Souris

1 400 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Une partie reçoit une alimentation enrichie en graisses pendant seize semaines, et chaque souris passe trois échographies cardiaques sur animal vigile, trois prélèvements sanguins, puis un test de glycémie comportant six prélèvements répétés en deux heures. Le porteur signale une sensibilisation ou une irritation de la queue liée à la répétition des prélèvements, et annonce qu'aucun effet indésirable n'est attendu chez les souris transgéniques. Sur le remplacement, il écrit que l'étude des interactions entre vieillissement, obésité, inflammation et fonction cardiaque "nécessite un organisme entier", et mentionne des analyses complémentaires sur une banque de tissus humains.

Objectifs

L’obésité et le vieillissement augmentent le risque de maladies du cœur. Parmi celles-ci, il existe une forme particulière d’insuffisance cardiaque dans laquelle le cœur pompe normalement mais se remplit mal, appelée insuffisance cardiaque à fraction d’éjection préservée. Cette pathologie est particulièrement fréquente chez les personnes âgées et en situation d’obésité, et reste encore mal comprise et difficile à traiter. L’ostéopontine (OPN) est une molécule impliquée dans l’inflammation et les modifications tissulaires, qui sont augmentés dans l’obésité et les pathologies cardiovasculaires. Ce projet vise à déterminer le rôle de l’OPN et de la sénescence (processus de vieillissement) de certaines cellules immunitaires dans les restructurations cardiaques associées à l’obésité et au vieillissement, et avec l’apparition d’une insuffisance cardiaque. Trois différents modèles de souris sont utilisés, chacun ayant une spécificité vis-à-vis de l’OPN ou de la sénescence, et étudiés notamment sous régime riche en graisses et au cours du vieillissement.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mieux comprendre les mécanismes impliqués dans les maladies cardiaques liées à l’obésité et au vieillissement. À terme, ces travaux pourraient contribuer à identifier de nouvelles pistes de traitement pour des maladies pour lesquelles il existe encore peu de solutions thérapeutiques.

Procédures

Certaines souris reçoivent une alimentation enrichie en graisses pendant une durée de 16 semaines. Au cours de l’étude, chaque animal bénéficie de trois échographies cardiaques, d’une durée d’environ 5 minutes chacune, réalisées sur animaux vigiles. Des prélèvements sanguins de très faible volume sont également réalisés, à trois reprises au cours de l’étude (environ 1 minute par prélèvement), sur animaux vigiles. Des tests visant à évaluer la régulation de la glycémie sont également effectués. Ces tests consistent en l’administration d’une substance (glucose ou insuline), suivie de six points de prélèvements sanguins répétés sur une durée totale de 2 heures, sur animaux vigiles. Enfin, un prélèvement sanguin terminal est réalisé une seule fois en fin d’étude, sous anesthésie générale

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus dans ce projet sont globalement modérés et de courte durée. Aucun phénotype dommageable ni effet indésirable n’est attendu chez les souris transgéniques. Les manipulations nécessaires aux examens (contention, échographie, prélèvements sanguins) peuvent entraîner un stress passager chez les animaux. L’utilisation d’une crème dépilatoire avant l’échographie peut occasionner une légère irritation cutanée transitoire. Les prélèvements sanguins répétés au niveau de la queue peuvent provoquer une gêne locale légère, des saignements transitoires et, plus rarement, la formation d’un léger hématome. La répétition de ces prélèvements peut également entraîner une sensibilisation locale ou une irritation de la queue. Les injections réalisées dans le cadre des tests métaboliques peuvent entraîner une gêne ponctuelle au point d’injection. Certains tests peuvent induire une baisse transitoire du taux de sucre dans le sang, susceptible d’entraîner des signes cliniques tels qu’une diminution de l’activité ou une faiblesse passagère. Le régime enrichi en graisses peut entraîner une prise de poids et des altérations métaboliques, correspondant au phénotype expérimental recherché.

Devenir

Les animaux expérimentaux seront mis à mort afin de permettre la réalisation des prélèvements biologiques nécessaires aux analyses prévues dans le projet.

Remplacement

L’étude des interactions complexes entre vieillissement, obésité, inflammation et fonction cardiaque nécessite un organisme entier avec un système immunitaire fonctionnel et un environnement métabolique intact. Il n’existe pas de modèle in vitro ou silico capable de reproduire fidèlement ces processus systémiques, c’est pourquoi l’utilisation de modèles murins est justifiée scientifiquement. Néanmoins, nous intégrons autant que possible des approches alternatives pour réduire la dépendance aux animaux vivants. Par exemple, nous mènerons des analyses sur des échantillons humains disponibles (banque de tissus myocardiques/adipeux de patients) en complément des données animales. Ces expériences in vitro permettent d’explorer certains mécanismes (voie de signalisation de l’OPN, interactions cellulaires) sans mobiliser d’animaux supplémentaires. De plus, les modèles informatiques et l’analyse de bases de données transcriptomiques publiques seront mises à profit en amont pour affiner nos hypothèses et réduire les explorations in vivo hasardeuses. Ainsi, le recours à l’animal est limité au strict nécessaire, c’est-à-dire pour valider les phénomènes intégrés qu’on ne peut tester autrement (impact global sur la fonction cardiaque, réseau hormonal et immunitaire entier).

