Souris
Création de modèles de rongeurs génétiquement modifiés et études aux stades embryonnaires précoces
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
Des souris femelles de quatre semaines reçoivent deux injections hormonales en 48 heures pour fournir des embryons, le porteur décrivant cet âge prépubère comme celui d'une réceptivité optimale. 1 630 souris vont être utilisées, 1 240 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger et 390 un niveau modéré. D'autres femelles subissent une chirurgie de quinze minutes pour recevoir les embryons transplantés et des mâles la même chirurgie pour être vasectomisés, avec environ une semaine de douleurs de cicatrisation, alors que des embryons congelés et des mâles déjà vasectomisés peuvent être commandés à des fournisseurs. Toutes et tous sont tués à l'issue, soit pour récupérer les embryons, soit parce qu'après la chirurgie ils ne pourront plus servir à un autre projet.
Objectifs
Notre institut étudie les mécanismes qui régulent l’ADN, aussi bien dans des conditions normales que pathologiques. Ces approches contribuent à une meilleure compréhension des grandes fonctions biologiques, notamment le développement, la fabrication de gamètes (spermatozoïdes et ovocytes) et certaines pathologies associées, comme les cancers. Cette demande d’autorisation de projet est de type générique de service pour 2 objectifs : 1) étudier des gènes candidats à des stades embryonnaires précoces (avant l’implantatoire dans l’utérus) et 2) développer des modèles animaux génétiquement modifiés.
Bénéfices attendus
Notre projet va consister à créer des souris génétiquement modifiées. En effet, notre institut s’appuie principalement sur des modèles in vitro. Il est essentiel de pouvoir, dans un second temps, étudier des pathologies sur un organisme entiers et un mammifère comme la souris. Ce projet produira ces modèles animaux qui seront étudier de façon approfondie pour mieux comprendre et tester des pistes thérapeutiques sur des maladies génétiques.
Procédures
Des femelles donneuses d’embryons recevront deux injections (moins d’une minute) sur 48 heures pour effectuer des stimulations hormonales. Des femelles porteuses subiront une chirurgie (15 minutes maximum) pour transplanter les embryons Des mâles subiront une chirurgie (15 minutes maximum) pour être rendus stériles (par vasectomie) pour stimuler par accouplement les futurs femelles porteuses.
Impact sur les animaux
La production d’embryons requiert une synchronisation et une stimulation hormonale, réalisée par deux injections intrapéritonéales. Cette intervention peut provoquer une douleur légère et de courte durée, mais le traitement hormonal n’entraîne pas de nuisance significative pour l’animal. Les deux chirurgies (implantation des embryons et vasectomie) seront sous anesthésie et analgésie prolongée mais peuvent induire des effets indésirables, notamment des douleurs et des inconforts de la cicatrisation (durant une semaine environ).
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort, soit pour récupérer les embryons, soit pour les animaux qui auront une chirurgie car ils ne pourront plus être utilisés pour d’autres projets
Remplacement
L’Institut développe principalement des modèles in vitro cellulaires, tels que la modification et l’étude des cellules souches embryonnaires. Il est également à la pointe du développement de modèles de substitution, notamment les organoïdes, grâce à l’hébergement d’un service dédié de plateforme Organoïdes. Cependant, ces approches présentent certaines limitesnotament lorsqu'il y a une implcation physiologique faisant intervenir plusieurs types cellulaires. Par ailleurs, dans une perspective préclinique, il est essentiel de disposer de modèles pathologiques pour approfondir l’étude des mécanismes biologiques et de leurs dérèglements. C’est dans ce contexte que le service sera sollicité pour réaliser des expérimentations préimplantatoires ou pour générer des souris transgéniques.
Réduction
De façon générale, nous nous assurerons que les modèles qui nous seront demandés n’existent déjà pas dans les bases de données pour éviter les doublons. Les techniques de transgénèse bénéficient de près de 35 ans de développement. Dans le cadre de la création de lignées, la détermination des lots – incluant la stimulation hormonale et les chirurgies – repose sur des données empiriques basées sur des moyennes établies. À l’issue d’une session de transgénèse, environ 5 à 10 souris transgéniques sont obtenues à partir d’une cinquantaine d’embryons injectés. Au fil du temps, ces techniques ont considérablement évolué, permettant des réductions à différents niveaux. Tout d’abord, pour la production des embryons, elle ne sera réalisée que dans deux cas spécifiques : - Lorsque l’utilisation d’embryons issus de nos lignées transgéniques est nécessaire. - En cas de rupture de stock chez les fournisseurs. En effet, ces derniers proposent désormais des embryons préimplantatoires congelés de différentes souches et à divers stades de développement. Nos tests ont montré qu’ils répondent remarquablement bien aux besoins expérimentaux. Cette solution offre un meilleur contrôle du nombre d’embryons et des dates d’expérimentation, tout en éliminant les contraintes liées à la disponibilité des femelles. Par ailleurs, le protocole classique de stimulation hormonale permet déjà de doubler le nombre d’embryons obtenus, nécessitant environ 8 femelles par session d’injection. À l’avenir, nous envisageons de tester une autre hormone, qui pourrait permettre d’obtenir jusqu’à 100 embryons à partir d’une seule femelle. Nous ne souhaitons pas y passer maintenant car son utilisation nécessite une mise au point qui pourra être plus ou moins longue ralentissant le projet au début. L’utilisation de cette hormone réduira donc au finale le nombre de femelle nécessaire pour produire des embryons. Enfin, la procédure de vasectomie ne devrait pas être réalisée, car nous prévoyons de commander des mâles vasectomisés auprès de fournisseurs spécialisés, ce qui réduira le nombre d'animaux utilisé dans le périmètre de ce projet. Toutefois, en cas de rupture de stock ou si ces mâles ne répondent pas à nos attentes (notamment en raison d’un faible taux de bouchons vaginaux chez les femelles), nous pourrions envisager de réaliser cette procédure en interne.
Raffinement
Les injections sont réalisées avec un faible volume (0,1 ml). Après chaque injection sur les femelles sous contention, une observation est effectuée pour vérifier la reprise normale de leur activité. Les chirurgies sont pratiquées sous une anesthésie et analgésie complètes à toutes les étapes de l’intervention. Des points limites spécifiques sont définis, notamment pour les jours suivant la chirurgie, afin d’assurer un suivi optimal. En effet, le bien-être des femelles opérées est une priorité, car une femelle en état d'inconfort post-opératoire pourrait ne pas s'occuper correctement de ses petits après la naissance. Dans le cadre des évolutions des techniques de transgénèse, il est désormais possible d'effectuer des transplantations d’embryons par voie basse, ce qui permet de se passer de chirurgie. Nous envisageons de tester ce système, mais étant donné que son efficacité n’est pas encore garantie et reste largement discutée au sein des réseaux nationaux, nous privilégions pour l’instant la technique chirurgicale.
Choix des espèces
Les outils de création des modèles génétiquement modifiés sont extrêmement bien développés et fiables chez la souris. De plus, ce mammifère est facile à élever et fournis des résultats qui peuvent être transposés chez l’homme. Les femelles reçoivent un traitement hormonal dès l’âge de 4 semaines. À ce stade prépubère, elles présentent une réceptivité optimale à la stimulation. Les interventions chirurgicales, telles que la transplantation d’embryons et la vasectomie, sont réalisées sur des animaux adultes âgés de plus de 8 semaines.
Utilisation d’un microARN inhibiteur pour le traitement de l’Ostéogénèse Imparfaite
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
Pour tester si un inhibiteur de microARN injecté dans la veine renforce les os dans une forme de maladie des os de verre, 40 souris oim, porteuses d'une mutation du collagène, vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Ces souris se fracturent sur de faibles traumatismes, en moyenne 10 fractures à 18 semaines selon le porteur, et toutes sont tuées sous anesthésie à l'issue pour l'analyse de leurs os et de leurs organes, dont un test de rupture des fémurs. Pendant huit semaines, elles sont anesthésiées chaque semaine pour une injection intraveineuse et une radiographie, des mesures que le porteur dit "non-invasives". Il prévoit des anti-douleurs dans l'eau de boisson et la mise à mort de toute souris qui atteint "un état de stress important ou un point limite de bien-être".
Objectifs
L'objectif de ce projet est de tester un nouveau traitement potentiel pour une maladie rare appelée l'ostéogenèse imparfaite (OI), communément connue sous le nom de "maladie des os de verre". Cette maladie héréditaire rend les os très fragiles et sujets à des fractures, même avec des traumatismes mineurs, et cause des déformations du squelette. Elle est due à une mutation génétique qui affecte la production de collagène de type 1, une protéine essentielle à la solidité des os. Il n’existe actuellement aucun traitement ayant fait solidement preuve de son efficacité sur la réduction du risque de fracture. Le traitement que nous testons utilise un inhibiteur de microARN, appelé AntagomiR, qui est administré par injection dans la veine. Les microARNs sont de petites molécules qui régulent l'activité des gènes, et dans le cas de l'OI, ils sont dérégulés, contribuant à l'aggravation des symptômes de la maladie. Au laboratoire, nous avons observé que cet inhibiteur stimule la production de collagène et d'autres composants importants pour la formation des os par les cellules osseuses. Cette étude se déroule sur des souris oim qui présentent les mêmes mutations génétiques que celles trouvées chez les personnes atteintes de la maladie des os de verre et présentent des fractures sur faible traumatisme tout comme les patients atteints. L'objectif est de voir si ce traitement peut renforcer les os et réduire les déformations squelettiques et fractures. Nous espérons développer de nouvelles thérapies pour les patients atteints de cette maladie, ou améliorer les traitements existants, qui sont actuellement très limités, surtout chez les enfants.
Bénéfices attendus
Bénéfices Scientifiques : Compréhension des mécanismes de la maladie : Cette étude vise à approfondir notre compréhension du rôle d'un microARN, qui influence la formation et le remodelage des os. En étudiant comment ce microARN agit, nous pourrions découvrir des mécanismes fondamentaux liés à la fragilité des os chez les personnes atteintes de la maladie des os de verre (ostéogenèse imparfaite). Cela pourrait aussi nous aider à mieux comprendre les interactions complexes au sein des cellules qui conduisent à cette maladie. Identification de nouvelles cibles pour les traitements : Si cette recherche démontre que le traitement à base d'un AntagomiR est efficace, cela pourrait confirmer que le microARN est une cible valable pour de futurs médicaments. Le mécanisme étudié pourrait être applicable pour un futur traitement pharmaceutique. Non seulement cela pourrait mener à de nouveaux traitements pour la maladie des os de verre, mais cela pourrait aussi avoir des implications pour d'autres maladies où les os sont anormalement fragiles. Progrès technologiques : En menant cette étude, nous allons également perfectionner des techniques avancées pour administrer des traitements basés sur les microARNs, comme cet AntagomiR, directement dans les organismes vivants. Les méthodes que nous développons pourraient être utiles dans d'autres domaines de la recherche médicale, notamment pour améliorer les approches en thérapie génique. Bénéfices Cliniques : Amélioration des traitements disponibles : Si le traitement avec cet AntagomiR s’avère efficace, il pourrait ouvrir la voie à de nouvelles options thérapeutiques pour les patients atteints de la maladie des os de verre, une maladie pour laquelle les traitements actuels sont limités. Un tel traitement pourrait non seulement renforcer les os et réduire les fractures, mais aussi améliorer de manière significative la qualité de vie des patients en diminuant les risques liés aux dommages osseux et des autres tissus comprenant du collagène. Réduction des effets secondaires : Comparé aux traitements existants, comme les bisphosphonates, qui peuvent entraîner des effets secondaires parfois difficiles à gérer, surtout chez les enfants, cet AntagomiR pourrait offrir une alternative mieux tolérée.
Procédures
Les injections seront hebdomadaires pendant 8 semaines dans chaque procédure et réaliser au cours de l'anesthéise gazeuse des radiographies. Pour connaitre l’efficacité du traitement, les souris sont anesthésiées pour une durée de 15 minutes pour avoir une injection intraveineuse du traitement suivie d’une radiographie par scanner afin d’évaluer la qualité osseuse et le nombre de fractures. Ces mesures sont non-invasives, ce qui signifie qu'elles ne causeront pas de douleur ou de dommage aux animaux. Cette intervention permet: > la surveillance de l'apparence et de la santé générale : Chaque semaine, nous examinerons les souris pour voir comment elles grandissent, si leur poids change et si elles subissent des fractures. > radiographies hebdomadaires et recherche de fracture. > Une analyse détaillée des os par imagerie : permet de voir l’aspect 3D des os et de mesurer plusieurs éléments importants, comme la densité des os, le volume osseux par rapport au volume total, l'épaisseur des petites structures osseuses (trabécules), leur nombre, et l'espace entre elles. Cette internvetion sera dont répétée 8 fois par souris pour une durée estimée de 15 minutes par souris.
