Souris

Soumises à onze injections de morphine en six jours, puis à une période de sevrage, 1 600 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Une partie subit une chirurgie stéréotaxique d'environ une heure, avec injection de virus et implantation de fibres optiques ou de canules, puis jusqu'à dix injections directement dans le cerveau, sur animal éveillé. Le porteur décrit un sevrage qui réduit l'activité pendant une semaine, puis des "symptômes psychiatriques" sur environ quatre semaines, le suivi comportemental s'étendant sur huit semaines. Les comportements annoncés dans les objectifs sont les interactions sociales, les signes anxio-dépressifs et la consommation de nourriture et de boisson, mais la rubrique des procédures se limite à indiquer qu'elles "subiront également des tests comportementaux".

Objectifs

Le but de ce projet est de décrire le rôle de la sous-unité GluN3A du récepteur N-Methyl-D-Aspartate (NMDA) au glutamate dans le sevrage aux opiacés. Cette sous-unité permet de former un hétéromère NMDA dit « non-conventionnel » car activé par la glycine. Son implication dans les pathologies psychiatriques émerge progressivement mais reste à être complètement caractérisé. Il a notamment été démontré que sa dérégulation, dans l’habénula médiane (HbM), une région clé dans le phénomène d'addiction aux opiacés, altère la réponse comportementale face à des stimulations aversives. Ainsi, cette sous-unité semble pouvoir participer aux symptômes aversifs observés lors du sevrage aux opiacés. Dans ce projet, nous utiliserons des approches génétiques et pharmacologiques afin de moduler l’activité de GluN3A dans des régions spécifiques du cerveau, chez des souris mâles et femelles. Nous analyserons les effets de ces manipulations sur différents comportements, notamment les interactions sociales, les symptômes anxio-dépressifs ainsi que la consommation de nourriture et de boisson. Ces mesures seront réalisées de manière automatisée et continue chez des animaux vivant en groupe, avant, pendant et après un traitement chronique à la morphine. Les comportements et les symptômes de sevrage seront suivis sur une période de 8 semaines, incluant des tests ponctuels permettant d’évaluer des signes d’anxiété et de dépression. Dans un second temps, nous mesurerons l’activité neuronale dans certaines régions cérébrales impliquées dans le sevrage, grâce à des enregistrements calciques réalisés pendant et après le traitement à la morphine, ainsi que lors des tests comportementaux. L’ensemble de ce projet permettra de mieux comprendre le rôle de GluN3A dans le sevrage aux opiacés et d’évaluer son potentiel comme cible thérapeutique.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à mieux comprendre le rôle de la sous-unité GluN3A dans le sevrage aux opiacés. Il permettra à la fois de caractériser son implication dans les symptômes de sevrage et d’évaluer son potentiel comme cible thérapeutique. À court terme, le projet est principalement fondamental et descriptif. Il s’agira de déterminer si, et à quel moment, GluN3A intervient dans le sevrage à la morphine. Ces travaux apporteront également de nouvelles connaissances sur les mécanismes cérébraux impliqués, en particulier dans les régions associées aux états émotionnels négatifs liés au trouble d’usage des opioïdes. À plus long terme, le projet visera à évaluer le potentiel thérapeutique de GluN3A, notamment en identifiant les périodes les plus pertinentes pour cibler cette sous-unité dans le traitement du sevrage. Dans son ensemble, ce projet pourrait ouvrir de nouvelles perspectives pour le développement de traitements visant à atténuer les symptômes de sevrage aux opiacés.

Procédures

Différentes procédures de ce projet nécessitent que des animaux subissent une chirurgie (1 intervention d'environ 1h). Les animaux recevront un traitement chronique de morphine (11 injections pendant 6 jours; une injection dure environ 1 minute). Les injections se feront sur animal vigile. Des composés seront administrés de façon intra-parenchymateuse (maximum 10 injections) et systémique, sur animal vigile. Les animaux subiront également des tests comportementaux.

Impact sur les animaux

Deux types de nuisances sont attendues au cours de cette étude : 1- Ce projet vise à étudier les symptômes de sevrage à la morphine. Ainsi, dans chaque les souris recevront un traitement chronique de morphine puis subiront une période de sevrage. Ce sevrage engendre des symptômes physiques transitoires, essentiellement visible par une réduction de l’activité de l’animal (durée : ~1 semaine). Suite à ces symptômes physiques, des symptômes psychiatriques se développe sur une période plus longue (~4 semaines) avant de progressivement disparaitre. 2- Chirurgies stéréotaxiques avec injection de virus et/ou implantations de fibres ou optiques ou de canules pouvant induire une douleur modérée, une inflammation transitoire et/ou un inconfort pour les animaux.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour réaliser les contrôles histologiques et prélèvements.

Remplacement

Ce projet a pour but de déterminer les mécanismes neurobiologiques du sevrage, notamment les modifications de comportements sociaux des individus. De plus, il permettra d’évaluer le potentiel thérapeutique de composés pharmacologiques. Ainsi, l’animal entier, vivant et se comportant, est nécessaire et ne peut être remplacé par un autre modèle.

