Souris

230 souris vont être utilisées, chacune subissant une chirurgie de une heure trente à une heure quarante-cinq sous anesthésie, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une thrombose est provoquée dans une veine, puis suivie par échographie-doppler sous anesthésie, avec une ou deux injections d'analgésique sur souris vigile. Pendant les 48 heures qui suivent la laparotomie, les souris peuvent éprouver des difficultés à se mettre debout sur leurs pattes arrière et des démangeaisons au niveau de la suture. Toutes sont tuées à l'issue, l'équipe indiquant devoir prélever le sang et les organes de chaque souris.

Objectifs

La maladie veineuse thromboembolique (MVTE), qui comprend la phlébite et l’embolie pulmonaire, est causée par la formation d’un caillot sanguin dans une veine. Malgré les traitements actuels, cette maladie reste fréquente, grave et peut entraîner des complications durables ou des récidives. Les traitements anticoagulants sont efficaces mais ne suffisent pas toujours à empêcher le retour de la maladie ni les séquelles vasculaires. Il est donc important de mieux comprendre les mécanismes impliqués afin d’identifier les patients les plus à risque et de développer de nouvelles approches thérapeutiques. Depuis quelques années, des équipes de recherche ont étudié le rôle du système immunitaire dans les pathologies cardiovasculaires. Notre équipe propose une approche innovante en s’intéressant au rôle du système immunitaire adaptatif dans la physiopathologie de la MVTE. L’objectif de ce projet est donc de mieux comprendre comment certaines cellules immunitaires (principalement les lymphocytes B et T) réagissent au cours d’une thrombose veineuse et d’identifier des signatures immunitaires qui pourraient servir de biomarqueurs ou de cibles thérapeutiques. Pour cela, une thrombose sera provoquée chez des souris puis étudiée à différents moments, depuis la formation du caillot jusqu’à sa résorption. Différents tissus biologiques seront prélevés, notamment la veine touchée et des organes du système immunitaire. Ces tissus serviront à quatre grands types d’expériences complémentaires afin d’obtenir une vision globale de ce qui se passe au cours de la thrombose, depuis la formation du thrombus jusqu’à sa résolution. L’ensemble de ces approches permettra de mieux comprendre les mécanismes immunitaires impliqués dans la thrombose veineuse et pourrait contribuer au développement de nouveaux outils diagnostiques et thérapeutiques.

Bénéfices attendus

Le traitement de la maladie veineuse thromboembolique repose sur les anticoagulants qui bien qu’efficaces à la phase aiguë de la maladie sont associés à un risque hémorragique important ce qui nuit à la qualité de vie des patients. De plus, ces traitements ne préviennent pas les complications chroniques telles que la récidive ou les atteintes vasculaires. Le but de ce projet est d’identifier précisément les cellules immunitaires impliquées dans ces complications chroniques afin de proposer de nouveaux biomarqueurs et de traitements adjuvants aux anticoagulants.

Procédures

L’ensemble des 230 animaux subiront : - une chirurgie sous anesthésie (durée 1h30 à 1h45). - Le suivi de la formation du thrombus sera assuré par une échographie-doppler sous anesthésie (durée 15 minutes). - Une ou deux administration(s) sous-cutanée d’analgésique sur animal vigile (durée 1 minute maximum). - Un prélèvement sanguin terminal (souris analgésiées et anesthésiées).

Impact sur les animaux

Pour les 230 souris de la procédure, les nuisances seront les suivantes sont envisageables : - stress lié à la contention (2 à 8 selon les groupes) et à la douleur liée à l’injection de l’analgésique (1 ou 2 injections sur animal vigiles). La nuisance subie est légère et d’une durée de 1 minute maximum. - stress des animaux (1 à 8 selon les groupes) lié à l’anesthésie gazeuse : durée 3 minutes maximum, d’intensité légère. - un inconfort lié à la chirurgie est à prévoir malgré la prise en charge de la douleur. Des démangeaisons sont possibles au niveau du site de suture et les animaux, du fait de la laparotomie, peuvent éprouver des difficultés à se mettre debout sur leurs pattes arrières. Durée 48 h en post-chirurgie d’intensité modérée.

Devenir

A l'issue de la procédure, nous devrons prélever du sang et des organes sur tous les animaux, pour cela ils devront tous être mis à mort.

Remplacement

La maladie veineuse thromboembolique est une maladie multifactorielle impliquant le système vasculaire, les cellules circulantes (plaquettes, globules rouges et globules blancs) et les organes lymphoïdes secondaires (ganglions, rate). Nous souhaitons justement explorer au cours du temps le lien entre le système immunitaire adaptatif et l’évènement thrombotique. Les modèles in vitro, ex vivo ou ex silico sont encore incomplets et ne permettent pas de prendre en compte la complexité de cette pathologie.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés dans ce projet a été évalué en fonction des expériences que nous devrons réalisées sur les tissus prélevés, il est estimé à partir des résultats obtenus dans des projets similaires que nous avons menés. Les animaux seront réceptionnés sur plusieurs commandes qui seront ajustées en fonction de nos besoins. Les tissus prélevés seront utilisés dans 4 grands groupes d’expériences. Les échantillons prélevés dans un groupe subiront un traitement adapté à l’expérience auxquels ils sont destinés et ils seront utilisés dans leur entièreté pour cette expérience, ils ne pourront donc pas être utilisés dans un autre groupe. Selon les expériences, nous aurons besoin au minimum de 5 ou de 10-12 animaux/groupe/expérience pour obtenir des résultats statistiquement robustes. Ces estimations prennent en compte le taux de réussite de la thrombose qui est de 80% (15 animaux au départ pour 12 inclus) et les résultats obtenus par notre laboratoire dans des projets antérieurs. Toutefois, quand nous aurons inclus 8 animaux par groupe, nous ferons une première estimation statistique des données obtenues. Nous arrêterons les inclusions si les résultats obtenus entre les groupes sham et chirurgie montrent une différence significative.

