Souris

75 souris immunodéficientes vont être utilisées, chacune subissant jusqu'à treize séances d'imagerie précédées d'une injection, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des cellules de cancer du sein humain triple négatif leur sont injectées directement dans le cœur, ce qui les dissémine dans tout le corps, avec des foyers attendus au foie, aux os et au cerveau, et une perte de poids une fois la maladie avancée. Toutes sont tuées à la fin pour analyse des tissus et des organes. Le porteur annonce qu'en cas de succès un brevet sera déposé et une étude clinique de phase I débutera, ce qui situe le bénéfice pour les patientes à plusieurs étapes de distance des métastases osseuses et cérébrales provoquées ici.

Objectifs

Le cancer du sein triple négatif est une forme particulièrement agressive de la maladie, qui représente environ 15 à 20 % des cas de cancer du sein, et de mauvais pronostic avec un risque élevé de rechute et de métastases au cours des trois premières années suivant le diagnostic. Contrairement à d'autres cancers du sein, ses cellules ne possèdent pas les trois récepteurs habituels (comme les récepteurs d'hormones) qui servent de "serrures" pour les traitements classiques. Faute de cible, les options thérapeutiques restent très limitées et il y a donc urgence à trouver de nouvelles armes sur mesure pour les patientes. Pour bloquer l'agressivité de ces tumeurs, le laboratoire a identifié une cible très précise : une protéine modifiée, qui agit comme un accélérateur de métastases. Il a ensuite développé un mini-anticorps capable de se fixer sur cette protéine pour la bloquer. Les premiers tests en laboratoire ( sur cellules in vitro) ont été un succès, le traitement empêchant efficacement les cellules cancéreuses de s'étendre. Pour vérifier si ce traitement fonctionne dans un organisme vivant, l'équipe souhaite tester son efficacité sur un modèle animal spécifique dont le système immunitaire est très affaibli permettant d'étudier précisément le développement de la maladie humaine et la réaction au traitement au plus près de la réalité clinique.

Bénéfices attendus

Si l'efficacité anti-métastatique du vecteur thérapeutique et sa spécificité pour sa cible est démontrée dans ce projet, un brevet sera déposé et une étude clinique de phase I débutera. A terme, cela ouvrira la voie vers une nouvelle stratégie thérapeutique ciblée anti-métastatique pour les patients ne bénéficiant actuellement d'aucune alternative de traitement et qui sont orphelins de traitement en cas de rechute par métastases à distance (90% des décès par cancers agressifs par métastases à distance).

Procédures

1- Injection de cellules tumorales : 1 injection, durée environ 10 min. 2- Suivi en imagerie : à J1 post greffe tumorale puis 2 fois/semaine pendant 6 semaines maximum soit 13 séances d'imagerie +injections/souris. Chaque séance dure environ 10 min/souris (injection, anesthésie et imagerie).

Impact sur les animaux

Compte-tenu du type cellulaire et de la voie d'administration, les cellules tumorales se répartissent de façon systémique chez l'animal. Des foyers pourront être localisés au niveau du foie, des os et du cerveau entre autres. Une perte de poids est donc attendue lorsque la maladie sera au stade avancé. Concernant les interventions, aucune douleur particulière n'est attendue puisque qu’elles seront réalisées sous anesthésie générale. Le stress potentiel subi par les animaux sera essentiellement consécutif aux administrations sur animal vigile avant l'anesthésie générale lors de la séance d'imagerie. Concernant les vecteurs, une étude antérieure a été conduite dans les mêmes conditions (greffes identiques en termes de voie d’injection et concentration cellulaire) avec une première construction du vecteur thérapeutique. Aucun animal n’a montré de signe clinique autre que ceux observés dans le cas du même modèle tumoral métastatique.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de la procédure pour analyse sur tissus et organes post-mortem.

Remplacement

Les modèles cellulaires alternatifs (cultures ou organoides) ne permettent pas d’appréhender le comportement tumoral dans toute sa complexité, en particulier, les interactions avec le microenvironnement, la dissémination métastatique, ou encore la réponse aux traitements impliquant souvent différents systèmes au sein de l’organisme. L’utilisation des modèles in vivo reste donc indispensable. Ce modèle animal va permettre d'étudier l’efficacité d’une nouvelle stratégie thérapeutique faisant actuellement défaut aux patients atteints de cancer du sein triple négatif.

Réduction

Le critère d'analyse de l'activité anti-tumorale du vecteur sera la variation de la radiance (intensité lumineuse) au cours du temps sur l’ensemble des métastases. Les animaux seront répartis en 5 groupes : les valeurs de radiance seront comparées entre les groupes par un test statistique. Dans le cadre d'une injection intracardiaque, la dispersion des données peut être importante car la prise de greffe et le développement des métastases dépendent fortement du passage systémique initial des cellules. Pour cette étude, le calcul de la taille de l'échantillon a été ajusté à la variabilité inhérente au modèle de métastases par injection intracardiaque. Une analyse de puissance a priori a permis de déterminer le nombre d'animaux nécessaire et suffisant.

Raffinement

Les souris sont greffées sous anesthésie générale. Les administrations seront réalisées en local par application cutanée d'anesthésiant. Tous les gestes seront réalisés par du personnel formé et habilité. Les animaux seront surveillés quotidiennement afin de détecter précocement l'apparition de signes cliniques. Compte-tenu du type de tumeurs, les animaux seront pesés au moins 2 fois par semaine afin de prévenir d'une détérioration de leur état général. Le suivi en imagerie permettra d'observer précocement le développement métastatique au cours du temps. Des points limite précis ont été définis et seront strictement respectés. Si des signes de douleurs sont détectés un analgésique sera administré. En cas de suspicion de mal-être, un enrichissement supplémentaire sera ajouté.

Choix des espèces

La souris est le modèle le plus utilisé en oncologie, notamment du fait de l'existence de souches immunodéficientes permettant le développement de tumeur d'origine humaine comme le modèle MDA-MB-231. La souris NOD-SCID est privilégiée de part son taux de prise de greffe (environ 80%). Les souris seront adultes (6-8 semaines).

Une partie des souris de ce projet appartient à une lignée dont la rétine dégénère d'elle-même, les autres reçoivent sur animal vigile une injection qui déclenche chimiquement cette dégénérescence. 192 souris sont utilisées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour éprouver chez elles le rôle d'une molécule inflammatoire, l'IL-1b, dans la réparation de la rétine. Elles subissent une injection dans l'œil sous anesthésie puis des injections répétées un à trois jours de suite sur animal vigile, le porteur annonçant une altération de la vision et une inflammation locale de l'œil. Toutes sont tuées pour que leurs rétines soient prélevées, les deux yeux de chaque souris étant utilisés, ce que le porteur compte comme une mesure de réduction.

Objectifs

La rétine, qui est une partie de l’œil essentielle à la vision, a une capacité très limitée à se réparer lorsqu’elle est endommagée, notamment dans les maladies dégénératives. Certaines cellules de la rétine, appelées cellules de Müller, possèdent toutefois un potentiel de réparation, qui peut être stimulé dans certaines conditions. Nous avons montré que des cellules impliquées dans l’inflammation (les microglies) jouent un rôle important dans l’activation de ce processus. Une molécule produite lors de l’inflammation, appelée IL-1b, semble particulièrement efficace pour stimuler cette activation dans des expériences réalisées in vitro. L’objectif de ce projet est de vérifier ce rôle dans un modèle chez la souris, en reproduisant une atteinte de la rétine et en étudiant l’effet de cette molécule sur les mécanismes de réparation. À terme, ce projet permettra de mieux comprendre les interactions entre inflammation et réparation dans la rétine.

