Souris

Valider un appareil neuf : 48 rongeurs, 24 souris et 24 rats, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués par inhalation de CO2 à l'issue. Le premier jour, une session de 6 minutes 20 délivre un choc électrique de 0,4 mA pendant une seconde, et le lendemain deux sessions de rappel, l'une de six minutes sur le contexte, l'autre de huit minutes sur les indices, mesurent la peur conditionnée. Le porteur écrit qu'il n'existe pas de méthode de remplacement et que le conditionnement de la peur chez le rongeur est la référence pour l'étude de la mémoire aversive. Le projet vise la seule confirmation que le matériel neuf donne les mêmes réponses que celui qu'il remplace.

Objectifs

L’objectif du projet est de valider le nouveau matériel en reproduisant le protocole de conditionnement de la peur chez le rat et la souris, et de confirmer que les réponses comportementales observées sont comparables à celles obtenues avec le dispositif précédent.

Bénéfices attendus

La validation du nouveau matériel permettra de s’assurer de la reproductibilité du protocole de conditionnement de la peur chez la souris et le rat, et de confirmer la comparabilité des résultats avec ceux obtenus précédemment. Elle assurera ainsi la fiabilité du nouvel équipement pour les études à venir.

Procédures

Les animaux seront soumis au test de conditionnement de la peur. Ce test comprend 3 sessions. Le premier jour, une session de 6 min 20 sec est réalisée durant laquelle un choc électrique (0.4 mA pendant 1 sec) est délivré. Le deuxième jour, 2 sessions de test sont réalisées. Une session de rappel contextuel d'une durée de 6 min a lieu le matin. Une session de rappel des indices d'une durée de 8 min a lieu l'après-midi.

Impact sur les animaux

Le protocole de conditionnement de la peur implique un stimulus aversif modéré, qui peut induire un stress aigu transitoire chez les animaux.

Devenir

Le test ne pouvant être répété, les animaux seront euthanasiés par inhalation de CO2 à l'issue de la procédure.

Remplacement

Il n'existe pas de méthode de remplacement. Le conditionnement de la peur chez le rongeur est le modèle de référence pour l’étude de la mémoire aversive.

Réduction

La variabilité des résultats obtenus avec ce nouveau dispositif n’étant pas encore connue, ce premier jeu d’animaux permettra d’en estimer la dispersion et de définir, pour les études futures, un effectif minimal adapté aux objectifs expérimentaux.

Raffinement

L'intensité du choc est faible (0,4 mA pendant 1 s) pour limiter la douleur. Les sessions sont courtes (6-8 min). Les animaux sont habitués aux manipulateurs et à la salle, logés avec enrichissement (nids), et observés attentivement avant/après chaque session.

Choix des espèces

Ces deux espèces couvrent les modèles utilisés dans le laboratoire. La validation sur souris et rat garantit la polyvalence du nouveau matériel pour les projets futurs. Les animaux seront utilisés au stade adulte jeune. Nous les réceptionnerons à l'âge de 8 semaines et ils seront testés à l'âge de 11 semaines.

3 800 rongeurs, 3 200 souris et 600 rats, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, chacun pouvant subir jusqu'à huit prises de sang en vingt-quatre heures et jusqu'à quatre-vingt-seize heures d'hébergement individuel en cage de collecte des urines et des fèces. Les molécules sont administrées par voie orale sans anesthésie, ou par injection sous anesthésie gazeuse. Tous sont tués à l'issue de chaque procédure pour prélever leurs organes. Le porteur présente ce travail comme une activité de plateforme, dont les résultats servent à décider de la poursuite ou de l'arrêt du développement d'une molécule.

Objectifs

Le développement d’un nouveau médicament est un processus long, qui nécessite de nombreuses étapes avant de pouvoir envisager son administration chez l’être humain. Il est notamment indispensable d’étudier son comportement dans un organisme vivant. Des équipements spécialisés permettent ainsi d’analyser comment une molécule est absorbée, distribuée dans les différents organes, transformée puis éliminée par l’organisme. Ces études permettent de déterminer si elle atteint bien les tissus ciblés, en quelle quantité, pendant combien de temps et par quelles voies elle est évacuée. Ces informations sont essentielles pour évaluer le potentiel d’une molécule innovante et accompagner son développement dans le cadre de projets de recherche scientifique et préclinique.

Bénéfices attendus

Les études menées par notre plateforme permettent de fournir des informations indispensables sur la répartition et la concentration de la molécule dans l’organisme, ainsi que sur sa persistance et ses voies d’élimination. Ces informations sont nécessaires pour évaluer la pertinence des molécules candidates et orienter la décision quant à la poursuite ou non de leur développement. D’un point de vue médical, une connaissance des paramètres de ces molécules dans des organismes vivants permettent une translation clinique de ces paramètres chez l’Homme.

Procédures

Un opérateur spécialisé réalisera une administration orale (30 secondes) sur un animal vigil ou une injection (30 secondes) sur animal sous anesthésie gazeuse. Des prises de sang(1 minute) seront réalisées : au maximum 8 sur une période de 24h par animal vigile. Certains animaux seront hébergés individuellement pendant maximum 96 heures dans des cages spéciales permettant de recueillir les urines et les fèces.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables relatifs à la manipulation sont potentiellement une douleur au niveau du site d’injection ou un stress lié à la contention des animaux lors de l’administration orale, un stress lors de la prise de sang et un stress avec parfois une légère perte de poids lié à l’hébergement individuel dans des cages spéciales permettant de recueillir les urines et fèces.

Devenir

Tous les animaux sont euthanasiés à l’issue de chaque procédure pour prélever leurs organes.

Remplacement

Bien que des études in vitro ou des études preuve de concept soient réalisées en amont pour l’ensemble des molécules, il n’est pas possible de recréer in vitro ou in silico la complexité d’un organisme entier avec tous les composants biologiques qui entrent en jeu. Dans le cadre d’une application future en santé humaine, il est donc indispensable de mener une étude in vivo.

Réduction

Afin de limiter le recours aux animaux, une sélection préalable des molécules d’intérêts sera réalisée in vitro. Pour chaque molécule retenue, une seule dose sera évaluée in vivo. Cette dose sera définie à partir des paramètres pharmacologiques obtenues in vitro et des données in vivo préliminaires déjà disponibles dans la littérature. Enfin, les analyses statistiques reposeront sur un nombre minimum d’animaux. Les molécules seront évaluées chez les deux sexes avec le nombre minimum d’animaux à manipuler, soit 3 à 5 animaux par sexe.

Raffinement

Dès leur arrivée, les animaux seront hébergés en groupe dans un environnement enrichi comprenant des maisons, des tunnels en carton, de la paille ou du mouchoir en papier pour leur nid et des bâtonnets en bois à ronger, pendant une période d’acclimatation d’au moins sept jours. Ils feront l’objet d’une surveillance quotidienne assurée par du personnel formé et habilité. Pour réduire ou supprimer le stress relatif aux administrations et aux prélèvements, ceux-ci seront réalisés dans une pièce au calme sans passage. La douleur engendrée est de courte durée et limitée par l’utilisation d’une anesthésie gazeuse lorsque cela est possible. Bien qu’il n’y ait pas, à priori, de douleur, souffrance et angoisse associées à l’administration des composés, les animaux seront sous surveillance accrue durant les 24H à 96H de la manipulation. Afin de détecter au plus vite tout signe de souffrance , une surveillance de leur état général et de leur comportement sera réalisée grâce à une grille de score et à l’utilisation de points limites définissant les circonstances potentielles pour lesquelles des prises en charge appropriées doivent être mises en place rapidement. Enfin, pour réduire ou supprimer le stress lié à l’hébergement individuel dans les cages spéciales permettant de recueillir les urines, les animaux maintiendront un contact visuel, olfactif et auditif car les cages sont transparentes, semi-ouvertes et localisées sur le même portoir dans la même pièce. De plus, des bâtonnets à ronger et des jeux suspendus seront ajoutés dans ces cages.

