Souris
Étude de l’impact des expositions prénatales sur la susceptibilité au cancer colorectal chez la souris.
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
Issues de lignées génétiquement modifiées élevées sur place, avec des témoins pris dans les mêmes portées et des "surplus" que le porteur dit limiter, 18 732 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Les femelles gestantes sont infectées par gavage avec la bactérie Yersinia pseudotuberculosis, ou soumises à un régime expérimental pendant treize semaines, tandis que leur descendance reçoit des injections intrapéritonéales, des inoculations intra-rectales sous anesthésie, des gavages répétés et jusqu'à quatre injections d'un marqueur de prolifération cellulaire, avec récolte de fèces une fois par semaine pendant neuf semaines. Un cancer colorectal est induit génétiquement chez une partie d'entre elles, la mise à mort intervenant dès une perte de poids supérieure à 20 %. Le porteur écrit employer des cultures cellulaires, des organoïdes intestinaux et des approches computationnelles en complément, et conclut que "l'utilisation d'animaux vivants demeure indispensable" pour atteindre les objectifs du projet.
Objectifs
L’objectif de ce projet est de mieux comprendre comment certains événements survenant chez la mère pendant la grossesse et la lactation, comme une infection, une modification du régime alimentaire ou une réaction inflammatoire, peuvent influencer le développement de l’intestin chez la descendance et modifier, plus tard dans la vie, le risque pour la descendance de développer un cancer du côlon et du rectum. L’intestin est un organe particulièrement sensible au début de la vie, car il se construit très tôt et de nombreux éléments importants s’y mettent en place de façon progressive et coordonnée. Des études menées chez l’être humain suggèrent que des événements précoces peuvent avoir des conséquences durables sur la santé, y compris sur le risque de certaines maladies à l’âge adulte, comme le cancer du côlon et du rectum. Cependant, on comprend encore mal comment ces effets apparaissent, et en particulier quelle est l’importance respective de la grossesse et de l’allaitement dans leur apparition et leurs conséquences. Ce projet poursuivra quatre objectifs principaux : 1. Caractériser les changements durables provoqués (ou les « empreintes tissulaires » laissées) dans l’intestin de la descendance par des événements survenant chez la mère pendant la grossesse ou l’allaitement. 2. Comprendre comment ces événements modifient, au cours du développement, le fonctionnement et les interactions entre les différents types de cellules présentes dans l’intestin. 3. Vérifier si ces changements sont encore présents à l’âge adulte et déterminer à quel moment du début de la vie ils se mettent en place, pendant la grossesse ou pendant l’allaitement. 4. Étudier les conséquences de ces changements sur le bon fonctionnement de l’intestin et sur le risque de développer plus tard in cancer du côlon et du rectum. Ce projet permettra de mieux comprendre comment l’environnement maternel au tout début de la vie peut laisser des effets durables sur l’intestin de la descendance. Il contribuera à identifier les périodes les plus sensibles du développement ainsi que certains facteurs liés au mode de vie ou à l’environnement sur lesquels il serait possible d’agir. À plus long terme, les résultats pourraient contribuer à mettre en place des actions de prévention dès les premières étapes de la vie et à mieux comprendre pourquoi les cancers du côlon et du rectum semblent devenir plus fréquents chez les jeunes adultes.
Bénéfices attendus
Ce projet générera des connaissances fondamentales sur la manière dont l’environnement au tout début de la vie peut influencer durablement la fonctionnalité des différents types de cellules présentes dans l’intestin. Il permettra d’identifier à quels moments précoces l’exposition à certains facteurs environnementaux de la mère enceinte ou du jeune enfant peut modifier, de façon durable, le développement normal de l’intestin et sa susceptibilité aux maladies au cours de la vie. En déterminant quand et sur quelles cellules les expositions maternelles, notamment inflammatoires, infectieuses et nutritionnelles, agissent sur le tissu intestinal au cours du développement, ce projet permettra d’identifier les fenêtres critiques au cours desquelles la susceptibilité au cancer colorectal est établie. Il précisera si ces effets résultent principalement de mécanismes mis en place pendant la grossesse ou de processus postnataux mis en place durant la lactation. De plus, ce projet évaluera si certaines altérations précoces peuvent être modulées, une question importante pour la biologie du développement et la prévention des maladies. Les bénéfices scientifiques attendus sont multiples : - mieux comprendre comment l’exposition précoce au cours de la vie à des facteurs environnementaux influence durablement le développement et le fonctionnement des cellules de l’intestin ; - identifier les périodes de la vie (prénatales ou postnatales) pendant lesquels les cellules de l’intestin sont le plus sensible à ces influences ; - améliorer les connaissances sur les origines précoces de certaines maladies intestinales, en particulier sur la compréhension du risque de cancer colorectal, envisagé non plus uniquement comme une maladie d’apparition tardive, mais potentiellement comme un processus influencé dès le développement durant la grossesse. Ce projet aura également des retombées biomédicales importantes en contribuant à expliquer pourquoi le risque de cancer colorectal varie selon les individus et pourquoi l’incidence de cette maladie semble augmenter chez les adultes de plus en plus jeunes. Les connaissances acquises fourniront des bases scientifiques pour identifier des facteurs de risque évitables et orienter, à terme, des stratégies de prévention ciblées dès les premières étapes de la vie.
Procédures
- Injection intrapéritonéale (dans la cavité abdominale) unique d’hormone: souris vigiles, quelques secondes. - Inoculation orale unique par gavage de bactérie: souris vigiles, quelques secondes. - Injection intrapéritonéale unique d’une molécule utilisée principalement dans le traitement et la prévention du cancer du sein: souris vigiles, quelques secondes. - Inoculation intra-rectale unique d’un dérivé d’une molécule utilisée principalement dans le traitement et la prévention du cancer du sein: souris anesthésiées, 1 min. - Injection intraveineuse unique de différentes molécules messagères de l’immunité : souris anesthésiées, quelques secondes. - Injection intrapéritonéale d’une molécule outil de choix pour étudier la prolifération cellulaire: souris vigiles, quelques secondes, jusqu’à 4 injections espacées de 24 heures. - Traitement avec une molécule outil de choix pour étudier la prolifération cellulaire dans l’eau de boisson : souris vigiles, pendant 7 jours maximum. - Prélèvement sanguin: souris vigiles, quelques secondes, 2 prélèvements espacés de 48 heures. - Injection intrapéritonéale de molécule utilisée principalement dans le traitement et la prévention du cancer du sein: souris vigiles, quelques secondes, jusqu’à 3 injections espacées de 48 heures maximum. - Inoculation orale par gavage de molécule utilisée principalement dans le traitement et la prévention du cancer du sein: souris vigiles, quelques secondes, jusqu’à 3 inoculations espacées de 48 heures maximum. - Récolte de fèces frais : souris vigiles, 5-10 minutes, répétée au minimum une fois par semaine pendant 9 semaines maximum. - Administration ad libitum d’un régime alimentaire expérimental ou contrôle : souris vigiles, pendant 13 semaines maximum. - Prélèvement sanguin terminal: souris anesthésiées.
Impact sur les animaux
Ce projet sera attentif aux 5 libertés individuelles de l’animal. Cependant, certaines procédures décrites dans ce projet peuvent induire divers effets indésirables, dont l’intensité et la durée dépendent de la nature de l’intervention. De manière générale, les effets les plus fréquemment observés sont une douleur et/ou un inconfort de courte durée liée aux différentes administrations (gavage, injections intrapéritonéales, intra-rectales ou intraveineuses), ainsi qu’aux prélèvements sanguins et à la collecte de fèces. L’infection intestinale des souris gestantes par la bactérie Yersinia pseudotuberculosis n’entraîne pas de signes cliniques majeurs (tels que léthargie, prostration, poil hérissé ou déshydratation), ni de mortalité. Elle peut toutefois induire une diminution modérée et transitoire du gain pondéral entre les jours 5 et 8 post-infection, avec un retour à la normale à partir du jour 11. L’infection reste localisée au tractus intestinal, sans dissémination systémique à d’autres organes, et est spontanément résolue avec une élimination bactérienne dans les fèces vers le jour 7 post-infection. Aucun passage transplacentaire n’est observé. Par conséquent, la taille des portées ainsi que la viabilité des nouveau-nés ne sont pas affectées. Le développement du cancer colorectal sera induit génétiquement par l’administration d’une substance chez des souris transgéniques. Cette procédure est susceptible d’entraîner des effets indésirables transitoires, notamment liés à l’administration d’une substance (altération temporaire de l’état général, perte de poids modérée) ainsi qu’aux premières étapes de l’induction tumorale. Toutefois, les analyses expérimentales seront réalisées à des stades précoces du développement tumoral, avant l’apparition d’une charge tumorale importante ou de signes cliniques marqués, limitant ainsi l’impact sur le bien-être des animaux.
Devenir
Toutes les procédures expérimentales nécessitent l’analyse de cellules présentes dans le tissu intestinal. La seule façon d’effectuer ces analyses est de mettre les animaux à mort à la fin de chaque expérience.
Remplacement
Les objectifs scientifiques de ce projet impliquent l’étude conjointe des systèmes immunitaire et épithélial intestinaux dans leur contexte physiologique et développemental intact. Les interactions systémiques complexes intervenant au cours de la vie prénatale et postnatale précoce – notamment les échanges mère-fœtus, la colonisation par le microbiote et la maturation progressive du système immunitaire – ne peuvent être reproduites de manière fiable par des approches alternatives. Des méthodes substitutives seront néanmoins mises en œuvre chaque fois que possible. Des cultures cellulaires, des organoïdes intestinaux et des approches computationnelles seront utilisées en complément afin d’explorer certains mécanismes moléculaires et de limiter le recours aux animaux. Toutefois, ces modèles ne permettent pas d’étudier de façon intégrée le dialogue entre cellules épithéliales et immunitaires in vivo, ni d’évaluer l’impact à long terme d’expositions précoces sur l’homéostasie intestinale et la susceptibilité au cancer colorectal. En l’état actuel des technologies disponibles, l’utilisation d’animaux vivants demeure indispensable pour atteindre les objectifs scientifiques de ce projet.
Réduction
Le nombre d’animaux a été soigneusement déterminé à partir d’analyses de puissance statistiques basées sur des jeux de donnée antérieures et sur des études comparables, afin de garantir l’utilisation du nombre minimal d’animaux nécessaire pour obtenir des résultats valides et fiables. Les effectifs ont été estimés pour permettre la comparaison de plusieurs groupes expérimentaux à l’aide de tests statistiques appropriés, Les protocoles expérimentaux ont été conçus afin d’optimiser l’utilisation de chaque cohorte. Lorsque cela est scientifiquement justifié, les groupes témoins seront mutualisés entre différents objectifs et procédures, chaque fois que possible. Le nombre d’animaux utilisés pour chaque cohorte et le nombre de répétitions de chaque expérience sont décrits et justifiés en détails pour chaque procédure expérimentale décrite dans ce projet. Des études pilotes préalables permettront d’affiner les conditions expérimentales (par exemple pour la modification des régimes alimentaires) et de limiter le risque d’échec lors des expérimentations à plus grandes échelles. Les lignées de souris génétiquement modifiées seront élevées de manière à limiter les surplus, et des animaux contrôles issus de la même portée seront utilisés afin d’optimiser les données recueillies pour chaque cohorte. Toutes les expériences seront réalisées avec un nombre suffisant de réplicats biologiques pour tenir compte de la variabilité, tout en évitant toute répétition inutile.