Bénéfices attendus

À court terme, ce projet permettra de mieux comprendre le rôle d’une molécule impliquée dans l’inflammation dans les mécanismes de réparation de la rétine. À plus long terme, ces travaux pourraient contribuer à identifier de nouvelles approches pour favoriser la réparation de la rétine dans les maladies dégénératives, qui représentent un enjeu important de santé publique en raison de la perte de vision qu’elles entraînent.

Procédures

Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : • Injection (48 souris) pour déclencher chimiquement la dégénérescence de la rétine : réalisée sur animal vigile, durée inférieure à 30 secondes. • Injection (96 souris) pour l’anesthésie : réalisée sur animal vigile, durée inférieure à 30 secondes. • Injection (96 souris) : réalisée sous anesthésie générale, permettant l’administration dans l’œil de la molécule testée et d’un marqueur de prolifération, durée inférieure à 30 secondes • Injections répétées (96 souris) : réalisées sur animal vigile pour marquer les cellules en prolifération, réalisées une fois par jour pendant 1 à 3 jours, durée inférieure à 30 secondes. Les animaux sont ensuite mis à mort afin de prélever les rétines pour analyses.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus incluent : • un inconfort transitoire lié aux injections • une altération de la vision liée au modèle expérimental • une inflammation locale au niveau de l’œil après injection intraoculaire Ces effets font l’objet d’une surveillance quotidienne afin d’adapter rapidement la prise en charge si nécessaire.

Devenir

Les animaux doivent être mis à mort à l’issue des procédures expérimentales afin de permettre le prélèvement des rétines et l’analyse des cellules étudiées (microglies et cellules de Müller). Ces analyses nécessitent des tissus prélevés et ne peuvent pas être réalisées sur des animaux maintenus en vie. Il n’est donc pas possible de réutiliser ou de replacer les animaux.

Remplacement

La nécessité d’avoir recours à des animaux se justifie par le fait que la rétine est un tissu complexe composé de nombreux types de cellules dont les interactions sont cruciales et l’objet même de notre étude. Les modèles alternatifs existants ne permettent pas d’étudier ce type d’interactions cellulaires dans un contexte physiologique.

Réduction

Le nombre d’animaux a été déterminé à partir d’une estimation statistique permettant d’obtenir des résultats robustes avec un effectif minimal. Nous utiliserons systématiquement les deux yeux de l’animal ce qui permet de réduire le nombre d’animaux.

Raffinement

Les animaux sont hébergés en groupe selon la réglementation en vigueur. Des mesures sont mises en place pour limiter la douleur et le stress des animaux tout au long du protocole, incluant un suivi quotidien, un hébergement enrichi et la limitation des manipulations. Les procédures susceptibles de générer une gêne sont réalisées sous anesthésie adaptée, et des soins de confort (notamment oculaires) sont mis en place. Des critères d’arrêt précoces permettent de retirer rapidement tout animal présentant des signes de souffrance et d'administrer un traitement pour soulager ces souffrances.

Choix des espèces

La souris est un modèle couramment utilisé pour l’étude des maladies de la rétine. Elle présente une organisation rétinienne comparable à celle de l’humain et permet l’utilisation d’outils génétiques adaptés à l’étude des mécanismes cellulaires et moléculaires. Les animaux sont utilisés à des stades de développement adaptés à l’étude des mécanismes de dégénérescence et de régénération rétiniennes. Dans le modèle génétique, ce stade correspond à l’apparition de la dégénérescence rétinienne. Dans le modèle de dégénérescence induite chimiquement, il correspond à une maturité suffisante de la rétine pour permettre le déclenchement de la dégénérescence.

Douze semaines de régime riche en graisses pour les rendre obèses, douze prélèvements sanguins à la queue sur animal éveillé, sept séances de contention pour mesurer la composition corporelle, deux jeûnes de quatre heures suivis chacun de deux heures de mesures de glycémie. 240 souris sont utilisées ainsi, toutes tuées à l'issue par prélèvement sanguin sous anesthésie profonde sans réveil, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur qualifie chacune de ces atteintes de transitoire, gêne, inconfort, fatigue légère, et juge le rapport entre bénéfices et risques "favorable". Il écrit pourtant que les souris ne sont pas réutilisées car les interventions "ne permettent pas leur maintien dans des conditions compatibles avec leur bien-être".

Objectifs

Le diabète de type 2 et l’obésité sont des maladies fréquentes caractérisées par une mauvaise utilisation du glucose par l’organisme, appelée insulino-résistance. Cette situation est en partie liée à une accumulation anormale de lipides dans certains organes comme le muscle et le foie. L’objectif de ce projet est de mieux comprendre comment certaines modifications du métabolisme des lipides peuvent influencer la sensibilité à l’insuline et la régulation de la glycémie. Pour cela, le projet vise à étudier l’impact d’une intervention ciblée sur le métabolisme lipidique dans un modèle expérimental d’obésité. L’objectif est de déterminer si cette approche permet d’améliorer la réponse à l’insuline et de limiter les perturbations métaboliques associées à un excès de graisses alimentaires. À terme, ces travaux pourraient contribuer à identifier de nouvelles pistes pour prévenir ou améliorer les troubles métaboliques liés à l’obésité.

Bénéfices attendus

Au regard des connaissances actuelles, l’insulino-résistance constitue un enjeu majeur de santé publique, impliqué dans le développement du diabète de type 2 et de ses complications. À l’échelle mondiale, le diabète touche plus de 500 millions de personnes, et sa prévalence est en constante augmentation. Le coût socio-économique du diabète et de ses complications est considérable, représentant plusieurs centaines de milliards d’euros par an à l’échelle mondiale, en raison des dépenses de santé directes et des pertes de productivité. Ce projet vise à mieux comprendre comment des modifications du métabolisme lipidique contribuent à l’altération de la sensibilité à l’insuline et de la régulation de la glycémie dans un contexte d’obésité. Les résultats attendus permettront d’améliorer la compréhension des mécanismes moléculaires et cellulaires impliqués dans l’insulino-résistance, et pourraient contribuer à identifier de nouvelles cibles thérapeutiques potentielles. Les contraintes imposées aux animaux sont classées comme modérées et seront encadrées par des mesures de raffinement visant à limiter la douleur, le stress et l’inconfort. Elles apparaissent proportionnées aux objectifs scientifiques poursuivis. Ainsi, les bénéfices attendus en termes de production de connaissances et d’identification de nouvelles pistes pour la prévention ou le traitement des troubles métaboliques justifient le recours à ce modèle animal. Le rapport bénéfices/risques est donc considéré comme favorable.