Raffinement

Nous avons mis en place des mesures de raffinement strictes et adaptées à notre modèle expérimental. Au cours de la chirurgie, nous préviendrons : (1) La survenue d’une infection (travail en condition aseptique avec des instruments stériles et du matériel à usage unique), (2) La douleur par la mise en place d’analgésie, (3) L’hypothermie par l’utilisation d’un tapis chauffant (4) La déshydratation par administration d’une solution d’hydratation, (5) le desséchement oculaire par l’utilisation d’un gel ophtalmique. En post-opératoire, les animaux auront à disposition au fond de la cage des croquettes humidifiées et du gel d’hydratation. De J0 à J2, nous administrerons de façon systématique un analgésique à tous les animaux et ils auront à disposition un gel d’hydratation supplémenté en analgésique la nuit suivant la chirurgie. Le bien-être et la douleur seront évalués 4-6h après la chirurgie, à J1, à J2 à l’aide d’une grille de score spécifique à notre modèle expérimental. Lors de ce scoring, tous les animaux seront anesthésiés et ils recevront une dose d’analgésique. Chaque animal ayant atteint les points limites sera pris en charge immédiatement par les responsables du projet. Une surveillance journalière sera mise en place jusqu’à la fin de la procédure.

Choix des espèces

Le modèle de thrombose veineuse chez la souris que nous utiliserons est le modèle de référence pour l’étude de la maladie veineuse thromboembolique. Il est très bien caractérisé dans la littérature, y compris par notre équipe, fiable, reproductible et reconnu par nos pairs. La maladie thromboembolique veineuse touchant les adultes, tous les animaux que nous utiliserons seront âgés de 7 à 12 semaines. L'utilisation de jeunes adultes, dont le poids variera entre 20-30g, facilitera la chirurgie.

Pour mesurer les effets d'une baisse des hormones thyroïdiennes sur le cerveau adulte et sur l'odorat, 40 souris mâles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent pendant deux ou six semaines une alimentation contenant une molécule qui diminue la production de ces hormones, ce qui provoque selon le porteur une baisse progressive du poids, une diminution de l'activité et un ralentissement général, plus marqués après six semaines. Deux tests suivent, l'un de discrimination où deux odeurs sont présentées successivement au coton-tige, l'autre de mémoire où la même odeur revient à trente ou soixante minutes d'intervalle, la reconnaissance se lisant à la baisse du temps d'exploration. Les souris qui perdent plus de 15 à 20 % de leur poids, se prostrent ou présentent des troubles de l'équilibre sont retirées de l'étude et tuées, les autres l'étant à l'issue des tests pour l'analyse de leur cerveau.

Objectifs

Les hormones thyroïdiennes jouent un rôle essentiel dans le fonctionnement du cerveau, aussi bien pendant le développement que chez l’adulte. Elles participent notamment au renouvellement de certains neurones et au maintien des circuits cérébraux impliqués dans la perception des odeurs. Lorsque la production de ces hormones diminue (hypothyroïdie), cela peut modifier l’équilibre des cellules du cerveau et altérer certaines fonctions sensorielles. Des travaux récents ont montré qu’une hypothyroïdie de courte durée peut modifier le renouvellement des neurones chez l’adulte. En revanche, les effets d’une hypothyroïdie plus prolongée sur l’organisation des circuits cérébraux et sur les capacités à distinguer ou mémoriser des odeurs restent mal connus. L’objectif de ce projet est d’étudier comment une hypothyroïdie de courte durée (2 semaines) ou prolongée (6 semaines) influence le fonctionnement du cerveau adulte et les capacités olfactives. Il permettra de mieux comprendre comment les hormones thyroïdiennes contribuent au maintien des fonctions cérébrales chez l’adulte et comment une perturbation prolongée peut affecter la perception des odeurs. À terme, ces résultats pourraient améliorer la compréhension des troubles sensoriels associés aux déséquilibres hormonaux.

Bénéfices attendus

Le projet permettra de mieux comprendre comment une diminution des hormones thyroïdiennes affecte le fonctionnement du cerveau adulte. En comparant une exposition courte et une exposition prolongée, il sera possible de déterminer si les effets observés sont transitoires ou s’ils entraînent des modifications plus durables des circuits cérébraux impliqués dans la perception des odeurs. Les résultats permettront de relier des modifications biologiques au niveau du cerveau à des changements mesurables du comportement, notamment la capacité à distinguer et mémoriser des odeurs. À plus long terme, ces travaux contribueront à une meilleure compréhension des effets des troubles thyroïdiens sur les fonctions cérébrales chez les mammifères. Ils pourront aider à mieux appréhender certains troubles sensoriels associés aux déséquilibres hormonaux et enrichir les connaissances fondamentales sur la plasticité du cerveau adulte.