Choix des espèces

La souris et le rat sont des organismes-modèles reconnus pour l’étude de la physiologie et de la physiopathologie de l’être humain. Les animaux seront utilisés au stade jeune adulte, correspondant à une période où les principales fonctions physiologiques, métaboliques, rénales, cardiovasculaires et hépatiques sont matures et stabilisées. Ce stade permet d’obtenir des paramètres biologiques interprétables, tout en limitant les biais liés à la croissance, au développement postnatal ou au vieillissement. L’utilisation de jeunes adultes est ainsi adaptée aux objectifs du projet et cohérente avec les standards des études précliniques réalisées chez le rongeur.

Dépourvues de système immunitaire pour accepter la greffe de cellules cancéreuses humaines, et de ce fait plus fragiles face aux infections, 440 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection dans la veine de la queue sans anesthésie, une prise de sang par semaine pendant trois semaines, puis une injection de cellules tumorales sous la peau du flanc, la croissance de la tumeur étant suivie jusqu'à six mois. Le porteur indique que la tumeur sous-cutanée peut gêner la souris pour se déplacer et fragiliser la peau, et que la maladie peut entraîner fatigue, perte de muscle et perte de poids. Toutes seront tuées pour prélever leurs organes et leurs tumeurs et mesurer la toxicité de deux candidats médicaments, comparés à un traitement déjà administré à des patients.

Objectifs

Ce projet vise à mettre au point de nouveaux médicaments « intelligents » pour lutter plus efficacement contre le cancer. Ces médicaments transportent une substance toxique pour s'attaquer aux cellules cancéreuses tout en étant plus stables dans l'organisme. Cette stabilité permet au médicament d'être plus efficace sur la tumeur tout en réduisant les effets secondaires pour le patient. Après avoir testé plusieurs options en laboratoire (test in vitro sur cellules en culture), nous avons sélectionné les deux médicaments les plus prometteurs. Nous allons maintenant vérifier, chez la souris, quelle est la dose maximale que l'organisme peut supporter sans risque (test de toxicité) et mesurer leur capacité réelle à réduire la taille des tumeurs. Nous allons faire le test en comparant ces nouvelles molécules avec un médicament déjà utilisé pour le traitement de patients.

Bénéfices attendus

L'utilisation de ces médicaments de nouvelle génération représente une piste très prometteuse pour traiter le cancer de manière ciblée. Grâce à des technologies améliorées, cette stratégie permet d'attaquer directement les cellules cancéreuses tout en épargnant les tissus sains, ce qui limite les effets indésirables. Il a déjà été montré que ces agents sont capables de détruire des cellules cancéreuses (notamment issues de cancers du côlon) qui résistent habituellement aux traitements classiques. Nous espérons que cette étude confirmera l'efficacité de ces médicaments pour soigner des tumeurs solides, offrant ainsi aux patients une meilleure espérance de vie et une qualité de vie préservée durant leur traitement.

Procédures

Pour évaluer la sécurité de nos nouveaux médicaments, nous réaliserons une injection unique dans la veine de la queue (souris non anesthésiée, durée: 30s) de souris saines. Durant les trois semaines suivantes, nous effectuerons une prise de sang hebdomadaire pour surveiller leur état de santé (souris non anesthésiée, durée: 30s). Pour tester l'efficacité de nos traitements contre le cancer, nous injecterons des cellules tumorales sous la peau des souris, au niveau du flanc (souris non anesthésiée, durée: 1 min). Une fois que la tumeur aura atteint une taille définie, nous administrerons le médicament par voie intraveineuse dans la queue (souris non anesthésiée, durée: 30s). Nous observerons ensuite l'évolution de la tumeur sur une période pouvant aller jusqu'à 6 mois pour vérifier si le traitement permet de stopper sa croissance ou de la réduire. À la fin de l'étude, un prélèvement sanguin sera effectué (souris non anesthésiée, durée: 30s).

Impact sur les animaux

Les souris utilisées dans ce projet n'ont pas de système de défense contre les microbes, leur permettant d'accepter l'injection de cellules tumorales d'origine humaine. Par contre, cela les rend plus fragile vis-à-vis des infections. L’administration du traitement et les prélèvements de sang peuvent générer un stress et une éventuelle gêne temporaire. Le développement de la tumeur sous la peau peut gêner la souris pour se déplacer. La peau au niveau de la tumeur peut également se fragiliser. Comme dans de nombreux cancers, la maladie peut entraîner une fatigue générale, une perte de muscle et de poids. Enfin, le médicament injecté lui-même peut provoquer des effets secondaires, comme des troubles de la digestion ou une baisse de l'activité habituelle de la souris.

Devenir

Tous les animaux de l’étude seront euthanasiés pour prélèvements d'organes et de tumeurs post-mortem afin d’évaluer la toxicité des molécules sur l’organisme et sur la tumeur.

Remplacement

À l'heure actuelle, aucun test sur des cellules isolées ne permet de reproduire fidèlement les interactions complexes qui existent au sein d'un organisme vivant. Dans le corps, les cellules cancéreuses ne sont pas seules : elles interagissent en permanence avec les cellules du système immunitaire, les vaisseaux sanguins et d'autres tissus environnants. Les modèles de laboratoire actuels sont trop simplifiés et ne permettent pas de simuler cet environnement complexe. Par conséquent, pour vérifier si ce nouveau traitement est réellement capable d'atteindre sa cible et d'agir efficacement sans causer de dommages imprévus, il est indispensable de le tester sur un modèle animal vivant entier, qui est le seul capable de refléter la complexité réelle de la maladie.

Réduction

Le nombre d'animaux a été précisément calculé à l'aide d'outils mathématiques pour utiliser le strict minimum nécessaire à l'obtention de résultats fiables et solides.

Raffinement

Afin de réduire au minimum la douleur et la souffrance qui pourraient être ressenties par les souris, nous prévoyons la mise en place de différentes actions. En raison de leur fragilité, les souris sont hébergées dans une structure répondant aux normes sanitaires requises avec de l’eau et de la nourriture à volonté. Des enrichissements sont mis en place (papier kraft pour la fabrication de nid, buchette en bois à ronger) afin que les animaux puissent répondre à leurs besoins primaires. Un suivi visuel quotidien (par les animaliers et/ou les expérimentateurs) des animaux est réalisé. Nous veillerons, par ailleurs, à réduire au minimum l’intensité et la durée des souffrances ressenties par les animaux. Trois fois par semaine, l'évaluation de signes cliniques sera réalisée à l’aide d’une grille d'évaluation comprenant différents critères comme l'apparence physique, le poids et le comportement des animaux. En fonction de la présence et de la catégorie du critère observé, différentes actions seront mises en place: augmentation du suivi clinique, accessibilité de la nourriture facilité et euthanasie de l’animal en cas d’attente de point limites.

Choix des espèces

La souris est l’espèce la plus couramment utilisée pour étudier l’effet de nouveaux médicaments sur la croissance des tumeurs. Pour ce projet, nous utiliserons des souris n’ayant pas de système immunitaire. Cela est indispensable pour que les cellules cancéreuses humaines puissent se développer chez l'animal et pour que nous puissions tester l’efficacité de nos traitements, qui sont spécifiquement conçus pour reconnaître des cibles humaines. Nous utiliserons des souris adultes pour l'ensemble des tests. Ce choix est important car les cancers que nous étudions touchent principalement des patients adultes ; il est donc nécessaire d'utiliser des animaux dont le stade de développement correspond à celui des personnes que nous souhaitons soigner à l'avenir.