Réduction

Au regard des données de la littérature, de notre expérience et de la variabilité phénotypique individuelle, nous avons réalisé une analyse statistique de puissance (power analysis) qui a déterminé que les données sont statistiquement exploitables et publiables avec des cohortes de 20 animaux/groupe. Les analyses statistiques seront essentiellement réalisées à l’aide de test de Student ou d’analyse de la variance à un ou plusieurs facteurs, selon les comparaisons.

Raffinement

Nos conditions d’hébergement, en groupes sociaux avec un enregistrement continu des souris permet un suivi quotidien du bien-être animal. De plus, dans ces conditions d’hébergement, l’enrichissement de l’environnement des animaux est important. En effet, les animaux sont hébergés en groupe social avec à disposition: bâtonnets à ronger, cotons compressés pour faire des nids et dômes en polycarbonate. Nous avons établi des points limites standards tels que des signes comportementaux d’inconfort et des signes cliniques qui seront recherchés quotidiennement par visionnage des cages et lors de la visite quotidienne de la pièce d’hébergement, par l’expérimentateur. Lors des chirurgies, toutes les conditions d’aseptise, d’anesthésie et d’analgésie respectent la réglementation vétérinaire en vigueur. De plus, la température des animaux est maintenue à l'aide d'un tapis chauffant. Après chaque chirurgie, les animaux sont réhydratés et ont accès à une nourriture gélifiée pour faovriser la récupération post-chirurgicale et leur état de santé est évalué et objectivé selon des points limites définis par les directives éthiques indiquées par l’association internationale pour l’étude de la douleur. Les animaux sont habitués aux conditions d'hébergement, aux manipulateurs, ainsi qu'aux procédures experimentales.

Choix des espèces

Nous avons choisi d’utiliser des souris pour ce projet car leur cerveau est suffisamment complexe pour nos études, elles possèdent une molécule appelée GluN3A qui est très similaire chez de nombreuses espèces, et leurs réactions à la morphine sont bien connues et ressemblent à celles observées chez l’humain. Notre projet ne s’intéresse pas au développement du cerveau. De plus, la consommation de substances comme la morphine concerne principalement les adultes, c’est pourquoi toutes les souris utilisées seront adultes (8 semaines) au moment des expériences.

Des lignées de souris génétiquement modifiées pour des gènes du métabolisme forment une partie des 2 736 souris utilisées dans ce projet, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Le protocole associe un régime riche en graisses et en sucres, un traitement chimique qui déclenche la fibrose du foie, des injections dans le péritoine et dans une veine, une biopsie de l'oreille pour le génotypage et une mise à jeun de six heures. L'objet déclaré est de suivre chez la souris l'évolution simultanée des lésions du foie et des artères, les retombées annoncées pour les patients, dépistage, cibles de traitement, thérapie génique, restant au conditionnel et au long terme. Le porteur écrit que ces nuisances seront "prises en charge de manière adéquate" et que "le bien-être de l'animal depuis sa naissance jusqu'à sa mort sera pris en compte".

Objectifs

La maladie hépatique stéatosique associée à un dysfonctionnement métabolique (MASLD) est une maladie chronique du foie très fréquente. Elle est notamment associée à l’obésité, au diabète de type 2, à des anomalies des lipides sanguins et à l’hypertension artérielle. Elle se caractérise initialement par une accumulation excessive de graisses dans le foie. Chez certaines personnes, elle peut évoluer vers une inflammation et des lésions des cellules du foie, puis vers une fibrose. Dans les formes les plus sévères, la fibrose peut conduire à une cirrhose ou à un cancer du foie. Les personnes atteintes de MASLD présentent également un risque accru de maladies cardiovasculaires, notamment d’athérosclérose. Celle-ci correspond à la formation progressive de dépôts dans la paroi des artères pouvant entraîner un rétrécissement et des complications cardiovasculaires graves. Ce risque semble particulièrement augmenté lorsque la maladie du foie s’accompagne d’une fibrose importante. Les mécanismes expliquant le lien entre fibrose hépatique et athérosclérose restent encore mal compris.L’objectif du projet est de développer un nouveau modèle chez la souris permettant d’étudier simultanément les atteintes du foie et des artères. Il permettra de déterminer si la fibrose hépatique participe au développement ou à l’aggravation de l’athérosclérose et d'identifier les mécanismes impliqués. Différentes conditions expérimentales seront utilisées. Les souris recevront soit une alimentation normale, soit une alimentation favorisant l’apparition de troubles métaboliques et de lésions du foie et des vaisseaux sanguins. Des interventions complémentaires permettront d’induire ou d’aggraver progressivement la fibrose hépatique. Certaines souris feront également l’objet d’une modification ciblée du fonctionnement du foie afin d'étudier le rôle de mécanismes biologiques spécifiques. L’état général et le poids des animaux seront surveillés régulièrement. Des prélèvements permettront d’étudier le sang, le foie et les vaisseaux sanguins. Les analyses porteront notamment sur les lésions du foie, l’inflammation, la fibrose, et la formation des plaques d’athérosclérose. Elles permettront également d’identifier les modifications biologiques associées à ces maladies. L’utilisation de souris est nécessaire car le projet vise à étudier les interactions entre plusieurs organes et l’évolution simultanée des maladies du foie et des vaisseaux sanguins dans un organisme vivant.