Procédures

Les animaux recevront temporairement une alimentation spéciale contenant une molécule utilisée en recherche pour diminuer la production d’hormones thyroïdiennes. Les animaux recevront cette alimentation pendant 2 semaines (exposition courte) ou 6 semaines (exposition prolongée). Durant la période d’exposition, les animaux seront régulièrement surveillés (poids, état général, comportement). À la fin du traitement, les animaux participeront à deux tests comportementaux simples permettant d’évaluer leurs capacités à distinguer et à mémoriser des odeurs. Dans le test de discrimination, deux odeurs différentes seront présentées successivement plusieurs fois à l’aide d’un coton-tige. La capacité à distinguer les odeurs sera évaluée à partir du temps passé par l’animal à les explorer. Dans le test de mémoire, une même odeur sera présentée plusieurs fois, avec un intervalle de 30 à 60 minutes entre certaines présentations, afin d’évaluer si l’animal la reconnaît. La mémoire olfactive sera estimée à partir de la diminution du temps d’exploration lors des présentations répétées. Chaque session dure quelques minutes, ne nécessite ni contention ni privation alimentaire, et est précédée d’une courte phase d’habituation. La reconnaissance et la mémoire olfactive seront estimées à partir de la diminution du temps d’exploration lors des présentations répétées : un animal qui reconnaît une odeur y consacre moins de temps. À l’issue des tests, les animaux seront euthanasiés sous anesthésie profonde afin de permettre l’analyse de leur cerveau. Aucun animal ne sera maintenu en vie après la procédure, les analyses nécessitant le prélèvement des tissus. L’ensemble des interventions est limité à une modification alimentaire, des tests comportementaux non invasifs et une euthanasie en fin d’étude.

Impact sur les animaux

La diminution des hormones thyroïdiennes induite par l’alimentation spécifique peut entraîner chez les animaux une baisse progressive du poids, une diminution de l’activité et un ralentissement général. Ces effets sont généralement modérés et peuvent être plus marqués après 6 semaines d’exposition qu’après 2 semaines. Aucune douleur aiguë n’est attendue et aucune intervention chirurgicale n’est réalisée. Les tests d’odeurs reposent sur l’exploration naturelle des animaux et ne nécessitent ni contention ni privation alimentaire. Ils ne devraient pas provoquer de stress important. Les animaux seront surveillés régulièrement afin de détecter rapidement tout signe de mal-être dépassant les effets attendus de l’hypothyroïdie, tels qu’une perte de poids supérieure à 15–20 %, une diminution marquée de la prise alimentaire, une prostration ou des troubles de l’équilibre. Si nécessaire, ils seront retirés de l’étude et euthanasiés afin d’éviter toute souffrance excessive. La procédure est classée comme modérée, avec un risque limité d’effets indésirables.

Devenir

À l’issue de la procédure, les animaux seront euthanasiés afin de permettre l’analyse de leur cerveau. Les objectifs du projet nécessitent l’étude détaillée des cellules cérébrales impliquées dans le renouvellement des neurones et dans le traitement des odeurs. Ces analyses ne peuvent être réalisées que sur des tissus prélevés après la mise à mort. L’euthanasie sera réalisée sous anesthésie profonde afin d’éviter toute souffrance. Les tissus prélevés seront utilisés exclusivement dans le cadre des objectifs scientifiques décrits. Ce choix est justifié par la nécessité d’obtenir des données fiables sur l’organisation du cerveau, tout en garantissant que la mise à mort soit réalisée de la manière la plus respectueuse possible du bien-être animal.

Remplacement

Les objectifs du projet nécessitent d’étudier les effets d’une diminution des hormones thyroïdiennes sur le cerveau adulte et sur les capacités à distinguer et mémoriser différentes odeurs (présentées de manière répétée dans des tests comportementaux standardisés). Ces phénomènes reposent sur des interactions complexes entre le système hormonal, le renouvellement des neurones et le fonctionnement global du cerveau. À ce jour, aucune méthode alternative (culture de cellules, organoïdes ou modèles informatiques) ne permet de reproduire simultanément l’ensemble de ces mécanismes, ni d’évaluer les conséquences sur le comportement. Les modèles in vitro ne permettent pas d’étudier les interactions entre les hormones circulantes, les différentes régions du cerveau et les réponses comportementales. L’utilisation d’animaux est donc indispensable pour analyser de manière intégrée les effets d’une hypothyroïdie de courte ou de longue durée sur le cerveau et la fonction olfactive. Aucune méthode de remplacement complète n’est actuellement disponible pour répondre aux objectifs scientifiques du projet.