Les souris sont tuées quand leur tumeur atteint un centimètre cube. Elles sont 210, immunodéficientes, utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit une injection de cellules tumorales et subit dix-huit mesures au pied à coulisse, 150 d'entre elles recevant trente injections intrapéritonéales en un mois et trente autres jusqu'à trente-huit, la tumeur sous-cutanée croissant sur trois à quatre semaines avec dos voûté, activité réduite et pelage moins soigné. Le porteur cherche à savoir si le blocage d'une protéine ralentit cette croissance et présente ces travaux comme une réponse à un "besoin médical pour les patients en impasse thérapeutique", perspective qu'il renvoie à une exploration clinique ultérieure.

Objectifs

Ce projet vise à mieux comprendre le rôle d’une protéine impliquée dans la progression du cancer du rein à cellules claires. Pour cela, nous utilisons des modèles expérimentaux murins permettant de reproduire la formation et la croissance de tumeurs afin d’étudier l’impact de cette protéine sur leur développement. L’objectif est de déterminer 1) si l’augmentation de cette protéine conduit à une croissance tumorale plus rapide, 2) si le blocage de cette protéine, à l’aide de nouveaux traitements utilisés seuls ou en association, permet de ralentir la croissance des tumeurs.

Bénéfices attendus

Ces travaux pourraient contribuer à développer de nouvelles approches thérapeutiques innovantes à explorer cliniquement, répondant à un besoin médical pour les patients en impasse thérapeutique avec les thérapies actuelles pour le cancer du rein.

Procédures

Les interventions suivantes seront réalisées sur animaux vigiles : 210 animaux : 1 injection de cellules tumorales (2 minutes) + 18 mesures de la taille tumorale au pied à coulisse (1 minute) ; 150 animaux : 30 injections en intrapéritonéale sur 1 mois (30 secondes) ; 30 animaux : 38 injections en intrapéritonéale sur 1 mois (30 secondes)

Impact sur les animaux

Les animaux peuvent présenter des effets liés à la croissance de la tumeur sous-cutanée, apparaissant progressivement sur une durée maximale d’environ 3 à 4 semaines. Cette croissance peut entraîner une gêne modérée se traduisant par une diminution de l’activité, une altération de la posture (dos voûté), une diminution de l’état général et un aspect moins soigné du pelage. À un stade plus avancé, des modifications locales au niveau de la tumeur peuvent apparaître, telles qu’une tension cutanée ou une rougeur. Les administrations répétées de traitements peuvent provoquer une gêne légère et transitoire au moment des injections, associée à un stress de courte durée lié à la manipulation des animaux. La contention nécessaire aux manipulations et au suivi peut également entraîner un stress léger et temporaire. Ces effets sont transitoires pour les manipulations et progressifs pour la croissance tumorale, qui constitue la principale source de gêne au cours de l’étude.

Devenir

Les animaux seront mis à morts pour effectuer des prélèvements lorsque la tumeur atteint 1 cm3.

Remplacement

À ce jour, aucun modèle alternatif ne permet de reproduire de manière complète les interactions entre les cellules tumorales et leur environnement dans un organisme vivant. L’utilisation d’un modèle murin reste donc nécessaire pour étudier la croissance tumorale et la réponse aux traitements dans des conditions proches de la réalité biologique. Les approches in vitro sont indispensables en amont mais ne permettent pas, à elles seules, de modéliser l’ensemble de ces interactions.

Réduction

Avant la mise en place du modèle in vivo, toutes nos expériences impliquant la surexpression et l’inhibition génétique ou pharmacologique de notre protéine d’intérêt ont été validées in vitro. Les doses et modalités d’administration ont été choisies sur la base de protocoles publiés et de données expérimentales antérieures, après revue de la littérature. Afin de réduire le nombre d’animaux utilisés, nous nous appuyons sur ces données pour définir les conditions expérimentales. La planification des expériences inclut également la mutualisation de certains groupes témoins afin d’optimiser le nombre d’animaux utilisés. Les analyses statistiques seront réalisées pour évaluer les effets des traitements, avec des effectifs adaptés pour permettre la détection des différences attendues.

Raffinement

Les souris immunodéficientes seront hébergées en cages ventilées individuellement sur portoirs adaptés afin d’assurer leur protection et de limiter le stress. Les expérimentateurs procéderont à une évaluation régulière (3 fois par semaine) de l’état général des souris à l’aide d’une grille de score, permettant de détecter toute altération du bien-être, notamment des changements de posture, de mobilité, de poids ou d’aspect général. Les points limites sont définis dans chaque procédure afin de permettre une intervention rapide si nécessaire et garantir le bien-être des animaux.

Choix des espèces

Nous utilisons la souris comme modèle expérimental car elle permet d’étudier la croissance tumorale et la réponse à de nouveaux traitements dans un organisme entier. Ce modèle est largement utilisé en recherche biomédicale en raison de la proximité de certains mécanismes biologiques avec l’humain et de la disponibilité de modèles reproductibles pour le type de cancer étudié. Les animaux utilisés sont des souris jeunes adultes âgées de 6 à 8 semaines à leur arrivée, correspondant à des animaux ayant atteint leur maturité sexuelle et présentant une physiologie stable, ce qui permet de limiter la variabilité entre individus et d’assurer la comparabilité des résultats expérimentaux.

Établir un lien causal entre le tissu adipeux intramusculaire et le métabolisme du glucose conduit à utiliser 2 232 souris, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections de glycérol ou de cardiotoxine dans le quadriceps sous anesthésie pour provoquer une lésion musculaire, des gavages quotidiens pendant cinq jours, des injections intrapéritonéales et des prélèvements sanguins caudaux allant jusqu'à 130 microlitres cumulés, une partie étant soumise à un régime enrichi en lipides dont le porteur écrit que l'inconfort "pourrait durer plusieurs semaines". La fonction musculaire est évaluée par trois tests nommés, agrippement, cadre inversé et endurance sur tapis roulant, et les souris sont tuées par groupes d'âge, à 2-3, 6-7, 12-13 ou 18-19 mois, pour la récolte des tissus. Le porteur écrit qu'un calcul de puissance est difficile à mettre en œuvre ici et qu'il s'est appuyé sur ses "habitudes expérimentales" pour fixer l'effectif.