Bénéfices attendus

Le projet présente un impact direct chez l'Homme en mettant en avant le rôle clé de la fibrose du foie dans les maladies cardiovasculaires, première cause de décès des patients atteints de MASLD. En s’appuyant sur des modèles précliniques bien caractérisés et des cohortes humaines validées, il permettra 1) de mieux comprendre les mécanismes entre pathologie du foie et complications cardiovasculaires et d’identifier des biomarqueurs dans le sang qui pourraient aider aux stratégies de dépistage en clinique humaine ; 2) de tester de nouvelles cibles de traitement ciblant le foie pour prévenir ou limiter les maladies cardiovasculaires ; 3) d'explorer des approches innovantes de thérapie génique ciblant le foie, avec des applications potentielles à la médecine personnalisée. Ces avancées contribueront à réorienter les stratégies de traitement actuelles qui sont soit orientées sur le foie, soit sur le cœur, vers une approche globale tenant compte des interactions entre les organes, ce qui permettrait de mieux prendre en charge la santé cardiovasculaire.

Procédures

Biopsie à l'oreille : anesthésie gazeuse isoflurane, temps pour le prélèvement inférieur à 10 secondes. Prélèvement de sang à la queue : anesthésie gazeuse isoflurane , temps inférieur à 1 minute. Injection intrapéritonéale: anesthésie locale, temps d'injection inférieur à 10 secondes. Injection intraveineuse : anesthésie par spray xilocaïne 5%, temps d'injection inférieur à 10 secondes. Euthanasie des souris : anesthésie gazeuse isoflurane, disclocation cervicale temps < 1 seconde

Impact sur les animaux

Certaines procédures peuvent engendrer du stress : douleurs liées à la biopsie à l’oreille pour le génotypage ainsi que le marquage avec une bague (courte durée et léger), injections intrapéritonéales d’un composé chimique ou pharmacologique (modérée) ; Stress métabolique suite à une alimentation enrichie en graisses et en sucres (léger) ; stress lié à une mise à jeûn des animaux pendant 6h (léger). Toutes ces nuisances possibles seront prises en charge de manière adéquate et le bien-être de l’animal depuis sa naissance jusqu'à sa mort sera pris en compte grâce à un environnement contrôlé dépourvu de germes pathogènes, la présence d’abris et de jeux dans les cages, une surveillance quotidienne de l’état de santé des animaux par du personnel formé, et la prise en compte de tout signe physique de stress ainsi que de la hiérarchie sociale.

Devenir

A la fin de P1+P2/P3 +P4, les animaux seront euthanasiés.

Remplacement

L’objectif de ce projet est d’évaluer l’impact de la fibrose hépatique sur le développement de l’athérosclérose dans un conteste métabolique qui met en jeu une communication inter-organes. Pour répondre à cette problématique, il sera utilisé des modèles de souris génétiquement modifiées pour des gènes du métabolisme mais également des procédures d'altération nutritionnelles de type régime riche en graisse associé à un traitement chimique qui va favoriser le développement de la fibrose hépatique. L'utilisation d'animaux vivants revêt donc un caractère de stricte nécessité avec le développement d’approches de physiologies intégrées. Concernant la nécessité de recourir à des méthodes alternatives, nous privilégions cette option quand elle est possible.

Réduction

Le nombre total d’animaux concernant les procédures de l’ensemble des protocoles de notre équipe sur les 5 ans à venir est estimé à 2736. Cette utilisation maximise les données obtenues de chaque animal, ce qui permet de limiter ou d'éviter l'utilisation subséquente d'animaux supplémentaires, et ce, sans pour autant compromettre le bien-être animal. La réduction du nombre d'animaux utilisés peut être obtenue par trois moyens principaux : 1.Optimisation des élevages : Éviter la production d'animaux inutiles. 2. Optimisation des groupes expérimentaux : Une prévision du nombre d’animaux total nécessaire par groupe sera réalisée pour respecter le principe des 3R à l’aide du site : https://eda.nc3rs.org.uk/experimental-design-group. 3. Formation adéquate : Assurer une bonne formation des personnes manipulant les animaux afin de maîtriser les gestes techniques et minimiser le stress des animaux. La maîtrise technique permet de réduire la variabilité inter-animale et, par conséquent, le nombre d'animaux nécessaires pour confirmer statistiquement un effet biologique