Procédures

Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : Administration d’une préparation biologique expérimentale destinée à modifier l’expression d’une protéine impliquée dans le métabolisme lipidique. Cette administration sera réalisée une seule fois, sous anesthésie générale, par voie systémique. La durée de l’administration sera de quelques secondes. Mise en place d’un régime alimentaire spécifique pendant 12 semaines. Une partie des animaux recevra un régime standard, tandis que l’autre recevra un régime riche en graisses afin d’induire une obésité et des altérations métaboliques. Ces régimes seront donnés à volonté, avec un accès libre à l’eau. Mesure de la composition corporelle par une méthode non invasive. Les animaux seront placés brièvement dans un dispositif de contention adapté, sans anesthésie. Cette mesure sera réalisée une fois toutes les deux semaines pendant les 12 semaines de régime, ainsi qu’en fin d’étude, soit au maximum 7 fois par animal. Chaque mesure durera moins de 2 minutes. Prélèvements sanguins de faible volume pour le suivi métabolique. Ces prélèvements seront réalisés sur animaux éveillés, au niveau de la queue, une fois par semaine pendant les 12 semaines de régime, soit 12 fois par animal. Chaque prélèvement durera quelques secondes. Test de tolérance au glucose. Ce test sera réalisé une seule fois par animal, sur animal éveillé, après 12 semaines de régime. Il sera précédé d’une mise à jeun de 4 heures avec accès libre à l’eau. Il comprendra une administration orale de glucose et des mesures répétées de la glycémie pendant environ 2 heures. Test de sensibilité à l’insuline. Ce test sera réalisé une seule fois par animal, sur animal éveillé, à distance du test de tolérance au glucose. Il sera également précédé d’une mise à jeun de 4 heures avec accès libre à l’eau. Il comprendra une administration d’insuline et des mesures répétées de la glycémie pendant environ 2 heures. Prélèvement sanguin de fin d’étude. En fin de procédure, un prélèvement sanguin sera réalisé une seule fois, sous anesthésie générale profonde, sans réveil de l’animal, afin d’analyser certains paramètres biologiques circulants. Euthanasie. À la fin de la procédure, les animaux seront euthanasiés par une méthode réglementaire.

Impact sur les animaux

Les animaux pourront ressentir une sensation de faim transitoire lors des périodes de mise à jeun nécessaires aux tests métaboliques. Le régime riche en graisses entraînera une prise de poids progressive et des modifications du métabolisme pouvant altérer l’état physiologique des animaux. Les injections pourront provoquer une gêne ou un inconfort transitoire lié à la manipulation et à l’acte d’injection. Une irritation locale ou une infection au site d’injection est possible mais rare. Les anesthésies pourront entraîner un stress physiologique transitoire, notamment lors de l’induction et du réveil. Les prélèvements sanguins répétés de faible volume pourront provoquer une douleur légère et transitoire, un stress lié à la manipulation, un hématome, un saignement local ou, plus rarement, une infection au site de prélèvement. Une fatigue transitoire ou une déshydratation légère pourra également survenir en lien avec les mises à jeun et les prélèvements répétés. Les manipulations et la contention nécessaires aux différentes procédures, notamment lors de la mesure de la composition corporelle, pourront induire un stress transitoire.

Devenir

À l’issue de la procédure expérimentale, les animaux seront euthanasiés. L’euthanasie est nécessaire afin de permettre la réalisation de prélèvements de sang et de tissus, indispensables à l’analyse des paramètres biologiques étudiés. Ces analyses ne peuvent pas être réalisées chez un animal maintenu en vie et sont essentielles pour comprendre les mécanismes impliqués dans les altérations métaboliques étudiées. Les animaux ne sont pas réutilisés après la procédure, car les interventions réalisées ne permettent pas leur maintien dans des conditions compatibles avec leur bien-être ni leur inclusion dans d’autres protocoles expérimentaux. Ainsi, le recours à l’euthanasie est scientifiquement justifié par la nécessité d’obtenir des données fiables et complètes, tout en garantissant le respect du bien-être animal.

Remplacement

Ce projet vise à mieux comprendre comment certains déséquilibres du métabolisme des graisses peuvent perturber l’utilisation du glucose par l’organisme, un phénomène appelé insulino-résistance, impliqué dans le diabète de type 2. Des études préalables réalisées sur des cellules ont permis d’identifier certains mécanismes impliqués. Cependant, ces modèles ne permettent pas de reproduire le fonctionnement global de l’organisme, ni les interactions entre les différents organes, ni la régulation hormonale. Or, les paramètres étudiés dans ce projet, comme la capacité à réguler la glycémie ou à répondre à l’insuline, dépendent du fonctionnement coordonné de plusieurs organes et ne peuvent être évalués que chez un organisme entier. Ainsi, il n’existe pas de méthode alternative permettant de répondre à ces questions, ce qui justifie le recours à un modèle animal.

Réduction

Un total de 240 animaux sera utilisé dans ce projet. Ce nombre a été déterminé afin d’utiliser le minimum d’animaux nécessaire pour répondre à la question scientifique. La taille des groupes a été établie à l’aide d’un calcul permettant d’estimer le nombre d’animaux nécessaire pour obtenir des résultats fiables. Des tests statistiques seront ensuite utilisés afin d’interpréter correctement les résultats obtenus. Les animaux seront répartis en différents groupes expérimentaux incluant les mâles et les femelles, et l’étude sera réalisée sur plusieurs séries indépendantes afin de renforcer la fiabilité des résultats. Plusieurs mesures permettront de limiter le nombre total d’animaux utilisés : les mêmes animaux seront suivis au cours du temps, plusieurs tests non terminaux seront réalisés sur les mêmes individus, et les prélèvements biologiques permettront plusieurs analyses. Lorsque cela sera possible, les échantillons seront conservés pour des analyses complémentaires. L’ensemble de ces dispositions permet de limiter le nombre d’animaux au minimum nécessaire pour atteindre les objectifs scientifiques du projet.

Raffinement

Les conditions d’hébergement seront conformes à la réglementation. Les animaux proviendront d’un fournisseur extérieur agréé et bénéficieront, à leur arrivée à l’animalerie, d’une période d’acclimatation réglementaire minimale de 7 jours avant toute procédure expérimentale. Les animaux seront hébergés avec leurs congénères, l’hébergement individuel étant limité au maximum, en portoirs ventilés avec un système d’abreuvement automatique et un accès ad libitum à la nourriture et à l’eau. Le milieu sera enrichi avec au minimum deux enrichissements adaptés, et les animaux seront vérifiés quotidiennement. Le projet a été mis au point afin de permettre une interprétation fiable des résultats dans le respect du bien-être animal. Raffinements spécifiques au projet : une habituation préalable des animaux aux manipulations sera mise en place afin de réduire le stress lors des procédures expérimentales ; la durée de mise à jeun sera limitée au strict minimum, soit 4 heures, avec accès libre à l’eau, afin de réduire l’inconfort ; les manipulations, administrations de substances et prélèvements seront réalisés par du personnel expérimenté, avec une durée de contention limitée ; les animaux bénéficieront de périodes de récupération sans manipulation entre les différents tests ; lors des anesthésies, un gel ophtalmique sera appliqué pour prévenir le dessèchement oculaire ; les animaux seront maintenus sur un tapis chauffant pendant les procédures sous anesthésie afin de préserver leur température corporelle ; une alimentation facilitée, avec des croquettes déposées au sol, sera mise en place après intervention si nécessaire pour favoriser la reprise alimentaire ; une surveillance clinique quotidienne permettra de détecter précocement tout signe d’altération de l’état général ; des critères d’arrêt humanitaires précoces seront définis afin d’éviter toute souffrance prolongée. Ainsi, la douleur et le stress seront limités par des soins adaptés, une surveillance attentive et des points limites suffisamment prédictifs et précoces.