Impact sur les animaux
Au cours de cette étude, les souris pourraient éprouver certains inconforts en raison des manipulations fréquentes et des injections répétées du traitement ou des fractures. Les effets possibles incluent une perte de poids, une diminution de l'appétit, et des difficultés à se déplacer. En raison de leur mutation génétique spécifique, les souris sont également plus susceptibles de subir des fractures osseuses spontanées, ce qui peut causer de la douleur. Les souris oim présentent des fractures spontanées sur de faible traumatisme, en moyenne 10 fractures à 18 semaines, sans mortalité associée. Les signes de douleur ou de stress que nous pourrions observer chez les souris incluent un frottement ou un léchage excessif, une agressivité inhabituelle, ou une posture anormale. Elles pourraient également montrer un malaise général, une réduction de leur activité, et un pelage qui semble mal entretenu. Conformément à la littérature scientifique, il n’existe pas d’effet attendu du traitement sur le plan de la tolérance viscérale ou comportementale au-delà de l’effet thérapeutique recherché
Devenir
A l’issue de chaque procédure, tous les animaux seront mis à mort sous anesthésie générale afin de réaliser les analyses post-mortem qui permettront : - La mesure des marqueurs osseux et des niveaux circulants de miR-93-3p dans les sérums des animaux. - L’analyse des vertèbres et des fémurs pour évaluer la structure et la qualité des os par histomorphométrie - L’évaluation de la résistance mécanique par test de rupture en 3 points, réalisé sur les fémurs. - L’autopsie par examen des principaux organes (cœur, poumons, foie, reins) pour évaluer la tolérance systémique du traitement et analyse des niveaux d’expression de miR-93-3p dans les tissus
Remplacement
Pour trouver de nouvelles solutions de traitement pour la maladie des os de verre (ostéogenèse imparfaite, OI), il est crucial de mener des études sur des souris. Ces études sont nécessaires car elles permettent de recréer un environnement qui se rapproche le plus possible de celui des patients atteints d’OI. Les souris utilisées dans ces expériences présentent des altérations génétiques et physiques similaires à celles des personnes atteintes par la maladie, c’est-à-dire une mutation du collagène qui se traduit par une fragilité osseuse et des fractures. Ceci rend les résultats plus pertinents pour le développement de nouveaux traitements. Ces projets sont basés sur les résultats obtenus par nos études cliniques chez l’homme qui montrent que de petites séquences d’ARN (miRNAs) excrétés des tissus, notamment du tissu osseux sont dérégulés chez les patients. Avant de passer à ces études in vivo, nous avons réalisé des expériences en laboratoire sur des cellules osseuses de souris, montrant que l'inhibiteur de l’un de ces miRNAs, appelé AntagomiR, a des effets bénéfiques sur la fragilité osseuse. Ces tests nous ont permis d'affiner notre approche et de nous préparer pour les essais plus complexes sur des souris. Bien que nous ayons déjà effectué des tests en laboratoire sur des cellules osseuses, ces modèles cellulaires ne peuvent pas reproduire toutes les interactions complexes présentes chez la souris notamment en termes de tolérance et efficacité phénotypique. Par conséquent, les études in vivo sur des souris restent indispensables pour obtenir des données cliniquement pertinentes. Les souris OIM constituent le modèle le moins sensible reproduisant le plus fidèlement sur le plan physiopathologique et sur le plan clinique l’atteinte humaine.
Réduction
Les protocoles d'injection seront optimisés au cours d’une première étape pilote sur 10 animaux avec 5 régimes d’injection différents, garantissant que le rythme d'injection le mieux toléré et le plus efficace sera utilisé dans les étapes suivantes. L’innocuité et la durée du traitement seront précisés par absence d’effets secondaires et le rythme d’injection le mieux toléré par les souris, sera déterminé en observant la réaction des animaux à l’issue de la première administration et les signes pertinents de mal être. L’efficacité du traitement sera également prise en compte par le jugement du critère principal d’amélioration fonctionnelle, c’est-à-dire une diminution de la fragilité osseuse et du nombre de fractures, en fin de procédure. Cela permettra de minimiser les variations et de réduire le nombre total d'animaux nécessaires par la suite, avec l’injection chez 10 souris de l’antagomiR et 10 souris de l’antagomiR-contrôle. Enfin dans une dernière phase, en cas d’échec de la phase 2, l’utilisation de 10 souris avec cette fois l’injection unique d’un antagoniste du microARN sous forme de particules lentivirales qui conduirait à une antagonisation stable et continue du microARN. Pour réduire le nombre d'animaux utilisés tout en obtenant des résultats statistiquement significatifs, nous avons défini des critères précis de réduction basés sur l'incidence des fractures. Nous anticipons une diminution de 30% des fractures par rapport au groupe contrôle. Cette estimation nous conduit à un échantillon de 10 souris par groupe expérimental. L'utilisation de cette approche statistique rigoureuse permet de minimiser le nombre d'animaux nécessaires tout en garantissant la robustesse des résultats obtenus. La collecte de données longitudinales sur les mêmes animaux à différents points de temps maximisera les informations recueillies et réduira le besoin d'augmenter la taille des groupes pour les analyses de fin d'étude.
Raffinement
Nous mettons en place plusieurs mesures pour garantir le bien-être des souris. Une anesthésie gazeuse sera utilisée pour permettre l’injection de traitements et l’immobilisation simultanée des animaux pour les examens d’imagerie, minimisant ainsi les manipulations. Des techniques d’injection moins invasives seront également adoptées. Les souris seront surveillées quotidiennement pour détecter rapidement tout signe d’inconfort, de douleur ou de détresse, permettant une intervention immédiate. Pour leur confort, les souris bénéficieront d’un environnement enrichi avec des matériaux de nidification et des structures souples pour limiter le stress et les traumatismes, particulièrement chez les souris à fragilité osseuse accrue. Les manipulations seront effectuées à l’aide de tunnels pour éviter les traumatismes et réduire le stress, toute manipulation autre que par main en coupe étant proscrite. Le personnel recevra une formation continue sur les meilleures pratiques de soins et de manipulation. Les conditions d’hébergement seront adaptées : les souris seront logées en groupes réduits pour minimiser les risques d’agressivité et bénéficier d’un suivi qualitatif renforcé. Les cages seront équipées de matériaux non abrasifs et d’une litière épaisse, avec de la nourriture et de l’eau gélifiée disposées au fond pour faciliter l’accès, même en cas de douleur ou de boiterie. Une évaluation du bien-être et de la douleur de manière standardisée permettra une intervention rapide. Des anti-douleurs seront mis dans l’eau de boisson pour la gestion autonome des douleurs, et en cas de douleur ou de fracture, de l'anti-inflammatoire ou un anti-douleur plus puissant sera administré. Si un animal atteint un état de stress important ou un point limite de bien-être, il sera euthanasié après une sédation gazeuse pour une fin de vie sans douleur. Les souris seront identifiées par tatouage d’oreille effectué par le fournisseur avant leur arrivée, deux semaines avant l’expérimentation, afin de s’acclimater à leur nouvel environnement. Tous les équipements ou fournitures entrant en contact avec les souris seront stérilisés pour éviter toute contamination. Les expérimentations auront lieu dans un environnement confiné et sécurisé. En cas de plaies mineures, une crème apaisante sera appliquée pour faciliter la cicatrisation.
Choix des espèces
L'utilisation de souris dans cette étude est justifiée par leur capacité à mimer la maladie humaine, en particulier les souris oim+/+, qui présentent un phénotype très proche de celui observé chez les patients atteints d’ostéogenèse imparfaite (OI). Âge des Souris : 6 Semaines à J0 : Développement Osseux Critique : À 6 semaines, les souris sont en pleine croissance rapide, ce qui est essentiel pour étudier l'effet des traitements sur le développement osseux et la fragilité liée à l'OI. Les manifestations de l'OI, telles que les fractures et les dommages osseux, sont déjà présentes à cet âge, permettant une évaluation claire des effets thérapeutiques. Homogénéité et Comparabilité : Utiliser des souris du même âge assure une cohérence dans les données, réduisant les variations dues à des différences de développement entre individus. Cette approche soigneusement planifiée permet d'assurer que les résultats obtenus seront significatifs et utiles pour envisager des interventions thérapeutiques chez les patients humains souffrant d'OI.
Mise en place de la technique de PV loop (pressure-volume loop) chez les rongeurs (souris et rat)
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Rats : 20
Intubés, cathétérisés par la veine jugulaire puis ouverts au thorax pour qu'un cathéter soit poussé dans le ventricule gauche, 50 souris et 20 rats sont opérés sous anesthésie et tués avant tout réveil. Le porteur reconnaît que l'introduction du cathéter dans le cœur peut provoquer douleur, traumatisme des tissus cardiaques et inflammation locale, avant d'écrire que le bien-être des animaux non-humains demeure une priorité absolue. Ces interventions ne visent aucun résultat biologique propre, le projet consistant à mettre au point la technique de mesure pression-volume chez le rongeur. Le taux d'échec ou de mortalité chirurgicale, que le porteur estime à 15 ou 20 %, a été intégré par avance dans l'effectif.
Objectifs
Les maladies du cœur restent l'une des principales causes de décès et de problèmes de santé dans le monde. Trouver de nouveaux traitements est donc un vrai défi. Grâce aux progrès en génétique, les chercheurs peuvent aujourd’hui repérer de nombreux gènes qui pourraient jouer un rôle dans l’apparition de ces maladies. Mais comme le cœur est un organe très complexe, il est important de tester ces découvertes dans des animaux vivants pour vérifier leur impact réel. Il existe plusieurs méthodes pour évaluer comment fonctionne le cœur. Mais une technique en particulier, appelée boucle pression-volume (ou Pressure-Volume loop), permet de mesurer en même temps la pression et le volume dans le cœur, ce qui donne une image très précise de son activité pendant un battement. Le but de ce projet est de mettre en place cette technique chez la souris et le rat. Cela permettra d'étudier de manière très détaillée la façon dont le cœur fonctionne, en mesurant des éléments clés comme sa force de contraction, sa capacité à se détendre, et sa souplesse.
Bénéfices attendus
Aujourd’hui, la meilleure méthode pour analyser en détail le fonctionnement du cœur est l’étude des relations entre la pression et le volume dans le ventricule. Cette approche est considérée comme la plus fiable pour évaluer le cœur dans son ensemble, sans l’isoler. Grâce aux progrès technologiques, il est maintenant possible d’utiliser cette méthode même chez de très petits animaux, comme les souris. Cela a permis aux chercheurs d’étudier avec précision le cœur de souris génétiquement modifiées, de tester des traitements, ou encore d’explorer les effets de certaines maladies. Ce qui rend cette méthode particulièrement utile, c’est qu’elle fournit des informations très précises sur le ventricule gauche du cœur (la partie qui envoie le sang dans tout le corps), tout en étant peu influencée par les variations de la pression sanguine dans les vaisseaux, ce qui permet une analyse plus fiable de la performance réelle du cœur.
Procédures
Les animaux seront soumis à 4 différentes interventions : 1- Administration d'un antalgique et d'un myorelaxant d'une couverture de 2 heures minimum (5min). 2- Contrôle des voies aériennes par intubation (10-30 min) 3- Mise en place d’un cathéter dans la veine jugulaire (10-15 min) 4- Thoracotomie et placement du cathéter dans le ventricule gauche (10-30 min)
Impact sur les animaux
Les principales nuisances associées à la mesure des courbes pression-volume (PV) chez les animaux sont les suivantes : 1- Le stress : une douleur lors de l’injection d’antalgique et de myorelaxant réalisé sur animal vigile avant l’anesthésie. 2- une gêne malgré l'antalgique avant l'opération lors de la procédure d'insertion du cathéter pour réaliser une intubation afin de contrôler les voies aériennes ou le cathéter qui sera introduit dans le ventricule cardiaque peut induire un stress significatif et provoquer de la douleur, notamment lors de l'introduction du cathéter dans le cœur. 3- Les risques d'infection ou de traumatisme : L'insertion d'un cathéter dans le cœur présente un risque d'infection si les mesures de stérilité ne sont pas strictement respectées. De plus, un traumatisme lors de l'insertion du cathéter peut endommager les tissus cardiaques ou les structures vasculaires avoisinantes. La présence du cathéter dans le ventricule peut aussi provoquer une inflammation locale, perturbant ainsi la fonction cardiaque et affectant les mesures obtenues. Nous minimisons ces nuisances par une préparation méticuleuse (choix approprié de l'anesthésie, techniques stériles rigoureuses, surveillance continue) et en prenant en compte ces effets lors de l'analyse des données. L'éthique expérimentale et le bien-être des animaux demeurent nos priorités absolues tout au long de cette expérience.
Devenir
Aprés l'approche chirurgical invasive et à la fin de l'expérience, les animaux (souris ou rats) seront mis à mort pour effectuer des prélévements d'organes et des analyses approfondies.