Réduction

Le nombre d’animaux a été strictement limité au minimum nécessaire pour obtenir des résultats fiables. Les tests comportementaux utilisés pour évaluer les capacités olfactives présentent une variabilité naturelle entre individus. Afin de détecter des différences entre les groupes tout en limitant le nombre d’animaux utilisés, un effectif de 10 animaux par groupe a été retenu. Ce nombre est basé sur notre expérience préalable de ces tests comportementaux et correspond aux effectifs habituellement utilisés pour ce type d’étude. Quatre groupes sont constitués : un groupe témoin et un groupe traité pendant 2 semaines, ainsi qu’un groupe témoin et un groupe traité pendant 6 semaines, soit un total de 40 animaux. Chaque animal est utilisé pour plusieurs types d’analyses (comportement et étude du cerveau), ce qui permet de maximiser les informations obtenues sans créer de groupes supplémentaires. La conception expérimentale a été optimisée afin de répondre aux objectifs scientifiques tout en respectant le principe de réduction du nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

Le protocole a été conçu pour limiter au maximum la souffrance et le stress des animaux tout au long de l’étude, que l’exposition dure 2 ou 6 semaines. Les animaux seront surveillés quotidiennement afin de détecter rapidement tout signe de mal-être. Leur poids ainsi que leur consommation alimentaire seront contrôlés chaque semaine. Les tests comportementaux reposent sur l’exploration naturelle des animaux. Les animaux seront hébergés en groupes stables dans un environnement enrichi (abri, matériau pour nid, bâtonnet à ronger) afin de favoriser leurs comportements naturels et de réduire le stress. L’ensemble de ces mesures vise à garantir un niveau élevé de bien-être animal pendant toute la durée du projet.

Choix des espèces

La souris C57BL/6 est l’un des modèles les plus couramment utilisés en recherche biomédicale. Elle est bien caractérisée sur le plan génétique et physiologique, ce qui permet d’obtenir des résultats fiables et comparables aux données déjà disponibles dans la littérature scientifique. Elle constitue un modèle de référence pour l’étude des hormones thyroïdiennes et de leurs effets sur le cerveau adulte. Les animaux utilisés sont des adultes jeunes (8 à 12 semaines au début de l’étude). À cet âge, le cerveau est mature mais conserve une capacité de renouvellement cellulaire active. Ce choix permet d’étudier les effets d’une hypothyroïdie acquise à l’âge adulte, sans interférence avec les processus du développement ou du vieillissement, qui pourraient fausser l’interprétation des résultats. Seuls des animaux mâles seront utilisés afin de limiter la variabilité hormonale liée au cycle reproducteur.

Mesurer la concentration sanguine de quatre-vingts candidats-médicaments par an, pour affiner leur posologie avant les études d'activité : 1 200 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit de une à vingt et une administrations espacées d'au moins huit heures, subit la section de la pointe de la queue, puis jusqu'à dix micro-prélèvements sanguins sur quarante-huit heures au minimum, et une partie une chirurgie d'implantation d'un implant médicamenteux sous anesthésie. Le porteur écarte toute grille de score, au motif qu'elle "nécessite de maintenir la souffrance de l'animal pour en évaluer l'évolution", et annonce la mise à mort dès qu'apparaît une différence de poids de 2 à 5 %. L'effectif déclaré se déduit d'un calcul simple, trois souris par condition testée et quatre-vingts composés par an sur cinq ans, le porteur précisant qu'aucune comparaison statistique n'est requise.

Objectifs

Pour le développement de nouveaux médicaments, il est nécessaire d'étudier le devenir de la substance active dans l'organisme, dans le but de déterminer : l’absorption, la distribution, le métabolisme et l’élimination du composé (ADME), des propriétés qui vont influencer la posologie du candidat-médicament (dose administrée et fréquence d'administration). L’objectif scientifique est de suivre la concentration sanguine de produits pharmacologiques en cours de développement chez la souris. Les produits pourront être de différentes natures (chimique, peptidique, oligo-nucléotidique) et/ou pour diverses applications : analgésie, anti-inflammatoire, antibiotique, immunodépresseur, anticancéreux, cardio-protecteur, anti-arthrosique, antidépresseurs, neuro-protecteur…

Bénéfices attendus

La mesure de la concentration sanguine au court du temps des candidats-médicaments permettra de sélectionner les plus adaptés et d’en affiner la posologie (dose et fréquence d’administration) selon les résultats de l’ADME. Ce projet s'inscrit pleinement dans les étapes indispensables au développement des candidats-médicaments. Il permet de réduire drastiquement le nombre de candidat-médicament à tester dans les études d’activité et le nombre d'études nécessaires pour mesurer ensuite l’activité des candidats-médicaments sélectionnés, tout en augmentant les probabilités d'obtenir un médicament.

Procédures

Les animaux seront soumis à des injections pour l'administrer les candidat-médicaments étudiés. Les candidat-médicaments et médicaments étudiés seront administrés 1 à 21 fois avec un minimum de 8h entre chaque administration. Une anesthésie de quelques minutes est nécessaire pour le rasage des animaux et pour les administrations ID, IN, IT. Afin de suivre la concentration sanguine du candidat médicament au cours du temps, un maximum de 10 micro-prélèvements de sang (environ 1min) seront réalisés à l’extrémité de la queue et sur une durée minimum de 48h. Une partie des animaux pourront être soumis à une chirurgie sous anesthésie (environ 15 min) et analgésie pour l’implantation d’un implant médicamenteux.