Objectifs

L'augmentation du nombre de personnes âgées et/ou obèses constitue un enjeu majeur de santé publique. Ces 2 situations ont des conséquences (i) individuelles, favorisant la fragilité et la dépendance et (ii) sociétales, entrainant une augmentation des dépenses de santé. De plus, ce sont des facteurs de risque de pathologies telles que le diabète de type 2 (DT2), lié à des désordres du métabolisme glucidique, et la sarcopénie, liée à une diminution de la masse et de la force musculaire. Le vieillissement et l’obésité représentent deux contextes dans lesquels il y a émergence, au sein du muscle squelettique, d’un tissu adipeux intramusculaire (IMAT) dont les cellules matures sont les adipocytes intramusculaires. Ce tissu a été bien documenté dans les muscles squelettiques des animaux de rente, puisqu’il donne son goût à la viande, mais il n’existe que peu de données chez l’Homme. Toutefois, des données corrélatives semblent indiquer que la présence chronique d’IMAT pourrait participer à la perte de sensibilité à l’insuline musculaire participant à l’étiologie du DT2. Nos données préliminaires chez la souris sont encourageantes et vont dans le même sens. D’un autre côté des données observationnelles dans différents modèles murins de lésions musculaires, révèlent une émergence transitoire d’IMAT qui pourrait participer à la régénération musculaire nécessaire au maintien de la masse et de la force de ce tissu. C’est l’hypothèse que nous avançons. Il semble donc que l’IMAT via son abondance, sa cinétique d’apparition/disparition et/ou son phénotype soit un acteur important des fonctions métabolique et régénérative du muscle squelettique. Ce projet a comme objectif principal de montrer le lien causal entre (i) IMAT et désordres métaboliques glucidiques, principalement musculaires et (ii) IMAT et régénération musculaire ; ceci à l’aide d’un modèle murin transgénique dans lequel l’ablation spécifique et contrôlée des adipocytes intramusculaires, constituant l’IMAT, est possible. Afin d’avoir une étude la plus complète possible et étant donné le dymorphisme sexuel existant à la fois dans la composition corporelle (i.e. masses grasse et maigre), la régulation des métabolismes ou les capacités régénératives, des animaux femelles et mâles seront inclus dans cette étude. Ils seront étudiés à des âges physiologiques différents, afin de reproduire les effets de l’avancée en âge chez l’Homme. CE PROJET EST MULTISITE, IL SERA REALISE DANS 3 ETABLISSEMENTS UTILISATEURS.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra, pour la première fois, de mettre en évidence les effets d’un dépôt adipeux ectopique méconnu, l’IMAT sur l’homéostasie du muscle squelettique en fonction du sexe et de l’âge. Le muscle squelettique représente, en masse, le tissu le plus abondant de l’organisme et joue un rôle majeur dans certaines fonctions clés telles que la locomotion mais aussi dans la gestion de l’énergie, i.e. le métabolisme. Il devrait permettre, d’une part, d’obtenir des données nouvelles sur le contenu lipidique et le phénotype de l’IMAT (i.e. hypertrophie/ hyperplasie adipocytaire, inflammation, sécrétions, etc…), son évolution avec l’âge et/ou l’obésité mais également avec le sexe des individus. D’autre part, grâce à l’originalité du modèle de souris double transgénique permettant une diminution partielle ou totale de l’IMAT, il devrait permettre d’établir un lien causal (délétère ou bénéfique) entre ce tissu et les fonctions musculaires étudiées (i.e. métabolisme glucidique et régénération) selon le sexe, l’âge, le régime alimentaire et/ou le statut régénératif. Ce projet pourrait en particulier faire émerger des molécules actives (lipides, cytokines, etc…) explicatives des effets observés lors de l’obésité, du vieillissement ou bien de la régénération. A plus long terme, les connaissances générées par cette étude pourraient être exploitées en santé humaine puisque de nombreuses conditions pathologiques musculaires aiguës ou dégénératives sont caractérisées par un dépôt important d’IMAT. Nous anticipons que ces travaux pourraient donc avoir des répercussions sur le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques du patient en situation de fragilité musculaire résultant de l’avancée en âge, d’obésité ou même de myopathies.

Procédures

Dans les établissements utilisateurs 1 ou 3, la partie 1 du projet s’attellera à caractériser les désordres métaboliques glucidiques et l’IMAT en fonction de l’âge, du régime alimentaire et du sexe des animaux. Les animaux seront soumis à 2 tests consécutifs d'évaluation métabolique comprenant chacun 1 injection intrapéritonéale et des prélèvements sanguins caudaux (20 sec à 2 min/prélèvement, 130 μL de volume cumulé maximal). La partie 2 du projet étudiera le lien causal entre la présence d’IMAT et les désordres métaboliques glucidiques dans un modèle murin de lésion musculaire induite par l’injection intramusculaire de glycérol ou de cardiotoxine, facilitant le développement d’IMAT. Les animaux seront soumis à 1 injection unique dans le quadriceps sous anesthésie (moins de 10 min). Suivi, après 10 jours, de 2 tests consécutifs d'évaluation métabolique précédemment décrits. La partie 3 du projet étudiera le lien causal entre la présence d’IMAT et les désordres métaboliques glucidiques dans un modèle murin double transgénique permettant l’élimination sélective de l’IMAT, en fonction de l’âge, du régime alimentaire et du sexe des animaux. Les animaux seront soumis à un gavage 1 fois par jour pendant 5 jours (env. 20 sec). Suivi, après 2 semaines, d’une injection unique dans le quadriceps sous anesthésie (moins de 10 min). Puis, après 10 jours, de 2 tests consécutifs d'évaluation métabolique précédemment décrits. La partie 4 du projet concernera le lien causal entre la présence d’IMAT et la régénération musculaire dans un modèle de souris double transgénique permettant l’élimination sélective de l’IMAT, en fonction de l’âge et du sexe des animaux. Les animaux seront soumis à un gavage 1 fois par jour pendant 5 jours (env. 20 sec). Suivi, après 2 semaines, de 2 injections consécutives séparées de 4 jours dans le quadriceps sous anesthésie (moins de 10 min). La fonction musculaire d’une partie des animaux sera ensuite évaluée par différents tests non invasifs : agrippement, cadre inversé et endurance sur tapis roulant. Dans le second établissement utilisateur, des tests terminaux d’évaluation du métabolisme utilisant des radioélements seront réalisés à la place des tests classiques afin d’affiner la caractérisation des désordres métaboliques en lien avec l’IMAT et utilisant des radioélements seront réalisés. Ces tests comprennent 1 injection intrapéritonéale et deux prélèvements sanguins à la queue (20 sec à 2 min/prélèvement, 10 μL de volume cumulé maximal).

Impact sur les animaux

Plusieurs nuisances ou effets indésirables pourraient être observés dans cette étude : 1- Stress lié à la contention lors des gavages et lors des injections. La durée de cet effet indésirable sera réduit au minimum de part l’expérience de l’expérimentateur ; 2- Stress lié à l'isolement, lors des expériences de mesure de la composition corporelle, de la force musculaire ou lors du test d'endurance ; 3- Inconfort voire douleur lors du réveil des animaux anesthésiés pour la réalisation des injections intramusculaires ou pour leur identification par tatouage. Dans premières heures suivant la réalisation de l'injection intramusculaire, une mobilité réduite pourra être observée. Le geste chirurgical étant réalisé le matin et cet état de mobilité réduite n’étant que passager, il n’entrave pas la prise alimentaire la nuit suivante ; 4-Inconfort engendré par l’obésité résultant de la mise en régime enrichi en lipides. Cet inconfort pourrait durer plusieurs semaines ; 5- Stress lié au transport entre les deux des établissements utilisateurs (EU1 et 2) (5 à 10 min max).

Devenir

Comme indiqué dans les pagraphes concernant chacune des procédures expérimentales, les animaux seront nécropsiés en fin de procédure pour récolter des tissus d'intérêt. Ils seront mis à mort en fonction des groupes d'âge inclus dans les procédures: à 2-3 mois, à 6-7 mois, 12-13 mois ou à 18-19 mois.

Remplacement

A l’aide d’expériences réalisées in vitro avec des cellules humaines nous avons précédemment publié que les sécrétions des adipocytes musculaires obtenus en culture étaient capables de diminuer la réponse à l’insuline des cellules musculaires également obtenues en culture, appuyant l’hypothèse que l’IMAT pourrait être un régulateur du métabolisme glucidique musculaire et plus particulièremet des perturbations de ce métabolisme. Par ailleurs, nous avons également mis en évidence plus recemment des modifications du phénotype des adipocytes musculaires obtenues in vitro en fonction de l’age des volontaires dont étaient issues les biopsies musculaires. Ce sont ces données qui nous ont conduits à nous tourner vers l’animal. En effet, il est bien connu que la culture à a ses limites qui sont clairement ici (1) que les cellules (adipocytes et myocytes) n’arrivent jamais au stade terminal de différenciation donc sont des formes immatures des cellules observées in vivo et (2) qu’il est impossible dans un tel modèle d’imaginer l’impact sur le muscle en entier et sur l’organisme. Il est cependant évident qu’en fonction des résultats obtenus dans ce projet des expériences complémentaires sur des points mécanistiques précis seront réalisées sur des cultures primaires humaines et/ou murines qui permettent de par la capacité de prolifération des cellules de réaliser un certain nombre d’analyses.