Remplacement
La chirurgie Pressure-Volume loop (PV loop) est une technique invasive permettant une évaluation directe, dynamique et précise de la fonction cardiaque (précharge, postcharge, contractilité, compliance). À ce jour, aucune méthode in vitro, ex vivo, ni de modèle informatique ne permet de reproduire la complexité de ces mesures dans un organisme entier vivant. Des alternatives telles que : - les modèles in silico de la fonction cardiaque, - les organoïdes cardiaques ou cultures de cellules myocardiques, - ou les mesures échographiques ou IRM cardiaques non invasives, ne fournissent pas les données continues en temps réel, couplées aux variations de charge, que la PV loop permet. Par conséquent, l’utilisation d’un modèle animal vivant est indispensable à ce stade pour répondre aux objectifs scientifiques du protocole.
Réduction
Ce projet a été conçu de manière à réduire autant que possible le nombre d'animaux utilisés. Forts de notre expérience dans la mise en place et la validation de protocoles chirurgicaux de ce type, nous savons que la chirurgie PV loop est invasive, avec un taux de mortalité ou d’échec technique de 15–20 %, nous inclurons donc un coefficient de sécurité pour compenser les pertes chirurgicales attendues. Nous avons prévu d'utiliser 50 souris et 20 rats dans cette étude afin d'avoir des résultats statistiquement exploitables. En revanche, les volumes cardiaques plus petits des souris entraînent des fluctuations de pression et de volume plus marquées au cours du cycle cardiaque. Cela nécessite l'utilisation d'un plus grand nombre de souris afin de satisfaire à des exigences plus strictes en matière de précision des mesures et de fiabilité des équipements utilisés pour obtenir des données fiables. La standardisation du protocole chirurgical dans ce projet, permettra à l’avenir dans les autres protocoles expérimentaux, pour un seul animal, de produire des données complètes et exploitables sur la pression, le volume et la compliance du cœur, réduisant ainsi le besoin d’animaux supplémentaires.
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans des conditions optimales. Une thermosonde rectale sera insérée pour surveiller la température, et des coussins chauffants ainsi que des lampes chauffantes seront utilisés afin de maintenir une température corporelle physiologique (37 °C) pendant la collecte des données hémodynamiques et tout au long de l'expérience. Pour contrer la perte de sang et de volume, une solution à 10 % d'albumine dans 0,9 % de NaCl mise à T° ambiante sera administré. Pour un rat qui pèse 250 g on ajoutera 1.6 ml (10%) de volume en solution albumine/NaCl et pour la souris 0.8 ml. Afin de limiter le stress et la douleur, nous injecterons un antalgique, comme la buprénorphine (2 mg/kg), et un myorelaxant, tel que le pancuronium (2 mg/kg), 30 minutes avant la chirurgie. Tout au long de la procédure chirurgicale, les animaux seront sous anesthésie pour minimiser la douleur aiguë. Une solution à 10 % d'albumine dans 0,9 % de NaCl sera également préparée pour contrer la perte sanguine et de volume. Lors de l'approche chirurgicale, un thermocautérisateur sera utilisé pour optimiser l'hémostase. Afin d'assurer une ventilation adéquate pour la collecte de données PV de haute qualité, les pressions inspiratoires seront limitées à
Choix des espèces
Comprendre les causes et la progression de la maladie cardiaque présente un défi important pour la communauté biomédicale. La flexibilité génétique de la souris et maintenant du rat offre un grand potentiel pour explorer la fonction cardiaque au niveau moléculaire. La petite taille de la souris et du rat présente des défis en ce qui concerne l'exécution phénotypage cardiaque détaillée. Miniaturisation et d'autres progrès technologiques ont fait de nombreuses méthodes d'évaluation cardiaque possible chez la souris et le rat. Parmi ceux-ci, la collecte simultanée des données de pression et de volume fournit une image détaillée de la fonction cardiaque qui ne sont pas disponibles par le biais de toute autre modalité. Les animaux souris et rats seront âgées de 10 semaines au début de protocole. Afin de travailler sur un modèle adulte où la fonction cardiaque est bien développée et pour suivre les recommandations de l'entreprise qui fabrique les cathéters spécifiques pour les tailles de cœur.
Etude des fonctions de réparation tissulaire et d’immunomodulation d’une sous-population de lymphocytes T dans un modèle de dommage consécutif à l’infection par influenza
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système respiratoire
Infectées par un virus de la grippe sous anesthésie, des souris reçoivent ensuite des traitements répétés une à deux fois par semaine pendant dix jours, et jusqu'à six injections en deux heures juste avant la mise à mort. 2 138 souris vont être utilisées, toutes tuées pour des analyses post-mortem, 2 017 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger et 121 un niveau sévère. Le porteur décrit une hypothermie et une perte de poids durant cinq à dix jours après l'infection, tout en affirmant que les activations induites du système immunitaire ne sont pas douloureuses pour l'animal. Sur le dimensionnement de l'étude, il écrit qu'aucune approche statistique n'a été réalisée.
Objectifs
Lorsqu'ils sont infectés, les tissus subissent des dommages dus non seulement à l'infection elle-même, mais aussi aux mécanismes de défense mis en place pour supprimer le pathogène. Il est donc nécessaire pour l'organisme de contrôler ces mécanismes de défense et de réparer ces dommages une fois l'infection contrôlée, afin que le ou les organes touchés conservent leur fonction. C'est le cas notamment des poumons suite à une infection virale telle que la grippe, mais à l'heure actuelle, les mécanismes de réparation sont mal connus. Pendant les infections virales, le dommage de la barrière entre le sang et les alvéoles pulmonaires, et l’œdème en résultant perturbe les échanges gazeux et entraine un syndrome de détresse respiratoire quand les lésions s’étendent. Cliniquement, ce syndrome est caractérisé par un défaut aigu de la fonction respiratoire dans les 7 jours après les premiers symptômes et présente un taux de mortalité de près de 40%. Malgré de nombreux essais cliniques, peu de traitements sont aujourd’hui proposés et leur efficacité reste limitée. Il est donc nécessaire de mieux caractériser les mécanismes empêchant le contrôle de l’inflammation, ainsi que ceux induisant la réparation des tissus.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de mieux caractériser le syndrome de détresse respiratoire aigu, afin de proposer des traitements efficaces. Les résultats obtenus permettront 1) de mieux caractériser une sous population immunitaire présente en nombre important chez l’homme, avec des propriétés variées, à la fois anti-infectieuses et de réparation tissulaire, 2) de mieux comprendre leur implication dans les pathologies respiratoires et 3) de tester leur potentiel thérapeutique en les stimulant spécifiquement lors d’une infection virale. Par ailleurs, leur étude permettra d’étendre ces résultats à la biologie d’autres sous populations immunitaires proches qui s’établissent dans les tissus sur le long terme suite à des infections virales.
Procédures
Un premier lot d’animaux sera infecté par un virus de la grippe (1 fois seulement, sur animal anesthésié, durée anesthésie : 20 min Un second lot sera à la fois infecté (administration sur animal anesthésié – durée de l’anesthésie : 20min), puis traité selon des protocoles allant de l’administration unique à l’administration répétée une à deux fois par semaine pendant 10 jours (administration des traitements sur animaux vigiles ou anesthésiés, durée de chaque geste inférieure à 10 sec). Un troisième lot d’animaux sera utilisé pour la mise en place d’un modèle. Ces animaux recevront une administration unique de cellules sur animaux vigiles (durée du geste inf à 10 sec) ou anesthésiés (durée de l’anesthésie : 20 min)). Certains de ces animaux seront préalablement infectés par le virus de la grippe (administration sur animal anesthésié – durée de l’anesthésie : 20min), Un quatrième lot comprendra des animaux injectés soit avec des cellules ou avec un colorant physiologique (administration unique sur animaux anesthésiés, durée de l’anesthésie : 20 min). Certains animaux seront préalablement infectés par la grippe (infection unique sur animal anesthésié, durée de l’anesthésie : 20 min). Ceux-ci seront ensuite traités selon des protocoles allant de l’administration unique à l’administration répétée une à deux fois par semaine pendant 10 jours (administration des traitements sur animaux vigiles ou anesthésiés, durée de chaque geste inférieure à 10 sec, durée de l’anesthésie : 20 min). Un cinquième lot recevra : Sous groupe 1 : un ou deux traitements (administration unique pour chaque traitement sur animaux vigiles, durée du geste :10 sec), puis recevra des injections répétées (6 fois en 2h sur animaux vigiles, durée de chaque geste inférieure à 10 sec) juste avant sacrifice. Certains animaux seront préalablement infectés par la grippe (infection unique sur animal anesthésié, durée de l’anesthésie : 20 minutes). Sous-groupe 2 : Si les résultats initiaux du sous-groupe 1 ne sont pas probants, nous utiliserons une autre souche de souris, en répétant les administrations du sous-groupe 1 ainsi qu’un transfert de cellules (administration unique sur animaux anesthésiés, durée anesthésie : 20 min). Si les résultats sont concluants, certains animaux seront préalablement infectés par la grippe (infection unique sur animal anesthésié, durée de l’anesthésie : 20 min).
Impact sur les animaux
Les animaux infectés par le virus de la grippe développeront la maladie qui entrainera une légère hypothermie et une perte de poids qui durera entre 5 et 10 jours en fonction de la souche de virus utilisée. Les nuisances attendues lors de l’administration des virus ou des traitements seront celles liées aux injections elles-mêmes (douleur légère de courte durée). Suite à l'injection d’anesthésique ou de traitement (sans anesthésie) dans l'abdomen, une douleur légère immédiate de courte durée liée à la piqûre est attendue. Au réveil de l’anesthésie, une douleur légère de courte durée pourrait être ressentie par les animaux après l’administration des traitements ou l’injection de cellules. Il est important à souligner que les activations induites du système immunitaire ne sont pas douloureuses pour l’animal.
Devenir
Les animaux sont euthanasiés pour des analyses post-mortem qui permettront de comprendre les mécanismes mis en jeu.
Remplacement
Le fonctionnement du système immunitaire repose sur des interactions tridimensionnelles et des flux de cellules finement régulés entre organes. De plus, les cellules résidant dans le poumon sont adaptées à cette localisation et à leur microenvironnement. Enfin, l’infection virale entraîne la réaction de différentes sous-populations cellulaires qui interagissent entre elles, ces cellules étant à la fois déjà dans le poumon ou recrutées à des temps variables suite à l’infection. Ces phénomènes ne peuvent pas être reproduits in vitro. En revanche, si les premiers résultats in vivo nous le permettent, des expériences in vitro à partir de cellules isolées de souris non manipulées seront réalisées. Cela pourrait permettre d’affiner les hypothèses et de réduire le nombre final de souris. De même, il existe dans la littérature des caractérisations exhaustives des populations cellulaires et de leurs dynamiques au cours de la grippe. Dès que cela sera possible, nous utiliserons ces données plutôt que d’en générer de nouvelles, et nous baserons sur celles-ci afin de réaliser des prédictions in silico, c’est à dire tenter de prédire des mécanismes afin de mieux cibler les expériences nécessitant effectivement l’animal. Enfin, certaines procédures décrites ici cherchent à mettre des modèles qui évitent de générer de nouvelles lignées, ce qui limite fortement le nombre d’animaux qui serait nécessaire pour la génération de ces lignées.
Réduction
1) Le nombre d’animaux à utiliser par groupe expérimental se base sur des expériences préliminaires déjà réalisées au laboratoire ou par des collaborateurs en utilisant ces modèles. Ces nombres sont ajustés pour limiter le nombre d’animaux à utiliser tout en surmontant les effets liés à la variabilité biologique entre les souris ainsi qu’aux variations intrinsèques liées à nos modèles. Par ailleurs, certaines procédures décrites ici cherchent à mettre des modèles qui évitent de générer de nouvelles lignées, ce qui limite fortement le nombre d’animaux qui serait nécessaire pour la génération de ces lignées. Enfin, les procédures contiennent des expériences permettant de valider le modèle expérimental choisi. Si ces validations ne sont pas concluante, nous ne continuerons pas l’expérimentation à partir de cette procédure (points de go/no go). 2) Aucune approche statistique n’a été réalisée.