Impact sur les animaux

Les injections entraînent une douleur légère de courte durée, de même que la section de la pointe de la queue (moins d’un demi millimètre) utilisée pour permettre les prélèvements sanguins. [Modification] L’implantation chirurgicale d’un implant médicamenteux peut potentiellement induire une douleur modérée et une altération de l'état de santé général des animaux durant les 48h premières heures suivant l’implantation (sensibilité de la zone d’implantation, gène dans les déplacements, une activité moindre, une appétence modérée pour la nourriture pouvant entrainer une très légère et transitoire perte de poids…)

Devenir

Les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure expérimentale afin de recueillir les échantillons nécessaires aux analyses

Remplacement

Les candidats-médicaments auront été sélectionnés préalablement pour leur activité et leur innocuité sur les modèles cellulaires, ainsi que pour leur caractéristiques pharmacochimiques (solubilité, stabilité plasmatique et microsomale…). Cependant, tous les essais réalisés ne peuvent prédire avec exactitude l’ADME d’un composé car aucun modèle alternatif (bio-informatique, moléculaire et/ou cellulaire) n’est suffisamment intégré et complexe pour reproduire l’ensemble des phénomènes biologiques impliqués dans l’absorption, la distribution, la dégradation et l’élimination des médicaments. Ces phénomènes biologiques sont liés à la circulation sanguine, aux barrières biologiques et aux voies d'élimination (dégradation par le foie, élimination biliaire et rénale...) et régulent l’activité des médicaments. Pour ces raisons, une approche chez l’animale reste indispensable pour sélectionner les candidats-médicaments les plus prometteurs avant de poursuivre leur développement. La mesure de la pharmacocinétique sera réalisée chez le souris, car cette espèce est la plus utilisée pour cette approche dans le cadre du développement des candidats-médicaments.

Réduction

La réalisation des procédures par un technicien rompu à ces manipulations garantit une bonne reproductibilité et permet de limiter le nombre d’animaux à engager dans les protocoles. La procédure expérimentale parfaitement maîtrisée permet une mesure efficace à l’aide de 3 souris par condition testée. La mise en place de micro-prélèvements répétés chez un même animal permet de réduire drastiquement le nombre d’animaux utilisés pour suivre la concentration sanguine des candidats médicaments. Les résultats sont exploités sous la forme de courbes cinétiques et aucune comparaison statistique n’est requise. Il est prévu de mesurer la pharmacocinétique de 80 composés chaque année sur une période de 5 ans soit un maximum de 1200 souris.

Raffinement

La procédure expérimentale est conçue pour garantir le bien-être de l’animal et réduire au maximum l’inconfort, le stress et la souffrance. La souris étant un animal social, les souris seront maintenues en groupes sociaux, dans des cages enrichies d’un tube de change et de matériaux de « nidification ». Une période d'acclimatation et d'habituation de 2 semaines sera respectée mais pourra exceptionnellement être ramenée à une semaine minimum en cas de contraintes temporelles. Le bien-être des animaux sera pris en compte tout au long de l’étude, avec un suivi journalier de l’état des animaux par l’expérimentateur. [Modification] La douleur liée aux injections est une douleur ponctuelle réversible qui fera l’objet d’une surveillance de l’animal. Lorsque les caractéristiques du composé le permettront (solubilité et stabilité), l'usage d'un implant médicamenteux pourra être mis en place pour éviter le recourt à des administrations répétées génératrices de stress et de douleur. Les souris seront anesthésiées pour permettre certaines administrations (intranasale, intratrachéale, intradermique, intramusculaire) ou l’implantation d’un implant médicamenteux qui fera aussi l’objet d’une couverture analgésique pré et post opératoire. L’implantation chirurgicale sera réalisée dans des conditions d’asepsie strictes et sous un poste de sécurité microbiologique dédié. Les souris anesthésiées seront placées sur un tapis chauffant afin de prévenir une hypothermie. Une alimentation hydratée sera mise à disposition des animaux pour assurer une récupération postopératoire rapide. Les animaux seront particulièrement surveillés après l’administration des candidats-médicaments ou des sondes, pour mettre en évidence tous signes de toxicité imprévue qui nécessiterait la mise à mort de l’animal. Aucun animal ne sera maintenu en vie s’il présente des signes de douleur ou d’inconfort. Pour cette même raison, aucun « scoring » n’est envisagé, car il nécessite de maintenir la souffrance de l’animal pour en évaluer l’évolution. Il arrive cependant qu’aucun signe extérieur de douleur ne puisse être observé, et que seule une perte ou absence de prise de poids soit mise en évidence. Dans ce cas, les animaux seront mis à mort dès la mise en évidence d’une différence significative (généralement dès 2 à 5% d’écart). Les micro-prélèvements de sang sont réalisés sur les animaux vigiles et non contraints (sans boite ou tube de contention), à même de signifier librement tout manquement

Choix des espèces

La mesure de la pharmacocinétique est réalisée chez la souris, car cette espèce est la plus utilisée pour cette approche dans le cadre du développement des candidats-médicaments. Certain candidat-médicament sont très difficile à synthétiser et la petite taille de la souris nécessite beaucoup moins de composé. Enfin, ce choix permet aussi de mesurer l’ADME d’un composé chez la même espèce que pour les futures études d’activités, elles-mêmes nécessitant le plus souvent le recourt à des animaux génétiquement modifiés, plus facile à trouver ou générer chez la souris. L’âge des souris sera déterminé en fonction de l’objectif scientifique et de la pathologie visée. Les souris seront âgées d’au minimum 4 semaines afin que la procédure puisse être réalisée sans remettre en cause le bien-être de l’animal.