Réduction

Pour déterminer le nombre d'animaux nécessaires et suffisants nous nous sommes essentiellement basés sur nos habitudes expérimentales, des expériences préliminaires et sur les variabilités inter-individuelles régulièrement constatées. En effet, un calcul de puissance est difficile à mettre en oeuvre étant donné le nombre de tests inclus dans la même procédure. Les tests statistiques qui seront mis en oeuvre seront des tests pour comparer des variables quantitatives uniques entre deux temps des procédures pour un même animal, un test différent pour comparer des variables quantitatives uniques entre deux groupes d'animaux, un autre test à une ou deux voies pour comparer des variables quantitatives continues entre plusieurs groupes d'animaux. D'autre part, grâce à l'utilisation d'un appareil permettant de mesurer la répartition des masses maigre et grasse, nous pouvons réaliser un suivi longitudinal de ces paramètres sans euthanasier les animaux. Enfin, récemment a été mis en place au sein de notre Institut un fichier de partage des tissus ou organes collectés lors des nécropsies, nous pensons proposer les tissus autres que nos tissus d'intérêt aux autres équipes de recherche.

Raffinement

Les animaux seront hébergés par fratrie dans des cages sur portoirs ventilés en respectant le nombre d'animaux indiqué dans la Directive Européenne 2010/63/UE. De l'enrichissement type feuille de papier, bâtonnet en bois ou igloo seront systématiquement ajoutés dans les cages. Un suivi quotidien sera réalisé soit par le personnel de la zootechnie soit par les expérimentateurs en charge du projet. La pesée hebdomadaire permettra une habituation à l'Homme et, le stress ainsi diminué, devrait diminuer la variabilité inter-individuelle dans les réponses mesurées. Le réveil de l'animal, après injection musculaire, se fera dans une cage posée sur un tapis chauffant ; du collyre sera appliqué sur l'oeil de l'animal qui aura été injecté. L'observation et la surveillance des animaux permettent d’appliquer des points limites précis et des critères d’arrêt des souffrances. Les animaux seront transportés entre les deux établissements suivant une procédure de transport déclarée lors de l’agrément de l’établissement (cheminement et conditions de transport validés par signature d’une charte de transport). Les cages d'origine des animaux sont placées dans des valises de transport adaptées à 2 cages permettent un isolement de la lumière et des conditions météorologiques extérieures. Le trajet se fait à pied (inférieur à 5 min), est pré-déterminé et évite la rencontre avec le public.

Choix des espèces

L’espèce Mus musculus (souris), mammifère proche d’Homo sapiens, est le modèle animal expérimental le plus étudié dans la littérature notamment pour les études physiologiques et métaboliques, ce qui permet de meilleures comparaisons et une certaine pertinence des résultats. Des animaux de différents âges seront inclus dans les procédures : 2-3 mois, 6-7 mois, 12-13 mois ou 18-19 mois. L'utilisation de ces différents groupes d'âge permettra, dans certaines procédures, d'étudier la cinétique d’évolution « naturelle » de certains paramètres (i.e. régulation du métabolisme, composition corporelle, développement du tissu adipeux intramusculaire, etc....) au cours d’une diète normale ou riche en graisses. Dans d'autres procédures, l'utilisation des animaux de différents groupes d'âge permettra de mettre en évidence l'impact du vieillissement sur certains processus (i.e. processus d'installation du diabète et rôle du tissu adipeux intramusculaire, processus régénératifs musculaires, etc ...). Les âges des souris de chaque procédure ont été choisis en fonction de résultats d’expériences préliminaires du laboratoire et de données rapportées dans la littérature.

Les femelles gestantes opérées sont tuées après le sevrage de leurs portées, et leur descendance après prélèvement du cerveau : 3 129 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. À 13,5 jours de gestation, chaque femelle subit sous anesthésie générale l'ouverture de la cavité abdominale, l'exposition des cornes utérines, une injection dans le cerveau des embryons et une électroporation, en trente minutes au maximum. Les souriceaux ainsi porteurs d'un médulloblastome reçoivent, pour une partie d'entre eux, deux injections par jour en contention entre le quatrième et le quatorzième jour de vie, et le porteur annonce des pertes embryonnaires, une croissance ralentie et des troubles neurologiques aux stades avancés. Il écrit que la mise à mort de l'ensemble des souris est justifiée par "la nécessité scientifique des analyses réalisées, l'impossibilité de réutilisation et la prise en compte prioritaire du bien-être animal".

Objectifs

Le médulloblastome est la tumeur cérébrale maligne la plus fréquente chez l’enfant et représente environ 20 % des cancers du système nerveux central pédiatrique. Il est lié à une croissance anormale de certaines cellules du cervelet, une région du cerveau impliquée dans la coordination des mouvements et l’équilibre. Normalement, ces cellules se développent de manière contrôlée au cours de l’enfance puis arrêtent de se multiplier. Lorsque ce processus est perturbé, elles peuvent se multiplier de façon excessive et former une tumeur. Des travaux récents suggèrent que des mécanismes moléculaires liés au développement normal du cerveau, ainsi que l’activité des neurones, pourraient influencer la croissance de ces tumeurs. Mieux comprendre ces interactions est essentiel pour progresser dans la compréhension de la maladie. L’objectif de ce projet est de mieux comprendre les mécanismes impliqués dans l’apparition et la progression du médulloblastome. Il vise à mettre en place un modèle expérimental chez la souris permettant d’étudier le développement de cette tumeur, à identifier les mécanismes moléculaires qui contrôlent la croissance des cellules tumorales, à étudier le rôle de l’activité des cellules nerveuses dans l’évolution de la tumeur et enfin, à explorer les interactions entre les cellules tumorales et leur environnement dans le cervelet. Les résultats permettront d’améliorer la compréhension de cette maladie et pourraient contribuer, à long terme, à l’identification de nouvelles approches thérapeutiques.

Bénéfices attendus

Le médulloblastome est la tumeur cérébrale maligne la plus fréquente chez l’enfant. Bien que des traitements existent, ils peuvent entraîner des effets secondaires importants et ne sont pas toujours efficaces à long terme. Il est donc essentiel de mieux comprendre les mécanismes qui contrôlent l’apparition et la croissance de ces tumeurs afin d’améliorer leur prise en charge. Ce projet permettra d’apporter de nouvelles connaissances sur la manière dont certaines cellules du cervelet deviennent tumorales et sur les facteurs qui influencent leur prolifération. En particulier, il vise à mieux comprendre le rôle de l’environnement et l’activité des cellules nerveuses et tumorales dans l’évolution de la maladie. Les résultats obtenus pourraient contribuer à identifier de nouveaux mécanismes impliqués dans le développement du médulloblastome. À plus long terme, ces connaissances pourraient orienter la recherche vers de nouvelles approches thérapeutiques, potentiellement plus ciblées et mieux tolérées par les patients. Par ailleurs, ce projet présente également un intérêt plus large en biologie, car il permettra d’améliorer la compréhension du développement normal du cervelet, en particulier des mécanismes qui régulent la croissance et la maturation de certains neurones.