Choix des espèces

Le modèle murin a été choisi car il permet d’étudier, dans un organisme entier, les perturbations de la régulation du glucose observées dans l’obésité et l’insulino-résistance. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte, lorsque leur métabolisme est stabilisé, afin d’éviter les variations liées à la croissance ou au vieillissement. Les expériences seront réalisées chez des souris mâles et femelles, car les réponses métaboliques peuvent différer selon le sexe ; cela permet d’obtenir des résultats plus robustes et plus représentatifs.

Toutes tuées à l'issue pour "récupération et valorisation des tissus", 2 181 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules de cancer de l'ovaire humain chimiorésistant, sont transportées entre deux établissements, puis reçoivent des radioligands couplés à un isotope avant 45 minutes d'imagerie TEP sous anesthésie et des prélèvements de sang à la veine saphène. Le porteur attend de cette irradiation ciblée qu'elle abîme l'ADN des cellules tumorales, signale que l'accumulation des radiotraceurs dans certains organes peut provoquer une irradiation localisée des tissus sains, et annonce une observation quotidienne du comportement, rupture du lien social et prostration, sans décrire de test comportemental. Sur le remplacement, il écrit qu'aucune puce microfluidique ni aucun organoïde ne restitue la distribution d'un composé dans un "organisme entier", et conclut à la "nécessité" de recourir à la souris.

Objectifs

Dans le domaine de la médecine nucléaire, la thérapie par radioligand (TRL) représente une avancée majeure pour le traitement des cancers. Cette approche théranostique repose sur l’utilisation d’agents biologiques, tels que des peptides ou des anticorps, ciblant spécifiquement des protéines exprimées à la surface des cellules tumorales, couplés soit à un radioisotope d’imagerie pour le diagnostic, soit à un radioisotope thérapeutique. Cependant, aucun agent théranostique n’existe encore pour des cancers agressifs tels que le cancer de l’ovaire séreux de haut grade dont le sombre pronostic est généralement associé à des résistances à la chimiothérapie. Ce projet multisite se déroulera sur deux établissemnents utilisateurs et vise à évaluer l’efficacité de nouveaux radioligands, développés pour cibler de façon spécifique différentes protéines membranaires surexprimées à la surface des cellules tumorales ovariennes. À ce jour, quatre cibles dont les ligands naturels sont déjà bien caractérisés ont été identifiées. Le premier objectif de ce projet consistera à évaluer la biodistribution de différentes molécules dirigées contre ces quatre cibles d’intérêt, après couplage à un radioisotope d’imagerie, afin de vérifier leur spécificité. Le second objectif sera d’étudier l’efficacité thérapeutique de ces molécules en les couplant avec un radioisotope thérapeutique émettant des rayonnements ionisants afin de créer des dommages à l’ADN des cellules tumorales ciblées et de provoquer leur mort. Des souris porteuses de tumeur sous-cutanées ovariennes humaines (chimiorésistantes) seront ainsi utilisées soit pour réaliser des imageries par Tomographie à Emission de Positron (TEP) après injection d’un radioligand couplé à un radioisotope d’imagerie ; soit pour étudier le suivi de la croissance tumorale après injection d’un radioligand couplé à un radioisotope thérapeutique. Cette étude a pour but d’évaluer la spécificité et l’efficacité thérapeutique de radioligands ciblant des protéines surexprimées dans les cancers de l’ovaire. Cela permettra de sélectionner les candidats les plus prometteurs qui pourraient avoir un intérêt dans le traitement de ces cancers.

Bénéfices attendus

Ces travaux permettront de déterminer la faisabilité d’une approche théranostique, chez les patientes atteintes de cancer de l’ovaire, en fournissant de précieuses informations sur la distribution des radioligands au sein de l’organisme, son excrétion et stabilité dans le sang, connaissances indispensables pour le choix des radioligands possédant la meilleure efficacité thérapeutique, tout en minimisant les effets sur les tissus sains. Ainsi, cela permettrait d’envisager de nouvelles méthodes de prise en charge des patientes atteintes de cancer de l’ovaire grâce à la théranostique, dans l’espoir d’augmenter leurs perspectives de survie et d’améliorer leur qualité de vie pendant et après le traitement, par la diminution des effets secondaires. De plus, les 4 récepteurs d'intérets étant également surexprimés dans d’autres types de cancers, cela pourrait étendre les bénéfices de ces composés innovants à d’autres patients.

Procédures

Injection de cellules tumorale (5minutes sous anesthésie gazeuse). Transfert entre les deux sites : moins de 3 km (environ 10 minutes). Injection de radiotraceurs (2 minutes) sous anesthésie gazeuse suivi d'imagerie TEP sous anesthésie gazeuse : environ 45 minutes. Prélèvements sanguin (veine saphène) sous contention : 1 minute.

Impact sur les animaux

Une inspection détaillée et quotidienne dans les périodes critiques, i.e. après implantation et après traitement, de chaque animal est effectuée afin d’observer le comportement et les symptômes cliniques de l’animal : rupture du lien social, prostration, grimace scale. De plus, de l’aliment gélifié leur sera proposé. Les animaux ressentiront de l’inconfort, voire de la douleur, en raison de la nécessité de procéder à des injections de cellules tumorales ou de radiotraceurs : - Stress de la préhension des souris pour les implantations des tumeurs : environs 2 min - Inconfort associé au développement tumoral : légère gène au niveau moteur : environ 2 semaines - Au moment du transfert des animaux : environ 3 jours - Injections des radiotraceurs sous anesthésie : pas de stress en dehors de la préhension pour sédation - Imagerie TEP : pas de stress ni douleur prévue, car non invasif et réalisé sous anesthésie Les signes de toxicité possibles sont principalement liés à l’accumulation des radiotraceurs dans certains organes qui peut entrainer une irradiation localisée. Ces toxicités seront évaluées via les études de bio distribution (et comptage gamma après prélèvements d’organes). Nous serons tout de même attentifs aux pertes d’appétit, de diarrhée et de perte de poids.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour récupération et valorisation des tissus.

Remplacement

Bien que de nombreux modèles in vitro, de plus en plus poussés, existent et qu’il s’agisse d’un champ de la biologie en essor, il n’est à l’heure actuelle pas possible de remplacer un organisme vivant par une puce microfluidique ou un organoïde. En effet, dans le cadre de l’étude présentée ici, il est nécessaire d’évaluer des paramètres tels que la distribution au sein d’un organisme entier ainsi que l’excrétion des radioligands. Tout ceci nécessite des systèmes circulatoires et excrétoires, dont toute la complexité ne saurait encore être retranscrite artificiellement. C’est pourquoi il est nécessaire d’avoir recours à un modèle murin. Les étapes de recherche de récepteurs cibles ont été menées in silico. Par ailleurs, les étapes de validation des cibles ainsi qu’une première sélection des ligands présentant les meilleures caractéristiques (liaison spécifique au récepteur cible et capacité d’internalisation) ont été réalisées in vitro, sur des lignées cellulaires de cancer ovarien. Cela permet ainsi de réduire l’utilisation d’animaux et leur utilisation n’arrive qu’à la fin d’un processus réfléchi et optimisé, de sorte à en minimiser l’usage.