600 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Toutes reçoivent sous anesthésie une injection de chlorure de baryum dans les muscles pour en détruire le tissu et déclencher sa régénération, 380 d'entre elles sont gavées deux fois au tamoxifène et 120 sept fois avec des modulateurs de la voie WNT avant leur mise à mort. Le porteur écrit qu'aucune complication majeure n'a été observée dans son expérience, tout en n'excluant pas "une diminution importante de l'utilisation de la patte, pouvant aller jusqu'à une paralysie" et une nécrose des tissus. Le bénéfice qu'il annonce tient en une phrase, comprendre si la cascade régulatrice étudiée est propre aux cellules satellites, et il affirme que l'étude de ces processus "au sein d'un organisme dans son ensemble, où toutes les cellules impliquées sont en étroite communication, est nécessaire et ne peut être substituée qu'en partie par des approches in vitro".

Objectifs

Parmi les tissus des organismes vertébrés, le muscle squelettique est l’un des plus remarquables : il présente un développement et une croissance prodigieux et possède de grandes capacités régénératrices. Ces capacités de croissance et de régénération font de lui un organe très plastique. À l’origine de cette plasticité musculaire se trouve un réservoir de cellules souches, dont les plus étudiées à ce jour sont les cellules satellites qui, comme leur nom l’indique, se localisent en périphérie des fibres musculaires. Ces cellules sont mises en place au cours du développement. Le développement et le maintien de ces cellules par cet environnement sont cruciaux à l’équilibre et à la régénération musculaire et déterminés par les gènes Hira et Daxx. Il a été récemment montré que l’absence de la protéine Hira ou Daxx dans les cellules souches musculaires adultes (cellules progénitrices, caractérisées par l’expression du gène Pax7 et, dans certains muscles, Pax3) a pour conséquence une inhibition de la régénération musculaire. De plus, il a été démontré que Hira et Daxx sont des facteurs clés pour garder l’identité myogénique des cellules satellites pendant la régénération du muscle. Nous souhaitons étudier la fonction spécifique de chacun de ces gènes dans les cellules satellites pendant la régénération musculaire. Dans un but de suivre le principe des 3R et de réduire et remplacer l’utilisation excessive d’animaux impliqués dans les expériences in vivo, nous avons établi des lignées cellulaires dérivées de muscles pour les expériences préliminaires. Nous avons caractérisé et étudié ces lignées in vitro pour cibler les expériences les plus pertinentes à développer chez la souris pour la validation in vivo. Les deux procédures principales visent à analyser et caractériser les fonctions d’Hira et Daxx au cours de la régénération musculaire. Pour essayer de minimiser la souffrance et le stress induits aux animaux, des analgésiques seront administrés avant et après la procédure d’induction de la régénération musculaire. De plus, de la nourriture humidifiée sera ajoutée dans les cages les 3 premiers jours pour faciliter l’alimentation des animaux qui peuvent présenter une mobilité réduite pendant cette période. Notre étude fera appel à un maximum de 600 souris au total, réparties sur 4 procédures expérimentales.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de comprendre si cette cascade régulatrice est spécifique des cellules satellites ou si elle joue un rôle plus général dans le maintien de l’identité cellulaire d’autres types de cellules composant le muscle squelettique.

Procédures

380 de la totalité des animaux (600) seront soumis au gavage de tamoxifène 2 fois avec un intervalle d’une semaine. Les gavages sont faits sur l’animal en vigile et ce geste ne prend que quelques secondes. La totalité des animaux (600) seront anesthésiés sous isoflurane (induction 4%, maintien 2%) et soumises à des injections de BaCl2 dans les muscles. L’intervention sera faite une seul fois par souris et la durée de l’intervention est de 10 minutes (après endormissement des animaux). Finalement, 120 de la totalité des animaux (600) seront soumis au gavage de modulateurs de la voie WNT 7 fois de suite avant mis à mort. Les gavages sont faits sur l’animal en vigile et ce geste ne prend que quelques secondes.

Impact sur les animaux

Dans notre expérience, aucune complication majeure liée à la régénération musculaire n’a été observée. Cependant, une diminution importante de l’utilisation de la patte, pouvant aller jusqu’à une paralysie, ainsi qu’une dégradation des tissus (nécrose) ne peuvent être totalement exclues. Les animaux seront surveillés régulièrement afin de détecter rapidement tout signe anormal et d’intervenir si nécessaire.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort au plus tard 28 jours post-lésion intramusculaire pour prélèvement des tissus nécessaires à l’analyse.

Remplacement

Nos projets s’intéressent à des processus biologiques qui reposent sur l’évolution au cours du temps et l’interaction entre de nombreux types cellulaires. De fait, l’étude de ces processus au sein d’un organisme dans son ensemble, où toutes les cellules impliquées sont en étroite communication, est nécessaire et ne peut être substituée qu’en partie par des approches in vitro. Pour réduire le nombre d’animaux nécessaires lors cette phase in vivo, des études préliminaires ont néanmoins été faites sur des lignées cellulaires musculaires.