Procédures

Les animaux seront soumis à une procédure chirurgicale unique d’électroporation in utero, ainsi qu’à une procédure terminale de prélèvement des tissus. La procédure principale est réalisée chez des femelles à 13,5 jours de gestation. Cette intervention est réalisée une seule fois par femelle et dure 30 minutes maximum. Elle consiste en une anesthésie générale suivie d’une ouverture de la cavité abdominale, de l’exposition des cornes utérines, d’une injection dans le cerveau des embryons, puis d’une électroporation permettant l’entrée du matériel génétique dans les cellules du cervelet. Elle est suivie d’une phase de récupération et d’un suivi post-opératoire des femelles gestantes. L’intervention sur chaque embryon dure quelques minutes. Chez les animaux du lot d’étude de l’activité neuronale, des injections seront réalisées sur animaux vigiles maintenus par contention, deux fois par jour (en alternant de côté) entre 4 et 14 jours après la naissance, et durent quelques secondes par injection. La procédure terminale correspond à l’injection d’un euthanasiant sous anesthésie générale avant traitement puis prélèvement postmortem des tissus. Cette intervention est réalisée une seule fois par animal et dure une dizaine de minutes.

Impact sur les animaux

Les femelles gestantes subiront une intervention chirurgicale sous anesthésie générale afin de réaliser l’électroporation in utero. Cette procédure peut entraîner une douleur post-opératoire modérée, un stress lié à la manipulation, ainsi qu’un risque faible d’infection ou de complication au niveau de la plaie chirurgicale. Chez les embryons manipulés, la procédure peut entraîner des pertes embryonnaires ou une variabilité dans le développement. Après la naissance, les souriceaux peuvent présenter une variabilité de croissance, notamment en raison de la procédure ou de l’efficacité de l’électroporation. Chez les animaux développant une tumeur, des effets indésirables peuvent apparaître au cours de la progression tumorale, tels qu’une diminution de la croissance, une altération du comportement, une réduction de l’activité ou, dans les cas les plus avancés, des troubles neurologiques. Dans le cadre de la modulation de l’activité neuronale, les injections répétées peuvent entraîner un stress léger, ainsi qu’une irritation locale au point d’injection.

Devenir

À l’issue des expériences, l’ensemble des animaux sera mis à mort de manière éthique et conforme à la réglementation en vigueur. Les animaux sont utilisés pour des analyses histologiques et moléculaires nécessitant le prélèvement des tissus cérébraux. Ces analyses impliquent soit une fixation des tissus, soit une extraction de matériel biologique qui ne permet pas le maintien en vie de l’animal. Par conséquent, aucune réutilisation des animaux n’est possible. De plus, le développement tumoral induit dans ce projet peut entraîner, à des stades avancés, une altération de l’état général et du bien-être des animaux. Afin d’éviter toute souffrance prolongée, des points limites stricts ont été définis et toute atteinte de ces critères entraîne une mise à mort immédiate. Les femelles gestantes utilisées pour les procédures chirurgicales ne sont pas réutilisées après les expériences et seront également mises à mort après le sevrage des portées, conformément aux pratiques de bien-être animal. Ainsi, la mise à mort de l’ensemble des animaux est justifiée par la nécessité scientifique des analyses réalisées, l’impossibilité de réutilisation et la prise en compte prioritaire du bien-être animal.

Remplacement

L’utilisation d’animaux est nécessaire pour ce projet, car il n’existe pas de méthodes alternatives permettant de reproduire de manière fiable le fonctionnement complexe du cerveau en développement et la formation des tumeurs. En particulier, certaines interactions entre les cellules du cerveau et leur environnement, ainsi que l’influence de l’activité des neurones, ne peuvent pas être étudiées correctement en laboratoire sur des cellules isolées. Cependant, afin de limiter autant que possible le recours aux animaux, des expériences préliminaires ont été réalisées sur des cellules en culture et sur des tissus en dehors de l’organisme. Ces approches ont permis de tester et d’optimiser les outils expérimentaux avant leur utilisation chez l’animal. Grâce à cette étape préalable, seules les conditions les plus pertinentes et les plus fiables sont utilisées dans ce projet, ce qui permet de réduire le nombre d’animaux nécessaires tout en garantissant la qualité des résultats.

Réduction

Le projet a été conçu de manière à utiliser le plus petit nombre d’animaux possible en garantissant des résultats fiables. Le nombre d’animaux a été estimé en tenant compte des contraintes techniques et de la variabilité du modèle étudié. Ce calcul prend en compte les pertes expérimentales attendues, liées à la réussite des gestations et à l’efficacité de la procédure utilisée. Les expériences sont réalisées sur plusieurs portées indépendantes afin d’assurer des résultats représentatifs. Les expériences seront arrêtées dès que le nombre nécessaire d’animaux permettant une analyse fiable sera atteint. Par ailleurs, la méthode utilisée permet de limiter le recours à la création de nouvelles lignées animales qui nécessiteraient la production d'un très grand nombre d'animaux pour très peu d'animaux ayant les bonnes caractéristiques pour l'étude). Plusieurs types d’analyses sont réalisés sur les mêmes animaux, ce qui permet d’obtenir un maximum d’informations à partir de chaque individu.

Raffinement

Les animaux seront suivis attentivement tout au long du projet, en particulier pendant et après les interventions. Toutes les procédures sont réalisées sous anesthésie générale, avec des traitements adaptés pour limiter la douleur et le stress. Des mesures strictes d’hygiène sont appliquées afin de réduire les risques d’infection. Après chaque intervention, un suivi régulier est mis en place pour vérifier l’état général des animaux, leur comportement et leur récupération. Une attention particulière est portée à leur croissance, leur mobilité et à tout signe de gêne ou de douleur. L’état des animaux est évalué à l’aide de grilles de suivi standardisées permettant de détecter rapidement toute altération. Les animaux sont observés au minimum une fois par jour, et plus fréquemment si nécessaire, notamment lorsque la maladie progresse. Si des signes de mal-être apparaissent, des mesures de soutien sont mises en place, comme un accès facilité à la nourriture et à l’eau ou une surveillance renforcée. Des critères clairs ont été définis pour intervenir rapidement si l’état d’un animal se dégrade. Si ces critères sont atteints, l’animal est mis à mort sans délai afin d’éviter toute souffrance. Des grilles spécifiques sont également utilisées pour le suivi des femelles après chirurgie.

Choix des espèces

Les souris ont été choisies comme modèle expérimental en raison de leur grande pertinence pour l’étude des mécanismes biologiques et des pathologies humaines. Le développement du système nerveux central chez la souris présente de fortes similarités avec celui de l’homme, ce qui permet d’étudier de manière fiable les processus impliqués dans la formation des tumeurs cérébrales. De plus, l’existence de lignées génétiquement modifiées adaptées aux objectifs du projet constitue un atout majeur pour répondre aux questions scientifiques posées. Les animaux seront utilisés à différents stades du développement, en lien direct avec les étapes de la progression tumorale. L’induction tumorale sera réalisée au stade embryonnaire correspondant à 13.5 jours de gestation chez les femelles, période clé du développement des progéniteurs à l’origine des neurones conduisant au type de médulloblastome étudié. Les analyses seront ensuite effectuées à plusieurs stades après la naissance, afin de couvrir les différentes phases de la maladie. L’initiation tumorale et les premiers événements de prolifération neuronale seront étudiés entre 7 et 14 jours après la naissance, la phase intermédiaire de croissance sera étudiée 21 jours après la naissance et la phase tardive caractérisée par des tumeurs établies 60 jours après la naissance.