Raffinement
Avant l’infection, les souris seront manipulées sur plusieurs jours dans les conditions expérimentales afin de limiter leur stress. Suite à l’infection grippale, les animaux seront suivis quotidiennement afin d’assurer leur bien-être et de surveiller les éventuels signes de souffrance ou de stress. Les souris infectées par le virus seront pesées tous les jours au pic de la maladie pour contrôler l’amplitude de l’infection (les pesées sont espacées de 2/3 jours en dehors du pic, afin de limiter le stress des animaux). Un apport supplémentaire de matériel de nidification est apporté afin de pallier l’hypothermie légère associée à la grippe. Une grille de score a été établie afin d’évaluer quotidiennement l’état des animaux de manière objective. Des points limites ont été définis, qui, s'ils sont atteints, marquent la fin de l'expérimentation pour l'animal concerné. Des doses de virus plus légères pourront être administrées si la question scientifique le permet, afin de limiter d’autant plus le nombre d’animaux atteignant un point limite. De même, dès que cela est possible, de la nourriture/eau en gel est placée dans la cage (en amont des symptômes grippaux, afin de permettre une habituation). Afin de limiter au maximum les douleurs et souffrances liées aux différentes injections, les animaux seront anesthésiés et placés sur tapis chauffant jusqu’au réveil. De la crème vaseline oculaire est déposée à l’aide d’un coton tige pour éviter l’assèchement de l’œil durant et après l’anesthésie.
Choix des espèces
La souris est ici le modèle de choix du fait de la forte similitude des systèmes immunitaires humains et murins. Plus particulièrement, nos cellules d’intérêt sont présentes à la fois chez l’homme et la souris, espèces entre lesquelles leurs caractéristiques et propriétés sont très fortement conservées. Par ailleurs, la disponibilité de souches génétiquement modifiées parfaitement définies nous permet enfin d’affiner les mécanismes de manière très précise. - Les souris seront utilisées à l’âge adulte (8 à 16 semaines après la naissance, afin que les populations étudiées soient installées). - Nous n’attendons pas d’effet lié à l’âge des souris. Nous utiliserons des souris adultes possédant un système immunitaire mature.
Etude de l’impact de l’inflammation et de la réponse immunitaire sur la perte auditive liée à la polyarthrite rhumatoïde »
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Pour comprendre pourquoi les personnes atteintes de polyarthrite rhumatoïde perdent l'audition, 144 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélever leurs organes. 48 subissent des procédures impliquant un niveau de souffrance léger et 96 un niveau modéré. Trois injections intrapéritonéales d'anticorps déclenchent l'arthrite, puis le gonflement des pattes est mesuré tous les deux à trois jours pendant quarante-huit jours et l'audition testée chaque semaine. La souche a été retenue pour sa susceptibilité à l'induction de l'arthrite, avec une incidence que le porteur annonce à 100 %, et pour sa compatibilité avec les mesures auditives.
Objectifs
Les maladies auto-immunes touchent 4 % de la population européenne. Elles sont associées à une réaction excessive du système immunitaire, négative pour l’homme, en aboutissant à la destruction des tissus des patients qui en sont atteints. Parmi les maladies auto-immunes, la polyarthrite rhumatoïde est caractérisée par la présence d’auto-anticorps (anticorps qui reconnaissent les molécules du soi). La polyarthrite rhumatoïde est caractérisée par une arthrite chronique et des lésions cartilagineuses irréversibles. Les manifestations de cette maladie auto-immune sont extrêmement variées. Si son origine reste souvent indéterminée, les auto-anticorps peuvent parfois être directement responsables du dérèglement du système immunitaire en causant des lésions tissulaires. Au-delà des articulations, l’inflammation associée à la polyarthrite rhumatoïde a aussi des impacts sur d’autres fonctions du corps, y compris sur l’audition. Des études récentes montrent une apparition de la perte auditive chez les patients atteints de la polyarthrite rhumatoïde. Elle peut atteindre entre 20 et 40 % selon le type de perte auditive. Ces chiffres soulignent l'importance de mieux comprendre cette pathologie souvent sous-diagnostiquée chez des patients atteints de la polyarthrite rhumatoïde. La polyarthrite rhumatoïde et la perte auditive partagent des mécanismes communs, notamment l’inflammation, qui pourrait altérer le fonctionnement de l’oreille interne. Les auto-anticorps impliqués dans cette maladie auto-immune pourraient également cibler les structures auditives, comme la cochlée et les nerfs auditifs. Par ailleurs, certains traitements de la polyarthrite rhumatoïde tels que les anti-inflammatoires et autres composés pour traiter les rhumatismes, peuvent être toxiques pour l’appareil auditif et aggraver la perte auditive. Une meilleure compréhension de ce lien entre la polyarthrite rhumatoïde et la perte auditive pourrait améliorer significativement la qualité de vie des patients.
Bénéfices attendus
Le projet devrait permettre une meilleure compréhension des mécanismes reliant les maladies auto-immunes et la perte auditive, en particulier le rôle de l'inflammation. Ces connaissances pourraient guider le développement de nouvelles approches thérapeutiques pour prévenir ou traiter efficacement ces troubles, améliorant ainsi la qualité de vie des patients et réduisant les impacts sur le système de santé.
Procédures
Les animaux issus des modèles de la polyarthrite rhumatoïde suivront 3 injections d’anticorps pathologiques à J0, J1 et J18. Un suivi du gonflement des pattes sera réalisé tous les 2-3 jours pendant toute la durée de la procédure (48 jours au total). Des mesures de la capacité auditive seront réalisées à différents temps après induction de la PR, de façon hebdomadaire à partir de J7 jusqu’à la fin de la procédure, et notamment juste avant de chaque point de prélèvement terminal.
Impact sur les animaux
Les procédures incluent trois injections i.p. d’auto-anticorps, des mesures de gonflement des articulations, des mesures de capacité auditive et des prélèvements terminaux. Les nuisances ou effets indésirables attendus incluent des douleurs causées par les inflammations induites ou des désordres systémiques chez les animaux.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort pour prélever les organes d'intérêt.
Remplacement
Le but du projet est d’identifier les mécanismes immunitaires impliqués dans l’induction de la polyarthrite rhumatoïde qui est impliquée dans la perte auditive, afin de développer à terme, des nouvelles interventions thérapeutiques pour traiter cette maladie auto-immune. Ceci nécessite des modèles expérimentaux dotés d’un système immunitaire complexe (et complet) et permettant l’étude intégrée de la réponse immunitaire dans un véritable contexte pathologique. Ceci étant difficilement possible chez l'homme, afin de progresser dans cette perspective, les expérimentations animales sont indispensables. Des méthodes alternatives (études in vitro) peuvent être complémentaires, mais ne peuvent pas se substituer à l’utilisation des animaux. Dans ce but, nous envisageons le développement des modèles in vitro complexes de culture cellulaire pour approfondir l’étude des mécanismes immunitaires liés au processus d’induction d’auto-immunité.
Réduction
Le nombre d’animaux a été calculé pour assurer que les résultats soient statistiquement significatifs tout en limitant le nombre d’animaux utilisés. En ce qui concerne les modèles de polyarthrite rhumatoïde, le nombre d’animaux a été calculé en se basant sur l'expérience acquise au laboratoire en termes d'incidence de l'arthrite chez la souris et degré de variabilité expérimentale liée à la magnitude de la réponse immunitaire.
Raffinement
Les actes techniques réalisés (injections) sont peu invasifs et conformes aux recommandations des textes de référence. Toutes les mesures seront prises pour réduire la souffrance des animaux. Des gels de nourriture hydratée seront placés dans la litière afin de faciliter l’accès à la nourriture et à l’eau. Le milieu d’hébergement sera enrichi (carrés de cellulose, copeaux de litière) et les animaux seront surveillés quotidiennement. Par ailleurs, nous maîtrisons les gestes expérimentaux et nous surveillerons le site d'injection. Tout au long des expériences, une observation régulière du bien être des souris sera effectuée. Tout animal présentant un éventuel signe de souffrance sera soigné ou euthanasié. Ces impacts seront strictement surveillés et minimisés grâce à des protocoles rigoureux, incluant un suivi clinique rapproché et une réduction du nombre d’animaux utilisés au strict nécessaire.
Choix des espèces
Les animaux utilisés sont des souris pour lesquels des données scientifiques de la réponse immunitaire sont bien établies et de nombreux outils sont disponibles pour étudier de façon approfondie la réponse immunitaire, ceci avec un recul statistique. Le projet est basé sur l’utilisation d’une souche de souris présentant un système immunitaire complet pour leur susceptibilité à l’induction de la polyar-thrite rhumatoïde par du sérum arthritogène et les anticorps anti-collagène. Cette souche de souris est adaptée pour des mesures de la capacité d’audition. Les animaux utilisés dans les modèles de la polyarthrite rhumatoïde seront utilisés à l’âge adulte (entre 8 et 15 semaines). Ceci permet l’induction de l’arthrite avec une incidence de 100% de façon synchronisée. Les animaux seront suivis pendant 30 jours après la troisième injection du sérum arthritogène (ou cocktail d’anticorps) puis mis à mort en fin d’expérimentation à J7, J14 et J30 après la troisième injection pour récupération d’organes post-mortem après des mesures de l’activité auditive.
Etude de la molécule de surface, ITGA7, dans les tumeurs cérébrales.
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système nerveux
845 souriceaux nouveau-nés reçoivent dans le cerveau une électroporation d'une minute qui déclenche un glioblastome. Toutes ces souris sont tuées à l'issue, 800 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et 45 un niveau sévère, 590 d'entre elles lors d'une chirurgie terminale de cinq minutes destinée à prélever le cerveau. Le porteur indique que les symptômes, activité réduite et poil hérissé, n'apparaissent qu'à partir de quarante jours et qu'une cohorte de 3,5 % des animaux sera suivie au-delà de ce seuil. Il justifie l'espèce par des contextes génétiques mutants qui, écrit-il, n'existent que chez la souris.
Objectifs
Les glioblastomes (GBM) représentent la forme la plus fréquente et la plus agressive des tumeurs primaires du cerveau avec un pronostic de survie très bas. Lors d’expériences pilotes, nous avons établi un modèle murin de GBM qui permet d’étudier le développement d’un glioblastome dès les étapes les plus précoces de l’induction du cancer et ce, dans un contexte physiologique conservant ainsi toute la complexité environnementale de la tumeur. Nous avons également observé qu’une protéine appelée Intégrine alpha7 (ITGA7) était présente dans les cellules tumorales au centre de la tumeur mais absente des cellules tumorales migrant à l’extérieur de la tumeur. Notre projet est de comprendre le rôle que joue ITGA7 dans le développement et la progression des glioblastomes. Pour cela 1) nous comparerons l’évolution des tumeurs quand elles sont induites en présence ou en absence d’ITGA7, en utilisant une lignée mutante pour ITGA7 et une lignée contrôle, 2) nous regarderons si la présence d’ITGA7 dans les cellules tumorales qui en sont dépourvues normalement influence leur destinée ou leur comportement.
Bénéfices attendus
Cette étude permettra une meilleure compréhension des propriétes des cellules tumorales dans les glioblastomes et notamment les différences entre les cellules tumorales du cœur de la tumeur et la sous-population qui se trouve à la marge de la tumeur et qui envahit les tissus sains adjacents. Ainsi, ce projet de recherche permettra d’évaluer le rôle d’une protéine présente à la surface des cellules cancéreuses, appelée ITGA7 dans l’évolution tumorale et peut-être d’envisager des approches thérapeutiques qui pourraient utiliser cette protéine comme cible pour limiter les propriétés invasives des cellules de glioblastome.
Procédures
Interventions: 1) Electroporation du cerveau: Ce geste est réalisé sous anesthésie générale. Durée de l'acte: 1 minute maximum, effectué sur 845 animaux nouveau-nés, 1 seule fois par animal. 2) Chirurgie terminale sous anesthésie générale en vue du prélèvement du cerveau. Durée: 5 minutes, 1 seule fois car conduit à la mort de l'animal, sur 590 animaux.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables attendus sont les effets liés au développement des tumeurs cérébrales. Ces effets ne se manifestent qu'à partir de 40 jours, apparaissent de façon soudaine et se caractérisent par une activité réduite de l’animal et un poil hérissé. Nous euthanasions ces animaux dès l’apparition de ces symptômes car il est synonyme de tumeurs très invasives. Dans la grande majorité de notre projet, nous euthanasierons les animaux au maximum à 28 jours soit bien avant l’apparition de tout symptôme. Toutefois, une cohorte représentant 3,5 % des animaux expérimentés sera sera suivi au-delà de 40 jours. Pour cette cohorte, l’apparition des symptômes décrits plus haut entrainera l’euthanasie immédiate des animaux.
Devenir
L’ensemble des animaux seront euthanasiés en fin de procédure car nous devons prélever leur cerveau en vue d’analyses histologiques et moléculaires des tumeurs.
Remplacement
Des cultures complexes de tissus tumoraux commencent à être utiliser pour étudier certains comportements cellulaires. Cependant, ces cultures ne récapitulent pas la complexité des interactions entre les cellules tumorales et son environnement, que l’on observe au cours du développement d’un glioblastome et notamment l’évolution des interactions avec les systèmes immunitaire et vasculaire qui sont fondamentales dans la progression tumorale. De plus, ces modèles utilisent des cellules tumorales issues de glioblastomes à un stade avancé, empêchant l’analyse du comportement cellulaire aux premiers stades de l’induction tumorale.