Réduction

Le nombre d’animaux par groupe a été déterminé à l’aide d’analyses statistiques afin d’obtenir des résultats fiables tout en limitant leur utilisation. Les paramètres étudiés concernent la fonction cardiaque (évaluée par échocardiographie) et le métabolisme (gestion du sucre dans le sang). Sur la base de l’expérience du laboratoire et de la littérature, un effectif de 10 animaux par groupe a été retenu, correspondant au minimum nécessaire pour atteindre la puissance statistique souhaitée. Pour les souris âgées (12 mois), cet effectif est porté à 15 animaux par groupe afin de compenser les pertes attendues liées à l’âge.

Raffinement

Des points limites ont été définis pour chacune des procédures. Tout signe témoignant d’une mauvaise tolérance au régime riche en graisse (par exemple perte de poids non désirée, souffrance, apathie, déshydratation des animaux) conduira à l’interruption de la procédure. Les animaux sont maintenus en groupes sociaux leur permettant d’exprimer leurs besoins avec leurs congénères et les cages sont enrichies avec une maison en carton et du papier kraft pour leur permettre de nicher. Un examen clinique des animaux sera effectué quotidiennement ou toutes les semaines selon le plan des procédures. De plus, les procédures que nous utilisons ont été optimisées et standardisées, ce qui permet de limiter la répétition des procédures.

Choix des espèces

Nous avons choisi la souris pour des raisons multiples : 1)Le développement d’une cardiomyopathie métabolique liée à l’obésité induite par un régime riche en graisse est un modèle pathologique expérimental bien établi et reproductible chez les souris. De plus, ce modèle murin présente l’avantage de développer le vieillissement et d’offrir des conditions très reproductibles d’induire une cardiomyopathie métabolique. 2)L’étude des voies impliquées dans le mécanisme de sénescence cellulaire est possible en recourant aux animaux transgéniques. Les animaux déficients pour les gènes d’intérêt de notre étude existent uniquement chez la souris ce qui explique l’utilisation de souris. 3)La courte durée de gestation chez la souris est compatible avec la durée de nos expériences qui contiennent pour la plupart des protocoles chronophages et des analyses à différents âges parfois tardifs. Les animaux âgés de 5, 8 et 12 mois correspondant respectivement au stade jeune adulte, âge intermédiaire et âge avancé afin de caractériser l’évolution progressive des altérations cardio-métaboliques liées au vieillissement et/ou au régime riche en graisse.

Le nerf sciatique pincé sur une patte, l'autre patte servant de témoin sur le même individu : 480 souris subissent une chirurgie de quinze minutes sous anesthésie, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour analyser leurs tissus. La compression du nerf provoque une douleur et une gêne pour marcher, que le porteur qualifie de légères et suit avec une grille d'évaluation de la douleur. L'objectif déclaré est d'imiter chez des souris saines la déconnexion des nerfs et des muscles observée dans la maladie de Charcot, faute de traitement capable d'en arrêter la progression. Le porteur présente l'effectif de 480 comme "soigneusement calculé" et réduit au minimum, sans qu'aucun calcul ni aucune référence n'apparaisse dans le résumé.

Objectifs

La maladie de Charcot est une maladie qui touche les nerfs et les muscles et rend les malades de plus en plus paralysés. Il n'existe à l'heure actuelle aucun traitement capable de stopper la progression de cette maladie gravement invalidante qui finit par être fatale. Notre objectif est de comprendre comment les défauts du nerf altèrent les muscles pour aboutir à la paralysie progressive constatée chez les patients atteints de la maladie de Charcot. Pour cela, nous devons mimer les atteintes des nerfs chez des animaux sains et chercher les défauts du muscle qui en découlent. Les résultats attendus permettront de trouver de nouveaux moyens d'empêcher les muscles de se paralyser pour ralentir voire stopper la progression de la maladie.

Bénéfices attendus

La SLA (Sclérose Latérale Amyotrophique) ou maladie de Charcot est une maladie grave qui affecte les nerfs et les muscles, entraînant une faiblesse progressive et la mort. Aujourd’hui, il n’existe pas de traitement pour la guérir. Notre projet a pour objectif de mieux comprendre la maladie et trouver de nouvelles pistes pour la traiter. Nous étudions particulièrement le muscle qui est une des cibles principales de la maladie. Nous comparerons les défauts que nous avons découverts dans la SLA à un modèle où les nerfs sont déconnectés puis reconnectés aux muscles, pour mimer une mort des neurones moteurs comme dans la SLA, pour mieux comprendre les changements. En observant l’évolution des dégâts sur les neurones, les connexions nerfs-muscles, et les muscles eux-mêmes, nous espérons mieux identifier les premières étapes de la SLA. En combinant cette compréhension des causes de la SLA avec des tests de traitements, notre projet espère ouvrir la voie à de futurs soins plus efficaces pour ralentir, voire arrêter, cette maladie.

Procédures

480 animaux seront destinés à la procédure chirurgicale de compression du nerf sciatique. La chirurgie dure quelques minutes (15 minutes environ) et sera effectuée sous anesthésie générale après traitement analgésique. Après ouverture de la peau au niveau de la cuisse, le nerf sciatique sera pincé sur une des 2 pattes puis la peau sera refermé

Impact sur les animaux

Une pression exercée sur le nerf sciatique peut provoquer une légère douleur et une gêne pour marcher, L’opération peut aussi être une source de stress pour les animaux. Nous mesurerons régulièrement la douleur chez les souris en utilisant la grille spécifique d'évaluation de la douleur que nous avons mise en place afin de prendre en charge chez ces animaux les nuisances induites par cette procédure.