Les souris utilisées sont immunodéficientes, privées de rate par ablation chirurgicale, et porteuses de cellules immunitaires et tumorales humaines greffées : 297 d'entre elles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Après la splénectomie viennent une injection intrapéritonéale de cellules immunitaires humaines et une injection sous-cutanée de cellules tumorales, puis une injection intraveineuse d'un photosensibilisateur suivie trois heures plus tard d'une illumination de trente minutes, des injections intraveineuses hebdomadaires d'immunothérapie, des prélèvements de sang chaque semaine et des mesures de la tumeur au pied à coulisse. Dans les groupes témoins et chez les souris que le traitement ne freine pas, le porteur écrit que la tumeur continuera de croître jusqu'au point limite. Il conclut que "ces nécessités, éthiques et scientifiques" justifient la mise à mort des souris en fin de procédure, après avoir écrit : "Aucune mesure invasive ne sera ainsi faite".

Objectifs

Le cancer du poumon non à petites cellules (CPNPC) est un cancer fortement immunogène. Le traitement de première intention repose sur des thérapies ciblées quand cela est possible ou des chimiothérapies de sels de platines avec ou sans immunothérapies. Cependant certains patients échappent au traitement. Dans ce contexte, il est indispensable de trouver de nouvelles cibles thérapeutiques et de nouvelles thérapies.

Bénéfices attendus

Il s'agit pour nous d'évaluer l'efficacité de nouveaux traitements dirigés contre le CPNPC humain. Les paramètres de PDT-Neptune testées ont préalablement été sélectionnés sur un ensemble d'expériences réalisées sur les modèles cellulaires en laboratoire. Il s'agira donc de confirmer l'efficacité de la PDT-Neptune dans le cadre d'un être vivant complet humanisé. Les bénéfices à long terme seront de pouvoir mettre sur le marché un nouveau traitement et d'aider dans la lutte contre le CPNPC. L'analyse de l'importance de la réponse immunitaire sur leur mode d'action fait que ces futurs traitements pourront s'intégrer dans des programmes adaptés à chaque patient au bénéfice d'une médecine personnalisée.

Procédures

Toutes les procédures ont en commun la mise en place du modèle et pour cela les animaux subiront une chirurgie sous anesthésie générale (10 min entre l’endormissement et le réveil). Une semaine après, les animaux subiront l’injection de cellules humaines (immunitaires en IP avec une seringue de 1 mL et une aiguille de 26G (0.45 x 13 mm) et tumorales SC avec une seringue de 1 mL et une aiguille de 23G (0.6 x 25 mm). Le modèle en place permettra de tester les traitements. Pour la PDT, les animaux auront une injection intra veineuse du PS Neptune et seront illuminées (extracorporel) 3h après pendant 30 min. L’immunothérapie sera ajoutée par une injection IV qui sera répétée toutes les semaines (1 fois par semaine) avec un cathéter 24G (0.7 x 19 mm) dans la veine caudale. Pour le suivi immunologique, un prélèvement de sang sera réalisé préalablement à tout traitement, puis une fois par semaine. Le suivi de la croissance se fera par 2 méthodes. Pour les procédures il s’agira d’utiliser les propriétés du modèle cellulaire et de faire un suivi par imagerie. Ce dernier nécessite l’endormissement sous anesthésie gazeuse des animaux, puis l’injection IP du substrat lumineux avec une seringue de 1 mL et une aiguille de 26G (0.45 x 13 mm). Toutes les souris auront également le suivi régulier de la croissance par le pied à coulisse. En fin de protocole, l’ensemble des animaux sera euthanasié, le sang, la tumeur et les organes vitaux seront récupérés pour analyse complémentaires

Impact sur les animaux

Plusieurs nuisances ou effets indésirables peuvent être relevés sur ce projet lors de nos interventions : - injections / prélèvement sanguins / pesées ; ces actions nécessitent une contention qui peut générer un stress léger de courte durée mais répété - anesthésie; les anesthésies notamment gazeuses à l'Isoflurane peuvent également générer un stress léger de courte durée mais répété - acte chirurgical pour la splénectomie; peut générer un problème lors de la cicatrisation notamment une légère démangeaison pendant un maximum de 5 jours – la croissance tumorale: les cellules tumorales sont injectées en un point précis prévu pour ne gêner en rien le comportement normal de l'animal, un risque de gène du déplacement pourrait être observable au cours des 4 semaines mais cela sera strictement géré (cf. points limites).

Devenir

Tous les animaux auront reçu l'injection d’une masse tumorale suivi ou non d'un traitement expérimental. Selon l’efficacité des traitements la croissance de la tumeur sera ralentie voire disparaitra, dans le cas contraire et pour les groupes témoins, la tumeur continuera de croitre jusqu'au point limite critique pour son bien-être. Nous pouvons ajouter également que pour des raisons scientifiques, nous devons procéder à la récupération des tissus (sang, tumeur, organes vitaux) qui nous serviront à confirmer l'efficacité du traitement et confirmer son mode d'action. L'ensemble de ces nécessités, éthiques et scientifiques, justifient le sacrifice des animaux en fin de procédure.

Remplacement

Notre objectif est de tester l’efficacité anti tumorale de la PDT-Neptune (qui de plus est immuno-activatrice) seule ou en combinaison avec des Immunothérapies (réduction des mécanismes immunorégulateurs). Des travaux préalables ont été réalisés sur les modèles de lignées cellulaires. Ces résultats mettent en évidence la faisabilité du projet au travers de la validation de l'application de la PDT et/ou des Immunothérapies in-vitro ; dont plusieurs paramètres ont été ainsi fixés. Cependant, s'agissant de développer une nouvelle approche thérapeutique, il est primordial que celle-ci soit également évaluée dans un système physiologique complet, en ce sens un modèle in- vivo est le plus adéquat, voire nécessaire. Le suivi par bioluminecence permet de diminuer le nombre d'animaux, néanmoins, une validation de l'efficacité nécessite d'emblée que plusieurs groupes expérimentaux soient présents, notamment les groupes contrôles (PS Neptune seul ; pour la PDT), non traité, et traitement unique ou traitement combiné de manière à limiter quantitativement les expérimentations. Dans la mesure où la modélisation expérimentale cellulaire ou in-silico est trop imparfaite, ce type de modèle demeure indispensable à la validation de ces futurs traitements.

Réduction

Grâce à notre expérience nous bénéficierons de protocoles déjà approuvés et mis en place au laboratoire, ce qui permet de ne pas avoir à faire de mise au point. L'ensemble des animaux ne servira uniquement que pour l'étude de l'effet des traitements. Néanmoins, dans un souci de conservation de la fiabilité des résultats et pour ainsi éviter d'avoir à refaire les expériences, nous réaliserons des groupes d'étude suffisamment solides d'un point de vue biostatistique (validé grâce à l'outils de l'EDA). Ainsi, pour des modèles humanisés des groupes de 5 souris pour 5 reconstitutions seront suffisants. Le suivi de croissance tumorale se fera de manière externe sans nécessité de recours à une dissection, permettant ainsi un suivi longitudinal optimisé sans sacrifice. Enfin, il s'agira de ne tester que les molécules déjà présélectionnés pour leur efficacité dans les modèles précliniques in-vitro. Aucune mesure invasive ne sera ainsi faite. Enfin, l'étude préalable du nombre d'animaux strictement nécessaire (grâce aux outils de l'EDA), nous permettra d'obtenir des résultats en quantité suffisante pour ne pas avoir à réitérer des lots expérimentaux.