Réduction
Nous utiliserons une méthode expérimentale simple et rapide que nous maitrisons depuis plus de 15 ans, et pour laquelle des études antérieures nous permettent de calculer au plus juste le nombre d’animaux nécessaires pour obtenir des résultats reproductibles et statistiquement relevants. Le nombre d’animaux a été estimé en s’appuyant sur des tests statistiques appropriés adaptés aux petits échantillons. Les groupes témoins et les groupes tests seront constitués à partir des mêmes portées, sans distinction de sexe, afin d’optimiser le nombre de nouveau-nés utilisés par portée et donc de réduire le nombre de portée par expérience.
Raffinement
Les souris sont élevées en groupes sociaux, dans des environnements enrichis par la présence de tunnel en carton, carré de coton et dôme pour la nidification, au sein d’une animalerie exempte de pathogènes et dont les paramètres physiques et sanitaires sont strictement contrôlés. Cinq personnes sont dédiées à l’organisation, l’entretien des élevages et le soin aux animaux. Les animaux sont systématiquement anesthésiés avant toute procédure. Après l’expérimentation, ils sont hébergés dans une salle spécifiquement dédiée à la stabulation post-expérimentation, avec un suivi clinique quotidien. Les souriceaux d’une portée continuent d’être élevés tous ensemble avec leur mère. Tout au long de l’expérimentation et de la surveillance post-expérimentation nous nous attacherons à reconnaître douleur et anxiété et à les soulager si elles apparaissent, à agir lorsque les points limites prédéfinis sont atteints, à noter les observations faites et les actions entreprises. pour éviter toute souffrance, une prémédication d’un anti-douleur est administrée Lors de la chirurgie terminale sous anesthésie. L'acte n'est réalisé qu'après s'être assuré que l'animal est sans réaction.
Choix des espèces
De façon générale, la souris est le modèle mammifère le plus utilisé par la communauté scientifique pour établir des modèles de cancers in vivo permettant l’étude des mécanismes cellulaires et moléculaires pendant le développement de cancer. Nous avons montré dans des travaux précédents que le modèle d'induction de GBM que nous utilisons était pertinent car il mime les différentes caractéristiques cellulaires et moléculaires de la genèse et du développement des glioblastomes. Notre méthode originale est basée l’électroporation de souris nouveau-né. Ceci permet, de façon unique, de cibler spécifiquement les cellules à l'origine des glioblastome et ainsi d'étudier les étapes d’induction et de développement précoce des GBM dans des contextes génétiques mutants qui n’existent que chez la souris.
Etude des fonctions cognitives et de la formation des circuits neuronaux dans un modèle de souris muté pour un gène associé à l’autisme EU2/2
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
799 souris vont être utilisées entre les deux établissements de ce projet, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour 394 d'entre elles et modéré pour 405. Sur ce second site, une partie des animaux subit une chirurgie terminale sous anesthésie, quand les autres passent par une biopsie de queue puis une série de tests comportementaux répétés sur plusieurs semaines. Il s'agit de caractériser une lignée porteuse d'une mutation identifiée chez des personnes autistes, en suivant la formation des circuits corticaux du stade fœtal à l'âge adulte. Des expériences en éprouvette ont déjà établi que la mutation altère la fonction du gène, mais le porteur affirme que l'approche in vivo est "une nécessité" et que l'étude des circuits corticaux "empêche le remplacement par un modèle invertébré".
Objectifs
Contexte de l’étude : La perturbation de la formation des réseaux neuronaux pendant le développement embryonnaire est une cause de troubles graves du neurodéveloppement tels que les troubles du spectre autistique (TSA), le retard mental, l’épilepsie ou les déficits cognitifs. Les TSA concernent aujourd’hui près de 1% des naissances et sont considérés comme l’un des troubles les plus répandus de l’enfance. Cette étude a pour but d’étudier un gène muté dans les TSA et important pour le développement du cortex cérébral de la souris. Des travaux précédents ont permis de décrire les conséquences de l’inactivation complète de ce gène sur le développement cérébral et le comportement chez la souris. Mais à ce jour aucun modèle avec une mutation liée à l’autisme n’a été étudié. Objectif principal : Les modèles d’étude actuellement disponibles pour ce gène ne sont pas adaptés à l’étude des mutations retrouvées dans les troubles autistiques. Ce projet a pour but de caractériser un nouveau modèle de souris possédant une mutation identifiée à l’origine chez les patients autistes. Ce projet se déroulera dans deux établissements utilisateurs nommés EU1 et EU2.
Bénéfices attendus
Il est important de comprendre comment les gènes, lorsqu’ils sont mutés, entraînent des maladies, pour améliorer le diagnostic et le conseil aux familles, et imaginer des pistes thérapeutiques. La création d’un nouveau modèle de souris permet de suivre quelles étapes du développement embryonnaire sont affectées et conduisent à l’installation de la maladie. Ceci ne peut pas être réalisé chez l’homme car ces mutations sont détectées après le diagnostic, quand la maladie est déclarée. Ce projet étudiera donc un nouveau modèle murin qui mime mieux la pathologie humaine et permettra 1) de valider le caractère pathologique des mutations de ce gène dans les troubles du neurodéveloppement et plus largement 2) une meilleure connaissance des causes des pathologies neurodéveloppementales.
Procédures
Dans l'EU1, l’essentiel des expériences seront observationnelles. Tous les animaux subiront une biopsie, une seule fois, pour le génotypage. La biopsie dure moins d'une minute. Les animaux seront de plus soumis à des tests d’exploration des fonctions comportementales, non invasifs, et non douloureux, mais qui nécessiteront de manipuler régulièrement les animaux. Chaque test sera réalisé une fois par animal, au maximum 4 test par animal. Chaque test dure quelques minutes. L’ensemble des tests se déroule sur plusieurs semaines. Ces procédures peuvent entraîner un stress léger. Certaines femelles subiront une chirurgie avec réveil, sous anesthésie gazeuse (isoflurane) et en respectant les règles d’analgésie et d’asepsie chirurgicale. La chirurgie dure environ 30 minutes et sera réalisée une seule fois. La procédure peut entraîner une douleur et du stress dans les heures suivant la chirurgie. Dans l'EU2, certains animaux subiront une procédure chirurgicale terminale, sous anesthésie et analgésie.
Impact sur les animaux
Les nuisances les plus sévères qui aient jamais été observées pour le gène d'intérêt chez la souris sont un retard de croissance, et des changements des fonctions cognitives comme par exemple une perturbation de la mémoire à long terme. Dans ce projet, nous nous attendons à des manifestations moins sévères car la mutation étudiée n’abolit qu’une partie des fonctions du gène. Les animaux subiront une biopsie, une seule fois, entraînant un stress et une douleur passagers. Certains animaux subiront une procédure chirurgicale avec réveil, selon une procédure bien maîtrisée par les expérimentateurs. Elle sera réalisée sous anesthésie générale avec analgésie péri- et post-opératoire, ainsi qu’un suivi post-opératoire adapté. Dans de très rares cas, cette technique peut entraîner une difficulté à la mise bas ou une mortalité intra-utérine d’embryons. Les tests d'exploration du comportement sont non invasifs mais peuvent entraîner un stress lié à la manipulation.
Devenir
Les animaux sont des souris génétiquement modifiées, nous ne pouvons donc pas les replacer à l’issue de ce projet. Par conséquent tous les animaux seront euthanasiés.
Remplacement
Ce projet a pour objectif de mieux caractériser un modèle murin possédant une mutation retrouvée chez des patients autistes . En préalable à ce projet, nous avons réalisé des expériences in vitro prouvant que la mutation étudiée altère la fonction du gène , ce qui nous permet de nous assurer que l’étude est pertinente. Néanmoins dans l’état actuel des connaissances scientifiques, les étapes de développement du cerveau ne peuvent être modélisées entièrement in vitro. L’approche in vivo est une nécessité afin d’aborder des troubles complexes de la cognition et du comportement. L’étude de circuits corticaux nécessite d’avoir recours à un animal possédant une structure corticale et par conséquent empêche le remplacement par un modèle invertébré.
Réduction
Les accouplements seront optimisés afin de produire strictement le nombre nécessaire d’animaux pour la caractérisation initiale du modèle. Une partie des animaux qui ont subi uniquement des observations (par exemple pesée) pourront être utilisés dans des tests de comportement, pour réduire le nombre total d'animaux Le nombre d’animaux utilisés est limité au minimum nécessaire pour déterminer la significativité statistique des résultats, et a été déterminé par un calcul préalable de puissance statistique.
Raffinement
Pour l'ensemble des procédures, nous avons défini des points limites prédictifs et précoces afin de prédire au mieux et le plus tôt possible des manifestations conduisant à la mise en place de traitements ou à l’arrêt de la procédure. Nous veillerons à adapter les conditions d’élevage aux phénotypes observés. La procédure chirurgicale est bien maîtrisée par les expérimentateurs et sera réalisée uniquement par un chercheur expérimenté. Un recours à l’analgésie péri-opératoire, ainsi qu’à une analgésie post-opératoire (calibrée par rapport à une grille d’évaluation de la douleur) nous permettra de limiter le stress et la douleur subis par les animaux. Concernant les évaluations comportementales, les animaux sujets aux tests de comportement seront acclimatés à la salle de test au préalable afin de réduire le stress causé par un nouvel environnement. Les différents tests seront réalisés les uns à la suite des autres, avec un temps de pause suffisant entre chaque test pour limiter un stress éventuel des animaux. A noter que les tests de comportement ne sont pas invasifs et ne portent pas atteinte à l’intégrité de l’animal.
Choix des espèces
L’architecture du cerveau de la souris est très proche de l’architecture du cerveau humain dans sa structure et son fonctionnement. Le modèle murin est un modèle animal reconnu dans le cadre des études des pathologies neurodéveloppementales tels l’autisme et/ou les déficiences mentales. Par ailleurs, nos précédents travaux nous ont permis de décrire que des mutations dans notre gène d'intérêt et associées à la pathologie autistique perturbent le développement cérébral et le comportement chez la souris (. Dans ce projet qui s'intéresse au neurodéveloppement, nous observerons des animaux depuis la naissance jusqu’à un stade adulte. L’étude de la formation des réseaux neuronaux se fera chez des fœtus au 3ème tiers de la gestation chez la souris. Les tests de comportement seront réalisés sur des animaux jeunes adultes, idéalement entre 60 et 90 jours mais cet âge peut différer légèrement selon la disponibilité des animaux et la composition des cohortes.
Etude de toxicité chez le rongeur
- Recherche appliquée
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
Rats : 7040
14 080 rongeurs, 7 040 souris et 7 040 rats, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les composés leur sont administrés par voie orale, intraveineuse, intrapéritonéale, intramusculaire, sous-cutanée ou intranasale, jusqu'à 120 administrations par animal, avec des prélèvements sanguins pouvant retirer 15 % de leur volume sanguin. Le porteur prévoit que certains animaux atteignent les points limites du fait des substances elles-mêmes, ce qui déclenchera leur mise à mort anticipée. Deux phrases suffisent au RNT pour exposer objectifs et bénéfices de cette évaluation toxicologique de candidats médicaments, sans nommer aucun composé ni justifier l'effectif de 14 080 animaux.
Objectifs
L’évaluation toxicologique de nouveaux candidats médicaments est une étape clé dans leur processus de développement. Ce projet vise donc à évaluer le profil toxicologique de nouveaux candidats médicaments.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d’avancer dans la caractérisation de nouveaux candidats médicaments en s’assurant de leur innocuité chez l’animal avant toute administration chez l’Homme.
Procédures
1) L’administration des composés à tester ou de leur solvant en moins d’une minute par animal pendant la durée de l’étude pourra être réalisée via différentes voies d’administrations : - par voie orale (une administration pour la procédure 1 – jusqu’à 28 administrations pour la procédure 2 – jusqu’à 120 administrations pour la procédure 3) - par voie intraveineuse (une administration pour la procédure 1 – jusqu’à 14 administrations pour la procédure 2 – jusqu’à 24 administrations pour la procédure 3) - par voie intrapéritonéale (une administration pour la procédure 1 – jusqu’à 28 administrations pour la procédure 2 – jusqu’à 24 administrations pour la procédure 3) - par voie intramusculaire (une administration pour la procédure 1) – par voie sous cutanée (une administration pour la procédure 1 – jusqu’à 28 administrations pour la procédure 2 – jusqu’à 120 administrations pour la procédure 3) – par voie intranasale sous anesthésie gazeuse a l’isoflurane (1 administration pour la procédure 1) 2) De 1 à 3 prélèvements sur 24h pourront être réalisés jusqu’à 2 fois dans l’étude avec un volume total ne dépassant pas 15% du volume sanguin de l’animal avec un temps de récupération de 2 semaines minimum. Le prélèvement pourra être fait à la veine submentale, saphène (sans anesthésie). Les prélèvements se feront sur une durée de deux minutes par animal.