Raffinement

Les souris seront hébergées dans un environnement non anxiogène regroupant des conditions favorables à leur bien-être : 2 à 6 souris par cage, une alternance lumière/obscurité de 12 h/12 h, un accès permanent à la nourriture et à l’eau, ainsi qu’un enrichissement de l’habitat comprenant des abris et du matériel pour la confection de nids, favorisant l’expression des comportements naturels et la stimulation cognitive. Les animaux feront l’objet d’une surveillance quotidienne, et un registre de suivi du bien-être sera tenu afin de garantir des conditions d’hébergement optimales. Lors de la mise sous régime, le changement de litière et des cages sera effectué deux fois par semaine pour maintenir un environnement propre et confortable. Toutes les procédures expérimentales seront réalisées selon les techniques les moins invasives possibles. L’utilisation d’anesthésiques et d’analgésiques adaptés, combinée à des manipulations douces et à l’habileté du personnel, contribuera à réduire le stress et l’inconfort des animaux. Les souris seront progressivement habituées aux manipulations et aux protocoles expérimentaux lorsque cela est possible. Des critères précis de points limites précoces seront définis et une surveillance rapprochée permettra de détecter rapidement tout signe de douleur, de détresse ou d’altération de l’état général. En cas de dépassement de ces critères, les animaux seront retirés de l’étude et euthanasiés conformément aux recommandations vétérinaires.

Choix des espèces

La souris offre de nombreux avantages pour la recherche en métabolisme et physiologie. Elles ont un temps de génération relativement court et peuvent développer des pathologies telles que l'obésité, l'insulino-résistance, la stéatohépatite non alcoolique, la fibrose et l’athérosclérose avec des caractéristiques similaires à celles observées chez l'homme. De plus, cette espèce permet de réaliser des manipulations génétiques. L'ensemble des procédures réalisées concerne le métabolisme, il sera donc nécessaire d'utiliser des souris adultes (de 2 à 6 mois). Par ailleurs, les protocoles ont été validés (publications) au sein du laboratoire sur des souris adultes et ce, en accord avec les 3R. Les souris seront utilisées à l’âge adulte (8 sem). Les pathologies métaboliques recherchées sont des pathologies de l’adulte.

Les souris utilisées sont diabétiques, soit par leur génotype db/db, soit par un régime riche en graisses et en sucres, avec les dérèglements qui suivent : hyperphagie, polydipsie, polyurie, troubles de la thermorégulation et risque important de déshydratation. 1 083 souris vont être utilisées sur cinq ans dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles reçoivent jusqu'à une injection intrapéritonéale par jour pendant trois à quatre semaines, une mesure de glycémie à la queue tous les deux jours, des prélèvements hebdomadaires de 20 et 50 microlitres de sang, et certaines passent plusieurs jours à plusieurs semaines seules en cage métabolique, isolement que le porteur juge "mineur" puisque le plexiglas leur permet de voir leurs congénères. La majorité est tuée pour prélever pancréas, foie, muscle et tissu adipeux, et 100 souris sont déclarées réutilisables dans d'autres procédures, les groupes témoins pouvant être partagés entre plusieurs études.

Objectifs

Le diabète et ses complications métaboliques sont en constante augmentation, touchant aujourd’hui des millions de personnes dans le monde. Malgré les avancées de la recherche, les options thérapeutiques efficaces restent limitées, en particulier pour cibler les causes profondes de la maladie. Un diabète mal contrôlé peut, avec le temps, entraîner de graves atteintes cardiaques, vasculaires, rénales, oculaires et nerveuses. Au coeur de cette pathologie se trouvent les cellules bêta-pancréatiques, dont la défaillance ou la destruction limite la production d’insuline nécessaire à la régulation de la glycémie. À ce jour, les traitements ciblant directement ces cellules restent rares. Dans ce contexte, les nanotechnologies offrent de nouvelles perspectives thérapeutiques. L’encapsulation de principes actifs dans des nanovecteurs permet une meilleure distribution des molécules dans l’organisme, en ciblant plus spécifiquement les tissus malades. Ces systèmes favorisent la libération contrôlée des principes actifs, réduisent leur toxicité, protègent les molécules fragiles de la dégradation précoce et améliorent leur pénétration intracellulaire. Ils peuvent également renforcer certaines méthodes d’imagerie et de diagnostic. Notre laboratoire a ainsi développé plusieurs types de nanoparticules, associées à des médicaments ou des composés actifs, dans le but de protéger les cellules bêta et de préserver leur fonctionnalité. Ces formulations ont démontré leur efficacité et leur innocuité à travers divers tests in vitro. Nous visons désormais à évaluer in vivo l’efficacité de trois de ces nanomédicaments, en les testant sur deux modèles animaux distincts de diabète de type 2. Nous prévoyons la réalisation de 5 études par an dans ce cadre. Ces travaux soulignent le rôle central des modèles murins dans la recherche sur le diabète de type 2, en tant qu’outils indispensables pour faire progresser notre compréhension et nos capacités de traitement face à cette pathologie complexe.

