteur qualifie ce phénotype de "silencieux, sans altération du bien-être de l'animal" et précise que les plaques restent stables chez la souris, sans infarctus ni accident vasculaire cérébral, ce qui ne l'empêche pas de présenter le projet comme une étude des conséquences cardiovasculaires. Les aortes sont prélevées après la mise à mort, l'échographie ne donnant rien chez la souris.

Objectifs

Notre projet évaluera l'importance d'un gène du foie (PGS1) sur le développement de l'athérosclérose et des maladies cardiovasculaires chez la souris.

Bénéfices attendus

Sur la base des données génétiques humaines ainsi qu’aux connaissances préliminaires générées, le projet fera la lumière sur les effets de Pgs1 sur les lipides sanguins et les conséquences métaboliques (athérosclérose et maladies cardiovasculaires). Le projet permettra de faire avancer les connaissances scientifiques sur l’implication de Pgs1 dans la régulation de mécanismes physiologiques impliqués. De plus, si, comme nous le prévoyons, l'inhibition de Pgs1 conduit à des bénéfices globaux sur maladies cardiovasculaires, ce travail représentera une pierre angulaire dans la valeur de PGS1 en tant que candidat prioritaire pour l'intervention pharmaceutique chez les patients ayant des besoins médicaux non satisfaits contre les maladies cardiovasculaires liées aux lipides.

Procédures

Au maximum, une vingtaine de prélèvements de sang d'une durée inférieure à 30 secondes (sur animaux vigiles après anesthésie cutanée locale) seront au maximum réalisé par souris sur la durée du protocole. Les souris subiront au cours du protocole également une injection intraveineuse (10 secondes par injection IV), un gavage oral (5 secondes par gavage) et trois injections intrapéritonéales (5 secondes par injection IP).

Impact sur les animaux

Les procédures de ce protocole sont de classe modérée. Les souris Ldlr-/-sont hypercholestérolémiques et prédisposées à l’athérosclérose mais ce phénotype est silencieux, sans altération du bien-être de l’animal. De plus contrairement à l’homme, les plaques d’athérosclérose sont stables chez la souris et n’entrainent pas de maladies cardiovasculaires telles que l’infarctus du myocarde, l’accident vasculaire cérébral ou l’artérite du membre inférieur (postérieur). De plus, les expériences précédemment réalisées n’ont pas identifié d’effets indésirables suite à l’inhibition hépatique de PGS1. Les principaux effets indésirables prévus pour les animaux, concernent le stress et les douleurs induits par les prélèvements sanguins à la queue, les injections ainsi que l’administration d’un bolus de glucose par gavage. Les injections seront réalisées par une personne expérimentée dans le sinus rétro-orbital (seringue à insuline) sous anesthésie (isoflurane). Cette zone d’injection est préférée aux autres (veine péniennes ou caudale) pour des raisons de comparaisons intersexe ainsi qu’une meilleure expérience sur la distribution des virus. Afin de limiter la souffrance liée à la répétition des injections, nous utiliserons des seringues microfines, ferons varier variation les points d’injection et les volumes injectés (d’insuline et de tyloxapol) seront faibles.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à l’issu du protocole. L’objectif principal est de mesurer les conséquences de notre traitement sur le développement de la plaque d’athérosclérose au niveau de l’aorte. Les méthodes non invasives type échographie n’étant pas applicable avec succès sur le modèle murin, il nous est nécessaire de collecter chirurgicalement les aortes pour mesurer l’étendue des lésions par explorations histologiques.

Remplacement

Les données déjà obtenues par analyse génétique semblent valider notre hypothèse sur l’effet fonctionnel de PGS1 et nous pousse à explorer son action dans un système complexe. En effet, les pathologies cardiométaboliques résultent de processus intégrés et de communications inter-organes, impossibles à modéliser in-vitro avec les méthodes actuelles. Ainsi, l’utilisation de modèles animaux intégrés reste indispensable.

Réduction

Ce projet a été construit avec la volonté de mettre en place et de respecter « la règle des 3 R ». Seules les expériences absolument indispensables au succès du projet seront mises en oeuvre. Le nombre d’animaux nécessaires pour chaque expérimentation a été défini en fonction de notre expérience passée. Nous avons pris soin d’optimiser au mieux nos expérimentations en choisissant les lignées murines les plus adaptées à l’étude.

Raffinement

Nous avons pris en compte le bien-être animal, une visite quotidienne des animaux par les zootechniciens formés permettra de prévenir les risques de stress et de souffrance. De plus un examen clinique hebdomadaire sera réalisé par les responsables du protocole de recherche. Nous avons intégré la gestion de la souffrance animale en utilisant des procédures adaptées, notamment anesthésiques pour les injections virales et avant la mise à mort des animaux et analgésiques pour les prélèvements sanguins. Des signes cliniques définissant les points limites, au-delà desquels l’expérimentation serait arrêtée et l’animal mis à mort, ont été fixés et résumés en Annexe. Nous utilisons des cages avec litières et des enrichissements (frisottis et un igloo ou un tube tunnel, en polycarbonate) et les animaux sont hébergés et maintenus en groupes sociaux.

Choix des espèces

Le modèle intégré animal est nécessaire pour tester les effets systémiques cardiovasculaires de l’inhibition de Pgs1. De plus, le modèle murin Ldlr-/- est un modèle de choix d’athérosclérose disponible au sein de l’équipe de recherche. En effet, le métabolisme lipidique murin protège les souris sauvages de l’accumulation de cholestérol dans le système vasculaire ne permettant pas l’observation de plaque d’athérosclérose. Les animaux débuteront le protocole de recherche à 8 semaines d’âge de façon à travailler sur des animaux adultes. Le but de ce travail n’étant pas de déterminer l’effet de l’inhibition de Pgs1 au cours du développement.