Impact sur les animaux
On pourrait observer des effets indésirables (stress, douleur de courte durée) liés à la voie d’administration des composés ou aux composés testés en eux même avec pour certains animaux l’atteinte potentielle des points limites. Des effets indésirables (stress, douleur de courte durée) liés aux prélèvements sanguins pourraient également être observés.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin des procédures expérimentales, des analyses sur les organes étant nécessaires pour évaluer l’innocuité des molécules testées.
Remplacement
A ce jour, aucun modèle cellulaire ne permet de rendre compte des potentiels effets indésirables in vivo des nouveaux candidats médicaments. De plus l’évaluation de la toxicité potentielle des candidats médicaments est une étape clé de leur développement.
Réduction
Afin de réduire au maximum le nombre d’études, et donc le nombre d’animaux utilisés, les différents candidats médicaments seront préalablement testés in vitro. Ne rentreront dans les études in vivo que ceux ayant montré le plus d’efficacité ainsi qu’une absence de toxicité dans ces tests in vitro. Le nombre d’animaux utilisés par étude sera réduit au maximum de manière à pouvoir observer de potentiels effets indésirables et est adapté des recommandations de l’OCDE associées à la réalisation d’étude toxicologique chez le rongeur. Pour la détermination des doses maximales tolérées un groupe vehicule unique sera utilisé tout au long du processus afin de réduire le nombre d’animaux. De plus, l’administration des composés se fera séquentiellement ce qui permettra d’utiliser le nombre minimum d’animaux possible en n'incluant pas les reste des animaux prévu si le composé est toxique. Enfin, les études de toxicité chronique avec récupération ne se feront que sur les dose maximales testées la encore afin de réduire le nombre d’animaux. De ce fait, ce projet permet de réduire le nombre de composés qui seront testés dans les études d'éfficacité nécessaires aux études précliniques.
Raffinement
Afin de réduire le stress, une acclimatation d’au moins 4 jours sera réalisée avant l'entrée en étude. Les animaux seront hébergés dans un environnement contrôlé en continu (température, pression, hygrométrie, renouvellement d’air, alternance jour/nuit) relié à un système d’alarme. La densité dans les cages sera en conformité avec les recommandations et autant que possible, les groupes d’animaux dans les études resteront ceux formés pendant l’acclimatation. Les animaux et leurs conditions d’hébergement (environnement, nourriture, eau de boisson) seront sous surveillance quotidienne. Enfin, si les points-limites préalablement établis sont atteints, l’animal sera mis à mort éthiquement et de façon anticipée afin d’éviter toute souffrance. En cas d’apparition de signes de souffrance animale, de la nourriture pourra être ajoutée dans les cages sous forme de nourriture humidifiée. Lors de la mise à mort les animaux seront placés sous anesthésie profonde à l’isoflurane. L’environnement des animaux sera enrichi à leur arrivée et pendant toute la période d’acclimatation (maisons en carton, carrés de coton, feuilles de cellulose, …).
Choix des espèces
L’évaluation toxicologique des candidats médicaments est une étape clé de leur développement qu’il est nécessaire de réaliser dans au moins une espèce de rongeurs. Pour cela ce projet sera réalisé chez la souris et/ou chez le rat qui sont les deux espèces de rongeurs les plus utilisées pour des études de toxicologie. Cela permettra également de définir les doses maximales pouvant être utilisées dans les futures études d’efficacité qui seront réalisées dans ces deux espèces. L’âge des animaux utilisé dans ce projet sera choisi en fonction de l’indication du nouveau candidat médicament.
Modèles expérimentaux de sécheresse oculaire chez le rat, la souris et le lapin.
- Formation professionnelle
- Recherche appliquée
- Maladies animales
- Troubles sensoriels
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
Rats : 2700
Lapins : 2700
Provoquer un œil sec chez des animaux pour tester des traitements et former des professionnels : 2 700 lapins, 2 700 souris et 2 700 rats vont être utilisés, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour 900 d'entre eux et modéré pour 7 200. Les produits sont instillés dans l'œil deux à six fois par jour pendant quatre semaines, des patchs collés sur la peau sont changés toutes les 48 à 72 heures, et une chirurgie de moins de dix minutes peut intervenir une à deux fois. Les animaux doivent ressentir picotements, brûlures et sensation de sable dans les yeux, ce que le porteur rapproche des symptômes décrits par les personnes atteintes. 1 620 d'entre eux, 540 par espèce, sont annoncés comme réutilisables après une dizaine de jours de retour à des conditions normales, les autres étant tués pour les prélèvements. Le porteur indique utiliser déjà ces modèles et vouloir "continuer à les proposer".
Objectifs
L'objectif de ce projet est de développer des modèles expérimentaux de sécheresse oculaire chez le rat, la souris et le lapin afin de tester l'efficacité de nouveaux traitements. Le syndrome de l'œil sec est une maladie multifactorielle affectant les larmes et la surface oculaire, plus fréquente chez les femmes et les personnes âgées, et touchant entre 5% et 35% de la population. Les manifestations cliniques sont variées et impactent considérablement la qualité de vie des patients. Les modèles de sécheresse oculaire chez les rongeurs et le lapin sont bien documentés dans la littérature. Nous avons sélectionné trois modèles parmi les plus référencés, les plus efficaces en termes d'impact sur la surface oculaire et de réduction de la sécrétion de larmes, et les moins contraignants pour les animaux. Nous utilisons déjà ces modèles et souhaitons continuer à les proposer.
Bénéfices attendus
Le bénéfice attendu de ce projet est de proposer des modèles expérimentaux permettant d'évaluer l'efficacité de nouveaux traitements. La recherche de traitements est en constante évolution et nécessite de pouvoir les tester dans les meilleures conditions possibles, tout en respectant le bien-être animal.
Procédures
Pour ce projet, les animaux seront soumis à différents types d’interventions : 1. Administration de traitements : Les traitements seront administrés 2 à 6 fois par jour pendant toute la durée de l’étude (généralement 4 semaines maximum). Ces administrations, le plus souvent par instillations (gouttes oculaires), sont indolores et ne durent que quelques secondes à chaque fois, le temps de prendre l’animal, de le maintenir et de lui appliquer le produit. 2. Pose de patchs : La pose de patchs sur la peau de l’animal ne dure que quelques secondes, le temps de prendre l’animal, de le maintenir et de lui appliquer le patch et le sparadrap qui le maintiendra en place. Ces patchs nécessitent un changement toutes les 48-72 heures pendant toute la durée de l’étude (généralement 4 semaines maximum). Pour leur retrait, l’animal sera maintenu le temps du retrait, qui ne durera pas plus de quelques secondes. 3. Chirurgie : Une petite chirurgie sous anesthésie légère pourra être nécessaire. Cette intervention durera moins de 10 minutes et sera généralement réalisée une seule fois durant l’étude, 2 fois au maximum. 4. Suivi sanitaire et comportemental : Les animaux feront l’objet d’un suivi sanitaire et comportemental quotidien, ainsi que d’un suivi pondéral hebdomadaire, afin de s’assurer de leur état et de leur bien-être. Les animaux seront manipulés quelques secondes puis remis dans leur environnement habituel. 5. Examens : Les animaux feront également l’objet d’examens (imagerie, observations au biomicroscope) afin de déterminer l’effet des traitements. Ces examens, réalisés chez l’homme en cabinet médical par un ophtalmologiste sans anesthésie et sans hospitalisation, le sont également chez l’animal en clinique vétérinaire. Certains examens pourront se faire sur des animaux vigiles, mais ceux nécessitant l’immobilisation complète de l'animal seront pratiqués sous anesthésie légère. Ces examens ne durent que quelques minutes, 5 tout au plus. 6. Prélèvements de sang : Des prélèvements de sang pourront être réalisés au cours des procédures expérimentales afin de doser le principe actif ou tout autre marqueur d'intérêt. Les prélèvements de sang qui durent généralement moins d’une minute, seront réalisés au maximum une fois par semaine.
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues chez les animaux devraient principalement être celles observées dans la sécheresse oculaire chez l'homme, telles que des picotements, des démangeaisons, des sensations de brûlure, de sable ou de corps étranger dans les yeux. Toutes ces manifestations sont dues à la composante inflammatoire de la maladie. L'administration des produits devrait provoquer tout au plus une gêne transitoire de courte durée et éventuellement une hyperémie des conjonctives, comme observé chez l'homme. L'administration sous-cutanée ou transdermique pourrait entraîner une légère inflammation avec l'apparition de rougeurs, sans conséquence majeure.
Devenir
Les animaux ayant subi une chirurgie ou la totalité de la procédure expérimentale (incluant la phase de mise au point) et nécessitant pour le besoin de l'étude des prélèvements post-mortem pour des évaluations ex vivo (évaluations histologiques, ELISA...) seront mis à mort. Les effets de ces procédures sur l’animal étant réversible après l’arrêt des administrations et la remise en conditions standards d’hébergement sous une période estimée de 10 jours, on pourra envisager une réutilisation des animaux après une évaluation sanitaire, physiologique et comportementale. Il en va de même pour les études d'efficacité de traitements, les animaux n'ayant pas suivi la totalité de la procédure (hormis ceux exclus pour cause de points limites) pourront être réutilisés dans d'autres procédures expérimentales compatibles avec l'avis du vétérinaire. Ces animaux sont des animaux qui sont exclus de l'étude en raison d'un défaut anatomique ou physiologique détecté aux examens baseline ou d'inclusion au niveau de l'oeil avant le début de l'étude. Ces animaux n'auront pas reçu d'induction de la pathologie, ni d'administration de traitement, seulement des examens qui ne sont pas invalidants mais qui potentiellement nécessite une anesthésie.
Remplacement
L'œil est un organe complexe, composé de plusieurs tissus anatomiquement et physiologiquement très différents. Il est soumis à d'importantes variations environnementales mécaniques et physicochimiques, ainsi qu'à des interactions biologiques significatives avec les tissus et organes voisins. À ce jour, bien que des méthodes alternatives telles que les tests in vitro (sur cellules ou tissus) et les simulations in silico existent, aucune ne permet de reproduire l'œil dans sa globalité fonctionnelle et environnementale. C'est pourquoi l'utilisation d'animaux vivants dans ces procédures expérimentales reste encore nécessaire pour atteindre les objectifs de ce projet.
Réduction
Le nombre maximum d'animaux prévu pour ce projet a été déterminé en fonction des distributions théoriques rencontrées dans les données bibliographiques et historiques de l'établissement, du nombre d'études estimées, et en tenant compte des variations du métabolisme, de la robustesse des mesures et de notre expérience. Ce nombre limité doit nous permettre de conclure sur l'efficacité ou non d'un traitement. L'effet d'un traitement sera évalué à chaque moment à l'aide de tests statistiques afin d'ajuster et de revoir à la baisse, si possible, le nombre d'animaux à inclure dans les procédures. De plus, dès que les procédures expérimentales le permettront, des évaluations non invasives seront choisies tout au long du projet pour améliorer la condition animale et éviter la mise à mort inutile des animaux. De même, l'analyse des deux yeux sera privilégiée autant que possible afin de réduire le nombre d'animaux utilisés.
Raffinement
Un suivi quotidien des animaux sera effectué afin de minimiser l'impact des procédures sur leur bien-être. Les rongeurs seront placés en groupe dans des cages d'hébergement contenant nourriture et boisson ad libitum, ainsi que des enrichissements à ronger. Si la procédure expérimentale le permet, un abri sera ajouté. Les lapins seront placés par deux dans des cages avec boisson ad libitum, nourriture et enrichissements à ronger. Les examens non invasifs choisis pour évaluer les signes cliniques de la maladie sont similaires à ceux pratiqués chez l'homme en cabinet ophtalmologique ou chez l'animal en cabinet vétérinaire. Les examens de l'œil nécessitant l'immobilité de l'animal pourront être réalisés sous anesthésie pour son confort. Des points limites adaptés, suffisamment prédictifs et précoces permettront de minimiser la douleur. Ce projet a été soumis à un comité d'éthique pour évaluation et sera suivi par la structure en charge du bien-être animal de l'établissement.
Choix des espèces
Les espèces animales choisies ont une physiologie, une anatomie et un métabolisme largement décrits dans la littérature scientifique, facilitant ainsi l'extrapolation des effets sur l'œil à l'homme. De plus, les modèles expérimentaux de cette pathologie sont largement utilisés et bien documentés pour ces espèces, sur lesquelles le projet est basé. Pour ce projet, des souris, des rats et des lapins ont été retenus afin de tenir compte des particularités anatomiques et physiologiques de chaque espèce, augmentant ainsi les chances de mener ce projet à terme. Les animaux utilisés seront de jeunes adultes à leur arrivée dans notre animalerie. Les lapins inclus dans ce projet auront 8 à 12 semaines et les rongeurs 6 à 12 semaines conformément aux publications de référence qui servent de base aux modèles.