Raffinement
Les modifications du régime alimentaire seront réalisées au moyen d’aliments purifiés spécialement formulés et nutritionnellement définis, administrés ad libitum aux animaux sans procédure invasive. Pour les manipulations répétées (prélèvements sanguins, injections), des méthodes peu invasives seront privilégiées et les sites d’injection ou de prélèvement seront alternés afin de limiter les irritations locales. Les modèles expérimentaux de cancer colorectal utilisés sont conçus pour étudier les phases précoces de l’initiation tumorale, en réduisant au maximum la durée d’exposition et la charge tumorale. Les protocoles d’induction seront optimisés pour permettre l’analyse des mécanismes précoces de dysrégulation des cellules souches dans des délais compatibles avec les objectifs scientifiques. Les expérimentations seront interrompues dès l’atteinte de points limites prédéfinis, sans laisser évoluer les animaux vers des stades avancés de la maladie. Un suivi clinique régulier sera assuré (état général, activité, comportement, poids) avec une surveillance renforcée en période de gestation, de lactation, et après infection ou induction du cancer colorectal. En cas de besoin, des mesures de raffinement supplémentaires seront mises en œuvre afin d’optimiser le bien-être des animaux. Celles-ci incluront notamment la mise à disposition d’une litière douce, d’éléments supplémentaires pour l’enrichissement du milieu (éléments à ronger par exemple), le maintien de conditions thermiques appropriées (avec apport de chaleur si nécessaire grâce à des chaufferettes placées sous la cage, en particulier pour les animaux fragilisés ou les nouveau-nés), ainsi que l’administration de supports nutritionnels adaptés (gel nutritif). Une attention particulière sera également portée aux portées, incluant la sélection de femelles présentant de bonnes aptitudes maternelles et, si nécessaire, la mise en place d’adoptions croisées afin d’assurer la survie et le bon développement des nouveau-nés. Des points limites précis, spécifiques et précoces pour chaque protocole expérimental seront établis : tout animal présentant des signes de détresse ou de douleur persistante (léthargie, piloérection, perte de poids supérieure à 20%) sera mis à mort immédiatement selon les procédures appropriées.
Choix des espèces
La souris est un modèle particulièrement pertinent pour étudier l’impact d’expositions précoces au cours de la vie sur la susceptibilité au cancer colorectal à l’âge adulte. Son développement prénatal et postnatal, ainsi que l’organisation de son système immunitaire et de son épithélium intestinal, présentent des similarités importantes avec ceux de l’être humain. De plus, la gestation courte et la maturation rapide permettent d’explorer efficacement les effets d’expositions survenues pendant la vie fœtale ou l’allaitement et d’en évaluer les conséquences à long terme. De nombreux modèles murins de cancer colorectal sont bien caractérisés et reproduisent les étapes précoces de l’initiation tumorale. Une large gamme de lignées de souris génétiquement modifiées est disponible pour étudier finement les mécanismes impliqués. La petite taille des souris facilite également la constitution de cohortes expérimentales de taille appropriée tout en limitant l’impact sur le bien-être animal, comparativement à des espèces de plus grande taille. Les souris seront utilisées entre 2 et 12 semaines de vie. Les points temporels précoces (avant sevrage à 3 semaines) sont essentiels pour analyser comment le régime alimentaire maternel, l’inflammation et l’exposition au microbiote programment les cellules immunitaires et la niche des cellules souches intestinales durant cette fenêtre critique du développement gastro-intestinal. L’étude au stade adulte (à partir de 6-7 semaines de vie) est nécessaire pour déterminer si ces programmations précoces persistent à l’âge adulte et influencent l’homéostasie intestinale ainsi que la susceptibilité au cancer colorectal. L’étude de ces différentes fenêtres développementales permettra d’identifier le moment où survient l’empreinte au niveau de l’intestin et d’évaluer si une programmation inadaptée établie précocement peut être modifiée ultérieurement au cours de la vie.
Nouvelle stratégie de thérapie photodynamique avec un nouveau PS de 3ème génération pour le ciblage de la NRP1 dans le CPNPC
- Recherche appliquée
- Cancers
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
Les souris utilisées sont immunodéficientes, privées de rate par ablation chirurgicale, et porteuses de cellules immunitaires et tumorales humaines greffées : 297 d'entre elles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Après la splénectomie viennent une injection intrapéritonéale de cellules immunitaires humaines et une injection sous-cutanée de cellules tumorales, puis une injection intraveineuse d'un photosensibilisateur suivie trois heures plus tard d'une illumination de trente minutes, des injections intraveineuses hebdomadaires d'immunothérapie, des prélèvements de sang chaque semaine et des mesures de la tumeur au pied à coulisse. Dans les groupes témoins et chez les souris que le traitement ne freine pas, le porteur écrit que la tumeur continuera de croître jusqu'au point limite. Il conclut que "ces nécessités, éthiques et scientifiques" justifient la mise à mort des souris en fin de procédure, après avoir écrit : "Aucune mesure invasive ne sera ainsi faite".
Objectifs
Le cancer du poumon non à petites cellules (CPNPC) est un cancer fortement immunogène. Le traitement de première intention repose sur des thérapies ciblées quand cela est possible ou des chimiothérapies de sels de platines avec ou sans immunothérapies. Cependant certains patients échappent au traitement. Dans ce contexte, il est indispensable de trouver de nouvelles cibles thérapeutiques et de nouvelles thérapies.
Bénéfices attendus
Il s'agit pour nous d'évaluer l'efficacité de nouveaux traitements dirigés contre le CPNPC humain. Les paramètres de PDT-Neptune testées ont préalablement été sélectionnés sur un ensemble d'expériences réalisées sur les modèles cellulaires en laboratoire. Il s'agira donc de confirmer l'efficacité de la PDT-Neptune dans le cadre d'un être vivant complet humanisé. Les bénéfices à long terme seront de pouvoir mettre sur le marché un nouveau traitement et d'aider dans la lutte contre le CPNPC. L'analyse de l'importance de la réponse immunitaire sur leur mode d'action fait que ces futurs traitements pourront s'intégrer dans des programmes adaptés à chaque patient au bénéfice d'une médecine personnalisée.
Procédures
Toutes les procédures ont en commun la mise en place du modèle et pour cela les animaux subiront une chirurgie sous anesthésie générale (10 min entre l’endormissement et le réveil). Une semaine après, les animaux subiront l’injection de cellules humaines (immunitaires en IP avec une seringue de 1 mL et une aiguille de 26G (0.45 x 13 mm) et tumorales SC avec une seringue de 1 mL et une aiguille de 23G (0.6 x 25 mm). Le modèle en place permettra de tester les traitements. Pour la PDT, les animaux auront une injection intra veineuse du PS Neptune et seront illuminées (extracorporel) 3h après pendant 30 min. L’immunothérapie sera ajoutée par une injection IV qui sera répétée toutes les semaines (1 fois par semaine) avec un cathéter 24G (0.7 x 19 mm) dans la veine caudale. Pour le suivi immunologique, un prélèvement de sang sera réalisé préalablement à tout traitement, puis une fois par semaine. Le suivi de la croissance se fera par 2 méthodes. Pour les procédures il s’agira d’utiliser les propriétés du modèle cellulaire et de faire un suivi par imagerie. Ce dernier nécessite l’endormissement sous anesthésie gazeuse des animaux, puis l’injection IP du substrat lumineux avec une seringue de 1 mL et une aiguille de 26G (0.45 x 13 mm). Toutes les souris auront également le suivi régulier de la croissance par le pied à coulisse. En fin de protocole, l’ensemble des animaux sera euthanasié, le sang, la tumeur et les organes vitaux seront récupérés pour analyse complémentaires
Impact sur les animaux
Plusieurs nuisances ou effets indésirables peuvent être relevés sur ce projet lors de nos interventions : - injections / prélèvement sanguins / pesées ; ces actions nécessitent une contention qui peut générer un stress léger de courte durée mais répété - anesthésie; les anesthésies notamment gazeuses à l'Isoflurane peuvent également générer un stress léger de courte durée mais répété - acte chirurgical pour la splénectomie; peut générer un problème lors de la cicatrisation notamment une légère démangeaison pendant un maximum de 5 jours – la croissance tumorale: les cellules tumorales sont injectées en un point précis prévu pour ne gêner en rien le comportement normal de l'animal, un risque de gène du déplacement pourrait être observable au cours des 4 semaines mais cela sera strictement géré (cf. points limites).
Devenir
Tous les animaux auront reçu l'injection d’une masse tumorale suivi ou non d'un traitement expérimental. Selon l’efficacité des traitements la croissance de la tumeur sera ralentie voire disparaitra, dans le cas contraire et pour les groupes témoins, la tumeur continuera de croitre jusqu'au point limite critique pour son bien-être. Nous pouvons ajouter également que pour des raisons scientifiques, nous devons procéder à la récupération des tissus (sang, tumeur, organes vitaux) qui nous serviront à confirmer l'efficacité du traitement et confirmer son mode d'action. L'ensemble de ces nécessités, éthiques et scientifiques, justifient le sacrifice des animaux en fin de procédure.
Remplacement
Notre objectif est de tester l’efficacité anti tumorale de la PDT-Neptune (qui de plus est immuno-activatrice) seule ou en combinaison avec des Immunothérapies (réduction des mécanismes immunorégulateurs). Des travaux préalables ont été réalisés sur les modèles de lignées cellulaires. Ces résultats mettent en évidence la faisabilité du projet au travers de la validation de l'application de la PDT et/ou des Immunothérapies in-vitro ; dont plusieurs paramètres ont été ainsi fixés. Cependant, s'agissant de développer une nouvelle approche thérapeutique, il est primordial que celle-ci soit également évaluée dans un système physiologique complet, en ce sens un modèle in- vivo est le plus adéquat, voire nécessaire. Le suivi par bioluminecence permet de diminuer le nombre d'animaux, néanmoins, une validation de l'efficacité nécessite d'emblée que plusieurs groupes expérimentaux soient présents, notamment les groupes contrôles (PS Neptune seul ; pour la PDT), non traité, et traitement unique ou traitement combiné de manière à limiter quantitativement les expérimentations. Dans la mesure où la modélisation expérimentale cellulaire ou in-silico est trop imparfaite, ce type de modèle demeure indispensable à la validation de ces futurs traitements.
Réduction
Grâce à notre expérience nous bénéficierons de protocoles déjà approuvés et mis en place au laboratoire, ce qui permet de ne pas avoir à faire de mise au point. L'ensemble des animaux ne servira uniquement que pour l'étude de l'effet des traitements. Néanmoins, dans un souci de conservation de la fiabilité des résultats et pour ainsi éviter d'avoir à refaire les expériences, nous réaliserons des groupes d'étude suffisamment solides d'un point de vue biostatistique (validé grâce à l'outils de l'EDA). Ainsi, pour des modèles humanisés des groupes de 5 souris pour 5 reconstitutions seront suffisants. Le suivi de croissance tumorale se fera de manière externe sans nécessité de recours à une dissection, permettant ainsi un suivi longitudinal optimisé sans sacrifice. Enfin, il s'agira de ne tester que les molécules déjà présélectionnés pour leur efficacité dans les modèles précliniques in-vitro. Aucune mesure invasive ne sera ainsi faite. Enfin, l'étude préalable du nombre d'animaux strictement nécessaire (grâce aux outils de l'EDA), nous permettra d'obtenir des résultats en quantité suffisante pour ne pas avoir à réitérer des lots expérimentaux.
Raffinement
Afin de limiter au minimum toute souffrance, stress ou angoisse des animaux, ces derniers seront hébergés selon les recommandations établies à raison de 5 animaux maximum par cage, dans un environnement enrichi (maison, carré de coton) et dans des conditions classiques de stabulation (température régulée, cycles jour/nuit). Avant toute manipulation, les animaux seront acclimatés 7 à 10 jours dans leur salle d'hébergement. Concernant le projet, nous avons cherché à optimiser l'expérimentation en mettant en place une méthodologie d'étude courte et efficace : suivi de tumeur sur un temps limité (4 semaines maximum), tout en minimisant les douleurs ou détresse. Nous avons ainsi choisi des modèles de souris dont nous connaissons les comportements et la capacité de prise de greffe. Les animaux plus jeunes, seront manipulés régulièrement et ainsi entrainés en vue d'une réduction du stress. En cours d'expérimentation, nous avons choisi de faire les greffes tumorales uniquement sous-cutanées (au flanc) de manière à ne gêner en rien la vie de l'animal (locomotion, alimentation), le suivi sera ainsi facilité par mesure manuelle externe sur animal vigile (mesure au pied à coulisse), ou grâce à un système d'imagerie par bioluminescence (l'animal sera alors sous anesthésie dans l'appareil à +37°C et aura préalablement reçu une injection de luciférine). Aucune mesure invasive ne sera ainsi faite. Enfin, l'étude préalable du nombre d'animaux strictement nécessaire (grâce aux outils de l'EDA), nous permettra d'obtenir des résultats en quantité suffisante pour ne pas avoir à réitérer des lots expérimentaux.