Réduction

Les différents tests in vitro permettent de sélectionner uniquement les composés ayant montré les meilleures caractéristiques pharmacologiques avant l’utilisation d’animaux. La quantité d’animaux utilisée a été réduite au minimum nécessaire, en limitant la quantité de ligands testés grâce à une analyse « en entonnoir ». Ainsi, le nombre d’animaux annoncé est un nombre maximum est pourra être réduit si un des radioligands testés répond à tous les paramètres étudiés. De plus, le nombre d’animaux utilisés par groupe a été défini comme le nombre minimum nécessaire pour être en mesure de mettre en évidence une différence statistiquement significative sur les paramètres étudiés.

Raffinement

Concernant l'hébergement, les cages sont insérées dans un portoir ventilé, permettant le maintien d’un statut sanitaire exempt d’organismes opportunistes et pathogènes et d’éviter l’apparition d’infections. Pour chaque procédure chirurgicale, les souris sont maintenues sur des tapis chauffants et leurs yeux lubrifiés afin d’éviter toute sècheresse ou irritation oculaire. Les conditions d’anesthésie sont réalisées pour une meilleure prise en compte de la douleur. Afin de diminuer l'effort en convalescence, de l'aliment gélifié est placé dans les cages après chaque anesthésie (il aura été présenté en amont aux souris pour les habituer et passer l’étape de néophobie alimentaire). En fin de protocole, les souris seront placées dans une salle isolée du reste des souris pour la mise à mort et les manipulations post-euthanasies seront également réalisées dans une autre pièce. Les animaux seront transportés entre les deux établissements (3 km) suivant une procédure de transport déclarée lors de l’agrément de l’établissement (cheminement et conditions de transport validés par signature d’une charte de transport). Tout au long du déroulement des expériences, une observation quotidienne de l’état clinique des souris utilisées sera assurée. Les greffes sont réalisées sous anesthésie gazeuse afin de réduire à son strict minimum le stress et la souffrance de l’animal. Les antalgiques ou anti-inflammatoires non stéroïdiens sont prévus et pourront être utilisés si nécessaire. Les tumeurs seront mesurées 2 fois par semaine afin de suivre leur progression et/ou l'apparition de zones de nécrose. Des points limites suffisamment prédictifs et spécifiques au projet seront appliqués.

Choix des espèces

La souris demeure un modèle de choix pour les études précliniques en oncologie : les souches sont parfaitement décrites et la parenté biologique des souris avec l’Homme permet d’obtenir des informations extrapolables à la pratique clinique humaine. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte, soit entre deux et six mois. Les expériences sur adultes permettent de garantir une bonne reproductibilité et donc une réduction du nombre d’animaux à utiliser.

Tirées du surplus de l'élevage de l'établissement, où elles étaient de toute façon promises à la mort, 370 souris vont servir de support de formation, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les stagiaires s'exercent sur elles vigiles à la contention, au sexage, à l'administration de substances et au prélèvement sanguin, puis, pour le volet chirurgical, pratiquent sur des femelles adultes une ovariectomie sous anesthésie générale pouvant durer 45 minutes. Le porteur reconnaît que la maîtrise technique des participants peut être imparfaite et provoquer un stress ou une douleur supérieurs à ceux d'un geste fait par du personnel expérimenté, et qu'une hémostase insuffisante peut entraîner une hémorragie. Sur le remplacement, il décrit un apprentissage initial sur planches, supports pédagogiques et mannequins, puis affirme que certaines compétences ne s'acquièrent pas sans "recours à l'animal vivant".

Objectifs

Ce projet vise à former des personnels amenés à réaliser des procédures expérimentales et des interventions chirurgicales sur des animaux dans le cadre de la recherche scientifique. Ces formations sont obligatoires et permettent d’acquérir les connaissances et compétences nécessaires pour travailler dans le respect de la réglementation et du bien-être animal. La formation « applicateur » permet aux participants de se familiariser avec les gestes techniques de base réalisés sur animaux vigiles, tels que la manipulation, la contention, le sexage, le prélèvement sanguin et l’administration de substances. La formation « chirurgie » a pour objectif d’enseigner les bases des interventions chirurgicales sur animaux, en intégrant les bonnes pratiques visant à limiter la douleur, le stress et le nombre d’animaux utilisés. Ces formations contribuent à améliorer la qualité des pratiques expérimentales, à réduire les erreurs et à garantir le respect des principes des 3R (Remplacement, Réduction, Raffinement).

Bénéfices attendus

Chaque participant bénéficiera d’une formation pratique intégrant le respect du bien-être animal et des principes des 3R. À court terme, cette formation permet l’acquisition et la maîtrise des gestes techniques et chirurgicaux. À moyen terme, elle contribue à améliorer la qualité des pratiques expérimentales et chirurgicaux et à obtenir des résultats scientifiques plus fiables et reproductibles. Elle permet également de limiter le stress et la souffrance des animaux, ainsi que le nombre d’animaux utilisés.

Procédures

Dans le cadre de la formation, certains gestes sont réalisés sur animaux vigiles, ce qui peut entraîner un stress ainsi qu’une douleur légère et de courte durée. Cela concerne notamment la manipulation, la contention, l’administration de substances et les prélèvements sanguins. Chaque animal fait l’objet au maximum d’une administration et d’un prélèvement sanguin, ces gestes étant de courte durée (quelques secondes chacun). Dans le cadre de la formation chirurgicale, les animaux reçoivent une injection d’analgésique (durée de quelques secondes) puis subissent une intervention réalisée sous anesthésie générale, d’une durée maximale de 45 minutes. Chaque animal ne subit qu’une seule intervention chirurgicale.

Impact sur les animaux

Dans le cadre de la formation, les gestes sont réalisés par des participants en cours d’apprentissage. La maîtrise technique pouvant être imparfaite, cela peut entraîner, de manière ponctuelle, un niveau de stress ou de douleur légèrement supérieur à celui observé lors de gestes réalisés par du personnel expérimenté. Dans le cadre de la formation chirurgicale, un risque d’hémorragie peut survenir en cas d’hémostase insuffisante, bien que ce risque soit limité par l’encadrement et les mesures mises en place.

Devenir

À l’issue de chaque procédure, les animaux sont mis à mort, leur réutilisation n’étant pas possible dans les autres projets autorisés de l’établissement utilisateur.

Remplacement

Des méthodes alternatives sont utilisées autant que possible afin de limiter le recours aux animaux. Ainsi, certains enseignements, comme l’anatomie, l’identification ou la contention, sont réalisés à l’aide de supports inertes (planches, modèles 3D, supports pédagogiques ou mannequins). L’apprentissage initial des gestes chirurgicaux peut également débuter sur des modèles non vivants. Cependant, dans l’état actuel des connaissances, certaines compétences ne peuvent pas être acquises sans recours à l’animal vivant. En particulier, l’apprentissage des gestes techniques en conditions réelles nécessite de prendre en compte les réactions de l’animal ainsi que le suivi de paramètres essentiels comme l’anesthésie, l’asepsie et les fonctions vitales.

Réduction

Le nombre totale d’animaux est calculé strictement en fonction du nombre de personnes à former. Les animaux utilisés proviennent, dans la mesure du possible, d’animaux de surplus issus de l’établissement, initialement destinés à être mis à mort. Le recours à des animaux provenant de fournisseurs agréés reste exceptionnel et uniquement lorsque les animaux nécessaires ne sont pas disponibles. Les animaux utilisés n’ont pas subi de procédure expérimentale préalablement à ce projet. Le nombre de gestes réalisés sur chaque animal est strictement limité. Dans le cadre de la formation aux procédures expérimentales, chaque animal ne subit qu’un nombre restreint de manipulations, ce qui permet de limiter leur impact. Dans le cadre de la formation chirurgicale, un entraînement préalable sur des modèles non vivants est réalisé afin de réduire le recours aux animaux. Chaque animal ne subit qu’une seule intervention chirurgicale.