Greffe de fragments de rates humaines chez des souris humanisées et étude de la restauration de la fonction splénique.
- Recherche appliquée
- Diagnostic des maladies
- Troubles cardiaques
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système immunitaire
Les souris de ce projet sont immunodéficientes et humanisées, la rate qu'on leur retire étant remplacée par des fragments de rate humaine, y compris de rate fœtale. 1 050 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune subit une chirurgie de quarante-cinq minutes, jusqu'à huit prélèvements sanguins répartis sur 112 jours et une échographie de quarante-cinq minutes tous les quatorze jours, leur immunodéficience les exposant par ailleurs aux infections. Le porteur justifie la mise à mort par le fait que ces animaux sont modifiés et greffés de tissu humain, et prévoit de proposer les rates murines retirées à des équipes d'immunologistes du campus comme source de cellules.
Objectifs
Le premier objectif du projet est d’explorer expérimentalement le rôle de filtration de la rate et les différents mécanismes physiques et biologiques à l’origine de la rétention des globules rouges dans la rate, en particulier dans le cadre de maladies héréditaires (drépanocytose, sphérocytose héréditaire, ...) ou acquises (Paludisme,...). Dans ces maladies, la déformabilité des globules rouges est altérée, entraînant une rétention dans la rate à l’origine d’anémie et de complications pouvant être graves. Les mécanismes d’anémie et de congestion de la rate sont complexes et requièrent un modèle expérimental. Les modèles murins conventionnels ne sont pas totalement pertinents pour analyser cette fonction physiologique et les mécanismes physiopathologiques. Des souris greffées par des fragments de rate humaine permettraient en revanche d’aborder ces questions. La filtration des globules rouges est un phénomène dynamique, tridimensionnel et multicellulaire, impossible à répliquer entièrement in vitro dans l’état actuel de la technique. L’étude aura également pour objectif d’étudier la prise de greffe et le développement de fragments de rate fœtale. Cela permettra d’analyser la fonction filtrante et immunologique de ces rates immatures en considérant que leur développement reflète – ou non – en partie la poursuite de leur développement physiologique. En deuxième objectif, nous souhaitons explorer la faisabilité de l’auto-greffe splénique humaine afin de restaurer une fonction déficiente, sur le modèle de la préservation de la fertilité par cryopréservation-réimplantation différée des ovaires en médecine humaine. Chez les patients atteints de drépanocytose, une splénectomie est parfois nécessaire du fait de complications graves. La cryopréservation d’une partie du tissu splénique permettrait sa réimplantation et la restauration d’une fonction splénique normale chez les patients guéris ultérieurement de leur drépanocytose. Démontrer dans le modèle murin la prise de greffe avec des fragments de rate humaine serait une indication forte du succès possible de notre démarche. La probabilité de succès est élevée du fait du phénomène de splénose (repousse de petits fragments spléniques), observé tant chez l’être humain que chez la souris.
Bénéfices attendus
La rate joue un rôle crucial dans le système immunitaire et aide à maintenir une circulation fluide des globules rouges en éliminant ceux qui pourraient obstruer les petits vaisseaux. En cas de certaines maladies des globules rouges, la rate peut devenir hyperactive, entraînant une anémie et d'autres complications. Les mécanismes exacts de ces processus ne sont pas encore bien compris. Un processus spécifique appelé "pitting" permet à la rate d'éjecter des corps rigides ou des parasites morts des globules rouges sans les endommager. Ce processus est difficile à étudier en laboratoire, car il nécessite l'utilisation de rates humaines, qui sont rares et limitées. Pour mieux comprendre ces mécanismes, l’étude propose de greffer des fragments de rate humaines sur des souris afin d'observer directement la filtration des globules rouges et d'évaluer les effets de médicaments sur la déformabilité des globules rouges. Ce modèle pourrait également être utilisé pour des interventions thérapeutiques ou prophylactiques. L’utilisation de rates fœtale permettrait également d’étudier la maturation de ces dernières dans notre modèle. La perte de fonction splénique peut entraîner des complications graves. Après une rupture de rate traumatique, la rate peut se régénérer spontanément, ce qui suggère qu'une réimplantation contrôlée de tissu de la rate pourrait améliorer le pronostic à long terme des patients. Cette étude préclinique est une étape nécessaire avant de solliciter l'agence de la biomédecine pour la mise en œuvre d'une démarche ambitieuse de préservation de la fonction de la rate chez l'être humain, ce qui pourrait avoir de grands bénéfices pour certains patients.
Procédures
Les animaux dans ce projet expérimental seront soumis : Procédure 1 : - 2 à 6 injections (15sec) sur animaux vigiles répétables toutes les 8-12h - 1 à 3 injections (15sec) sur animaux vigiles répétables toute les 8-12h - 1 chirurgie (45 min) sur animaux anesthésiés et analgésiés - 8 prélèvements sanguins sur animaux vigiles (30 sec) répétés tous les 14 jours sur une période totale de 112 jours - 1 échographie tous les 14 jours sur animaux endormis jusqu’à 112 jours (45min) Procédure 2 : - Pour l’ablation de la rate et la greffe, les interventions seront les mêmes que pour la procédure 1 - 1 échographie tous les 14 jours sur animaux anesthésiés jusqu’à un temps déterminé en procédure 1 (45 min) sur animaux anesthésiés - 2 injections (30 sec) espacées de 3 jours si besoin - 1 injection sur animaux endormis (2min) - 5 prélèvements sanguins (30sec) de faible volume répété à 1 min, 30 min, 2h, 24h et 48h - Imagerie sur animaux anesthésiés durant un temps défini ne dépassant pas 4 heures
Impact sur les animaux
Les souris utilisées sont immunodéficiente ce qui augmente leurs sensibilités aux infections. Les injections et prélèvements de sang peuvent causer une douleur légère et temporaire à chaque site d'injection. La piqure d’aiguille pour l’injection elle-même provoque une douleur légère de courte durée. La chirurgie (exérèse de la rate, greffe) quant à elle, entraîne une douleur et un inconfort modérés.
Devenir
Tous les animaux à la fin de la procédure seront mis à mort car étant des organismes génétiquement modifiés et/ou greffés et/ou injectés avec du tissu humain ils ne peuvent pas être réutilisés ou replacés.
Remplacement
La démarche n'est pas directement applicable chez l'être humain et nécessite une étape préclinique. Les seules données antérieures disponibles sur cette démarche de greffe de rate humaine ont été obtenues chez la souris. Les modèles in vitro et ex vivo préalablement développés présentent des limites dans leur puissance d’exploration (visualisation directe de la filtration des globules rouges, évaluation de l’impact des médicaments in vivo), ne pouvant être franchies que par l’expérimentation animale.
Réduction
Le nombre de souris impliquées est réduit au maximum pour confirmer la faisabilité de la démarche et évaluer les médicaments avant leur utilisation chez l'être humain. Nous souhaitons nous assurer d'une probabilité de prise de greffe fonctionnelle supérieure à 70%. L’utilisation de l’échographie pour évaluer la prise de greffe lors de nos procédures permet un suivi transversal permettant de réduire le nombre d’animaux. Les rates murines enlevées lors de la splénectomie préparatoire seront proposées à des équipes d’immunologistes du campus comme source de cellules. Le nombre d’animaux a été défini avec un biostatisticien et à l’aide d’un outil statistique où nous considérons deux groupes et 3 répétitions. Chaque répétition sera divisée en 4 jours d'expériences, avec 2 animaux par groupe et par jour. Par conséquent, nous considérons un effet aléatoire jour qui inclut à la fois les effets de la répétition et du jour. Un effet lot/jour pourrait représenter 10,00 % de la variabilité totale, ce qui nous amène à multiplier le nombre total d'individus par un facteur adapté par rapport à une situation où aucun effet de lot n'est attendu. Résolution statistique de l'expérience : Nous avons décidé d'utiliser 8 individus par groupe et par répétition, ce qui porte le nombre total d'individus à 48. En tenant compte d'un effet lot/jour de 10,00 %, ces nombres devraient nous permettre d'obtenir des résultats significatifs pour des effets importants à très importants.
Raffinement
Le choix du modèle animal participe au raffinement en sélectionnant une espèce et une souche adaptées aux objectifs scientifiques tout en minimisant l’inconfort. Leur immunodéficience impose un hébergement en conditions sanitaires strictes où tout ce qui sera en contact avec les animaux sera stérile pour limiter les risques infectieux. Les interventions chirurgicales et injections seront faites sous anesthésie gazeuse avec une analgésie adaptée afin de limiter la douleur, le stress et d’optimiser la récupération. Des plaques chauffantes préviendront l’hypothermie, une réhydratation post-opératoire sera assurée, et un gel appliqué pour éviter le dessèchement oculaire. Les greffons stériles seront traités afin de garantir une asepsie maximale et prévenir toute infection ou réponse inflammatoire. La greffe sera effectuée là où la rate se régénère naturellement. Cette technique est privilégiée car elle est robuste et évite une nouvelle incision. L’échographie permet un suivi transversal des animaux et déceler des signes précoces de nécrose des greffons. Les animaux seront observés quotidiennement, avec des critères d’évaluation précis basés sur les recommandations de la SBEA. Des points limites spécifiques et précoces, tels qu’une perte de poids, des signes de détresse, des signes inflammatoires ou d’infections sont identifiés et pourrons permettre de traiter l’animal avec l’avis du vétérinaire et le cas échéant, la mise à mort sera réalisée.
Choix des espèces
Notre objectif est de développer des mesures fiables et indépendantes de fonctionnement anormal de la rate. Nous utilisons plusieurs techniques. Les marqueurs actuels, peu adaptés aux contraintes hospitalières, nécessitent une validation plus robuste comme prédicteurs de gravité. Le produit final visé est un test biologique de routine quantifiant la fonction splénique. Pour atteindre cet objectif, un modèle expérimental animal est indispensable. Après avoir testé diverses hypothèses physiopathologiques et agents pharmacologiques in vitro, nous devons désormais confirmer nos résultats in vivo pour proposer de nouvelles solutions thérapeutiques. Un modèle murin est essentiel, car les systèmes moins évolués ne reflètent pas suffisamment le contexte humain. L’humanisation du modèle murin par greffe d’organes humains a déjà permis des avancées significatives dans la compréhension de plusieurs phénomènes physiopathologiques. De jeunes adultes de 8 semaines seront utilisés afin d’être suffisamment âgés pour permettre une chirurgie aisée et suffisamment jeunes pour permettre un suivi prolongé (3 mois). De plus, cet âge correspond à l’âge des souris dans l’article publié sur lequel nous nous basons pour ce projet.
Identification de biomarqueurs prédictifs pour le traitement personnalisé des cancers du pancréas et du foie par radiothérapie externe ou radiothérapie interne vectorisée EU1/2
- Recherche appliquée
- Cancers
Livrées par un transporteur spécialisé après un trajet limité à trente minutes, les souris arrivent à cinq semaines et entrent en expérience une semaine plus tard, une partie d'entre elles quasiment dépourvue de système immunitaire. 6 539 souris vont être utilisées sur les deux sites du projet, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une tumeur du pancréas ou du foie implantée sous la peau ou dans l'organe, une radiothérapie externe ou un produit radioactif injecté, puis jusqu'à une heure trente d'IRM sous anesthésie. Les essais en éprouvette ont déjà confirmé l'efficacité des produits testés, ce dont le porteur déduit qu'il est "indispensable" de passer à l'animal, faute de reproduire in vitro la complexité du milieu tumoral.
Objectifs
Les avancées récentes en cancérologie ont considérablement amélioré les options de traitement, notamment en radiothérapie. Parmi les techniques utilisées, il y a la radiothérapie externe, qui cible les tumeurs à l'aide de rayons et la radiothérapie interne, qui consiste à injecter des substances radioactives se fixant directement sur les cellules tumorales. L'objectif principal de ce projet, qui se déroulera sur 2 sites de recherche différents (EU1 et EU2), est d'identifier des biomarqueurs prédictifs de la réponse aux radiothérapies dans des modèles animaux de cancers pancréatique et hépatique. Actuellement, l'absence de biomarqueurs fiables pour évaluer l'efficacité et la toxicité de ces traitements empêche de personnaliser les soins oncologiques. Ce projet vise à relier des marqueurs biologiques à la réponse tumorale et aux effets secondaires des traitements, afin d'adapter ces approches thérapeutiques en clinique. L'utilisation de modèles animaux est essentielle pour se rapprocher des conditions humaines. De plus, nos techniques d'imagerie permettront de suivre l'évolution des biomarqueurs d'intérêt sur le long terme, sans avoir à euthanasier les animaux à chaque étape. Ces outils aideront à identifier des biomarqueurs prédictifs la réponse aux traitements en milieu clinique.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à valider de nouveaux biomarqueurs d’imagerie prédictifs pour mieux identifier les patients susceptibles de bénéficier de la Radiothérapie externe ou de nouvelles approches en Radiothérapie Interne Vectorisée, tout en permettant une évaluation rapide de l’efficacité des traitements.