Devenir

Les animaux sont mis à mort à la fin des procédures pour analyser les tissus et mieux approfondir la compréhension de la maladie. Dans tous les cas, ces étapes sont menées avec le plus grand respect pour l’animal et dans le souci constant de limiter toute forme de souffrance.

Remplacement

Cette maladie neuromusculaire est très complexe. Elle touche plusieurs organes et types de cellules en même temps, ce qui rend son étude difficile en laboratoire avec des méthodes simples. Les dommages subis par les nerfs et les muscles ont des conséquences directes sur le mouvement et la coordination, ce qui ne peut être observé qu’en étudiant des animaux vivants. Pour mieux comprendre cette maladie, il est donc essentiel de mener des recherches sur des modèles vivants. Cependant, en parallèle, nous utilisons aussi des techniques sur des cellules cultivées en laboratoire. Ces approches permettent d’explorer plus en détail certains mécanismes biologiques et d'identifier des cibles thérapeutiques potentielles.

Réduction

Dans le cadre de nos recherches, nous avons fait en sorte d’utiliser le moins d’animaux possible tout en garantissant des résultats fiables. Notre objectif est de mieux comprendre cette maladie neurodégénérative. Pour cela, nous avons soigneusement calculé le nombre d’animaux nécessaires afin d'obtenir des résultats solides, sans en utiliser plus que ce qui est strictement nécessaire. Nous analysons ensuite les données recueillies à l’aide de méthodes adaptées à chaque situation, afin de tirer des conclusions justes. Pour réduire le nombre d’animaux, les deux pattes de chaque souris sont utilisées : une dans le groupe contrôle et une dans le groupe expérimental. De plus, nous analysons les mâles et les femelles, ce qui limite les reproductions pour obtenir le nombre d’animaux. Par ailleurs, pour éviter le non emploi, nous prélevons autant de tissus que possible sur chaque animal à la fin de l'expérience Ces échantillons sont ensuite conservés et mis à disposition de l’ensemble des chercheurs de notre équipe. Une liste des tissus encore disponibles est également partagée afin qu’ils puissent être utilisés dans d’autres projets, réduisant ainsi encore le besoin d’utiliser de nouveaux animaux.

Raffinement

Dans notre projet de recherche chez la souris, nous mettons tout en œuvre pour respecter le bien-être des animaux utilisés et réduire au maximum leur stress et leur inconfort. Pour cela, nous avons mis en place plusieurs mesures spécifiques. Tout d’abord, nous avons créé des grilles d’évaluation de la douleur et de la souffrance, adaptées à ces expériences. Ces grilles ont été conçues avec l’aide du personnel spécialisé en soins animaliers. Elles permettent de repérer rapidement tout signe de détresse chez les souris. Si un animal montre des signes de faiblesse, comme une perte de poids ou des difficultés à se déplacer, des aliments faciles à consommer et des gels d’hydratation sont placés à sa portée. Et surtout, si malgré tout l’état d’un animal se dégrade, nous appliquons des règles strictes pour arrêter l’expérience à temps. Cela permet d’éviter toute souffrance inutile. Ces points d’arrêt anticipés sont décidés à l’avance pour chaque situation.

Choix des espèces

Les souris sont souvent utilisées dans la recherche car leur fonctionnement biologique est assez proche de celui de l’être humain. Cela permet de mieux comprendre certains mécanismes naturels qui protègent le corps, en particulier lorsqu’ils font intervenir plusieurs organes. Ce type d’étude ne peut se faire que sur un organisme entier, ce qui rend l’animal indispensable. Dans le cadre de nos travaux, nous mimons la dégénérescence des neurones pour mieux comprendre son effet sur le muscle, ce qui est essentiel pour comprendre comment les muscles sont impliqués dans la pathologie.

672 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, chacune subissant une biopsie de l'oreille sur animal vigile, trois injections quotidiennes pour activer une modification génétique, puis une quatrième une semaine plus tard qui provoque la dégénérescence de sa rétine, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. L'objectif déclaré est de comprendre comment deux types de cellules de la rétine communiquent par la voie de signalisation Notch, les retombées thérapeutiques étant renvoyées par le porteur au "plus long terme". La mise à mort sert à prélever les rétines, analyse qu'il dit impossible sur des souris maintenues en vie. Il annonce des effets indésirables "limités et de sévérité légère", la liste qui suit comprenant une perte de la vision.

Objectifs

La rétine, qui est une partie de l’œil essentielle à la vision, a une capacité très limitée à se réparer lorsqu’elle est endommagée, notamment dans les maladies dégénératives. Certaines cellules présentes dans la rétine, appelées cellules de Müller, possèdent toutefois un potentiel de réparation, qui peut être stimulé dans certaines conditions expérimentales. Nous avons montré que d’autres cellules, impliquées dans la défense de l’organisme (les microglies), jouent un rôle important dans l’activation de ce processus de réparation. Dans ce contexte, notre projet vise à mieux comprendre les mécanismes de communication entre les microglies et les cellules de Müller, notamment le rôle de la voie de signalisation Notch. Pour cela, l’objectif est de manipuler l’activité de cette voie dans les microglies dans un modèle de souris reproduisant une dégénérescence de la rétine et étudier l’impact de ces manipulations sur la réparation. À terme, ce travail permettra de mieux comprendre les mécanismes impliqués dans la réponse de la rétine aux lésions et dans ses capacités de réparation.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d’améliorer les connaissances fondamentales sur les mécanismes impliqués dans les maladies de la rétine. À plus long terme, ces travaux pourraient contribuer au développement de stratégies thérapeutiques pour des maladies dégénératives de la rétine, actuellement sans traitement curatif.