Raffinement

Des mesures sont mises en place afin de limiter au maximum le stress, la douleur et la souffrance des animaux. Dans le cadre des travaux pratiques, les animaux sont manipulés avec précaution afin de réduire leur stress. Les participants sont encadrés et formés à reconnaître les signes de stress ou de douleur, et les gestes ne sont réalisés sur un animal vivant qu’une fois les techniques maîtrisées. Le nombre de manipulations par animal est limité. Pour les interventions chirurgicales, les animaux sont hébergés en groupe dans un environnement enrichi et ne sont manipulés qu’au moment nécessaire afin de limiter le stress. Une analgésie est administrée avant la procédure et l’intervention est réalisée sous anesthésie générale, afin de supprimer la douleur. Des points de surveillance permettent de détecter rapidement tout signe de souffrance et d’adapter la prise en charge si nécessaire. Après l’intervention, les animaux sont surveillés attentivement pendant la phase de réveil. Le nombre de participants par formateur durant une session de travaux pratiques est limité afin d’assurer un encadrement optimal et une surveillance rapprochée, permettant de détecter précocement tout signe de stress ou de souffrance des animaux et de garantir la bonne réalisation des gestes techniques.

Choix des espèces

Le choix de l’espèce s’est porté sur la souris, en cohérence avec les activités de l’établissement, spécialisé dans l’utilisation de ce modèle. Dans ce contexte, les formations sont spécifiquement orientées vers l’utilisation de la souris. Dans le cadre de la formation « applicateur », des souris mâles et femelles, âgées de 8 semaines et plus, sont utilisées. Ce choix permet de couvrir les différentes situations rencontrées en expérimentation animale et de former les participants à la manipulation de ces deux sexes. La formation « chirurgie » a pour objectif de dispenser les concepts fondamentaux de la chirurgie expérimentale (asepsie, anesthésie, analgésie, respect des structures anatomiques, choix du matériel, principes de suture, suivi des animaux). Bien que ces notions soient applicables à l’ensemble des mammifères utilisés à des fins scientifiques, les travaux pratiques sont réalisés exclusivement sur souris, espèce majoritairement utilisée en recherche biomédicale et adaptée aux activités de l’établissement. Seules des femelles adultes sont utilisées, la procédure enseignée étant une ovariectomie.

Les souris employées ici portent une mutation qui permet de tuer sélectivement leurs propres cellules du foie par injection, et un système immunitaire délibérément détruit, deux conditions qui rendent possible la greffe d'hépatocytes humains. 8 800 d'entre elles vont être utilisées sur cinq ans, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent jusqu'à huit injections du composé qui tue leurs hépatocytes, une greffe de cellules par la veine porte, jusqu'à deux puçages sous anesthésie et des prélèvements sanguins répétés, le porteur signalant un risque hémorragique accru, une anémie possible et une gêne du transit intestinal. L'effectif ne repose sur aucun calcul statistique, le porteur l'établissant d'après les études des années antérieures et "en accord avec le plan commercial". 8 600 souris sont tuées, 200 réutilisées dans d'autres projets, dont une formation interne aux gestes techniques sur souris.

Objectifs

L’objectif de ce projet est de caractériser la toxicité et l'efficacité de candidats médicaments visant par exemple à guérir les infections virales (e.g. hépatites), le cancer du foie ou des maladies métaboliques telles que la MASH (Metabolic dysfunction-Associated Steato Hepatitis), ou encore de traitements indiqués en cas d’insuffisance hépatique. Pour ce faire nous utiliserons des souris au foie humanisé permettant de recréer un foie présentant les caractéristiques tissulaires et fonctionnelles du foie humain. Le protocole consiste à remplacer les cellules hépatiques de souris par des cellules hépatiques humaines (greffe d’hépatocytes). Dans certains cas, l’humanisation du système immunitaire, en complément d’un foie humanisé, est essentielle pour étudier des processus physiopathologiques complexes, notamment dans le cadre de maladies métaboliques (par exemple, la MASH) ou d’infections virales (comme la dengue). Pour répondre de manière optimale aux objectifs scientifiques et aux questions posées, une double humanisation des souris, incluant à la fois le foie et le système immunitaire, pourra être mise en œuvre. Les cellules hépatiques humaines, et le cas échéant les cellules immunitaires humanisées, pourront ensuite être utilisées pour des études ciblées, comme l’infection par des virus humains spécifiques. Ce modèle permettra de reproduire fidèlement le métabolisme du foie humain dans une espèce facilement manipulable, bien caractérisée sur le plan génétique. Une souche de souris au foie non humanisé sera utilisée. Elle présenten une mutation génétique permettant d’induire la mort sélective des hépatocytes murins par injection. Cela permet non seulement de greffer des hépatocytes humains en vue d’humaniser le foie, mais également d’évaluer des solutions thérapeutiques indiquées dans le cas d’insuffisance hépatique. Par ailleurs, étant fortement immunodéprimée, elle est également permissive, après myéloablation, à la greffe des cellules souches hématopoïétiques ou cellules immunitaires humaines.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à recréer, chez la souris, un foie présentant les caractéristiques tissulaires et fonctionnelles du foie humain. Lorsque nécessaire, il sera également possible d’humaniser simultanément les compartiments hépatique et immunitaire. Cette double humanisation constitue un avantage majeur, car elle permet de modéliser de manière plus fidèle les interactions complexes entre le foie et le système immunitaire humain, en particulier dans le cadre de maladies métaboliques ou infectieuses. Par ailleurs, les cellules hépatiques humaines pourront être infectées par des virus spécifiques à l’humain, et le métabolisme du foie humain pourra être reproduit dans une espèce facilement manipulable, mieux caractérisée sur le plan génétique, et plus acceptable sur le plan éthique que l’utilisation de primates non-humains. Les propriétés génétiques de la souche immunodéficiente utilisée offrent également des opportunités pour explorer les mécanismes d’insuffisance hépatique et développer des thérapies adaptées à cette pathologie. Enfin, l’intégration d’un système immunitaire humanisé renforcera la pertinence des modèles expérimentaux en permettant d’étudier les réponses immunitaires humaines dans des contextes complexes, tels que les traitements antiviraux ou les pathologies impliquant des mécanismes immunitaires.