Choix des espèces
Les souris sont des petits rongeurs qui permettent de réaliser des groupes cohérents et limités pour l'étude efficace des effets des molécules thérapeutiques testées en faibles quantités. Nous utilisons des souris SCID pour permettre la xénogreffe de cellules humaines (tumorales et immunitaires). Par ailleurs le campus dispose d'outils performants spécialement adaptés à la souris (Imagerie du petit animal). Les souris entreront en phase expérimentales à partir de l’âge de 7 semaines. Elles seront déjà sevrées et sexées. A ce stade de développement elles seront suffisamment robustes pour supporter les traitements et suffisamment grande pour supporter les injections et le développement des cellules tumorales.
Impact des pièges extracellulaires sur la fonction neuromusculaire chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système nerveux
- Système respiratoire
Toutes tuées après des évaluations fonctionnelles terminales, sans qu'aucune soit maintenue en vie ni réutilisée, 818 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune subit une injection intrapleurale d'un traceur, puis une chirurgie d'environ quarante-cinq minutes sous anesthésie générale ouvrant l'accès à la moelle épinière cervicale, où sont injectés des pièges extracellulaires produits en laboratoire. La perte de poids attendue va jusqu'à 10 % du poids initial dans la semaine suivant l'opération, y compris chez les souris du groupe témoin, opérées sans injection. Le porteur affirme qu'aucune méthode de remplacement ne permet d'observer à la fois ces pièges dans la moelle épinière, leur effet sur les cellules nerveuses qui commandent le diaphragme et les conséquences musculaires dans un "organisme entier".
Objectifs
Ce projet cherche à mieux comprendre comment une inflammation générale dans l’organisme peut aussi provoquer une inflammation de la moelle épinière et perturber le fonctionnement des muscles, en particulier ceux impliqués dans la respiration. Parmi les mécanismes étudiés figurent les « pièges extracellulaires », des structures libérées par certaines cellules immunitaires. Ces structures jouent normalement un rôle de défense, mais lorsqu’elles sont produites en excès, elles peuvent entretenir l’inflammation et endommager les tissus. L’objectif est de déterminer si la présence de ces pièges extracellulaires dans la moelle épinière peut, à elle seule, provoquer une inflammation locale et altérer la fonction neuromusculaire. Pour cela, des pièges extracellulaires produits en laboratoire à partir de différentes cellules immunitaires (neutrophiles, macrophages et microglies) seront injectés dans la moelle épinière de souris saines. Cela permettra de comparer leurs effets respectifs sur l’inflammation et sur le fonctionnement des muscles respiratoires.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus de ce projet sont une meilleure compréhension des liens entre une inflammation générale de l’organisme, l’inflammation de la moelle épinière et l’apparition de troubles musculaires et respiratoires. Nos premiers résultats suggèrent que les « pièges extracellulaires », produits par certaines cellules immunitaires, pourraient jouer un rôle dans ces altérations, mais leur effet exact reste encore mal connu. Ce projet permettra de déterminer si la présence de ces structures dans la moelle épinière est suffisante pour provoquer à elle seule une inflammation locale et perturber le fonctionnement neuromusculaire, en particulier celui du diaphragme, principal muscle respiratoire. Il permettra aussi de comparer les effets de pièges extracellulaires provenant de différents types cellulaires, afin de mieux comprendre si certains ont des effets plus délétères que d’autres. À plus long terme, ces travaux pourraient aider à identifier de nouvelles pistes thérapeutiques pour limiter les conséquences neurologiques, musculaires et respiratoires associées à une inflammation systémique, notamment dans certaines maladies graves comme le sepsis.
Procédures
Les souris seront soumises à une chirurgie sous anesthésie générale (chirurgie durant environ 45 minutes), permettant d’atteindre la moelle épinière cervicale et d’y injecter des « pièges extracellulaires » produits par des cellules en laboratoire. Cette chirurgie sera précédée de quelques jours par une injection intrapleurale quasi non-invasive (5 minutes) d’un traceur moléculaire permettant d’identifier les cellules permettant la contraction du muscle diaphragmatique, et localisées dans la moelle épinière cervicale. Ces souris seront ensuite soumises à des tests fonctionnels terminaux.
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues ou effets indésirables pouvant être attendus sur les animaux sont : - Stress et douleur potentiellement induits par l’administration du traceur en intrapleuraléritonéal. - Perte de poids jusqu’à 10% du poids initial durant la première semaine après la chirurgie et l’injection dans la moelle épinière des pièges extracellulaires. Les animaux du groupe contrôle pourront, eux aussi, présenter des effets passagers liés à la chirurgie contrôle sans injection de pièges extracellulaires.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à l’issue de chaque procédure, après les évaluations fonctionnelles terminales. Les tissus et organes d’intérêt, notamment la moelle épinière cervicale, le diaphragme et, selon les analyses prévues, d’autres tissus associés, seront ensuite prélevés pour des analyses histologiques, immunohistochimiques, cytométriques et moléculaires. Aucun animal ne sera maintenu en vie ou réutilisé à l’issue de la procédure.
Remplacement
À l’heure actuelle, il n’existe pas de méthode de remplacement permettant d’étudier en même temps les effets des pièges extracellulaires dans la moelle épinière, leur impact sur les cellules nerveuses qui commandent le diaphragme, et les conséquences sur le fonctionnement musculaire. Les études réalisées uniquement sur des cellules ou des tissus isolés ne permettent pas de reproduire toute la complexité des interactions entre le système nerveux, le système immunitaire et les muscles dans un organisme entier. L’utilisation de l’animal est donc nécessaire pour répondre à cette question de recherche.
Réduction
Le nombre d’animaux sera réduit au minimum nécessaire pour obtenir des résultats scientifiques fiables. L’organisation de l’étude repose sur l’expérience du laboratoire, sur des données préliminaires, et sur les analyses prévues à la fin des expériences. Le choix de plusieurs groupes et de plusieurs temps d’observation est nécessaire pour comparer correctement les effets étudiés, mais a été limité afin d’éviter toute utilisation excessive d’animaux. Cette stratégie permet d’obtenir des résultats exploitables tout en respectant le principe de réduction.
Raffinement
Une attention particulière sera portée au bien-être des animaux pendant toute l’étude. Les interventions seront réalisées sous anesthésie générale, avec des mesures adaptées pour limiter la douleur et l’inconfort. Les conditions opératoires seront soigneusement contrôlées afin de réduire au maximum les risques liés aux injections et aux manipulations. Après chaque intervention, les animaux seront surveillés attentivement jusqu’à leur réveil complet puis de façon régulière pendant toute la durée de l’étude. Leur état général, leur déplacement, leur poids, leur température et l’aspect de la zone opérée seront contrôlés à l’aide de grilles de suivi. Si nécessaire, les animaux seront pris en charge de manière adaptée. L’isolement (dans un environnement enrichit) ne sera utilisé qu’en cas de besoin lié aux soins ou à l’état de l’animal.
Choix des espèces
La souris a été choisie car c’est une espèce largement utilisée en recherche biomédicale pour étudier les interactions entre inflammation, système nerveux et fonction musculaire. Les modèles murins de neuroinflammation sont bien connus et permettent d’obtenir des résultats comparables à ceux d’autres études. La souris est aussi adaptée aux techniques utilisées dans ce projet, comme les injections dans la moelle épinière, le marquage de certaines cellules nerveuses et les analyses des tissus en fin d’expérience. Sa petite taille, son cycle de vie court et la disponibilité de lignées élevées dans des conditions standardisées permettent de bien contrôler les conditions expérimentales et de limiter la variabilité entre animaux. De plus, la souris partage avec l’humain plusieurs caractéristiques importantes du fonctionnement des systèmes nerveux, musculaire et immunitaire, ce qui en fait un modèle pertinent pour ce type de recherche. Les animaux utilisés seront de jeunes adultes mâles, âgés d’au moins 8 semaines. Ce choix permet d’éviter les effets liés à la croissance et au développement, qui pourraient influencer les résultats. Il permet aussi d’étudier ces mécanismes dans une situation plus proche de celle observée chez l’adulte humain.
Rôle d’une protéine de stress dans l’inflammation du foie
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
Comprendre le rôle d'une protéine de stress dans l'inflammation du foie conduit à utiliser 1 260 souris génétiquement modifiées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Sur ce total, 756 reçoivent une injection unique de cinq secondes, et les 504 autres une injection par jour pendant quatre jours. Le porteur annonce une gêne abdominale transitoire et une réaction de type état grippal, avec baisse d'activité et diminution de l'appétit, et prévoit la mise à mort des souris chez lesquelles ces signes persistent. Leur foie et leurs macrophages péritonéaux sont prélevés après la mise à mort, et l'effectif de 1 260 est présenté comme issu d'une "méthode mathématique reconnue" que le porteur ne nomme pas.
Objectifs
La maladie du foie gras touche de plus en plus de personnes et peut évoluer vers une inflammation chronique du foie, une fibrose et un cancer du foie. Ce projet vise à mieux comprendre le rôle d’une protéine présente en grande quantité dans le foie des personnes atteintes par cette maladie métabolique, et impliquée dans la manière dont les cellules du foie réagissent lorsqu’elles sont soumises à des situations de stress, comme l’accumulation excessive de graisses. Pour mieux comprendre son rôle, nous utiliserons des souris génétiquement modifiées afin d’étudier comment cette protéine influence l’accumulation de graisses et l’inflammation dans le foie, en particulier dans les cellules immunitaires. Ces travaux permettront de mieux comprendre les mécanismes de la maladie et de déterminer si cette protéine peut être un candidat important comme future cible thérapeutique.
Bénéfices attendus
Ces travaux permettront de mieux comprendre les mécanismes qui conduisent à l’accumulation de graisses et à l’inflammation dans le foie. Les résultats pourront contribuer au développement de nouvelles stratégies pour prévenir, ralentir ou inverser la progression de la maladie du foie gras et de ses complications.
Procédures
Une injection unique (environ 5 secondes) sera réalisée sur 756 animaux. Quatre injections consécutives (une injection par jour pendant 4 jours, environ 5 secondes par injection) seront réalisées sur 504 animaux.
Impact sur les animaux
Les modèles utilisés chez la souris peuvent entraîner un léger inconfort lié aux injections (réalisées en quelques secondes), une gêne abdominale transitoire ainsi qu’une réaction temporaire de type état grippal pouvant se traduire par une baisse d’activité, une diminution de l’appétit et un comportement plus calme. Les animaux seront surveillés régulièrement afin de détecter ces signes le plus tôt possible. Des seuils d’alerte ont été définis pour permettre une prise en charge rapide et éviter toute souffrance prolongée.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure afin de prélever leurs tissus : le foie pour étudier l’inflammation, le métabolisme et certains mécanismes de mort cellulaire, et les macrophages péritonéaux pour analyser leur fonctionnement.
Remplacement
Avant de recourir aux animaux, des expériences sont réalisées sur des cellules cultivées en laboratoire afin d’étudier certains mécanismes impliqués dans l’inflammation et le fonctionnement du foie. Ces méthodes sont utilisées chaque fois qu’elles permettent de répondre aux objectifs scientifiques et de sélectionner les conditions expérimentales les plus pertinentes. Cependant, les interactions entre le foie, le système immunitaire et le reste de l’organisme sont très complexes et ne peuvent pas être reproduites avec des cellules cultivées seules. Pour les étudier correctement, il est donc nécessaire d’utiliser un modèle animal. La souris est l’espèce la plus adaptée, car son fonctionnement biologique est proche de celui de l’être humain.»
Réduction
Le nombre d'animaux utilisé a été déterminé à l'aide d'une méthode mathématique reconnue permettant de calculer le plus petit effectif nécessaire pour obtenir des résultats scientifiques fiables. Chaque animal permettra de recueillir plusieurs types d'informations à partir des mêmes prélèvements, ce qui limite le recours à des animaux supplémentaires. Les expériences seront réalisées par étapes : certaines ne seront engagées que si les résultats des précédentes le justifient. Cette stratégie permet de limiter le nombre total d’animaux utilisés tout en répondant aux objectifs du projet.