Procédures

Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : • Prélèvement pour génotypage : biopsie d'un morceau d'oreille (environ 1-2 mm de diamètre), réalisée une seule fois par animal. La procédure dure environ 5 secondes et est effectuée sur animal vigile. • Injections (672 souris) : réalisées sur animal vigile, d’une durée inférieure à 30 secondes par injection. Les injections sont effectuées une fois par jour pendant 3 jours consécutifs pour activer la modification génétique, puis une injection une semaine plus tard avec une autre molécule permettant de provoquer la dégénérescence de la rétine.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus sont limités et de sévérité légère. Ils incluent : • un inconfort transitoire et de très courte durée lié aux injections • une possible perte de poids liée au traitement • une perte de la vision et une inflammation locale dans la rétine Ces effets font l’objet d’une surveillance quotidienne afin d’adapter rapidement la prise en charge si nécessaire.

Devenir

Les animaux doivent être mis à mort à l’issue des procédures expérimentales afin de permettre le prélèvement des rétines et l’analyse des cellules étudiées (microglies et cellules de Müller). Ces analyses nécessitent des tissus prélevés et ne peuvent pas être réalisées sur des animaux maintenus en vie. Il n’est donc pas possible de réutiliser ou de replacer les animaux.

Remplacement

La nécessité d’avoir recours à des animaux se justifie par le fait que la rétine est un tissu complexe composé de nombreux types de neurones et de cellules gliales dont les interactions sont cruciales et l’objet même de notre étude. Les modèles alternatifs existants ne permettent pas d’étudier l’ensemble des mécanismes impliqués dans un contexte physiologique complet.

Réduction

Le nombre d’animaux a été déterminé à partir d’une estimation statistique permettant d’obtenir des résultats robustes avec un effectif minimal. L’utilisation des deux yeux par animal et l’optimisation des croisements permettent de réduire le nombre total d’animaux. Les animaux non porteurs des modifications génétiques induites servent de contrôles, évitant ainsi l’utilisation d’animaux supplémentaires.

Raffinement

Les animaux sont hébergés selon la réglementation en vigueur. Des mesures additionnelles sont mises en place pour limiter la douleur et le stress (suivi quotidien, enrichissement du milieu, limitation des manipulations, prévention de la perte de poids).

Choix des espèces

La souris est un modèle couramment utilisé pour l’étude des maladies de la rétine. Elle présente une organisation rétinienne comparable à celle de l’humain et permet l’utilisation d’outils génétiques adaptés à l’étude des mécanismes cellulaires et moléculaires. Les animaux sont utilisés à des stades compatibles avec l’étude du développement et de la réponse à la dégénérescence rétinienne.

Exposées chaque jour à une source de lumière bleue pendant six à douze heures sur une période de 28 jours, les mouvements restreints pour optimiser l'exposition, 900 souris et 900 rats subissent des procédures d'un niveau de souffrance modéré. S'y ajoutent jusqu'à six à huit instillations oculaires par jour, des administrations systémiques quotidiennes, des prélèvements sanguins hebdomadaires et des examens de la cornée sous sédation. Le porteur décrit les trois protocoles d'induction retenus comme "les moins contraignants pour les animaux", et annonce des picotements, des démangeaisons, des sensations de brûlure et de corps étranger dans les yeux. Sur les 1 800 rongeurs, 180 sortiront de l'étude après les examens d'inclusion et pourront être réutilisés dans d'autres procédures, les 1 620 autres étant tués pour les analyses histologiques.

Objectifs

L'objectif de ce projet est de développer des modèles expérimentaux de sécheresse oculaire chez le rat et la souris afin de tester l'efficacité de nouveaux traitements. Le syndrome de l'œil sec est une maladie multifactorielle affectant les larmes et la surface oculaire, plus fréquente chez les femmes et les personnes âgées, et touchant entre 5% et 35% de la population. Les manifestations cliniques sont variées et impactent considérablement la qualité de vie des patients. Les modèles de sécheresse oculaire chez les rongeurs sont bien documentés dans la littérature. Nous avons sélectionné trois modèles parmi les plus référencés, les plus efficaces en termes d'impact sur la surface oculaire et de réduction de la sécrétion de larmes, et les moins contraignants pour les animaux. Nous utilisons déjà ces modèles et souhaitons continuer à les proposer.

Bénéfices attendus

Le projet vise à développer des modèles expérimentaux performants permettant d’évaluer l’efficacité de nouveaux traitements. Dans un contexte où la recherche thérapeutique évolue constamment, il est essentiel de disposer d’outils fiables et adaptés pour tester ces innovations dans des conditions optimales. Ces travaux contribueront ainsi à améliorer la pertinence des résultats tout en veillant strictement au respect des principes de bien-être animal.