Procédures

En fonction des besoins expérimentaux, les souris pourront recevoir, sous anesthésie générale, une puce classique et/ou une puce permettant la mesure de la température corporelle. En cas de perte ou de non-fonctionnement de leur puce électronique, elles pourront recevoir une nouvelle puce avec au maximum deux puçages pendant leur durée de vie. Des prélèvements sanguins seront réalisés avec ou sans anesthésies. Les volumes maximaux de prélèvements seront proportionnels au poids et à l’âge de l’animal selon un schéma établi et une limite fixée sur une période glissante de 14 jours. Une réhydratation avec du sérum physiologique sera réalisée si nécessaire. La répartition des prélèvements figurera dans le protocole de l’étude et sera contrôlé par un vétérinaire. Chaque prélèvement durera quelques secondes. Pour les analyses nécessitant un volume plus important, un prélèvement terminal sous anesthésie gazeuse sera réalisé. Un maximum de 8 injection(s) de composé(s) induisant la mort des hépatocytes et des cellules souches et permettant au moment de la greffe de réduire la présence des macrophages murins présent dans le foie et empêchant les hépatocytes humains de s’implanter. Chaque injection dure entre 10 et 15 secondes. Injection d’analgésique : moins d’une minute. Greffe des cellules ou implants thérapeutiques : entre 5 et 30 minutes. À l’issue des études, les animaux non intégrés aux essais précliniques seront euthanasiés selon les méthodes réglementaires. Toutes les interventions seront réalisées sous un suivi clinique rigoureux afin de minimiser douleur et stress des animaux.

Impact sur les animaux

Des nuisances peuvent être induites par : -identification par puce électronique classique ou thermopuce : stress, gêne, douleur dans les heures suivants l’injection. -injections : douleur abdominale transitoire, et pour l’agent myéloablatif effets hématologiques possibles -actes chirurgicaux : douleur, risque hémorragique, risque anesthésique, défaut de cicatrisation -traitements et prélèvements sanguins : douleur, hématome ou lésion au point d’injection, anémie en cas de prélèvements répétés -injection d’hépatocytes via la veine porte : gêne au niveau du transit intestinal liée au déplacement des viscères dans les heures suivant, risque hémorragique accru -imagerie sous anesthésie : hypothermie, déshydratation, sécheresse oculaire (gel ophtalmique en prévention).

Devenir

Dans le cadre d’une utilisation continue, les animaux issus de ce projet et ayant subit une humanisation pourront être utilisés dans d’autres projets autorisés par le Ministère dans l’établissement utilisateur. Des souris pourront être utilisées dans le projet « Formation interne aux procédures et gestes techniques appliqués aux souris », sous réserve d’un avis vétérinaire favorable. Sinon, les animaux sont euthanasiés car ils ne recouvreront pas leur état de santé et de bien-être général. Dans le cadre d’une réutilisation et afin d’affiner le protocole, les animaux issus des procédures « Humanisation du foie des souris via injection splénique d’hépatocytes » et « Humanisation du foie des souris via injection d’hépatocytes dans la veine porte » pourront être utilisés dans la procédure « Mise au point d’un modèle de double humanisation : foie + système immunitaire » de ce même projet.

Remplacement

Il n'existe à ce jour, aucune alternative performante capable de prédire l'activité/toxicité d'un candidat médicament agissant sur le foie, qui présente une architecture et un fonctionnement complexes qui ne peuvent être reproduits in vitro ou chez d'autres animaux (zébrafish, drosophiles, ...). La souris au foie humanisée constitue un modèle scientifiquement valide et pertinent pour le développement et la mise au point de traitements innovants visant à lutter contre les pathologies hépatiques, telles que les maladies virales ou métaboliques, les insuffisances hépatiques et le cancer chez l’humain.

Réduction

Un total de 8800 souris sera utilisé, couvrant une période de 5 ans. 78 études précliniques de 50 souris seront réalisées, sachant que le processus d’humanisation n’est efficient qu’à environ 50%, soit 7800 souris. 1000 souris supplémentaires seront utilisées dans le cadre de l’implantation d’un patch contenant des hépatocytes humaines, permettant de réaliser pour chacune des 4 étapes de cette procédure, 5 études précliniques de 50 souris. L’humanisation du foie des souris via injection d’hépatocytes dans la veine porte est une mesure de réduction par l’amélioration attendue de la réussite de la greffe (autour de 50% pour l’injection splénique d’hépatocytes) et donc l’utilisation de moins d’animaux. Aucune approche statistique n'a été réalisée, l’estimation du nombre d’animaux est réalisée sur base du nombre d’études effectuées les années antérieures et anticipant une croissance chaque année, en accord avec le plan commercial. Le nombre d’animaux utilisés dans chaque étude sera réduit au maximum.

Raffinement

En début d'étude et tout en respectant la réglementation en vigueur, les souris seront hébergées préférentiellement par groupes sociaux stables composés de 5 individus. La nourriture et l’eau de boisson seront fournies ad libitum sauf si le protocole d’étude nécessite un jeûne de nourriture. La durée de ce jeûne ne pourra dépasser 12 heures par semaine avec un maximum de 6h consécutives. L’eau ne sera jamais retirée des cages. Des compléments alimentaires pourront être administrés suivant l’état de santé des animaux. La cage contiendra à minima une couche de litière permettant aux souris de creuser, de se cacher et de réaliser un nid, élément essentiel à leur bien-être. En outre, des enrichissements de qualité seront fournis dans chacune des cages : par exemple morceaux de bois, tunnel en carton, kraft et/ou boules de cotons. À leur entrée dans l’animalerie, les souris bénéficieront d’une période d’acclimatation de minimum 4 jours. Lors d’un changement de zone au sein de l’animalerie, les souris bénéficieront d’une période d’acclimatation d’une nuit au minimum. Pour gérer la douleur, la souffrance et l’angoisse, nous évaluerons l’état de santé par une échelle de scores appliquée dès que nécessaire (par exemple en cas d’altération de l’état général d’une souris notée lors de l’observation quotidienne). Le vétérinaire aura pleine autorité pour euthanasier un animal pour raison éthique ou mettre en œuvre un traitement anti-douleur s’il/elle le juge nécessaire. Concernant les prélèvements sanguins, le volume maximal est défini, au-delà il s’agira d’un prélèvement terminal sous anesthésie. Les fréquences sont limitées et une réhydratation est prévue. Les points limites conduisant à une euthanasie seront fonction du score clinique et de la perte de poids.

Choix des espèces

90 % des gènes humains ont un équivalent chez la souris, permettant d’élaborer des approches génétiques et fonctionnelles valides. Lorsque les gènes produisent des effets différents entre souris et humain, le remplacement du gène de la souris par son équivalent humain permet la création de lignées humanisées. La souche immunodéficiente utilisée présente une mutation génétique permettant d’induire la mort sélective des hépatocytes murins par injection. Cela permet non seulement de greffer des hépatocytes humains en vue d’humaniser le foie, mais également d’évaluer des solutions thérapeutiques indiquées dans le cas d’insuffisance hépatique. Par ailleurs, cette souche étant fortement immunodéprimée, elle est également permissive, après myéloablation, à la greffe des cellules souches hématopoïétiques ou cellules immunitaires humaines. De plus, cette souche et ses dérivés présentent une mutation génétique permettant d’induire la mort sélective des hépatocytes murins par injection. L'humanisation du foie se déroulera sur des animaux âgés de 5 à 12 semaines. Il a été néanmoins décrit que travailler avec des animaux jeunes permet une meilleure prise de greffe. Les pathologies hépatiques pourront être induites sur les animaux humanisés ou non. L'insuffisance hépatique pourra être induite chez la souris immunodéficiente par exemple par une ou plusieurs injection(s) causant la mort des hépatocytes murins, permettant ainsi d’étudier l’effet d’un implant contenant des hépatocytes.