Raffinement
Les animaux seront observés régulièrement afin de détecter rapidement tout signe de souffrance ou de malaise. Une grille d’évaluation permettra au personnel formé de suivre leur état de santé et d’agir si nécessaire. Toute modification visible de leur apparence ou de leur comportement sera notée. Les animaux concernés seront alors suivis et peuvent éventuellement recevoir un traitement contre la douleur. Si certains signes de mal-être persistent, l'animal sera mis à mort.
Choix des espèces
La souris est un modèle adapté pour cette étude car son fonctionnement biologique est proche de celui de l’être humain. De nombreux outils génétiques et moléculaires ont été développés chez la souris, permettant de mieux comprendre les mécanismes de nombreuses maladies. Les expériences seront réalisées sur des souris dont les principaux systèmes étudiés, notamment le foie et le système immunitaire, ont atteint une maturité fonctionnelle et un fonctionnement stable, afin d’obtenir des résultats fiables et représentatifs des mécanismes biologiques étudiés.
Développement d’un modèle Murin pour l’étude de l’hypertension pulmonaire dans le syndrome d’overlap 1/2
- Recherche appliquée
- Troubles respiratoires
Privées d'oxygène huit heures par jour ou jusqu'à vingt-quatre heures par jour pendant seize semaines, et pour certaines nourries d'un régime riche en graisses pendant la même durée, 270 souris vont toutes être tuées à l'issue. Les procédures vont d'un niveau de souffrance léger à modéré, la mesure de pression intracardiaque étant faite sous anesthésie sans reprise de conscience, et comprennent six prélèvements de sang en deux heures par incision de la queue, une hypoglycémie provoquée, une échographie cardiaque et un électrocardiogramme. L'objectif est de mettre au point une méthode d'induction du syndrome d'overlap chez la souris, association d'une bronchopneumopathie obstructive et d'apnées du sommeil, pour explorer des pistes thérapeutiques dans de futurs projets. Le porteur écrit que le cumul de l'obésité et des deux formes de privation d'oxygène "peut augmenter les effets mais c'est le but de l'étude".
Objectifs
Développer un modèle original et innovant reproduisant certains mécanismes du syndrome d’overlap. Ce syndrome est défini par une bronchopneumopathie chronique obstructive liée à un manque d’oxygène dans le sang couplé à un syndrome d’apnées obstructives du sommeil. Ce syndrome d’overlap sera mis au point avec ou sans obésité, afin d’identifier les déterminants biologiques de l’hypertension pulmonaire et d’explorer des pistes thérapeutiques ciblées dans de futurs projets.
Bénéfices attendus
Perspective d'application ou de développement éventuel de ce travail et incidences éventuelles sur la santé respiratoire : La mise au point de ce modèle murin inédit, combinant spécifiquement un manque d’oxygène chronique et intermittent, ainsi que l'obésité induite par régime, ouvrira des perspectives significatives tant sur le plan scientifique que clinique. Ce modèle permettra une caractérisation fine et détaillée des voies biologiques clés impliquées dans le développement de l'hypertension pulmonaire et des complications cardiaques du syndrome d’overlap. Grâce au développement de ce modèle préclinique robuste (en cas de succès du projet), il sera par exemple possible de tester de manière pertinente des stratégies thérapeutiques ciblées, actuellement utilisées dans l’hypertension artérielle pulmonaire, et qui pourraient être transposées dans le syndrome d’overlap pour lequel aucun traitement spécifique n’a démontré son efficacité actuellement, comme en témoigne notamment l’échec récent de l’essai clinique utilisant le tréprostinil inhalé. Ainsi, le modèle murin que nous développons permettra non seulement d’explorer et comparer l’efficacité des différentes voies thérapeutiques potentielles dans le contexte spécifique du syndrome d’overlap, mais aussi de mieux identifier les approches thérapeutiques les plus prometteuses pour de futurs essais cliniques chez l’homme. Bien que l’évaluation directe de traitements dépasse les objectifs immédiats du présent projet, elle constitue une perspective importante de notre recherche à venir.
Procédures
Les animaux seront soumis à un manque d’oxygène intermittent (8h/jour) et/ou chronique (16 à 24h/j) pendant 16 semaines. Certains animaux pourront également recevoir un régime riche en graisses durant 16 semaines pour induire une obésité. Afin de suivre leur glycémie et voir comment le glucose ou l’insuline sont régulés dans le sang, les animaux seront injectés avec du glucose ou de l'insuline (temps d’injection = 20 secondes) puis une goutte de sang sera prélevée de façon répétée 6 fois durant 2h. Une échographie du coeur associée à un électrocardiogramme seront réalisés sous anesthésie générale (15-20min). Juste avant la mise à mort de l’animal, sous anesthésie et analgésie, la pression à l’intérieur du cœur sera mesurée durant 5 minutes.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables généralement observés sont principalement dus au manque d'oxygène. Une augmentation de la fréquence respiratoire avec essoufflement et perte de poids s'observent les premiers jours d'exposition. Par la suite les animaux s'adaptent à ce changement d'ambiance. Les tests pour mesurer la régulation du taux de sucre dans le sang (= tests métaboliques) étant induits par une injection, une douleur minime peut se produire au site d'injection. Les animaux étant mis à jeun avant les tests métaboliques, cela peut induire un stress léger et de l'inconfort. Aussi, le suivi de la glycémie pendant ces tests se faisant à l'extrémité de la queue après une légère incision, une légère douleur et du stress peuvent être observés à ce moment-là. Un des tests métaboliques provoque une hypoglycémie transitoire contrôlée. Enfin l'obésité induite par le régime peut provoquer des mouvements plus compliqués pour l'animal mais aucune gêne majeure n'a été observée dans les précédentes études. Un stress légé peut-être associé à l'anesthésie nécessaire à l'échographie du coeur, l'électrocardiogramme et le transfert des animaux entre les deux animaleries. Le cumul de l'obésité et de l'exposition à l'hypoxie intermittente et stationnaire peut augmenter les effets mais c'est le but de l'étude.
Devenir
Les animaux sont mis à mort en fin d’expérimentation pour permettre l’analyse (moléculaire, cellulaire et histologique) du coeur et des poumons (nécessité de prélever les organes). Une mutualisation des prélèvements pour d'autres analyses ou mises au points techniques pourra être faite avec d'autres chercheurs du laboratoire.
Remplacement
L'objectif de recherche est d'étudier et comprendre les mécanismes moléculaires et cellulaires impliqués dans le développement du syndrome d'overlap. Le recours à des animaux est indispensable et se justifie par la nécessité d'étudier la fonction cardiaque, la réactivité des vaisseaux, l'étude des tissus des poumons dans un contexte physiologique et pathologique. Ce projet se justifie également par l'impossibilité de simuler ex vivo la mise en place d'une hypertension pulmonaire puis d'une altération du cœur à droite chez l'humain qui est un processus multifactoriel complexe.
Réduction
Lorsque les animaux seront mis à mort en fin d'expérimentation après le cathétérisme pour évaluer la fonction du coeur et des vaisseaux, les tissus prélevés (coeur et poumons) seront stockés pour une utilisation directe mais aussi ultérieure, pour des études mécanistiques plus poussées (surplus de tissu) Des expériences de biochimie et biologie moléculaire à partir des différents tissus collectés et des études sur cellules isolées seront effectuées. Les calculs de puissance ont été faits en utilisant le logiciel GPower en amont de la manipulation pour réduire au maximum le nombre d'animaux inclus dans l'étude et les tests statistiques ad hoc seront utilisés pour analyser les résultats et identifier les différences attendues le cas échéant.
Raffinement
Tout au long du déroulement des expériences, une observation quotidienne de l’état clinique des souris utilisées sera assurée. Toutes les procédures seront pratiquées sous anesthésie générale et couverture analgésique adaptées aux actes pratiqués. Des points limites spécifiques ont également été mis en place. Les souris à euthanasier seront placées dans une salle isolée du reste des souris et les manipulations posteuthanasies seront réalisées dans une troisième pièce. Pour les tests de cathétérisme, des animaux de réutilisation pourront être utilisés.
Choix des espèces
Le choix de l’espèce s’est oriente vers la souris car c’est le modèle actuellement le plus utilisé pour modéliser le syndrome d'apnées obtructives du sommeil dans notre laboratoire. Nous avons donc des données robustes associées à celui-ci. Aussi, notre dispositif d'exposition à l'hypoxie ne permet que l'utilisation des rongeurs. Nous utliserons pour ce projet des souris qui répondent également bien au régime induisant une obésité utilisé dans ce projet. Les données de la litérature montrent également que ce modèle est pertinent pour le projet.
Etude de la circulation pulmonaire et du remodelage dans un modèle d’hypertension artérielle pulmonaire (HTAP) induite par de l’hypoxie chronique chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système respiratoire
920 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont maintenues quatre semaines en caissons hypoxiques pour développer une hypertension pulmonaire, reçoivent une injection sous-cutanée par jour pendant ces quatre semaines et subissent des mesures de pression cardiaque sous anesthésie, avant d'être tuées pour prélèvement d'organes. Le porteur écrit que les souris deviennent un peu amorphes pendant les premières vingt-quatre heures puis "s'acclimatent ensuite très bien", et qu'aucune méthode ne permet d'étudier autrement les mécanismes de cette maladie, dont la survie humaine à cinq ans atteint 36 % dans les formes sévères. Une nécrose cutanée au point d'injection quotidien entraîne la mise à mort de la souris concernée.
Objectifs
L’hypertension pulmonaire est une maladie vasculaire qui mène régulièrement à la mort du patient. La greffe cœur/poumons est l’ultime recours pour les patients car pas ou peu de traitements pharmacologiques permettent d’améliorer les conditions de vie des malades atteints d’hypertension pulmonaire. Il est ainsi nécessaire d’identifier les mécanismes moléculaires impliqués dans le développement de cette maladie pour établir de nouvelles molécules thérapeutiques. Ainsi, notre objectif est d’évaluer le potentiel thérapeutique de nouvelles molécules sur l’hypertension pulmonaire
Bénéfices attendus
Actuellement, aucun traitement efficace ne permet de soigner l’hypertension pulmonaire. Pour cette maladie, 36% de survie des patients à 5 ans pour les formes sévères. Identifier des molécules permettant de soigner l’hypertension pulmonaire est donc une priorité
Procédures
- Hypoxie en continue pendant 4 semaines, - 1 injection quotidienne de 30 sec en sous-cutané, - Mesures de pression cardiaque sous anesthésie (1 minute/mesure)
Impact sur les animaux
- L’induction de l’HTAP nécessite d’héberger les animaux dans des caissons hypoxiques. Le changement d’environnement peut induire un stress sur les animaux. L’induction de l’HTAP rend les souris un peu « amorphe » sur les premières 24h, le temps qu’elles s’adaptent. Elles s’acclimatent ensuite très bien. - Toutes les molécules sont préalablement testées pour éviter des effets indésirables majeurs chez la souris. Seules les molécules montrant pas ou peu d’effets indésirables (toxicité, solubilité, bonne biodisponibilité de la molécule…) seront testées in vivo. - Stress induit par contention quotidienne pour injecter les molécules en sous-cutané pendant 4 semaines. Si une nécrose cutanée apparait, l’animal sera alors mis à mort.
Devenir
Mise à mort des animaux pour prélèvements d’organes et pour analyses fonctionnelles et histologiques
Remplacement
Il n’existe pas à ce jour de méthode alternative permettant d’étudier les mécanismes de développement de l’HTAP. Le modèle murin d’hypoxie chronique est décrit pour se rapprocher de la pathologie humaine. Cette approche expérimentale permet ainsi d’étudier, dans un système intégré, les mécanismes impliqués dans le développement de la pathologie et également d’évaluer le potentiel thérapeutique de nouvelles molécules.
Réduction
Nous avons fait une sélection in vitro des molécules à tester pour réduire l’expérimentation animale. Comme toutes les molécules sélectionnées sont solubles, le solvant sera identique pour tous les tests. Cela nous permettra de réduire le nombre d’animaux utilisés pour les groupes contrôles. Nous utiliserons un test statistique ANOVA (Prism, GraphPad) pour interpréter nos résultats.