Bénéfices attendus

Le diabète et l’obésité constituent aujourd’hui des enjeux majeurs de santé publique, classés parmi les urgences sanitaires en raison de la croissance rapide du nombre de personnes touchées. Actuellement, les options thérapeutiques disponibles pour traiter ou ralentir la progression de ces pathologies et de leurs complications demeurent limitées. Il apparaît donc essentiel d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques et de développer des agents pharmacologiques innovants pour répondre à ce besoin médical non satisfait. Parmi les approches prometteuses, l’utilisation de molécules capables de protéger les cellules bêta pancréatiques et de renforcer leur fonction représente une stratégie intéressante dans le développement de traitements antidiabétiques. Dans cette perspective, les nanotechnologies offrent des solutions innovantes et durables pour améliorer la délivrance ciblée de principes actifs. En particulier, l’encapsulation de peptides dans des nanovecteurs permet d’optimiser leur stabilité, leur biodisponibilité et leur efficacité thérapeutique. Nous utiliserons ainsi différents types de nanovecteurs biocompatibles : l’alginate, un polysaccharide naturel extrait d’algues brunes, des capsules phospholipidiques, ainsi que des nanoparticules d’amidon. Ces nanovecteurs, déjà largement utilisés dans l’industrie pharmaceutique en tant qu’adjuvants ou excipients, présentent un excellent profil de sécurité, ce qui en fait des candidats de choix pour des applications en nanomédecine.

Procédures

Le type d'intervention se limite à des injections intra-péritonéales, et des prélèvements sanguins au niveau de la queue pour mesurer la glycémie. La mesure de la glycémie à l’aide d’un glucomètre nécessite une petite piqûre à l'aide d'une fine aiguille au niveau de la veine caudale pour prélever une quantité de sang d’environ de 2 à 2,5 μL. Après chaque mesure, un analgésique local de type xylocaïne sera appliqué au niveau de la queue. Ce type de prélèvement dure 3-4 secondes. Les injections s'effectueront sur une durée de 3-4 semaines, selon une fréquence pouvant aller au maximum jusqu'à 1 fois/jour. Pour chaque injection, l’animal sera immobilisé pour une durée de 5 secondes. La mesure de la glycémie se fera à une fréquence une fois tous les 2 jours sauf lors des tests de tolérance au glucose ou les tests de tolérance à l'insuline, où dans ce cas s'effectueront à plusieurs reprises dans un temps limité de 2h ou 1h30 respectivement. Il est également prévu de mesurer l'insuline et les triglycérides en prélevant 20 μl et 50μl de sang, respectivement de la queue, une fois par semaine et lors des tests de tolérance.

Impact sur les animaux

Tout au long de ce projet, l’état général des animaux obèses et des animaux diabétiques sera surveillé quotidiennement car bien que ces pathologies ne soient pas des points limites, les conséquences qu’elles engendrent peuvent être une source de dérèglements internes, tels que une hyperphagie, polydipsie, un problème de thermorégulation, une hyperlipémie et une augmentation des productions hormonales de la glande hypophyse et des glandes surrénales. Ces désordres métaboliques entrainent une polyurie et une activité physique amoindrie. Ainsi les risques de déshydratation sont très importants chez les animaux diabétiques et nécessite une attention particulière. Pour le modèle d’obésité, une prise de masse trop importante peut entraîner une difficulté d’accès à la nourriture et à l’eau de boisson. De plus un excès d’apport alimentaire en lipides peut également entraîner le développement passager de dermatite. Enfin, pour la dernière procédure, l'utilisation des cages métaboliques impose l'isolement des souris pendant plusieurs jours à plusieurs semaines, ce qui peut provoquer un inconfort. Celui-ci reste mineur puisque les animaux sont libres de tout mouvement dans des cages de type standard et en plexiglas ce qui leur permet de visualiser leurs congénères.

Devenir

Tous les animaux diabétiques, ainsi qu’une partie de leurs contrôles, seront utilisés dans les procédures expérimentales et la majorité d’entre eux sera euthanasiée afin de procéder au prélèvement d’organes (pancréas, foie, muscle, tissu adipeux). Les animaux non euthanasiés pourront éventuellement être réutilisés dans d’autres procédures. Par exemple, les animaux des groupes contrôle pourront être partagés entre plusieurs études, ou, si cela est possible, être transférés à d’autres groupes.

Remplacement

Ce projet propose des substances novatrices pour lesquelles les informations ne sont pas encore disponibles dans la littérature. Bien que le remplacement par des alternatives non animales, telles que les lignées cellulaires ou organoïdes, soient un atout précieux pour la recherche, ces dernières ne peuvent reproduire la physiologie intégrative complexe présente chez la souris, qui est étroitement liée à celle de l'homme. En raison de la grande complexité des troubles physiopathologiques du diabète et de l’obésité et de leur intégration complexe dans l’organisme, les inconnues sont trop nombreuses pour créer des modèles informatiques fiables. Par conséquent, il n'existe aucun modèle non animal utilisable pour ces études.

Réduction

Des expériences in vitro préalables ont été effectuées dans le but de déterminer les conditions optimales de délivrance des molécules, permettant ainsi de réduire le nombre d’animaux. Afin d’observer une différence statistiquement significative entre deux groupes, 5 animaux par groupe expérimental sont nécessaires. Une réduction de ce nombre pourrait être problématique car quelques animaux peuvent être perdus au cours des expériences (pour cause de mort naturelle). Des études précédentes sur les souris spontanément diabétiques montrent que l’utilisation d’un minimum de 14 à 16 animaux (soit un triplicat d’expériences avec 5 souris/groupe) par groupe de traitement est nécessaire pour obtenir une puissance statistique suffisante et donc des effets significatifs sur la glycémie. Le nombre de souris sera également limité puisque l’établissement d’un profil métabolique et l’isolement post-mortem des organes cibles s’effectuera sur un même individu. Enfin, dès que possible, le groupe contrôle sera commun à plusieurs études non refaites.