Réduction

Le nombre d’animaux a été calculé sur la base de protocoles publiés utilisant 10 animaux par lot, ce qui est le minimum pour avoir une pertinence statistique et obtenir suffisamment de matériel biologique pour réaliser l’ensemble des analyses nécessaires.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans des cages enrichies conformément aux recommandations en vigueur. Les enrichissements comprendront du matériel de nidification, des abris permettant aux animaux de se cacher ainsi que des éléments manipulables et/ou à ronger favorisant l’expression des comportements naturels. Les animaux seront maintenus en groupes sociaux stables lorsque cela est compatible avec les objectifs scientifiques et leur bien-être. Ces mesures visent à réduire le stress et à améliorer les conditions de vie des animaux tout au long de l’étude. Des points limites ont été définis et seront appliqués dans les cas nécessaires.

Choix des espèces

Nous avons choisi la souris pour des raisons multiples. Les approches de transgénèse et recombinaison homologue nécessaires à l’étude de mécanismes moléculaires de processus biologiques sont facilement réalisables. La recombinaison homologue permet de modifier de manière efficace et contrôlée le locus des gènes murins. Ce modèle étant couramment utilisé, de nombreuses lignées transgéniques, notamment lignages spécifiques, sont aujourd’hui disponibles à toute la communauté. Des lignées pures et génétiquement caractérisées sont disponibles pour ce modèle. La courte durée de temps pour avoir des animaux adultes (8 semaines) est aussi compatible avec la durée du projet demandé. Nos expérimentations concernent les jeunes adultes de 8 semaines, date à laquelle le muscle adulte est complètement formé.

384 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, chacune subissant une implantation chirurgicale de cellules tumorales dans le poumon puis six séances d'imagerie thoracique sous anesthésie gazeuse. Chaque animal reçoit aussi une injection de chimiothérapie, trois injections d'immunothérapie par semaine pendant trois semaines et cinq injections quotidiennes d'interleukine-1 bêta, une partie d'entre elles portant une délétion du récepteur IL-1R1. La tumeur pulmonaire induite peut dégrader progressivement la respiration et l'état général, et le porteur signale des complications possibles au niveau de la cicatrice thoracique, infection, déhiscence de plaie, douleur. À long terme, il situe le bénéfice dans "l'intérêt de trouver et tester des molécules induisant cette voie chez la souris (futur projet), puis chez l'Homme".

Objectifs

Le cancer du poumon fait partie des cancers les plus fréquents et les plus meurtriers. Son traitement repose sur l’utilisation de chimiothérapies, qui malheureusement ne conduisent que rarement à une rémission totale du patient, en particulier dans les cas de cancers avancés. Il a été montré que le système immunitaire jouait un rôle important dans la réponse aux traitements par chimiothérapie. Ainsi, l’immunothérapie a été associée à la chimiothérapie afin d’augmenter son efficacité dans de nombreux cancers. Cependant, cette association n’est pas toujours efficace pour les tumeurs pulmonaires. Il apparait donc important d’étudier les mécanismes responsables de cette résistance. L’inflammation a un rôle ambigu dans la réponse à la chimiothérapie et peut avoir des effets pro- ou anti-tumoraux. Le but du projet est d’évaluer son rôle sur l’efficacité antitumorale de la chimio-immunothérapie utilisée en clinique, dans un modèle murin de cancer du poumon chez la souris. Cette étude nous permettra également de comprendre les mécanismes de résistance aux traitements actuellement utilisés en clinique. Ce projet sera réalisé dans 2 sites, avec un site pour toutes les étapes (EU1/2), excepté les imageries (EU 2/2).

Bénéfices attendus

Les traitements combinant chimiothérapie et immunothérapie ont montré une réelle efficacité pour de nombreux cancers. En ce qui concerne le cancer du poumon, leur efficacité reste hétérogène selon les contextes biologiques et immunologiques. L’intérêt de ce travail est donc de mieux comprendre les mécanismes responsables de la résistance dans des tumeurs pulmonaires orthotopiques.. L’identification du rôle de l’inflammation dans la résistance aux traitements aura des avantages à court terme, comme la validation (ou non) de nos résultats précédents, et à long terme en confirmant l’intérêt de trouver et tester des molécules induisant cette voie chez la souris (futur projet), puis chez l’Homme.

Procédures

5 interventions : - Implantation chirurgicale de cellules de cancer du poumon murines dans le poumon (EU1/2) : - Geste réalisé sous anesthésie générale gazeuse - Une seule injection par animal - Durée : 15 minutes - Nombre de souris : 384. - Traitements par chimiothérapie ou solution contrôle (EU1/2) : - Geste réalisé sur animal vigil - Une seule injection par animal - Durée : 1 minute - Nombre de souris : 384. - Traitements par immunothérapie ou solution contrôle (EU1/2) : - Geste réalisé sur animal vigil - Une injection trois fois par semaine pendant 3 semaines par animal - Durée : 1 minute - Nombre de souris : 384. - - Traitements par IL-1β ou solution contrôle (EU1/2) : - Geste réalisé sur animal vigil - Une injection quotidienne pendant 5 jours par animal - Durée : 1 minute - Nombre de souris : 384. Imagerie thoracique (EU2/2) : -Geste réalisé sous anesthésie générale gazeuse -1 imagerie par animal répétée 6 fois -Durée : 5 minutes -Nombre de souris : 384