Raffinement
Les animaux seront observés tous les jours par des personnes expérimentées afin d’assurer le bien-être des animaux et détecter toute souffrance. Les cages des animaux sont enrichies avec des frisottis et des bâtonnets en bois. Les traitements dureront 4 semaines avec des injections quotidiennes en sous-cutanée par contention douce. Nous injecterons à différents endroits pour éviter l’apparition de lésions cutanées.
Choix des espèces
Le modèle murin soumis à une hypoxie chronique est décrit pour se rapprocher le plus de la pathologie humaine. Les souris seront utilisées à l’âge adulte. Pour étudier le potentiel thérapeutique des molécules, nous devons travailler avec un système pulmonaire et hémodynamique mature.
Évaluation de l’immunogénicité et de l’efficacité d’un vaccin nasal contre l’infection au virus influenza dans un modèle préclinique murin
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Troubles immunitaires
- Troubles respiratoires
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
4 712 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, chacune pouvant recevoir deux vaccinations sous anesthésie, une infection grippale intranasale et quatre ponctions du sinus submandibulaire à l'état vigile. Les procédures vont d'un niveau de souffrance léger à sévère, cette dernière classification portant sur l'infection grippale, que le porteur décrit avec une perte de poids, une prostration, une anorexie et un pelage hirsute entre le deuxième et le neuvième jour, et une mortalité possible chez les souris non vaccinées, le suivi comportemental annoncé après l'infection restant sans détail. Aucun antidouleur ni anti-inflammatoire ne leur est administré, le porteur indiquant que ces traitements modifieraient les résultats de l'étude. Les retombées annoncées, des formulations "transposables à l'Homme" et un renforcement des stratégies prophylactiques, sont renvoyées à l'issue du projet, quand la mortalité et les pertes de poids, elles, sont attendues dès les premières semaines.
Objectifs
Malgré la disponibilité de vaccins prophylactiques, les infections virales respiratoires restent insuffisamment contrôlées à l’échelle mondiale. L’efficacité limitée des stratégies actuelles s’explique notamment par la grande diversité antigénique des virus, leur capacité à franchir la barrière d’espèce, la durabilité restreinte de l’immunité induite par l’infection ou la vaccination, ainsi que par une réponse vaccinale souvent suboptimale chez les populations vulnérables. À cela s’ajoutent des facteurs sociétaux tels que l’hésitation vaccinale. Ces limites soulignent la nécessité de développer des approches antivirales alternatives et/ou complémentaires. Dans ce contexte, notre projet vise à développer une plateforme innovante dédiée à la prévention des infections virales respiratoires, avec un focus particulier sur le virus de l’influenza A (grippe). S’appuyant sur des données préliminaires solides et sur l’expertise conjointe de spécialistes en vaccination et en administration par voie respiratoire, ce projet ambitionne de concevoir de nouvelles stratégies d’immunoprophylaxie ciblant directement les muqueuses respiratoires. L’objectif principal est de concevoir et d’évaluer des candidats vaccins par la voie respiratoire, afin d’optimiser la réponse immunitaire locale et systémique. Ces approches seront administrées par voie nasale ou pulmonaire, dans le but d’induire une protection rapide, efficace et durable au niveau du site d’entrée des pathogènes. Ce projet vise ainsi à répondre à des enjeux scientifiques et cliniques majeurs, en proposant des solutions mieux adaptées à la prévention des infections respiratoires, notamment dans des contextes d’émergence virale ou chez des populations à risque.
Bénéfices attendus
Le projet vise à développer et évaluer une vaccination nasale contre le virus influenza A (grippe), ciblant directement les muqueuses respiratoires pour limiter l’infection initiale et la transmission. Il permettra de caractériser les réponses immunitaires locales et systémiques, d’analyser leur durabilité et d’évaluer l’intérêt d’un rappel nasal en complément des vaccins classiques par exemple. Les résultats contribueront à valider des formulations transposables à l’Homme et à renforcer le développement de stratégies prophylactiques innovantes contre les infections respiratoires.
Procédures
Au maximum, chaque souris pourra être soumise à deux vaccinations, réalisées soit par instillation intranasale, soit par administration oro-trachéale, sous anesthésie gazeuse (isoflurane). Chaque intervention durera environ 2 à 5 minutes, incluant l’induction anesthésique et le geste technique. Une semaine après la dernière vaccination, les animaux des procédures concernées pourront être soumis à une infection intranasale par le virus Influenza, sous anesthésie gazeuse, d’une durée d’environ 2 à 5 minutes. Tout au long de l’expérimentation, une prise de sang hebdomadaire pourra être réalisée (4 prélèvements maximum au total selon la durée du protocole), chaque prélèvement durant quelques secondes à 1 minute maximum. Pour les animaux soumis à l’infection influenza (procédures concernées), un suivi clinique post-infection sera réalisé, comprenant pesée, observation comportementale et score clinique, en quelques minutes par animal. La fréquence et le nombre exacts d’interventions dépendront de la procédure expérimentale concernée.
Impact sur les animaux
La vaccination intranasale a été administrée, dans notre laboratoire, chez des souris BALB/c et K18-hACE2 sans effet secondaire observé. Classée légère, cette procédure implique une manipulation respiratoire et une anesthésie ; toutes les précautions sont prises pour limiter gêne et stress. La vaccination oro-trachéale (intrapulmonaire) permet une délivrance reproductible de la solution dans les poumons. Réalisée sous anesthésie gazeuse à l’aide d’un cathéter, elle est classée modérée en raison de son caractère invasif et des risques respiratoires potentiels. Le prélèvement sanguin, classé léger, est effectué par ponction du sinus submandibulaire sur animal vigile. La douleur est limitée à la piqûre, le stress est généralement très bref. Cependant ce geste, peut entrainer un hématome au site de ponction. Le nombre de prélèvements est limité à 1 ponction maximum par semaine et par animal, en respectant les volumes sanguins autorisés (100μL de sang maximum). Les infections respiratoires sont généralement peu douloureuses car le poumon n’est pas un organe nociceptif. Toutefois, elles entraînent une inflammation et une gêne respiratoire pouvant devenir douloureuse selon l’intensité. Dans le modèle d’infection grippale chez la souris, les signes cliniques apparaissent entre J2 et J5 post-infection selon la dose et l’effet vaccinal, avec un pic entre J7 et J9. Ils incluent une perte de poids liée à une altération des comportements (prostration, anorexie, réduction de la prise d’eau, pelage hirsute). L’amélioration survient progressivement entre J10 et J12 avec retour au poids initial. Cette procédure est classée comme sévère en raison du stress physiologique et d’une mortalité possible chez les animaux non vaccinés.
Devenir
Mise à mort des animaux pour prélèvements de tissus biologiques voués à l’étude scientifique.
Remplacement
L’étude des réponses immunitaires de l’hôte ne peut pas être réalisée sans expérimentation animale. En effet, les études in vitro ne tiennent pas compte de la complexité des coopérations cellulaires et de l’environnement biologique (interaction cellulaire, recrutements cellulaires, etc.). Cependant, nous investiguerons au maximum possible la mise en place d’étude in vitro complémentaire.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés dans ce projet est réduit au minimum nécessaire. Avant toute expérimentation chez l’animal, les candidats vaccins sont d’abord testés en laboratoire sur des modèles in vitro. Seuls les candidats les plus prometteurs sont ensuite évalués chez l’animal. Le protocole expérimental a été conçu de manière à obtenir des résultats fiables tout en limitant le nombre d’animaux. Plusieurs types d’analyses sont réalisés à partir d’un même animal (réponse immunitaire, analyses des tissus, présence du pathogène), et les organes prélevés sont utilisés pour différentes études. Cette approche permet de maximiser les informations obtenues sans augmenter le nombre d’animaux. Le nombre d’animaux par groupe ainsi que l’organisation des expériences ont été soigneusement calculés afin d’assurer la validité scientifique des résultats tout en évitant toute utilisation excessive. Les deux sexes sont inclus dans l’étude afin de prendre en compte les différences biologiques éventuelles entre mâles et femelles. Chaque groupe comprend un nombre équilibré d’animaux des deux sexes. Les résultats sont analysés à l’échelle du groupe, avec la possibilité d’examiner également l’influence du sexe si nécessaire. Dans l’ensemble, ce projet vise à trouver un équilibre entre la qualité scientifique des résultats et la réduction du nombre d’animaux utilisés.
Raffinement
Les animaux sont hébergés en groupe dans des cages enrichies (matériaux de nidification et éléments favorisant leur comportement naturel). Tout au long de l’étude, leur état de santé est surveillé plusieurs fois par jour par du personnel formé, afin de détecter rapidement tout signe de gêne ou de souffrance. Une attention particulière est portée dans les jours suivant l’infection, période durant laquelle les effets sont les plus susceptibles d’apparaître. Des mesures sont mises en place pour faciliter l’accès à la nourriture et à l’eau, notamment pour les animaux les plus affectés (par exemple, mise à disposition de nourriture adaptée directement dans la cage). L’utilisation de traitements antidouleur ou anti-inflammatoires n’est pas possible dans ce modèle, car ils pourraient modifier les résultats de l’étude. Toutefois, des critères d’arrêt stricts sont appliqués afin de prévenir toute souffrance excessive et garantir le bien-être des animaux.
Choix des espèces
Ce projet est réalisé avec des souris adultes, dont le système immunitaire est pleinement développé. La souris est un modèle couramment utilisé pour l’étude des réponses immunitaires et du développement de vaccins. Elle présente des similitudes importantes avec l’Homme, ce qui permet d’obtenir des informations pertinentes pour la recherche en santé. Différents types de souris sont utilisés afin d’étudier de manière complémentaire les différentes composantes de la réponse immunitaire. Cela permet d’évaluer à la fois la production d’anticorps et les réponses immunitaires plus complexes. L’utilisation de l’animal est nécessaire dans ce projet, car la réponse immunitaire implique de nombreux mécanismes et interactions entre différents organes, notamment les voies respiratoires. Ces phénomènes ne peuvent pas être reproduits entièrement en laboratoire sur des modèles non animaux. Ce modèle permet également de suivre l’évolution de l’infection et de la réponse immunitaire dans le temps, dans un organisme entier. Enfin, les expériences sont conçues de manière à optimiser les données obtenues à partir de chaque animal, notamment en réalisant plusieurs analyses à partir des mêmes échantillons, afin de limiter le nombre total d’animaux utilisés.
Etude des séquelles métaboliques de la malaria cérébrale par imagerie 1/2
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Jusqu'à huit examens d'imagerie sous anesthésie gazeuse, dont quatre de quatre-vingt-dix minutes, dix injections intrapéritonéales quotidiennes et six gouttes de sang prélevées à la queue : 84 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Celles qui sont infectées développent une perte de poids, des poils hérissés, une léthargie, une chute de la température corporelle, une faiblesse musculaire et des troubles de la conscience, et une partie d'entre elles est tuée après un unique examen, sans traitement. Il s'agit de mesurer par imagerie comment le cerveau utilise le glucose après guérison d'une malaria cérébrale, et de chercher une inflammation résiduelle. Le porteur retient la souris parce que les déficits neurologiques y ressemblent à ceux des enfants, et parce que le parasite employé, spécifique de cette espèce, a selon lui l'avantage "de ne présenter aucun risque pour l'expérimentateur humain".