Procédures
Dans ce projet, des tumeurs pancréatiques et hépatiques seront implantées chez des souris, soit sous la peau (1 minute), soit directement dans l'organe (4 minutes), après anesthésie gazeuse (5 minutes). Certaines souris recevront un médicament radioactif par injection (20 secondes), tandis que d'autres auront un traitement de radiothérapie externe (4 minutes), également sous anesthésie chimique par voie intrapéritonéale (15 secondes). Des prises de sang (15 secondes) seront effectuées pour vérifier l'impact des traitements sur le sang, le foie et les reins. Une partie des souris sera utilisée pour tester l'efficacité des différents traitements, et une autre pour étudier par imagerie des marqueurs biologiques. L’imagerie PET-CT sera réalisée au sein de l’EU1 (1 heure maximum), l’imagerie IRM sera réalisée au sein de l’EU2 (1h30 maximum). En outre, certaines souris permettront de mesurer la répartition du médicament dans différents organe après euthanasie. La croissance des tumeurs sera suivie minutieusement et évaluée deux fois par semaine par des techniques n'induisant pas de nuisances.
Impact sur les animaux
On peut s'attendre à un léger stress dû à la manipulation des animaux. La douleur associée aux injections intrapéritonéales, intratumorales et intraveineuses est équivalente à celle d'une piqüre avec une aiguille. De plus, la douleur générée par les prélèvements sanguins, l'implantation des cellules tumorales sera soigneusement contrôlée. Le suivi du développement tumoral, avec des mesures et observations régulières, garantira que leur augmentation de volume n’entraine pas de souffrance ou de difficulté pour la locomotion. Si nécessaire, des médicaments anti douleurs seront administrés.
Devenir
Les souris seront toutes euthanasiées en fin de procédure expérimentales ou plus précocement sur la base de critères éthiques
Remplacement
Des tests in vitro ont été réalisés en laboratoire pour évaluer la cytotoxicité des traitements ainsi que leur impact sur la survie et la prolifération des cellules tumorales. Ces essais ont confirmé l’efficacité des radiopharmaceutiques et des modalités de traitement dans un environnement contrôlé. Ils ont également fourni des informations clés sur les mécanismes d’action des traitements et leurs effets sur les cellules tumorales ainsi que sur les fibroblastes associés au cancer. Cependant, malgré la richesse de ces résultats, il est indispensable de passer à des modèles in vivo, car les tests in vitro ne peuvent pas reproduire la complexité du milieu tumoral ni permettre l'évaluation de l’efficacité thérapeutique par imagerie ou la recherche de biomarqueurs prédictifs dans un contexte vivant. Ainsi, les protocoles qui seront utilisés in vivo reposent directement sur les résultats obtenus lors des tests in vitro.
Réduction
Le nombre d'animaux utilisés sera limité au strict nécessaire pour obtenir des résultats fiables. Grâce à des techniques d'imagerie non invasive, nous pourrons suivre l'évolution des traitements sans avoir à euthanasier les animaux à chaque étape. Les effets des traitements seront suivis de près pour observer l'évolution des tumeurs et comprendre les effets de chacun des traitements. Tout au long du projet, le bien-être des animaux sera une priorité.
Raffinement
Afin de limiter la douleur et le stress des animaux, nous avons établi des point limites gradés, précis et adaptés pour toutes les procédures mises en oeuvre au cours de ce projet. Si les animaux atteignent ces points limites, cela constitue un critère d’arrêt de l’expérimentation et les animaux seront euthanasiés. Une surveillance minutieuse des animaux sera réalisée (suivi journalier du poids, du volume tumoral et du comportement) afin réduire au minimum les nuisances sur le bien-être des animaux. En cas de douleur, un traitement antidouleur adapté sera donné. Concernant l’enrichissement du milieu, les souris disposent de carrés en cellulose pour la formation d’un nid commun confortable, de baguettes en bois qu’elles peuvent ronger. En cas d’isolement forcé d’une souris dans une cage, un abri supplémentaire sera également fourni. Certains animaux utilisés dans ce projet n’ont quasiment pas de système immunitaire, ils seront donc hébergés dans des conditions sanitaires strictes. Les animaux seront transportés par un transporteur spécialisé, dans des boîtes de transport ventilées, avec de la litière, de l’hydrogel et de la nourriture. Le trajet sera court et ne dépassera pas 30 minutes pour limiter leur stress.
Choix des espèces
La souris est un mammifère suffisamment proche de l’espèce humaine d’un point de vue physiologique et la souris immunodéprimée est un bon modèle pour l’étude de la cancérologie humaine. Les animaux, âgés de 5 semaines, seront utilisés après une période d’acclimatation d’une semaine après la réception. Ils seront alors âgés de 6 semaines, âge où l’on observe une forte incidence de prise de greffe et une bonne homogénéité de réponse.
Etude des fonctions cognitives et de la formation des circuits neuronaux dans un modèle de souris muté pour un gène associé à l’autisme EU1/2
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Une biopsie de queue pour le génotypage, jusqu'à quatre tests comportementaux et, pour certaines femelles, une chirurgie de trente minutes avec réveil : 799 souris vont être utilisées entre les deux établissements du projet, toutes tuées à l'issue. Les procédures impliquent un niveau de souffrance léger pour 394 d'entre elles et modéré pour 405. L'objectif est de caractériser une lignée porteuse d'une mutation retrouvée chez des personnes autistes, en observant le développement du cortex du stade fœtal à l'âge adulte. Les tests comportementaux, annoncés comme non invasifs et non douloureux, ne sont jamais nommés, et la mise à mort de tous les animaux est justifiée par leur statut d'organismes génétiquement modifiés.
Objectifs
Contexte de l’étude : La perturbation de la formation des réseaux neuronaux pendant le développement embryonnaire est une cause de troubles graves du neurodéveloppement tels que les troubles du spectre autistique (TSA), le retard mental, l’épilepsie ou les déficits cognitifs. Les TSA concernent aujourd’hui près de 1% des naissances et sont considérés comme l’un des troubles les plus répandus de l’enfance. Cette étude a pour but d’étudier un gène muté dans les TSA et important pour le développement du cortex cérébral de la souris. Des travaux précédents ont permis de décrire les conséquences de l’inactivation complète de ce gène sur le développement cérébral et le comportement chez la souris. Mais à ce jour aucun modèle avec une mutation liée à l’autisme n’a été étudié. Objectif principal : Les modèles d’étude actuellement disponibles pour ce gène ne sont pas adaptés à l’étude des mutations retrouvées dans les troubles autistiques. Ce projet a pour but de caractériser un nouveau modèle de souris possédant une mutation identifiée à l’origine chez les patients autistes. Ce projet se déroulera dans deux établissements utilisateurs nommés EU1 et EU2.
Bénéfices attendus
Il est important de comprendre comment les gènes, lorsqu’ils sont mutés, entraînent des maladies, pour améliorer le diagnostic et le conseil aux familles, et imaginer des pistes thérapeutiques. La création d’un nouveau modèle de souris permet de suivre quelles étapes du développement embryonnaire sont affectées et conduisent à l’installation de la maladie. Ceci ne peut pas être réalisé chez l’homme car ces mutations sont détectées après le diagnostic, quand la maladie est déclarée. Ce projet étudiera donc un nouveau modèle murin qui mime mieux la pathologie humaine et permettra 1) de valider le caractère pathologique des mutations de ce gène dans les troubles du neurodéveloppement et plus largement 2) une meilleure connaissance des causes des pathologies neurodéveloppementales.
Procédures
Dans l'EU1, l’essentiel des expériences seront observationnelles. Tous les animaux subiront une biopsie, une seule fois, pour le génotypage. La biopsie dure moins d'une minute. Les animaux seront de plus soumis à des tests d’exploration des fonctions comportementales, non invasifs, et non douloureux, mais qui nécessiteront de manipuler régulièrement les animaux. Chaque test sera réalisé une fois par animal, au maximum 4 test par animal. Chaque test dure quelques minutes. L’ensemble des tests se déroule sur plusieurs semaines. Ces procédures peuvent entraîner un stress léger. Certaines femelles subiront une chirurgie avec réveil, sous anesthésie gazeuse (isoflurane) et en respectant les règles d’analgésie et d’asepsie chirurgicale. La chirurgie dure environ 30 minutes et sera réalisée une seule fois. La procédure peut entraîner une douleur et du stress dans les heures suivant la chirurgie. Dans l'EU2, certains animaux subiront une procédure chirurgicale terminale, sous anesthésie et analgésie.
Impact sur les animaux
Les nuisances les plus sévères qui aient jamais été observées pour le gène d'intérêt chez la souris sont un retard de croissance, et des changements des fonctions cognitives comme par exemple une perturbation de la mémoire à long terme. Dans ce projet, nous nous attendons à des manifestations moins sévères car la mutation étudiée n’abolit qu’une partie des fonctions du gène. Les animaux subiront une biopsie, une seule fois, entraînant un stress et une douleur passagers. Certains animaux subiront une procédure chirurgicale avec réveil, selon une procédure bien maîtrisée par les expérimentateurs. Elle sera réalisée sous anesthésie générale avec analgésie péri- et post-opératoire, ainsi qu’un suivi post-opératoire adapté. Dans de très rares cas, cette technique peut entraîner une difficulté à la mise bas ou une mortalité intra-utérine d’embryons. Les tests d'exploration du comportement sont non invasifs mais peuvent entraîner un stress lié à la manipulation.
Devenir
Les animaux sont des souris génétiquement modifiées, nous ne pouvons donc pas les replacer à l’issue de ce projet. Par conséquent tous les animaux seront euthanasiés.
Remplacement
Ce projet a pour objectif de mieux caractériser un modèle murin possédant une mutation retrouvée chez des patients autistes . En préalable à ce projet, nous avons réalisé des expériences in vitro prouvant que la mutation étudiée altère la fonction du gène , ce qui nous permet de nous assurer que l’étude est pertinente. Néanmoins dans l’état actuel des connaissances scientifiques, les étapes de développement du cerveau ne peuvent être modélisées entièrement in vitro. L’approche in vivo est une nécessité afin d’aborder des troubles complexes de la cognition et du comportement. L’étude de circuits corticaux nécessite d’avoir recours à un animal possédant une structure corticale et par conséquent empêche le remplacement par un modèle invertébré.
Réduction
Les accouplements seront optimisés afin de produire strictement le nombre nécessaire d’animaux pour la caractérisation initiale du modèle. Une partie des animaux qui ont subi uniquement des observations (par exemple pesée) pourront être utilisés dans des tests de comportement, pour réduire le nombre total d'animaux Le nombre d’animaux utilisés est limité au minimum nécessaire pour déterminer la significativité statistique des résultats, et a été déterminé par un calcul préalable de puissance statistique.
Raffinement
Pour l'ensemble des procédures, nous avons défini des points limites prédictifs et précoces afin de prédire au mieux et le plus tôt possible des manifestations conduisant à la mise en place de traitements ou à l’arrêt de la procédure. Nous veillerons à adapter les conditions d’élevage aux phénotypes observés. La procédure chirurgicale est bien maîtrisée par les expérimentateurs et sera réalisée uniquement par un chercheur expérimenté. Un recours à l’analgésie péri-opératoire, ainsi qu’à une analgésie post-opératoire (calibrée par rapport à une grille d’évaluation de la douleur) nous permettra de limiter le stress et la douleur subis par les animaux. Concernant les évaluations comportementales, les animaux sujets aux tests de comportement seront acclimatés à la salle de test au préalable afin de réduire le stress causé par un nouvel environnement. Les différents tests seront réalisés les uns à la suite des autres, avec un temps de pause suffisant entre chaque test pour limiter un stress éventuel des animaux. A noter que les tests de comportement ne sont pas invasifs et ne portent pas atteinte à l’intégrité de l’animal.
Choix des espèces
L’architecture du cerveau de la souris est très proche de l’architecture du cerveau humain dans sa structure et son fonctionnement. Le modèle murin est un modèle animal reconnu dans le cadre des études des pathologies neurodéveloppementales tels l’autisme et/ou les déficiences mentales. Par ailleurs, nos précédents travaux nous ont permis de décrire que des mutations dans notre gène d'intérêt et associées à la pathologie autistique perturbent le développement cérébral et le comportement chez la souris (. Dans ce projet qui s'intéresse au neurodéveloppement, nous observerons des animaux depuis la naissance jusqu’à un stade adulte. L’étude de la formation des réseaux neuronaux se fera chez des fœtus au 3ème tiers de la gestation chez la souris. Les tests de comportement seront réalisés sur des animaux jeunes adultes, idéalement entre 60 et 90 jours mais cet âge peut différer légèrement selon la disponibilité des animaux et la composition des cohortes.