Une injection de virus dans la région de l'œil, sous anesthésie, ouvre le protocole pour 448 souris, dont la moitié porte des mutations reproduisant la maladie d'Alzheimer. Toutes vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, puis tuées à sept mois pour prélever leur sang et leur cerveau. L'injection peut provoquer un saignement oculaire et une inflammation, avec œil fermé et écoulement. Le porteur annonce quatre tests comportementaux de 8 à 70 minutes portant sur l'exploration et la mémorisation, sans préciser lesquels.

Objectifs

La maladie d’Alzheimer MA est une maladie neurodégénérative, au cours de laquelle les cellules du cerveau dégénèrent. Elle affecte environ 1 million de personnes en France et il n’existe aucun traitement efficace à ce jour. Notre activité de recherche est dédiée à l'étude des mécanismes cellulaires impliqués dans la MA. L’objectif est de comprendre le fonctionnement de cette maladie, afin de trouver des moyens d’action dans le système nerveux qui permettront de ralentir le développement de la MA.

Bénéfices attendus

L’objectif final est d'améliorer la qualité de vie des personnes atteintes par la MA. Les bénéfices à plus court terme, concernent d'une part la compréhension des mécanismes de fonctionnement de la MA et d'autre part de trouver des moyens d’action sur le système pour réduire le développement et l’agressivité de la MA.

Procédures

Les jeunes adultes de 3 mois recevront une injection unique (durée une minute) sous anesthésie gazeuse, d'un virus qui a pour effet de retarder l'apparition des symptômes de la MA. A l'âge de 6,5 mois, les animaux subiront 4 tests comportementaux dont la durée varie entre 8 minutes et 70 minutes. La finalité de ces tests consiste à étudier l'activité d'exploration et la mémorisation. A la fin de la procédure, tous les animaux seront anesthésiés en vue d'un prélèvement sanguin et d'une perfusion.

Impact sur les animaux

L'injection du virus est susceptible de provoquer un stress lié à la manipulation de l'animal, un saignement oculaire, une inflammation (oeil fermé, écoulement oculaire...). Les tests comportementaux peuvent être à l'origine de stress de courte durée qui s'atténuera avec la fréquence des séances d'habituation des animaux.

Devenir

A l’issue de la procédure, tous les animaux seront mis à mort sous anesthésie générale profonde pour réaliser des prélèvements de sang et de tissus cérébral à des fins d'histologie. Ceci permettra de comprendre les mécanismes impliqués dans la maladie d'Alzheimer.

Remplacement

Bien que des progrès considérables aient été faits dans la modélisation des pathologies à l’aide de systèmes cellulaires et moléculaires innovants, ces modèles ne fournissent que des informations très partielles. Il est encore à ce jour indispensable d’utiliser des animaux pour mieux appréhender la complexité des interactions cellulaires et moléculaires et développer de nouvelles thérapies adéquates pour traiter des maladies neurodégénératives comme la MA. En ce sens, nous développons aussi des approches expérimentales in vitro dont les résultats doivent dans tous les cas être confortés in vivo. L’efficacité de futurs traitements originaux doit se traduire par une amélioration biologique/histologique et comportementale dans des modèles murins, notamment le modèle souris de la MA. Ces souris représentent un modèle de choix pour l’étude de la maladie car elles développent rapidement une MA expérimentale (dès 2 mois), laquelle est similaire à celle observée chez l’homme.

Réduction

Le nombre de lots expérimentaux et d'animaux au total : souris Contrôles (mâles+ femelles) n= 7 groupes x32 souris = 224 - souris modèle Alzheimer (mâles+ femelles) n= 7 groupes x32 souris = 224 Soit 448 animaux. Ce nombre d'animaux a été réduit à son minimum pour pouvoir être validé d’un point de vue statistique notamment pour les études comportementales, d'autant que nous travaillons sur des souris issues de plusieurs reproductions.

Raffinement

Les souris seront hébergées sous environnement contrôlé, dans des cages enrichies (dômes en papier, nids végétaux à base de fibres courtes de coton). Une observation quotidienne des animaux sera effectuée pour s’assurer de leur bien-être. Au cours de l'injection dans la région de l'oeil, chaque souris sera préalablement anesthésiée et recevra une goutte de collyre (anesthésie locale). Suite à l'injection, une attention particulière sera accordée aux yeux lors de l'observation quotidienne afin d'identifier de possibles effets indésirables (œil fermé, saignement, inflammation, écoulement oculaire…). Toutes les évaluations de l'état des animaux seront faites selon une grille d'évaluation adaptée. Préalablement aux tests comportementaux, les souris seront habituées à la préhension et à l'expérimentateur.

Choix des espèces

Les souris constituent des modèles de choix pour notre travail car elles sont couramment utilisées comme modèles de la MA, ainsi que comme modèle pré-clinique pour tester les effets in vivo de molécules thérapeutiques potentielles. Pour nos études, nous utiliserons des souris sauvages et des souris génétiquement modifiées modèle de la maladie d’Alzheimer. Les animaux seront utilisés à 4 stades : 1) Stade jeune adulte 3 mois, dans lequel une injection sera faite, permettant ainsi l’expression des variants de protéines d’intérêt dans les neurones. 2) Stade adulte 4 mois afin de tester des stades intermédiaires sans participer aux tests comportementaux. 3) Stade adulte à l’âge de 7 mois. Cet âge représente une phase de la maladie dans laquelle nous observons des marques évidentes de la pathologie, aussi bien au niveau comportemental que biochimique et histopathologique. Le comportement des animaux sera testé à partir de 6,5 mois, et ce pendant environ 15 jours. 4) Stade adulte à l'âge de 7 mois. A ce stade les animaux seront mis à mort.