Raffinement

Dans le cadre de ce projet, des mesures de raffinement seront mises en oeuvre pour minimiser la douleur, la souffrance et le stress des animaux, notamment par l’utilisation systématique d’analgésiques et d’anesthésiques adaptés, la surveillance accrue des animaux avec des points limites spécifiques, ainsi que par l’enrichissement de leur environnement pour favoriser leur bien-être physique et social. Excepté pour quelques animaux de la procédure 5 (n=24), tous les animaux seront hébergés par groupe de 5, afin de favoriser leur interaction sociale et réduire leur stress. De plus, un enrichissement de leur milieu sera effectué par un ajout de tunnels et de matériaux de nidification. Un suivi quotidien sera réalisé par les zootechniciens (observation comportement, état de santé général et état sanitaire de leur cage). Les animaux étant diabétiques, leurs cages seront changées tous les jours afin d'éviter les désagréments causés par le syndrome polyuropolydipsique. Les nids préalablement construits par les animaux seront éventuellement remis dans leur nouvelle cage pour plus de confort et de sentiment de sécurité. Les points limites sont les suivants : troubles du comportement ; signes d’absence de toilettage (poil hirsute, pelage sale) ; perte de poids de 15 % à 20 % par rapport au poids initial de l’animal ou comparativement au poids moyen des individus soumis au même protocole expérimental.

Choix des espèces

Les caractéristiques morphologiques, physiologiques, endocriniennes et inflammatoires de la souris ne peuvent pas être entièrement reproduites in vitro. L’utilisation d’animaux d’expérimentation s’avère donc particulièrement pertinente dans le cadre du développement de dispositifs de délivrance de molécules à visée thérapeutique. Dans ce projet, les modèles animaux retenus sont des souris atteintes de diabète de type 2 : les souris db/db et les souris C57Bl/6N soumises à un régime riche en graisses et en sucres (HFD). Ces modèles sont largement validés et couramment utilisés pour l’étude de l’efficacité de traitements antidiabétiques, notamment pour l’évaluation de la réduction de la glycémie. Il est essentiel de travailler avec des animaux dont le développement physiologique est achevé, sans toutefois recourir à des individus trop âgés, afin d’éviter tout biais dans l’interprétation des résultats. Ainsi, les protocoles expérimentaux débuteront avec des souris âgées d’au moins 5 à 6 semaines, aussi bien pour les souris db/db que pour les C57Bl/6N.

Aucune des 72 souris n'est tuée dans ce projet, 8 ayant déjà été réutilisées de manière non invasive et les 64 autres pouvant l'être dans d'autres projets à l'issue de l'étude, sur avis vétérinaire favorable. Elles sont utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, pour mettre au point un harnais textile de mesure cardiorespiratoire adapté à leur taille. Chaque souris est tondue ou rasée, ce qui peut provoquer une hypothermie légère et une inflammation locale, endormie jusqu'à deux fois par jour pour l'équipement et le déséquipement, puis équipée jusqu'à 24 heures, avec un hébergement individuel si la cohabitation devient impossible. Le porteur présente ce dispositif comme une amélioration du "bien-être des animaux" et une alternative aux capteurs implantés par chirurgie, alors que ses propres procédures reposent sur des anesthésies répétées, un rasage et un isolement dont il reconnaît qu'il "peut provoquer un stress".

Objectifs

Lors d’études scientifiques, le bien-être des animaux peut être altéré par l’utilisation de dispositifs de mesure (électrocardiogramme, volume respiratoire), essentiel à la compréhension des fonctions physiologiques. Malgré leurs performances de mesure, ils nécessitent d’être implantés dans l’animal (par chirurgie) ou l’isolement des animaux. Outre les contraintes liées à leurs utilisations, (soins pré et post chirurgicaux,…) la chirurgie et l’isolement induisent des stress physiologiques pouvant altérer la qualité des résultats des études menées. Des dispositifs externes, développés chez les grands mammifères (singe, chien, porc…), permettent le recueil de données, sans chirurgie, sur des animaux éveillés et libres de leurs mouvements. Ces dispositifs ont permis l’amélioration du bien-être des animaux et contribuent à leur réutilisation et leur réduction dans les études. Grâce aux progrès de miniaturisation de la technologie, ces dispositifs ont été dernièrement adaptés aux petits mammifères de laboratoire (rat ou cochon d’inde), mais aucun dispositif de la sorte n’a été développé chez la souris notamment dû au challenge qu’elle représente (taille, comportement, manipulation…). Ce projet est initié pour aider les acteurs de la recherche à pallier cette situation dans les études nécessitant de mesurer des paramètres physiologiques chez la souris que ce soit pour évaluer les effets (bénéfiques ou néfastes) d’une molécule avant les premiers essais chez l’Homme ou comprendre les mécanismes de maladies et identifier de nouvelles pistes de traitements. L’objectif est de mettre au point un système chez la souris à partir d’un dispositif externe permettant la mesure de paramètres cardiorespiratoires dans le milieu d’hébergement habituel et avec ses congénères, sans chirurgie préalable. Un tel dispositif ayant pour seule contrainte le port d’un textile connecté, rend possible un suivi totalement indolore et plus respectueux des animaux. Ce dispositif participera à l’amélioration du bien-être des animaux et la qualité des résultats obtenus en permettant l’enregistrement de données plus pertinentes. Le projet se déroule comme suit : ● Des mesures morphométriques seront relevées afin de confectionner des prototypes du dispositif ● Des tests préliminaires des différentes formes de prototypes seront effectués sur des modèles 3D de souris Les prototypes seront évalués sur des animaux vivants, en conditions individuelles puis collectives et sur des durées progressives.