Objectifs
La malaria, aussi appelée paludisme, est une maladie parasitaire grave transmise par les moustiques. En 2024, elle a touché 282 millions de personnes et causé plus de 610 000 décès, surtout en Afrique, selon l’Organisation mondiale de la santé. Les enfants de moins de 5 ans sont les plus vulnérables, en particulier lorsqu’ils développent une complication sévère touchant le cerveau appelée malaria cérébrale. La malaria cérébrale provoque des convulsions, une altération de la conscience pouvant aller jusqu’au coma et entraîner le décès. Même après guérison, certains enfants gardent des séquelles : troubles de la mémoire, difficultés à marcher ou à parler, crises d’épilepsie, ou problèmes de concentration. Ces séquelles, souvent ignorées, peuvent handicaper leur développement et leur scolarité, avec des conséquences durables pour eux et leur famille. Pour étudier les séquelles cérébrales à court et moyen termes, nous utilisons des souris comme modèle. Nous les infectons avec un parasite similaire à celui qui provoque la malaria chez l’humain, puis nous les soignons avec un médicament antipaludéen dès qu’elles montrent des signes de complication cérébrale. Grâce à des techniques d’imagerie médicale aussi utilisées chez l’humain, nous avons déjà observé des anomalies persistantes plusieurs mois après la guérison. Par exemple, le cerveau semble avoir des difficultés à utiliser correctement le sucre (glucose), qui est sa principale source d’énergie. Cela pourrait être dû à une inflammation cachée qui persisterait même après la disparition du parasite. Notre objectif est de mieux comprendre ces anomalies pour développer des traitements qui pourraient limiter les séquelles. Nous allons étudier comment le cerveau des souris ayant eu la malaria cérébrale utilise le sucre et s’il existe une inflammation résiduelle. Nous espérons que ces recherches permettront un jour d’améliorer la prise en charge des enfants touchés par la malaria cérébrale, afin qu’ils puissent grandir et s’épanouir sans les conséquences de cette maladie.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à mieux comprendre les séquelles de la malaria cérébrale, une forme grave de la maladie qui touche principalement les jeunes enfants, notamment en Afrique. Pour cela, nous utilisons des souris comme modèle d’étude, car leur maladie ressemble beaucoup à celle des enfants. Grâce à des techniques d’imagerie médicale modernes, nous pouvons observer en détail ce qui se passe dans leur cerveau, de manière non invasive et avec des méthodes similaires à celles utilisées pour les humains. Des recherches antérieures par imagerie chez la souris ont déjà montré que la malaria cérébrale provoque un gonflement du cerveau, ce qui réduit l’apport en oxygène au cerveau, et représente la cause du décès chez les enfants. Ces observations ont été confirmées par la suite chez des enfants africains atteints de la maladie. Notre objectif principal est d’identifier les séquelles qui persistent chez les souris ayant survécu à la malaria cérébrale après avoir été traitées avec un médicament antipaludéen. Nous allons nous concentrer sur deux aspects importants : d’une part, les perturbations dans la manière dont le cerveau utilise le sucre, qui est sa principale source d’énergie, et d’autre part, la présence éventuelle d’une inflammation cachée qui pourrait persister même après la guérison et continuer à endommager le cerveau. Le sucre est essentiel au bon fonctionnement du cerveau, et un dysfonctionnement dans son utilisation pourrait expliquer certains troubles neurologiques observés, comme des difficultés d’apprentissage ou des crises d’épilepsie. Si nous parvenons à établir un lien entre ces perturbations métaboliques et une inflammation résiduelle, cela pourrait permettre de tester, dans de futures études, l’efficacité de traitements anti-inflammatoires pour réduire les séquelles chez les enfants. À plus long terme, cette étude pourrait aider à développer des outils pour mieux diagnostiquer les enfants à risque de complications après une malaria cérébrale, améliorer leur suivi médical en identifiant des signes précoces, et tester de nouveaux traitements pour limiter les dommages au cerveau. En somme, ce projet a pour but d’améliorer notre compréhension des effets durables de la malaria cérébrale afin de rechercher des traitements pour améliorer la vie des enfants touchés par cette maladie.
Procédures
Les animaux induits pour la malaria recevront une injection intrapéritonéale de globules rouges parasités. Ils subiront 2 prélèvements d’une goutte de sang espacés de 3 jours en moyenne, sur une période de 7 jours. Les animaux avec malaria qui seront traités par un médicament antipaludéen subiront deux prélèvements supplémentaires d’une goutte de sang chacun, effectués à 4 jours d’intervalle en moyenne, durant la période de traitement. Les animaux contrôles sains et les animaux avec malaria qui seront traités recevront au total 10 injections intrapéritonéales à l’état vigile (une injection quotidienne pendant 10 jours en alternant chaque jour le côté). Les animaux avec malaria non traités subiront un seul examen clinique par imagerie sous anesthésie gazeuse d’une durée de 45 minutes environ. Les autres animaux subiront, selon les groupes, soit une seule session de 4 examens cliniques par imagerie sous anesthésie gazeuse étalés sur une période de 10 jours, soit deux sessions de 4 examens (8 au total), chacune étalée sur une période 10 jours, le délai entre les 2 sessions d’imagerie étant de 60 jours. Pour chaque session d’imagerie, les deux premiers examens auront une durée d’environ 90 minutes et les 2 autres de 30 minutes. Deux des quatre examens d’imagerie de chaque session nécessiteront la mise à jeun des animaux pendant 4 heures ainsi que le prélèvement d’une à deux gouttes de sang pour mesurer la glycémie (3 gouttes au total pour une session d’imagerie, et 6 gouttes au total pour 2 sessions). Les animaux subiront 3 injections intrapéritonéales et une injection intraveineuse d’agents de contraste ou de traceurs sous anesthésie gazeuse, étalées sur 10 jours pour la réalisation de 4 examens d’imagerie (1 session). Pour 8 examens (2 sessions), ils subiront 6 injections intrapéritonéales et 2 injections intraveineuses effectuées sur une période de 3 mois.
Impact sur les animaux
Pendant cette étude, les souris pourraient subir plusieurs sources d’inconfort et de stress, bien que tout soit mis en œuvre pour limiter leur souffrance. D’abord, elles recevront des injections quotidiennes pendant 10 jours, alternativement sur chaque côté du corps, ce qui peut provoquer une gêne locale ou une légère douleur. Certaines souris subiront jusqu’à quatre injections différentes (médicaments, produits de contraste ou traceurs pour l’imagerie) selon les examens prévus. Les examens d’imagerie, bien que nécessaires, imposent aussi des contraintes : les souris seront placées sous anesthésie gazeuse à plusieurs reprises, ce qui peut causer un stress ou une désorientation au réveil. Certaines devront jeûner 4 heures avant certains examens, ce qui peut entraîner une sensation de faim ou d’inconfort. De plus, des prélèvements de sang (2 à 4 gouttes) seront effectués au niveau de leur queue, une procédure qui, bien que rapide, peut être légèrement douloureuse. Les souris infectées par le parasite de la malaria développeront des symptômes graves : perte de poids, poils hérissés, léthargie, puis une baisse dangereuse de leur température corporelle, une faiblesse musculaire et des troubles de la conscience. Certaines ne recevront pas de traitement et seront euthanasiées après un seul examen, tandis que d’autres, traitées avec un médicament, pourront malgré tout, souffrir d’une infection persistante.
Devenir
Les animaux utilisés en procédure 1 seront tous euthanasiés. Ces animaux atteints d’une forme mortelle de malaria ne peuvent survivre. Leur cerveau sera prélevé après le décès afin de collecter des informations sur le métabolisme du glucose et l’inflammation pendant la maladie afin de compléter les données d’imagerie in vivo. Les animaux utilisés en procédure 2 seront aussi tous euthanasiés. Leur cerveau sera prélevé après le décès afin de collecter des informations sur le métabolisme du glucose et l’inflammation après guérison de la malaria afin de compléter les données obtenues par imagerie in vivo. Ces données seront comparées à celles des souris contrôles de même âge.
Remplacement
Le recours à l’animal est incontournable car la détection des séquelles cérébrales et le suivi de leur évolution au cours du temps ne peuvent être réalisés que sur des animaux vivants. Il n'existe pas de méthodes alternatives in vitro ou in silico. Notre projet a pour objectif d’étudier à court et moyen terme l’évolution du neurométabolisme et de l’inflammation cérébrale. Le suivi des animaux sur plusieurs mois devrait permettre d’identifier les anomalies immédiates et/ou plus tardives, les éventuelles récupérations/compensations, ainsi que les effets combinés de l’âge.
Réduction
L’utilisation de techniques d’imagerie non invasives permettra de réduire le nombre d’animaux, grâce au suivi longitudinal de chaque individu. Un grand nombre de données sera recueilli sur un même animal dans des conditions de stress minimal, l’examen clinique par imagerie étant réalisé sous anesthésie gazeuse. La taille des groupes a été calculée à partir de données antérieures en utilisant un test statistique. Les données seront analysées au moyen d’une analyse statistique adaptée aux petits échantillons. Nous devrions ainsi générer des données robustes en utilisant le minimum d'animaux permettant de vérifier les hypothèses scientifiques du projet.
Raffinement
Le raffinement concernera toutes les procédures du projet ainsi que les conditions d’hébergement des animaux et devrait permettre de réduire le stress, l’angoisse et la douleur. En ce qui concerne l’induction de la malaria cérébrale et son traitement par la chloroquine, un examen clinique quotidien ou biquotidien permettra de déceler sans retard des signes d’aggravation neurologiques qui nécessiteraient de recourir à l’euthanasie en accord avec les points limites prédéfinis. Tous les examens cliniques par imagerie seront réalisés sous anesthésie gazeuse avec monitoring physiologique. Un délai d'acclimatation minimum de 14 jours et une habituation à l'expérimentateur seront assurés. Les animaux seront hébergés en groupes sociaux, avec cycle jour/nuit, nourriture et boisson ad libitum et enrichissement environnemental. Les cages contiendront des rondins de bois à ronger, du coton pour la nidification, un refuge, et une roue fast-track avec igloo afin de diminuer les comportements agressifs, réduire l’ennui, et favoriser l’expression d’un maximum de comportements naturels.
Choix des espèces
L’inoculation du parasite de la malaria chez la souris est un modèle validé et reconnu de la malaria cérébrale pédiatrique. De plus, les déficits neurologiques et cognitifs décrits dans ce modèle après guérison sont très proches de ceux rapportés chez l’Humain. Enfin, le parasite spécifique de la souris possède l’avantage de ne présenter aucun risque pour l’expérimentateur humain.
Evaluation de la réponse immunitaire de différents types de nanoparticules chez la souris.
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Trois injections intramusculaires dans la cuisse, échelonnées sur quatre semaines, sont administrées à chacune des 32 souris utilisées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur assimile ces injections à celles de n'importe quel vaccin et n'en attend que des "nuisances très superficielles", hématomes légers, contractures passagères et inflammation locale. Il annonce vérifier si ses nanoparticules peptidiques induisent une réponse immunitaire au même niveau que les vaccins à ARN messager du marché, tout en rapportant que l'étude précédente leur avait donné 20 à 66 % de réponses positives, contre 100 % pour la formulation commerciale. Toutes les souris sont tuées au trente-cinquième jour, le sang total étant prélevé pour obtenir des "volumes de serum conséquents".
Objectifs
Ce projet vise à améliorer les vaccins à ARN messager (ARNm), comme ceux utilisés contre la COVID‑19. Aujourd’hui, ces vaccins doivent être conservés à des températures très basses (entre –20 °C et –80 °C), car leur formulation est fragile et perd rapidement en efficacité. Nous développons une solution alternative à partir de petites molécules naturellement présentes dans le corps. Ces molécules permettent de transporter efficacement différents types d’ARN, de les conserver stables plusieurs semaines à 4 °C facilitant grandement le stockage et la distribution des vaccins. Des premiers tests montrent que ces molécules peuvent déclencher une réponse immunitaire. Nous allons donc comparer, chez l’animal, des vaccins formulés avec les deux formulations puis vérifier si les anticorps produits protègent bien contre une infection virale.
Bénéfices attendus
L’évaluation de l’efficacité des nanoparticules peptidiques à induire une réponse immunitaire au même niveau que celle générée par les vaccins à ARN messager actuels sur le marché permet d'ouvrir des perspectives intéressantes pour le développement de vaccins présentant une formulation, un transport et une conservation grandement simplifiés. Ce nouveau type de formulation pourrait permettre de réduire les couts de production des préparations vaccinales en allégeant fortement les contraintes pratiques associées à l’usage de nanoparticules lipidiques. Les résultats de ces études seront publiés et accessibles à la communauté scientifique et médicale.