Procédures

Dans le cadre de ce projet, les animaux seront soumis à différents types d’interventions tout au long des 28 jours d’étude : 1. Exposition à la lumière bleue Afin d’induire et de favoriser l’apparition des signes de la maladie, les animaux seront exposés quotidiennement à une source de lumière bleue pendant une durée de 6 à 12 heures, sur une période maximale de 28 jours. 2. Examens Les animaux feront l’objet de plusieurs examens visant à suivre l’installation de la maladie, évaluer l’efficacité des traitements ainsi que leur état général et leur bien-être. La mesure de la production lacrymale et l’évaluation de l’intégrité du film lacrymal et de la surface oculaire sont des examens rapides, réalisés en quelques secondes, à raison de 1 à 2 fois par semaine. L’observation in vivo des couches cellulaires de la cornée constitue l’examen le plus long, sans dépasser 5 minutes, et sera réalisée une fois par semaine. L’évaluation des cellules à mucus, effectuée 1 à 2 fois sur les 28 jours, est également très rapide et ne dure que quelques secondes. 3. Administration des traitements Les traitements pourront être administrés par instillation oculaire chez des animaux vigiles, avec une fréquence variable pouvant atteindre plusieurs administrations quotidiennes (en moyenne 3, jusqu’à un maximum de 6 à 8 par jour). Les administrations systémiques (intraveineuse, intrapéritonéale, sous-cutanée ou orale) pourront être réalisées quotidiennement. L’ensemble des traitements sera administré pendant toute la durée de l’étude (maximum 28 jours) et chaque administration dure seulement quelques secondes. Certains examens ou administrations pourront nécessiter une sédation ou une anesthésie, qui resteront de courte durée et limitées afin de minimiser les effets secondaires. 4. Prélèvements sanguins Des prélèvements sanguins pourront être réalisés afin d’évaluer l’efficacité des traitements. Ces procédures sont rapides (quelques secondes) et leur fréquence sera limitée à une fois par semaine. 5. Suivi sanitaire et comportemental Un suivi quotidien de l’état sanitaire et du comportement des animaux sera assuré, complété par une pesée hebdomadaire. Les manipulations associées sont très brèves et les animaux seront immédiatement replacés dans leur environnement habituel.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues chez les animaux devraient principalement refléter celles observées dans la sécheresse oculaire chez l’homme, notamment des picotements, des démangeaisons, des sensations de brûlure, de sable ou de corps étranger dans les yeux. Ces manifestations sont liées à la composante inflammatoire de la pathologie. Le modèle expérimental inclura une exposition quotidienne répétée à la lumière bleue sur une période allant jusqu'à 28 jours, pouvant atteindre jusqu’à 12 heures par jour. Cette exposition, susceptible d’accentuer les signes d’inconfort oculaire en induisant ou en aggravant les altérations de la surface oculaire, notamment un dégagement de chaleur produit par les sources lumineuses, nécessitera de restreindre les mouvements de l'animal afin d'optimiser l'exposition Par ailleurs, les animaux seront soumis à un stress lié aux manipulations nécessaires à l’évaluation de la sécheresse oculaire. Ces manipulations incluent notamment le maintien de l’animal, l’instillation de solutions ou de colorants (fluorescéine, vert de lissamine), la réalisation du test de Schirmer pour mesurer la production lacrymale, l’évaluation du temps de rupture du film lacrymal (TBUT), ainsi que des examens cliniques répétés de la surface oculaire. Ces interventions, bien que brèves, peuvent engendrer un stress transitoire. L’administration des produits testés devrait entraîner, au maximum, une gêne locale de courte durée, potentiellement associée à une hyperémie conjonctivale, comme observé chez l’homme. De plus, l’administration sous-cutanée ou transdermique pourrait occasionner une légère réaction inflammatoire locale, se manifestant par une rougeur au point d’administration, sans conséquence majeure. Dans l’ensemble, ces nuisances sont attendues comme modérées et transitoires, et feront l’objet d’une surveillance attentive afin de garantir le respect du bien-être animal.

Devenir

A l'issue de la procédure, tous les animaux qui auront suivi la totalité de la procédure expérimentale : examens, induction de la pathologie et traitements, seront mis à mort pour permettre de réaliser les évaluations ex vivo (évaluations histologiques, dosage de produit...). Mais nous est estimons qu’une proportion de 10% animaux ne suivra pas la totalité de la procédure. Ces animaux seront potentiellement exclus de l’étude après les examens d'inclusion pratiqués en baseline qui servent à révéler un défaut anatomique ou physiologique. Ces animaux n'auront pas reçu d'induction de la pathologie, ni d'administration de traitement, seulement des examens qui ne sont pas invalidants mais qui potentiellement nécessitent une anesthésie. Ils pourront être réutilisés dans d’autres procédures expérimentales compatibles avec l’avis du vétérinaire

Remplacement

L'œil est un organe complexe, composé de plusieurs tissus anatomiquement et physiologiquement très différents. Il est soumis à d'importantes variations environnementales mécaniques et physicochimiques, ainsi qu'à des interactions biologiques significatives avec les tissus et organes voisins. À ce jour, bien que des méthodes alternatives telles que les tests in vitro (sur cellules ou tissus) et les simulations in silico existent, aucune ne permet de reproduire l'œil dans sa globalité fonctionnelle et environnementale. C'est pourquoi l'utilisation d'animaux vivants dans ces procédures expérimentales reste encore nécessaire pour atteindre les objectifs de ce projet.