Bénéfices attendus

L’adaptation d’un dispositif de mesure externe à la souris, permettra de proposer aux acteurs de la recherche biomédicale (recherche fondamentale, appliquée, translationnelle…) un outil innovant d’investigation des paramètres physiologiques. Les bénéfices de ce projet sont donc : ● De remplacer les méthodes impliquant des actes de chirurgie (capteurs implantables) pour mesurer les paramètres physiologiques de l’espèce cible : la souris. Une alternative à ces méthodes permettra d’éviter le stress et la douleur ainsi qu’un suivi accru avant et après l’opération nécessitant des soins médicamenteux systématiques. Il permettra également le suivis de constantes physiologiques chez des animaux fragiles (génétiquement modifiés, modèle de maladie cardiaque et/ou respiratoire) ne supportant pas la chirurgie. ● D’améliorer les conditions d’hébergement lors du suivi, en rendant possible la mesure des paramètres physiologiques de l’animal directement dans sa cage d’hébergement, réduisant drastiquement le stress induit par l’isolement et permettant donc un suivi de ces paramètres sur une période longue. ● De collecter des données plus pertinentes ; le lien entre résultats et bien-être animal étant lié, l’amélioration des conditions de mesures physiologiques permettra des résultats plus précis et la diminution du nombre d’animaux utilisés dans les études.

Procédures

Les souris subiront une anesthésie de maximum 10 minutes pour effectuer différents gestes : ● Raccourcissement des griffes ● Tonte ou rasage ● Équipement ● Dé-équipement Spécifiquement pour la procédure d’évaluation des prototypes, les animaux seront maintenus jusqu’à 30 minutes sous anesthésie, afin de réaliser des mesures morphométriques pour alimenter la base de données, préalablement à l’équipement estimé, lui, à 10 minutes. Le temps total estimé est donc de 40 minutes. Les animaux pourront être amenés à être équipés plusieurs fois lors de chaque procédure selon leur comportement face aux différents prototypes. Par ailleurs l'anesthésie ne sera pratiquée que pour l’équipement et le dé-équipement des animaux soit 2 fois par jour et par individus. Lors de la procédure d’évaluation, les animaux seront équipés du dispositif pendant 90 minutes maximum. Avant la procédure de validation, les animaux seront équipés pendant 90 minutes le premier jour, et 150 minutes le deuxième jour, afin d’être habitués au dispositif. Lors de la procédure de validation, les animaux seront équipés pendant 3 heures maximum, en hébergement par 2 et par 4 individus. Puis ils seront équipés pendant 24 heures maximum (par 1, 2 ou 4 individus, en fonction des résultats de l’étape précédente) Au-delà de 2 jours sans équipement, les animaux seront ré-habitués au port du dispositif par un équipement de 150 minutes.

Impact sur les animaux

MODIFICATION Une fois équipé du dispositif (harnais textile externe), il est possible que l’animal cherche à retirer son prototype. Ce phénomène, décrit avec d’autres dispositifs externes, peut occasionner de légères irritations ou des marques de pression cutanées transitoires en cas d'ajustement sous-optimal ou de port prolongé. Pour éliminer ce risque, un ajustement fin de la tension du harnais au niveau du thorax est réalisé de façon fittée et individualisée, et l'état cutané de l'animal est régulièrement inspecté au retrait. En cas de sensibilité locale, une crème apaisante (EMLA) est appliquée. Les animaux seront hébergés individuellement pour une durée limitée à 150 minutes. Si l’hébergement collectif est impossible lors de la phase de validation de 24h maximum, les individus subiront également un hébergement individuel. L’isolement d’individus peut provoquer un stress mais aucune donnée bibliographique ne présente la possibilité d’utiliser un dispositif externe chez la souris, en hébergement collectif. Afin de permettre la pose optimale de capteurs et d’assurer le maintien du dispositif sur l’animal, en amont de l’expérience, les souris seront soit rasées soit tondues. Le rasage de l’animal peut entraîner une légère hypothermie et une inflammation locale.