Une injection de cellules tumorales directement dans le poumon ouvre le protocole, suivie de trente jours d'immunothérapie tous les quatre jours et de séances d'imagerie sous anesthésie. 84 souris mâles de 50 semaines sont utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélèvement de sang et de tissus, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Trois fois au cours du protocole, elles passent un test d'agrippement où le manipulateur les tire par la queue, une course sur tapis roulant poussée jusqu'à l'épuisement et un test d'équilibre au rotarod, pour mesurer si une supplémentation en acides gras et en bêta-hydroxybutyrate combinée à de l'activité physique volontaire renforce l'effet de l'immunothérapie. Le porteur annonce que la tumeur peut provoquer des difficultés respiratoires, de la léthargie et de l'agressivité, et qu'au-delà de trois points limites notables ou d'un point sévère "il sera pris une décision afin de limiter la douleur à son maximum", sans dire laquelle.

Objectifs

L’immunothérapie est une stratégie thérapeutique en plein essor, notamment dans le cancer du poumon, car elle n’induit pas de toxicité secondaire comme les traitements par radiochimiothérapie. Son efficacité reste cependant à améliorer car tous les patients ne répondent pas aux traitements d’où la nécessité de travailler sur des traitements adjuvants. Nous souhaitons combiner 2 approches pour améliorer cette efficacité : - nutritionnelle : supplémentation en acides gras polyinsaturés et en béta-hydroxybutyrate - activité physique : mise en place d’enrichissement dédié à l’augmentation de l’activité physique volontaire.

Bénéfices attendus

Nous attendons à ce que nos traitements améliorent l’efficacité de l’immunothérapie. Pour voir cela, nous suivrons l’évolution du volume tumoral. Des traitements adjuvants tels qu’une supplémentation nutritionnelle ou la mise en place d’une activité physique adaptée est envisageable au cours du traitement par immunothérapie chez les patients. Il y a donc une réelle possiblité de transfert des résultats obtenus dans ce projet en clinique.

Procédures

Les supplémentations nutritionelles se feront ad libitum, par remplacement de l’eau de boisson par le béta-hydroxybutyrate et avec des croquettes pour les acides gras en débitant une semaine vant la tumorigenèse puis pendat les 30 jours du suivi tumoral. L’implantation des tumeurs sera effectuée par injection intra-pulmonaire. Le suivie du volume tumoral par imagerie de biolomuminescence durera 30jours. L’administration de l’immunothérapie sera effectuée tous les 4 jours pendant les 30 jours de tumorigenèse par injection intra-péritonéale d’anicorps anti PD-1. La tumorigenèse sera suivie par imagerie avec calcul du volume tumoral sous anesthésie à l’isoflurane. La mesure de la synthèse protéique sera effectuée après injection sous cutané d’un traceur (isotope stable). Le test d'agrippement sera réalisé à l'aide d'un dynamomètre munie d'une grille où la souris s'accroche, le manipulateur tire alors la souris par la queue. La mesure de la vitesse maximale de course sera effectuée sur un tapis roulant, le test s'arrête quand la souris est épuisée, elle reste alors sur une grille en bout de tapis. Le test dure en moyenne une quizaine de minutes. Une habituation au tapis de course aura lieu en amont du test. Le test d'équilibre au rotarod se déroule sur un cylindre en rotation, les souris seront habituées à cette procédure en amont. Le test dure en moyenne 2-3 minutes. Le passage en echoMRI implique une légère contention des animaux dans un tube placé dans l'appareil. La mesure dure 1 minute environ. Les mesures de performances physiques ainsi que l'echoMRI auront lieu juste avant l'implanttaion (J0) puis à J15 et J30 post-implantation.

Impact sur les animaux

La tumorigenèse peut s'accompager de difficultés respiratoires, d'une perte de poids, de comportements anormaux, tels que l'isolement social, la léthargie, l'agressivité́ accrue ou une altération de la locomotion. Les souris seront surveillées quotidiennement pour suivre leur comportement général.

Devenir

tous les animaux seront euthanasiés à la fin du protocole pour prélèvements de sang et de tissus

Remplacement

L’utilisation d’animaux, dans ce projet est absolument nécessaire et ne peut être remplacer par l’utilisation de systèmes de culture cellulaire à 2 voire 3 dimensions. En effet, ces systèmes ne permettent pas d’aborder les relations inter-organes et de mesurer simultanément la digestibilité des acides gras polyinsaturés w3 et du béta-hydroxy-butyrate, l’évolution de la fonctionnalité musculaire, de la performance et de la mobilité, le métabolisme protéique musculaire et le statut inflammatoire circulant et enfin l’évolution du volume tumoral.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés dans ce projet est réduit à son minimum sans en compromettre les objectifs. Il a été déterminé par un calcul d’échantillonnage. Le nombre de souris nécessaires à l’étude est calculé pour une différence attendue de 25% pour le volume tumoral entre les souris supplémentées en acides gras ou en béta-hydroxybutyrate + activité physique et les souris nourries avec un régime standard. Des études antérieures ont montré que la variabilité du paramètre choisi est de 14%. L’effectif est calculé pour un risque de 1ère espèce alpha de 5% et un risque de 2ème espèce béta de 5%. Ainsi, le nombre de souris nécessaires par groupe est de 8. Toutefois, afin d’anticiper une mortalité éventuelle liée à la tumorigénèse, nous avons choisi de débuter l’étude avec des groupes de 12 souris. Le nombre total de souris nécessaires à la réalisation de ce projet est donc de 84. Pour comparer les résultats des différents paramètres mesurés, nous utiliserons une ANOVA (analyse de la variance) à 2 voies (effet régime, effet activité physique, interaction) suivie d’un test de comparaisons multiples, le test de Tukey si les conditions d’utilisation de l’ANOVA sont remplies (normalité des résidus et égalité des variances). Dans le cas contraire, le test non paramétrique de Kruskal-Wallis suivi d’un test de comparaisons multiples non paramétriques, le test de Dwass-Steel, seront réalisés.

Raffinement

Les conditions d’élevage, d’hébergement, de soin et les méthodes utilisées seront les plus appropriées pour éviter et réduire au maximum toute douleur, souffrance, angoisse ou dommage durable que pourraient ressentir les animaux. Les souris seront hébergées par 6. Tous les animaux auront un accès illimité à leur régime et à l’eau de boisson. Quotidiennement, l’animalier observera le comportement général de chaque souris, son apparence et contrôlera la présence d’eau et de nourriture. Hebdomadairement, les animaux seront pesés et un contrôle de consommation sera réalisé. L’état général de l’animal sera noté sur le cahier de suivi et l’expérimentateur sera informé de toutes observations anormales. Une grille d'évaluation définissant des points limites sera mise en place. Elle permettra d'identifier des points limites notables et des points limites graves. Si un animal présente 3 points limites notables ou 1 point sévère, il sera pris une décision afin de limiter la douleur à son maximum.

Choix des espèces

Pour réaliser notre projet d’étude, nous avons choisi la souris C57BL/6 car nous allons leur injecter des cellules tumorales issues de souris C57BL/6. Le modèle de tumorigenèse est donc syngénique et orthotopique. De plus, ces souris sont très actives en environnement enrichi ce qui est crucial pour tester l’effet de l’activité physique volontaire. Nous avons utilisé cette espèce par le passé et validé toutes les procédures détaillées dans ce dossier avec ces souris. Chez l’homme, le cancer du poumon non à petites cellules est diagnotiqué à l’âge moyen de 65 ans. Nous utiliserons par conséquent des souris mâles adultes de 50 semaines.