Réduction

Le nombre maximum d'animaux prévu pour ce projet a été déterminé en fonction des distributions théoriques rencontrées dans les données bibliographiques et historiques de l'établissement, du nombre d'études estimées, et en tenant compte des variations du métabolisme, de la robustesse des mesures et de notre expérience. Ce nombre limité doit nous permettre de conclure sur l'efficacité ou non d'un traitement. L'effet d'un traitement sera évalué à chaque moment à l'aide de tests statistiques. Un calcul de l'effectif sera réalisé avant chaque étape afin d'ajuster et de revoir à la baisse, si possible, le nombre d'animaux à inclure dans les procédures. De plus, dès que les procédures expérimentales le permettront, des évaluations non invasives seront choisies tout au long du projet pour améliorer la condition animale et éviter la mise à mort inutile des animaux. De même, l'analyse des deux yeux sera privilégiée autant que possible afin de réduire le nombre d'animaux utilisés.

Raffinement

Un suivi quotidien des animaux sera réalisé afin de limiter autant que possible l’impact des procédures sur leur bien-être. Les rongeurs seront hébergés en groupe dans des cages équipées de nourriture et d’eau disponibles ad libitum, ainsi que d’éléments d’enrichissement à ronger. En fonction de leur comportement et des premiers résultats obtenus, cet enrichissement pourra être complété par des équipements supplémentaires, tels que des balançoires. Il pourra également être nécessaire de placer la nourriture à l’intérieur de la cage afin de ne pas réduire l’exposition à la lumière. Les examens non invasifs sélectionnés pour évaluer les signes cliniques de la maladie sont comparables à ceux réalisés chez l’homme en cabinet d’ophtalmologie ou chez l’animal en clinique vétérinaire. Les examens oculaires nécessitant l’immobilité de l’animal pourront être effectués sous anesthésie afin d’assurer son confort. Des points limites adaptés, précoces et suffisamment prédictifs seront définis afin de minimiser toute douleur. Ce projet a été soumis à un comité d’éthique pour évaluation et sera suivi par la structure en charge du bien-être animal de l’établissement.

Choix des espèces

Les espèces animales choisies ont une physiologie, une anatomie et un métabolisme largement décrits dans la littérature scientifique, facilitant ainsi l'extrapolation des effets sur l'œil à l'homme. De plus, les modèles expérimentaux de cette pathologie sont largement utilisés et bien documentés pour ces espèces, sur lesquelles le projet est basé. Pour ce projet, des souris et des rats ont été retenus afin de tenir compte des particularités anatomiques et physiologiques de chaque espèce, augmentant ainsi les chances de mener ce projet à terme. Les animaux utilisés seront de jeunes adultes à leur arrivée dans notre animalerie. Les rongeurs inclus dans ce projet auront entre 6 et 12 semaines conformément aux publications de référence qui servent de base aux modèles.

Injectées à l'âge de 15 jours avec du N-nitrosodiéthylamine pour déclencher un cancer du foie, puis pour une partie d'entre elles soumises à des injections de tétrachlorure de carbone deux fois par semaine pendant douze semaines, 72 souris subissent des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Les tumeurs se développent sur neuf à dix mois, avec une augmentation du volume du foie, une baisse d'activité et une perte de poids possibles, avant quatre semaines d'injections quotidiennes d'un inhibiteur de cyclophilines, puis la mise à mort et le prélèvement du sang et du foie. Sur le remplacement, le porteur affirme qu'aucune méthode ne peut se substituer à cette étude et qualifie d'"essentielle" l'utilisation de lignées de souris. Les retombées annoncées, de nouvelles pistes thérapeutiques contre le cancer du foie, restent au conditionnel et à terme, quand les neuf à dix mois de développement tumoral sont, eux, au programme.

Objectifs

L’objectif de ce projet est d’évaluer l’efficacité d’un nouveau traitement potentiel contre le cancer du foie le plus fréquent. Pour cela, nous utiliserons deux modèles de souris permettant de reproduire différentes situations observées chez les patients. Dans le premier modèle, le cancer du foie se développe progressivement après l’administration d’une substance qui provoque l’apparition de tumeurs au fil du temps. Les animaux développent des lésions au niveau du foie après plusieurs mois. Dans le second modèle, le cancer se développe dans un foie déjà fragilisé par des lésions chroniques (appelées fibrose), une situation fréquente chez les patients atteints de cancer du foie. Ce modèle permet donc de se rapprocher davantage des conditions réelles observées chez l’Homme. Dans les deux cas, le traitement étudié sera administré pendant les dernières semaines de l’expérience afin d’évaluer sa capacité à ralentir la croissance des tumeurs déjà formées, plutôt que d’empêcher leur apparition.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de déterminer si ce nouveau traitement peut ralentir la progression du cancer du foie dans deux situations différentes : un foie sain et un foie déjà endommagé. Les résultats obtenus permettront de mieux comprendre les mécanismes impliqués dans le développement du cancer du foie, notamment le rôle de certaines protéines appelées cyclophilines. À terme, ces travaux pourraient contribuer à l’identification de nouvelles pistes thérapeutiques et servir de base à de futurs développements visant à améliorer la prise en charge des patients atteints de cancer du foie.