Impact sur les animaux

Injection de cellules tumorales dans le poumon : croissance d’une masse tumorale intrathoracique. Une altération progressive de la fonction respiratoire peut survenir au cours de la progression tumorale. - Possible altération de l’état général du fait de la pathologie cancéreuse induite. - Éventuels effets secondaires des injections d’IL-1β : perte de poids. - Possibles complications au niveau du site opératoire et de la cicatrice thoracique : infection, déhiscence de plaie, douleur. - Effets potentiels liés aux anesthésies répétées pour l’imagerie thoracique : refroidissement, ralentissement transitoire de la respiration, récupération retardée exceptionnelle. Les souris déficientes pour IL1-R1 (Il1r1-/-) ne présentent pas de phénotype dommageable en conditions basales. Aucune nuisance spécifique liée à ce génotype n’est donc attendue dans le cadre de ce projet.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure.

Remplacement

Le cancer est une maladie complexe impliquant des mécanismes de contrôle et des interactions possibles seulement dans un organisme vivant. En effet, la recherche a permis de comprendre l’importance de l’environnement dans lequel le cancer se développe et les multiples interactions avec le système immunitaire, le stroma tumoral, le système vasculaire et le métabolisme. En conséquence, pour être prédictifs, l’évaluation de l’efficacité ou de l’échec de nouvelles combinaisons thérapeutiques en oncologie doit être réalisée sur les organismes vivants. Nous réalisons à ces fins des études translationnelles sur des modèles d‘animaux greffés avec des cellules tumorales.

Réduction

Les expériences seront réalisées sur des petits effectifs, ce qui permet donc de réduire le nombre d’animaux de l’étude. Les souris C57BL/6 doivent être utilisées comme contrôles des souris Il1r1-/-. Les expériences seront conduites en même temps sur les souris Il1r1-/-, afin de ne pas doubler le nombre de souris contrôles. Le test statistique utilisé sera celui de Kruskal-Wallis en raison de la présence de nombreux groupes. Le nombre de souris par groupe et le nombre de répétitions des expériences ont été déterminés afin de garantir la possibilité d’utiliser ce test statistique et sa fiabilité. Les expériences visant à étudier la charge tumorale, l’imagerie thoracique et les infiltrats immunitaires seront réalisées sur les mêmes souris. Le suivi longitudinal par imagerie micro-CT permet une mesure intra-individuelle de la charge tumorale, permettant de confirmer la prise tumorale et de déterminer le moment opportun pour débuter les traitements, participant ainsi à la réduction du nombre d’animaux nécessaires. Les différents modèles utilisés dans ce projet sont nécessaires. En effet, selon les mutations intrinsèques des cellules cancéreuses utilisées, le microenvironnement tumoral sera différent et affectera par conséquent la réponse aux traitements.

Raffinement

Les animaux seront habitués aux techniques de préhension. Les animaux sont suivis au minimum 3 fois par semaine par des techniciens responsables d’études. Une anesthésie générale gazeuse (isoflurane 3 % + oxygène 1,5 L/min) sera réalisée avant chaque chirurgie et entretenue tout au long de la procédure, avec contrôle de l’absence de réflexe de la patte, surveillance de la fréquence respiratoire et protection de la cornée avec un collyre ophtalmique. Pour l’analgésie, des anti-inflammatoires (carprofène 4 mg/kg et buprénorphine 0.05 mg/kg, une fois par jour) seront administrés en sous-cutané en pré-opératoire à distance du site opératoire et prolongés pendant 48 h après l’opération, ainsi que des anesthésiques locaux (lidocaïne 4 mg/kg + bupivacaïne 2 mg/kg) au niveau du site opératoire. La surveillance post-interventionnelle sera réalisée 2 fois par jour durant les 3 premiers jours, puis quotidiennement pendant 2 jours et enfin espacée à 3 fois par semaine. Pour chaque imagerie, les souris seront transportées d’un EU à l’autre dans leur cage emballée dans un sac opaque afin d’éviter le stress extérieur. Des anesthésies courtes supplémentaires seront réalisées pour l’imagerie thoracique micro-CT. Les animaux seront réchauffés pendant la procédure et surveillés jusqu’au réveil complet. Durant toute l’expérience, suivi du poids et évaluation de la NEC (Note d’Etat Corporel) au minimum trois fois par semaine. L’apparition d’éventuels points limites sera recherchée.

Choix des espèces

Les souris présentent des caractéristiques physiologiques qui permettent une variété de techniques d’administration et de prélèvements présentant des analogies avec ce qui est réalisé en recherche clinique sur l’Homme. Diverses souches de souris immunocompétentes sont disponibles pour l’établissement de modèles tumoraux syngéniques, indispensables à la recherche préclinique en immuno-oncologie. De plus, l’existence de souris génétiquement modifiées renforce le choix de cette espèce. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (entre 8 et 12 semaines d’âge) pour la mise en œuvre de modèles expérimentaux stables et reproductibles avec des animaux possédant un système immunitaire mature et un poids corporel > 20g.