Procédures
Le nombre d’intervention prévu chez les animaux sont au nombre de quatre. Une première injection intramusculaire d’une dose vaccinale est programmée le premier jour de l'étude. Une deuxième injection identique se déroulera au 14eme jour de l’expérimentation et une dernière injection réalisée le 28eme jour assurera un « rappel vaccinal ». Chacune des injections sera réalisée en moins d'une minute. L’animal sera euthanasié au 35eme jour et son sang collecté pour réaliser de analyses ultérieures.
Impact sur les animaux
LLes différents groupes recevront intramusculairerement dans la cuisse trois doses vaccinales d'un volume de 50 microlitres échelonnées sur 4 semaines (J0, J14, J28). Ces injections peuvent être considérées comme de simples injections réalisées pour n'importe quel type de vaccin (COVID19, Tétanos, DTPolio...). Elles ne devraient occasionner que des nuisances très superficielles (légers hématomes, contractures musculaires passagères, inflammation locale). Lors de la première phase, aucun signe n'a été observé pour les différents groupes traités
Devenir
Pour obtenir des volumes de serum conséquents, toutes les souris seront euthanasiées et le sang total sera prélevé afin de procéder aux dosages d’anticorps correspondants aux types de vaccins utilisés.
Remplacement
Ce projet a pour objectif de caractériser les réponses immunitaires induites par la plateforme vaccinale testée. Bien qu’il soit possible de réaliser des études in vitro avec des lignées cellulaires, il est impossible à l’heure actuelle de recréer in vitro la complexité des interactions entre les acteurs cellulaires et moléculaires impliqués dans le fonctionnement du système immunitaire d’un mammifère. Le modèle murin (souris) dont la physiologie est proche de l’homme permet d’étudier les réponses immunitaires induites par la vaccination. Ce modèle permet donc de générer des données indispensables avant d'envisager de tester dans le futur un vaccin sur des sujets humains.
Réduction
Nous nous efforçons de maximiser le nombre d'expériences réalisées tout en minimisant le nombre d'animaux utilisés. Pour établir la signification de la réponse immunitaire induite par nos préparations vaccinales, nous avons déterminé que des groupes de 10 animaux sont suffisants. En effet, les vaccins commerciaux actuellement sur le marché affichent des taux de réponse immunitaire d'environ 95%. Ainsi, nous avons obtenu dans l'étude précédente 100% de réponses positives à la vaccination dans le groupe ayant reçu les doses commerciales. Les groupes traités avec nos nanoparticules ont montré des taux de réponses de l'ordre de 20 à 66% seulement, ce qui constitue un écart clairement significatif. Le nombre d'animaux choisi (10 animaux par groupe) nous permet donc ainsi d'avoir un effet attendu significatif avec un écart-type acceptable.
Raffinement
Les animaux seront élevés dans des conditions d’hébergement qui respectent leur bien-être, tout en limitant le stress et la souffrance des animaux. Le suivi de l’évaluation de l’état de santé des animaux (grilles d’évaluations et points limites) sera strictement respecté, et effectué régulièrement en concertation avec l'équipe de zootechnie. Notre projet ne nécessite pas la mise en place de mesures de raffinement plus spécifiques.
Choix des espèces
Il s’agit de souris particulièrement adaptées à des études générales incluant des études de toxicologie, de pharmacologie ou de physiologie. Les choix de cette espèce animale reposent sur des résultats probants obtenus dans une étude préliminaire. Nous souhaitons ainsi confirmer une méthodologie alternative de préparations vaccinales pour induire une réponse immunitaire équivalente. Nous recevrons les animaux âgés de 2 mois et ils seront suivis pour une durée de 6 semaines. L’âge de deux mois pour les souris traitées correspond à l’âge auquel le système immunitaire est pleinement développé. Nous maintenons ce critère afin de reproduire au mieux les résultats antérieurs qui s’étaient montrées positifs.
Evaluation de l’effet analgésique et du traitement de l’inconfort oculaire chez le lapin et le rongeur.
- Recherche appliquée
- Maladies animales
- Troubles sensoriels
Rats : 2100
Lapins : 2100
6 300 animaux non-humains vont être utilisés, 2 100 souris, 2 100 rats et 2 100 lapins, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Ils reçoivent des instillations oculaires répétées plusieurs fois par jour, maintenus immobiles à chaque application, puis subissent des examens de la sensibilité cornéenne à l'esthésiomètre de Cochet-Bonnet, des mesures de la fente palpébrale à la règle et des observations comportementales que le porteur ne détaille pas. Provoquer chez eux un inconfort et une douleur oculaires, rougeurs et irritations comprises, est l'objet même du projet, qui vise ensuite à évaluer des traitements candidats. Environ 90 % sont tués pour des analyses histologiques de la rétine, de la choroïde et de la sclère, les 630 autres, écartés avant l'induction ou en cours de protocole, pouvant être réutilisés ailleurs. Le porteur affirme mener ces inductions dans le "strict respect des principes du bien-être animal".
Objectifs
L’objectif du projet est de développer et de mettre en œuvre, dans le strict respect des principes du bien‑être animal, des modèles expérimentaux induisant un inconfort léger à modéré chez l’animal. Ces modèles ont pour finalité de mieux comprendre les mécanismes de l’inconfort oculaire et de permettre l’identification, la caractérisation et l’évaluation de traitements candidats susceptibles de le prévenir ou de le réduire. L’ensemble des procédures est conçu de manière à minimiser la douleur, la souffrance et le stress des animaux, notamment par le recours à des méthodes non invasives, des durées d’exposition limitées et une surveillance régulière des paramètres de bien‑être. Les modèles expérimentaux utilisés représentent un compromis nécessaire entre la pertinence scientifique et l’application rigoureuse des principes des 3R (Remplacement, Réduction et Raffinement), afin de garantir une utilisation responsable et éthique des animaux à des fins de recherche biomédicale.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus de ce projet résident dans l’identification, la caractérisation et la sélection de nouveaux traitements susceptibles d’améliorer la prise en charge clinique de l’inconfort et de la douleur oculaires. Les résultats obtenus pourraient contribuer au développement de stratégies thérapeutiques plus efficaces et mieux tolérées, visant à soulager les patients présentant des affections oculaires associées à une altération du confort visuel et du bien‑être. À terme, ce projet pourrait ainsi participer à l’amélioration de la qualité de vie des patients, en favorisant l’accès à des options thérapeutiques innovantes et mieux adaptées aux besoins cliniques, tout en répondant aux exigences actuelles de sécurité, d’efficacité et de tolérance.
Procédures
Tous les animaux recevront des instillations oculaires conformément au protocole expérimental. Ils seront maintenus immobile pendant quelques secondes pour permettre l'application topique. Ces administrations sont répétées plusieurs fois par jour et étalées sur un ou plusieurs jours selon la procédure choisie. Les examens réalisés dans le cadre des évaluations sont non invasifs et ne durent que quelques minutes. Ils reposent principalement sur des observations comportementales, sur l’évaluation de la sensibilité cornéenne à l’aide d’un esthésiomètre de Cochet‑Bonnet, la mesure de la fente palpébrale avec une règle et l'apparence de la surface oculaire. Ces examens, conçus pour limiter au maximum toute gêne ou contrainte pour l’animal, peuvent être répétés plusieurs fois au cours de la même journée en fonction du plan expérimental, sans impact significatif sur le bien‑être animal, il dure chacun quelques secondes à quelques minutes. L'animal est alors maintenu afin qu'il reste immobile pour permettre l'évaluation. L'ensemble de ces interventions seront étalées sur une journée.
Impact sur les animaux
Le projet a pour but de trouver des traitements à la douleur ou à l'inconfort oculaire. Les animaux vont sur une courte période ressentir un inconfort ou une douleur modérée. Des rougeurs et des irritations ponctuelles et réversibles pourront aussi apparaitre.
Devenir
À l’issue de la procédure expérimentale, l’ensemble des animaux ayant suivi la totalité du protocole pourront être euthanasiés de manière éthique et conforme à la réglementation, afin de permettre les analyses ex vivo nécessaires. Ces analyses pourront comprendre notamment : des études histologiques des structures oculaires (rétine, choroïde, sclère), des dosages biochimiques ou moléculaires, ainsi que des évaluations morphologiques complémentaires indispensables à la validation scientifique des résultats. En revanche, les animaux non inclus dans l’intégralité de la procédure, estimés à environ 10 % (hors exclusions pour atteinte d’un point limite), pourront être réutilisés dans d’autres protocoles compatibles, sous réserve de l’avis favorable du vétérinaire responsable. Il en va de même pour les animaux retirés avant l’induction pour une anomalie anatomique ou physiologique, un défaut oculaire préexistant. Ces individus n’auront subi ni induction, ni administration de traitement expérimental. Ils n’auront été exposés qu’à des examens non invalidants, sans conséquences durables. Dans ces conditions, leur réutilisation éventuelle s’inscrit pleinement dans les principes des 3R, en permettant une réduction du nombre total d’animaux utilisés tout en garantissant la protection du bien‑être animal et le respect des exigences scientifiques du projet.
Remplacement
L’œil est un organe sensoriel d’une grande complexité, constitué de structures anatomiques et physiologiques étroitement interconnectées (cornée, cristallin, rétine, choroïde, sclère, nerf optique), jouant un rôle central dans la perception sensorielle et la réponse aux stimuli irritatifs ou nociceptifs. Le maintien du confort oculaire repose sur des équilibres mécaniques, physicochimiques et biologiques précis, ainsi que sur une innervation et une vascularisation fonctionnelles. Toute perturbation de ces équilibres peut conduire à l’apparition d’inconfort ou de douleur oculaires. Bien que des approches alternatives telles que les cultures cellulaires, les organoïdes ou les modélisations in silico aient progressé ces dernières années, elles demeurent insuffisantes pour reproduire l’ensemble des interactions structurelles, fonctionnelles et pharmacocinétiques impliquées dans la genèse et la modulation de l’inconfort et de la douleur au sein d’un œil vivant. Ces modèles ne permettent notamment pas de simuler de manière fiable les réponses tridimensionnelles des tissus oculaires, l’intégration des signaux sensoriels et nociceptifs, ni les réponses cliniques et comportementales associées. Dans ce contexte, l’étude in vivo reste indispensable pour atteindre les objectifs du projet. Elle permet d’observer de manière intégrée et dynamique les mécanismes physiopathologiques impliqués dans l’apparition de l’inconfort et de la douleur oculaires, d’évaluer l’efficacité et la tolérance de traitements administrés par voie oculaire ou systémique, et d’étudier leurs effets à court et à long terme sur les différents tissus oculaires au sein d’un environnement physiologique complet, intégrant innervation, vascularisation et régulations neurosensorielles.
Réduction
Le nombre maximum d’animaux prévu pour ce projet a été déterminé en fonction de la distribution théorique rencontrée dans les données bibliographiques et historiques de l'établissement, du nombre d'études estimées et tient compte des variations du métabolisme, de la robustesse des mesures et de notre expérience. Ce nombre limité doit nous permettre de conclure sur l’efficacité ou non d’un traitement. L'effet d'un traitement sera évalué à chaque moment à l'aide de tests statistiques. Un calcul de l’effectif sera réalisé avant chaque étape afin d’ajuster et de revoir à la baisse si possible le nombre d’animaux à inclure dans les procédures. De plus, dès que les procédures expérimentales le permettront, des évaluations non invasives seront choisies tout au long du projet pour améliorer la condition animale et éviter la mise à mort inutile des animaux. De même, l'analyse des deux yeux sera privilégiée autant que possible afin de réduire le nombre d'animaux utilisé.
Raffinement
Un suivi quotidien des animaux sera effectué afin de minimiser au maximum l’impact des procédures sur leur bien-être. Les rongeurs seront placés en groupe dans des cages d’hébergement contenant nourriture et boisson ad libitum et enrichissement à ronger et un abri. Les lapins seront placés individuellement ou par deux dans des cages avec boisson ad libitum, nourriture et enrichissement à ronger. Les examens non invasifs choisis pour évaluer les signes cliniques sont semblables à ceux pratiqués chez l'homme en cabinet ophtalmologique ou chez l’animal en cabinet vétérinaire. Des points limites adaptés, suffisamment prédictifs et précoces permettent de limiter une éventuelle douleur à son minimum. Ce projet a été soumis pour évaluation à un comité d’éthique et sera suivi par la structure en charge du bien-être animal de l'établissement.