Procédures

Les animaux seront soumis à une injection intrapéritonéale unique de N-nitrosodiéthylamine (DEN) à l’âge de 15 jours afin d’induire la carcinogenèse hépatique. Dans le modèle combiné, les animaux recevront également des injections intrapéritonéales répétées de tétrachlorure de carbone (CCl4) deux fois par semaine pendant 12 semaines à partir de l’âge de 8 semaines, afin d’induire une fibrose hépatique. Le traitement par inhibiteur de cyclophilines sera administré par injection intrapéritonéale quotidiennement pendant 4 semaines au cours de la phase tardive des protocoles expérimentaux. Chaque injection intrapéritonéale a une durée approximative de quelques secondes par animal. Les administrations répétées peuvent entraîner une contrainte légère et transitoire liée à la manipulation. Un prélèvement sanguin sera réalisé au moment de la mise à mort afin de permettre les analyses biologiques nécessaires à l’évaluation des effets du traitement.

Impact sur les animaux

L’administration de N-nitrosodiéthylamine (DEN) entraîne le développement progressif de tumeurs hépatiques. À un stade avancé (environ 9 à 10 mois après administration), les animaux peuvent présenter une augmentation du volume du foie (hépatomégalie) liée à la présence de tumeurs. Dans le modèle combiné, l’administration répétée de tétrachlorure de carbone (CCl4) induit une fibrose hépatique, pouvant s’accompagner d’une altération de l’état général des animaux (fatigue, perte de poids modérée). De manière générale, le développement tumoral et la fibrose hépatique peuvent entraîner une dégradation progressive de l’état de santé, incluant une diminution de l’activité et une perte de poids. L’administration de l’inhibiteur des cyclophilines n’est pas associée, à ce jour, à des effets indésirables connus aux doses utilisées.

Devenir

Les animaux seront mis à mort à la fin des procédures afin de faire un prélèvement de sang et du foie pour étudier les effets de l'inhibiteur de cyclophilines.

Remplacement

L'utilisation de modèles animaux est essentielle pour étudier les effets d'un inhibiteur de cyclophilines sur le développement tumoral. Nous avons recours à des animaux car il n’y a pas de méthodes alternatives. En effet, il n’existe aucun moyen de remplacer une telle étude dans laquelle la réponse physiopathologique est complexe et met en jeu plusieurs types cellulaires (hépatocytes, cellules inflammatoires, fibroblastes, …).

Réduction

Le nombre de souris nécessaire a été déterminé comme celui permettant de démontrer une différence statistiquement significative de 30 % de l'aire tumorale. Les résultats seront analysés grâce à un test statistique non paramétrique.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en présence de papier kraft et de carrés de coton pour faire leur nid, ainsi que des maisonnettes et des dômes en cellulose. Par ailleurs, un suivi des souris sera réalisé en observant leur comportement et les indices pouvant suggérer une douleur. Des points limites ont été définis. Si un animal atteint l'un de ces points limites, il sera mis à mort de manière anticipée afin de prévenir toute souffrance. Une anesthésie sera réalisé au moment de la mise à mort des animaux.

Choix des espèces

La souris est une espèce largement utilisée dans les modèles expérimentaux de cancer du foie. Les modèles murins d’induction du cancer du foie par le DEN, seul ou en combinaison avec le CCl4, sont bien caractérisés et largement décrits dans la littérature scientifique. Ces modèles permettent de reproduire des étapes clés du développement du cancer du foie observé chez l’Homme, notamment la progression tumorale ainsi que l’association fréquente avec des atteintes chroniques du foie telles que la fibrose. La souris présente par ailleurs des caractéristiques physiologiques compatibles avec l’étude des mécanismes impliqués dans la carcinogenèse hépatique et la réponse aux traitements pharmacologiques. L’utilisation de ce modèle permet également de disposer d’outils expérimentaux validés (marqueurs biologiques, analyses histologiques, données de référence), facilitant l’interprétation des résultats et leur comparaison avec les données existantes. Les animaux seront utilisés à des stades précoces de développement ainsi qu’à l’âge adulte, en fonction des différentes phases du protocole expérimental. Dans le modèle de carcinogenèse induit par le DEN seul, une injection unique de DEN sera réalisée chez des souris mâles âgées de 15 jours. Ce stade de développement est choisi car il correspond à une période de forte prolifération hépatocytaire, ce qui favorise l’intégration d’altérations génotoxiques dans les cellules du foie et permet l’initiation du processus tumoral conduisant au développement progressif du cancer du foie 9-10 mois après l’administration. Dans le modèle combiné associant le DEN et le CCl4, le DEN sera également administré à l’âge de 15 jours selon les mêmes modalités. À partir de l’âge de 8 semaines, les animaux recevront des injections répétées de CCl4 afin d’induire une fibrose hépatique progressive, reproduisant un contexte pathologique chronique proche des situations cliniques humaines associant fibrose et carcinogenèse. Dans les deux modèles, le traitement par inhibiteur des cyclophilines sera administré au cours de la phase tardive de la carcinogenèse (injection 5 fois/semaine pendant les 4 sernières semaines des protocoles), lorsque les tumeurs sont présentes et établies, afin d’évaluer son effet sur la progression tumorale plutôt que sur l’initiation.

2 880 souris vont être utilisées, chacune recevant une greffe de tumeur des voies biliaires puis jusqu'à quatre séances de traitement sous anesthésie, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Aux injections et aux quinze minutes d'anesthésie gazeuse s'ajoutent des prélèvements de sang pratiqués sur animal vigile, auxquels le porteur attache un stress et une douleur légère. Le principe consiste à chauffer la tumeur en excitant par laser ou par champ magnétique des nanoparticules injectées sur place, le volume tumoral étant suivi par échographie. Le bénéfice avancé, un traitement local qui réduirait les doses de chimiothérapie et pourrait s'étendre à d'autres cancers digestifs, reste au conditionnel, quand les 2 880 mises à mort, elles, sont programmées.