Devenir

MODIFICATION Sur l’effectif total de 72 souris, 8 animaux ont déjà été réutilisés de manière non invasive. Les 64 animaux restants pourront être réutilisés dans d'autres projets à l'issue de cette étude, conformément à l'avis favorable du vétérinaire.

Remplacement

Afin de s’approcher au plus de la morphologie des souris, des modèles de souris 3D permettront, en amont de la phase sur animaux vivants, de tester les différents modèles de prototypes conçus, pour vérifier la bonne adaptation à la morphologie de la souris (forme du dos, périmètre du cou, diamètres des pattes etc…). Cette démarche permettra d’effectuer une première sélection des prototypes, et la mise en place des dispositions nécessaires pour équiper l’animal. Cependant, le recours au modèle animal reste, dans ce projet, un passage obligé étant donné que certains critères d’évaluations, tels que le comportement ou la tolérance de l’animal ne peuvent être déportés sur un modèle alternatif.

Réduction

Des calculs statistiques ont permis de déterminer le nombre d’animaux nécessaires par lot pour la réalisation de cette étude, à partir des courbes de croissances des fournisseurs et du premier jeu de mesures morphométriques obtenu sur des souris mortes issus d'autres études. Ces calculs tiennent aussi compte de la marge d’erreur de fabrication, d’un éventuel retrait des animaux de l’étude, et du schéma expérimental (équipement par 2 ou par 4 etc…). Des groupes de taille similaire ont été utilisés dans différentes publications rapportant l’utilisation de dispositif externe chez la souris (entre 5 et 9 animaux par groupe). Ce nombre d’animaux suffisait pour observer les avantages et inconvénients des dispositifs lorsque les animaux étaient équipés. Lors de la procédure d’évaluation, si plusieurs itérations doivent être réalisées, le même lot d’animaux sera équipé plusieurs fois afin de limiter au maximum l’utilisation de nouveaux lots d’animaux. Lors de la procédure de validation, le lot d’animaux sera équipé des plusieurs formes de prototypes ayant atteint cette phase. Cette méthode permettra de limiter le nombre total d’animaux requis afin de limiter au maximum l’utilisation de nouveaux lots d’animaux.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans la même salle où auront lieu les procédures. Ils effectueront une semaine d’acclimatation avant le début de l’étude. Seul un déplacement de cage sera opéré afin de réaliser l’anesthésie dans une autre salle, prévue à cet effet. Les animaux seront hébergés dans des cages standards, avec de la nourriture (standard) et de la boisson en accès libre. De l’enrichissement compatible avec le port d’un dispositif sera utilisé (litière, matériel de nidification). Les souris seront manipulées avec toutes les précautions requises et des interactions fréquentes sont prévues avec l’expérimentateur, afin de réduire le niveau de stress lié à la manipulation au cours des procédures. 24 heures avant la pose du prototype sur l’animal, une familiarisation au textile composant le prototype, similaire au protocole existant chez d’autres espèces, sera réalisée, diminuant le stress et maximisant les chances de succès de l’hébergement collectif. Une anesthésie légère sera effectuée facilitant l’équipement et le dé-équipement des souris minimisant le stress et éviter une contention des animaux éveillés. Sous anesthésie, l’hypothermie sera limitée par un tapis chauffant. Les griffes seront raccourcies. Si malgré ces précautions, des lésions ou des irritations apparaissent, des soins adaptés seront réalisés et une observation accrue de l’animal sera effectuée préalablement à sa réintégration au protocole. Les souris seront habituées progressivement à porter ce dispositif en se basant sur les protocoles d’habituation existants pour d’autres espèces. Un renforcement positif après les anesthésies sera mis en place en donnant quelques gouttes de lait concentré aux souris. Lors de la procédure d’évaluation, un test de prototype par jour par animal aura lieu pour limiter le mal être et les biais sur les résultats. Pour la procédure de validation, afin de limiter un biais éventuel dû à la présence du manipulateur dans la salle d’expérimentation, le manipulateur surveillera le comportement des souris via un suivi par vidéo, depuis une salle adjacente. Des points de contrôle seront réalisés à des temps réguliers. Chaque étape constituant la procédure de validation sera séparée par un temps de repos d’au moins une nuit. Si un des points limites prédéfinis est atteint (perte de poids importante, déshydratation, isolation dans un coin, automutilation, altération de la respiration etc…), la procédure sera arrêtée pour cet animal.

Choix des espèces

La souris représente environ 60% des modèles animaux utilisés à des fins scientifiques en France en 2021. Ce modèle est utilisé de manière importante dans des domaines nécessitant d’avoir accès aux constantes physiologiques des animaux pour répondre aux différentes thématiques de recherche ou pour suivre l’état des animaux au cours des expérimentations. Les souris seront utilisées à 10 semaines d’âge, le premier jour de l’expérience. Les animaux, à cet âge, sont les plus utilisés en recherche, et sont considérés comme adultes. Ceci permettra donc de toucher la plus grande gamme de souris utilisée dans le domaine de la recherche.