Choix des espèces
Les modèles expérimentaux présentés sont largement utilisés et décrits sur le lapin et le rongeur dont les publications de référence citées sur lesquelles le projet est basé. Le lapin sera choisi pour la taille de son œil. Les observations des paramètres observées en sont facilités. Si la quantité de produit à évaluer est limitée (difficulté à synthétiser, coût), le rongeur sera alors choisi. Il le sera aussi si des analyses histologiques spécifiques sont nécessaires, le catalogue d’anticorps par exemple y est plus développé. Enfin le choix de l’espèce, sera guidé aussi par les données existantes sur le produit à évaluer (spécificité d’action, données historiques sur l’espèce choisie). C’est pour ces raisons que des souris, des rats et des lapins ont été retenus pour tenir compte des particularités anatomiques et physiologiques de chaque espèce afin d’augmenter les chances de mener ce projet à terme. Les animaux seront de jeunes adultes : les rongeurs auront un minimum de 6 semaines au début de l’étude et les lapins environ 8-12 semaines, ces âges correspondent à la maturité visuelle.
Production d’ascite sarcome TG180 chez la souris
- Production de routine
- Tests réglementaires
10 831 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, chacune servant à fabriquer environ 1 100 tests de diagnostic, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque souris reçoit une injection de cellules de sarcome TG180, puis développe pendant quatorze jours une ascite abdominale qui lui fait prendre jusqu'à 50 % de son poids initial, avant d'être tuée pour que ce liquide soit prélevé. Le porteur compare cet état à une gestation, indique que les souris continuent à se toiletter, à se déplacer et à se nourrir, et écrit que la méthode ne demande pas d'analgésie du fait de son caractère "peu invasif". Douze références de réactifs marqués CE dépendent de cette production, et le porteur écrit que certaines ont déjà pu être produites in vitro, ce qui a divisé par deux le nombre de souris utilisées, l'arrêt complet restant conditionné au rythme des autorisations de commercialisation des nouveaux produits.
Objectifs
L’ascite de souris sarcome TG 180 est utilisée dans la production de 12 références de tests de diagnostic in vitro de pathologies humaines à forte mortalité ou graves conséquences parmi lesquelles nous retrouvons la toxoplasmose, les troubles thyroïdiens, différents cancers, l’anémie, des bilans hormonaux, des marqueurs d’allergies respiratoires… Tous les réactifs concernés sont marqués CE conformes à la directive européenne.
Bénéfices attendus
Ces tests de diagnostics sont basés sur une méthode immuno-enzymatique, reposant sur la capacité d’un anticorps à reconnaître et à se lier spécifiquement à une molécule appelée alors antigène. Ces principes immunologiques sont exploités pour révéler une molécule d’intérêt présente dans l’échantillon du patient grâce à un/des anticorps spécifique(s) présent(s) dans le réactif. Une souris permet la fabrication d’environ 1100 tests de diagnostic. L’ascite TG180 de souris est utilisée pour éliminer des réactions non-spécifiques éventuellement dues à la présence d’anticorps anti-souris dans l’échantillon du patient et pouvant amener à un faux résultat.
Procédures
Une injection sur souris vigile d’une durée 15 secondes maximum Un prélèvement sur animal préalablement euthanasié.
Impact sur les animaux
L’injection de cellules à des souris de 30g, provoque la production d’ascite après 14 jours d’incubation, avec une prise de poids n’excédant pas 50% du poids initial. Cette production provoque un inconfort comparable à une gestation. Toutefois les souris continuent à se toiletter, à se déplacer, à se nourrir, à boire ou à interagir.
Devenir
L’ensemble des animaux est euthanasié en vue de prélever leur ascite. En aucun cas ce prélèvement s’effectue sur animal vigile.
Remplacement
Le redéveloppement de ces tests de diagnostic nécessite de définir les matières de substitution, sans compromis aucun sur la qualité des tests, en maintenant donc les performances des tests à leur niveau actuel. Il s’agit là d’un programme d’innovation s’étendant sur des années. La réduction de l’utilisation du nombre de souris sera donc progressive et fonction du rythme d’obtention des autorisations de commercialisation des nouveaux produits dans les pays où ils seront commercialisés.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisé est calculé au plus juste suivant les besoins nécessaires pour la fabrication de l’ensemble des kits dans lesquels rentrent le produit. Dans le passé un gros travail de sélection des souches, visant à sélectionner des souches les plus productives avec un niveau de qualité supérieur, a été effectué permettant d’avoir aujourd’hui une productivité optimisée et constante. Ce travail a permis, au fil du temps de diminuer le nombre d’animaux utilisés pour le même volume de produit. L’ascite entre dans la composition de nombreux kits de dépistage de maladie humaine. Aujourd’hui certaines références ont pu être produites in-vitro permettant de s’affranchir de l’utilisation de ce produit. Cette avancée a permis de diviser par deux le nombre d’animaux utilisés. Les essais vont continuer dans cette voie afin de diminuer voire arrêter cette production dans le futur.
Raffinement
Les souris réceptionnées sont acclimatées à leurs nouvelles conditions d’hébergement pendant 14 jours Les animaux sont hébergés sur litière sciure. Des lanières cartons sont introduites dans chaque caisse permettant aux souris de construire un nid. Un tunnel en PVC est également placé dans les caisses permettant aux souris de se cacher. Tous ces éléments assurent l'enrichissement du milieu. Un suivi quotidien et individuel permet en cas d’apparition de signe clinique lors du protocole, l’application de points limites prédictifs adaptés afin de limiter toute souffrance animale. Cette méthode ne nécessite pas de recours à l’analgésie du fait de son caractère peu invasif. Une observation attentive des animaux n’a pas montré d’altération significative du comportement des animaux, mais plus un inconfort lié à la prise de poids du fait de la production d’un volume conséquent d’ascite, comparable à un état de gestation.
Choix des espèces
La spécificité d’espèce est requise car la fonctionnalité de ces anticorps est de neutraliser les interférences anti souris présentes dans les échantillons humains. Les animaux utilisés sont des souris de 21-39g. La spécificité d’espèce est requise car la fonctionnalité de ces anticorps est de neutraliser les interférences anti souris présentes dans les échantillons humains.
Comparaison des effets de différents extraits de Rosmarinus officinalis sur la cardioprotection et la cytoprotection suite à un stress
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
112 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent un extrait de romarin par voie orale pendant dix jours, ce qui peut selon le porteur provoquer des douleurs modérées, puis, aux jours huit et neuf, une injection dans le péritoine d'une molécule qui déclenche un stress cardiaque et peut accélérer leur rythme cardiaque. Le bénéfice avancé, une prévention de l'infarctus pour les patients qui ne peuvent pas pratiquer d'activité physique, dépend d'abord de savoir laquelle des formulations comparées protège le mieux du stress oxydant. Le porteur écrit que des expérimentations sur cellules ont déjà été conduites et conclut que le recours à l'expérimentation animale est "nécessaire" pour évaluer le passage de la molécule dans le sang.
Objectifs
Explorer le rôle protecteur cardiaque des extraits de Romarin (Rosmarinus officinalis), sera déterminant dans le cadre de la prise en charge préventive de patients à risque d’infarctus du myocarde. Notre objectif sera de comparer des effets protecteurs et anti-oxydants de différents extraits et différentes formulation de R. Officinalis sur des rongeurs, suite à une injection de molécule mimant un stress cardique modéré.
Bénéfices attendus
Explorer le rôle cytoprotecteur des phytonutriments issus d'extraits de Romarin, sera donc déterminant dans le cadre de la prise en charge préventive de patients à risque d’infarctus du myocarde (IdM). Notre approche permettra de déterminer quelle formulation est la plus efficace pour protéger du stress oxydant dans le coeur. Des stratégies préventives cardio-vasculaires sont peu nombreuses et sont très attendues pour certains patients ne pouvant pas réaliser le traitement préventif de référence (activité physique).
Procédures
Les animaux subiront chacun un traitement par voie orale pendant 10 jours (intervention évaluée à moins de 15 minutes). Puis dans l'heure suivant cette prise orale, aux jours 8 et 9, une injection de molécule entraînant un stress cardiaque modéré sera injectée.
Impact sur les animaux
Le traitement oral peut être à l’origine de douleurs modérées ou de stress pour l’animal. Il n'y a pas d'effets toxique attendus à ces doses. Nous n'attendons pas d'effets délétères pour les animaux à la dose utilisée par voie orale. Les deux doses de molécules entrainant un stress cardiaque modéré aux jours 8 et 9 du protocole par voie intra-péritonéale peuvent entrainer des rougeurs au point d'injection. De plus, la molécule entrainant un stress cardiaque modéré (une tachycardie peut être observée), donc dans l'heure suivant l'injection les animaux seront sous surveillance. L'ensemble des prélèvements sera réalisé post-mortem après pré-anesthésie puis anesthésie léthale.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de la procédure afin de permettre le prélèvement d'organes cibles.
Remplacement
Des expérimentations sur cellules ont été conduites pour évaluer les différents mécanismes qui impactent la fonction des cellules cardiaques et vasculaires. Cependant la question posée ici est complexe et l’évaluation de l’effet des molécules, de leurs extractions et de leurs formulations sur modèle animaux vivants est nécessaire afin d’évaluer la biodisponibilité (importance du passage de la molécule active dans la circulation sanguine) et l’efficacité biologique. L’intégration de l’expérimentation animale apparait donc nécessaire afin de compléter ce projet de recherche.
Réduction
Le nombre d'animaux a été établi pour permettre d'obtenir des résultats statistiques robustes et fiables. Ceci en se basant sur des résultats de la littérature scientifique et une analyse statistique permettant de déterminer le nombre minimum d'animaux à inclure pour démontrer une différence entre nos groupes. Les tests statistiques apropriés seront ensuite réalisés.
Raffinement
Le protocole a été conçu pour limiter au maximum le stress subit par les animaux. Les animaux seront acclimatés 7 jours après leur arrivé à l’animalerie avant toute procédure. Afin de permettre la formation de groupes sociaux, les souris sont hébergés en cages de 5 individus avec un enrichissement du milieu (tubes, coton, bâtons à ronger). La nourriture est standard ad libitum (à volonté) et un accès à de l’eau fraiche. La température et l’hygrométrie sont contrôlées. Les animaux sont visités quotidiennement par un personnel formé qui contrôle le bien-être des animaux à l’aide d’une fiche intégrant les différents point limites. Afin d’éviter toute douleur, les prélèvements seront réalisés post mortem suite à une anesthésie et une euthanasie. Durant toute la procédure expérimentale, les animaux seront suivis et en cas de douleur une injection d'analgésique est prévue. Afin d’éviter tout stress ou douleur, l’ensemble des prélèvements seront réalisés postmortem suite à une anesthésie et une euthanasie appropriée. Par ailleurs, durant toute la période d'hébergement des animaux, le bien-être des animaux sera évaluée par une grille de score présente en annexe. Il est prévu d'enrichir le milieu ainsi que l'alimentation. Lors de l'administration de la dose orale : les procédures seront réalisées par des personnels expérimentés ; et les animaux auront été au préalable habitués. Les animaux seront surveillés tout au long de la procédure pour s’assurer de leur bien-être. De plus, dans l'heure suivant l'injection de la molécule entraînant un stress cardiaque modéré, une surveillance accrue sera mise en place avec une grille de score adaptée présente en annexe.
Choix des espèces
La souris est un modèle de choix car la physiologie cardiovasculaire des rongeurs présente de grandes similitudes avec celle de l’homme. Le modèle rongeur a l’avantage de permettre des investigations depuis l’étage cellulaire et moléculaire jusqu’aux mesures in-vivo. L’utilisation du même animal pour différentes analyses permet de réduire le nombre d’animaux utilisés au cours du protocole expérimental. De plus, notre équipe est spécialisée dans l’étude des effets cardiovasculaires ce qui facilitera nos expériences et nos analyses biochimiques. Afin d’éviter des modifications liées au développement des animaux, les souris seront utilisés à un stade mature pour être représentatif d’une population adulte.