Objectifs

Les cancers des voies biliaires, en particulier le cholangiocarcinome (CCA), sont difficiles à traiter. Le développement de nanoparticules permet d’envisager des traitements anticancéreux mieux ciblés, plus efficaces et avec de moindres effets secondaires par rapport aux traitements systémiques conventionnels. Le projet a pour objectif d'évaluer l'efficacité d'une thérapie anticancéreuse localisée par nanoparticules en association ou non avec une thérapie par voie générale et une exposition à un rayonnement Laser ou un champ magnétique. L’évolution du volume tumorale sera suivie par échographie. L’imagerie permettra aussi de suivre la diffusion et l’élimination des nanoparticules utilisées. L’objectif final est d’identifier les nanomatériaux les plus efficaces avec les meilleures diffusions et sans effet indésirable à long terme.

Bénéfices attendus

Les cholangiocarcinomes (CCA) sont de très mauvais pronostiques et très agressifs. Les traitements sont limités, seule la résection chirurgicale est efficace mais seuls 20 à 30 % des patients sont éligibles, les autres recevront une chimiothérapie palliative. La recherche de traitements dit innovants dans un but de traiter localement la tumeur est nécessaire pour proposer de nouvelles options thérapeutiques pouvant être proposées seules ou en combinaison avec des thérapies systémiques déjà en place. Dans son ensemble, ce projet a pour objectif de tester dans des modèles expérimentaux murins, le traitement par nanohyperthermie dans des tumeurs de CCA. Les bénéfices attendus sont de démontrer un effet antitumoral de la nanohyperthermie dans des modèles bien décrits de CCA représentatifs de la maladie humaine. Si l’effet anti-antitumoral s’avérait efficace, ce projet pourrait permettre de développer un nouvel outil thérapeutique anti-cancéreux locorégional applicable en santé humaine, permettant de réduire à la fois les doses de chimiothérapies et les effets secondaires de ceux-ci dans le cas d'un traitement combinatoire. Au-delà du CCA, la nanohyperthermie pourrait être également utilisée pour traiter d’autres cancers digestifs (péritoine, tubes digestifs, foie, pancréas).

Procédures

- Injections durée 10-20 secondes/animal - Traitement sur souris anesthésiées 10 minutes/souris, répété 4 fois max. - Anesthésie gazeuse durée 15 min/souris - Prélèvements sanguins sur animal vigile, durée 5 min/souris.

Impact sur les animaux

-injections cutanées : stress et douleur légère de courte durée -anesthésie et chirurgie d'implantation de tumeurs : stress et douleurs modérée -Injections intratumorale et systémiques : stress et douleurs légères de courte durée - Prélèvement sanguin vigile : stress et douleur légères e de courte durée - Anesthésie Gazeuse : un stress légéer de courte durée.

Devenir

Les animaux impliqués dans ce projet seront mis à mort afin de réaliser les différents prélèvements nécessaires aux analyses ultérieures.

Remplacement

Il n'est actuellement pas possible de simuler le développement d'un cancer avec tous ses aspects dans un modèle in vitro. Neanmoins, nous développons également des modèles cellulaires in vitro en 3 dimensions afin de sélectionner les molécules, ce qui permetra de réduire le nombre d'animaux utilisés puisque l'effficacité de certaines molécules pourra être testée en amont. Cependant ces expériences menées sur ces modèles cellulaires ne sont pas suffisants et ne permettent pas de remplacer les animaux, notamment pour évaluer la réponse avec un système immunitaire ou pour évaluer les effets indésirables.

Réduction

Nous limitons au maximum le nombre d’animaux par groupe de façon à obtenir des résultats statistiquement fiables. Compte tenu des données existantes et des effets espérés, un test de puissance statistique a été utilisé pour déterminer le nombre minimum d’animaux nécessaire pour cette étude.

Raffinement

Dans la réalisation de ce projet, l’ensemble des procédures ont été mise au point afin de permettre une interprétation fiable dans le respect du bien-être animal, en limitant la douleur et le stress (anesthésie, analgésie, enrichissement). Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation, les animaux disposent de nourriture et d’eau ad libitum, le milieu est enrichi. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux en cours de procédure grâce à une surveillance attentive (points limites) et des soins adaptés (anesthésie, analgésie). Un analgésique sera utilisé en pré-opréatoire et en post-opératoire pour limiter la douleur et garantir un bien-être optimal des animaux. Un protecteur oculaire en gel sera aussi utilisé lors de l'anesthésie pour éviter tout assèchement des yeux. Pour le transport des animaux, celui-ci est effectué dans le respect du bien-être animal (mise à disposition d'eau sous forme de gel et de nourriture) et est réalisé par un transporteur agréé.

Choix des espèces

La souris est le modèle de référence des expériences et études en cancérologie car elle permet de représenter le comportement d'une tumeur se développant chez le patient (réponse immune, diffusion des traitements dans l'organisme). La possibilité de disposer d'animaux de fond génétique défini permet limiter les variabilités biologiques et de mieux identifier les effets des thérapies. Les animaux seront utilisés à l'âge de 5 à 8 semaines afin de disposer d’un organisme avec un processus de développement terminé. Les paramètres étudiés étant le développement de la masse tumorale après injection des cellules cancéreuses, une souris juvénile ou trop agées induirait un biais dans l'expérimentation.