Raffinement

Afin de limiter au minimum toute souffrance, stress ou angoisse des animaux, ces derniers seront hébergés selon les recommandations établies à raison de 5 animaux maximum par cage, dans un environnement enrichi (maison, carré de coton) et dans des conditions classiques de stabulation (température régulée, cycles jour/nuit). Avant toute manipulation, les animaux seront acclimatés 7 à 10 jours dans leur salle d'hébergement. Concernant le projet, nous avons cherché à optimiser l'expérimentation en mettant en place une méthodologie d'étude courte et efficace : suivi de tumeur sur un temps limité (4 semaines maximum), tout en minimisant les douleurs ou détresse. Nous avons ainsi choisi des modèles de souris dont nous connaissons les comportements et la capacité de prise de greffe. Les animaux plus jeunes, seront manipulés régulièrement et ainsi entrainés en vue d'une réduction du stress. En cours d'expérimentation, nous avons choisi de faire les greffes tumorales uniquement sous-cutanées (au flanc) de manière à ne gêner en rien la vie de l'animal (locomotion, alimentation), le suivi sera ainsi facilité par mesure manuelle externe sur animal vigile (mesure au pied à coulisse), ou grâce à un système d'imagerie par bioluminescence (l'animal sera alors sous anesthésie dans l'appareil à +37°C et aura préalablement reçu une injection de luciférine). Aucune mesure invasive ne sera ainsi faite. Enfin, l'étude préalable du nombre d'animaux strictement nécessaire (grâce aux outils de l'EDA), nous permettra d'obtenir des résultats en quantité suffisante pour ne pas avoir à réitérer des lots expérimentaux.

Choix des espèces

Les souris sont des petits rongeurs qui permettent de réaliser des groupes cohérents et limités pour l'étude efficace des effets des molécules thérapeutiques testées en faibles quantités. Nous utilisons des souris SCID pour permettre la xénogreffe de cellules humaines (tumorales et immunitaires). Par ailleurs le campus dispose d'outils performants spécialement adaptés à la souris (Imagerie du petit animal). Les souris entreront en phase expérimentales à partir de l’âge de 7 semaines. Elles seront déjà sevrées et sexées. A ce stade de développement elles seront suffisamment robustes pour supporter les traitements et suffisamment grande pour supporter les injections et le développement des cellules tumorales.

Toutes tuées après des évaluations fonctionnelles terminales, sans qu'aucune soit maintenue en vie ni réutilisée, 818 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune subit une injection intrapleurale d'un traceur, puis une chirurgie d'environ quarante-cinq minutes sous anesthésie générale ouvrant l'accès à la moelle épinière cervicale, où sont injectés des pièges extracellulaires produits en laboratoire. La perte de poids attendue va jusqu'à 10 % du poids initial dans la semaine suivant l'opération, y compris chez les souris du groupe témoin, opérées sans injection. Le porteur affirme qu'aucune méthode de remplacement ne permet d'observer à la fois ces pièges dans la moelle épinière, leur effet sur les cellules nerveuses qui commandent le diaphragme et les conséquences musculaires dans un "organisme entier".

Objectifs

Ce projet cherche à mieux comprendre comment une inflammation générale dans l’organisme peut aussi provoquer une inflammation de la moelle épinière et perturber le fonctionnement des muscles, en particulier ceux impliqués dans la respiration. Parmi les mécanismes étudiés figurent les « pièges extracellulaires », des structures libérées par certaines cellules immunitaires. Ces structures jouent normalement un rôle de défense, mais lorsqu’elles sont produites en excès, elles peuvent entretenir l’inflammation et endommager les tissus. L’objectif est de déterminer si la présence de ces pièges extracellulaires dans la moelle épinière peut, à elle seule, provoquer une inflammation locale et altérer la fonction neuromusculaire. Pour cela, des pièges extracellulaires produits en laboratoire à partir de différentes cellules immunitaires (neutrophiles, macrophages et microglies) seront injectés dans la moelle épinière de souris saines. Cela permettra de comparer leurs effets respectifs sur l’inflammation et sur le fonctionnement des muscles respiratoires.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus de ce projet sont une meilleure compréhension des liens entre une inflammation générale de l’organisme, l’inflammation de la moelle épinière et l’apparition de troubles musculaires et respiratoires. Nos premiers résultats suggèrent que les « pièges extracellulaires », produits par certaines cellules immunitaires, pourraient jouer un rôle dans ces altérations, mais leur effet exact reste encore mal connu. Ce projet permettra de déterminer si la présence de ces structures dans la moelle épinière est suffisante pour provoquer à elle seule une inflammation locale et perturber le fonctionnement neuromusculaire, en particulier celui du diaphragme, principal muscle respiratoire. Il permettra aussi de comparer les effets de pièges extracellulaires provenant de différents types cellulaires, afin de mieux comprendre si certains ont des effets plus délétères que d’autres. À plus long terme, ces travaux pourraient aider à identifier de nouvelles pistes thérapeutiques pour limiter les conséquences neurologiques, musculaires et respiratoires associées à une inflammation systémique, notamment dans certaines maladies graves comme le sepsis.

Procédures

Les souris seront soumises à une chirurgie sous anesthésie générale (chirurgie durant environ 45 minutes), permettant d’atteindre la moelle épinière cervicale et d’y injecter des « pièges extracellulaires » produits par des cellules en laboratoire. Cette chirurgie sera précédée de quelques jours par une injection intrapleurale quasi non-invasive (5 minutes) d’un traceur moléculaire permettant d’identifier les cellules permettant la contraction du muscle diaphragmatique, et localisées dans la moelle épinière cervicale. Ces souris seront ensuite soumises à des tests fonctionnels terminaux.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues ou effets indésirables pouvant être attendus sur les animaux sont : - Stress et douleur potentiellement induits par l’administration du traceur en intrapleuraléritonéal. - Perte de poids jusqu’à 10% du poids initial durant la première semaine après la chirurgie et l’injection dans la moelle épinière des pièges extracellulaires. Les animaux du groupe contrôle pourront, eux aussi, présenter des effets passagers liés à la chirurgie contrôle sans injection de pièges extracellulaires.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à l’issue de chaque procédure, après les évaluations fonctionnelles terminales. Les tissus et organes d’intérêt, notamment la moelle épinière cervicale, le diaphragme et, selon les analyses prévues, d’autres tissus associés, seront ensuite prélevés pour des analyses histologiques, immunohistochimiques, cytométriques et moléculaires. Aucun animal ne sera maintenu en vie ou réutilisé à l’issue de la procédure.

Remplacement

À l’heure actuelle, il n’existe pas de méthode de remplacement permettant d’étudier en même temps les effets des pièges extracellulaires dans la moelle épinière, leur impact sur les cellules nerveuses qui commandent le diaphragme, et les conséquences sur le fonctionnement musculaire. Les études réalisées uniquement sur des cellules ou des tissus isolés ne permettent pas de reproduire toute la complexité des interactions entre le système nerveux, le système immunitaire et les muscles dans un organisme entier. L’utilisation de l’animal est donc nécessaire pour répondre à cette question de recherche.

Réduction

Le nombre d’animaux sera réduit au minimum nécessaire pour obtenir des résultats scientifiques fiables. L’organisation de l’étude repose sur l’expérience du laboratoire, sur des données préliminaires, et sur les analyses prévues à la fin des expériences. Le choix de plusieurs groupes et de plusieurs temps d’observation est nécessaire pour comparer correctement les effets étudiés, mais a été limité afin d’éviter toute utilisation excessive d’animaux. Cette stratégie permet d’obtenir des résultats exploitables tout en respectant le principe de réduction.

Raffinement

Une attention particulière sera portée au bien-être des animaux pendant toute l’étude. Les interventions seront réalisées sous anesthésie générale, avec des mesures adaptées pour limiter la douleur et l’inconfort. Les conditions opératoires seront soigneusement contrôlées afin de réduire au maximum les risques liés aux injections et aux manipulations. Après chaque intervention, les animaux seront surveillés attentivement jusqu’à leur réveil complet puis de façon régulière pendant toute la durée de l’étude. Leur état général, leur déplacement, leur poids, leur température et l’aspect de la zone opérée seront contrôlés à l’aide de grilles de suivi. Si nécessaire, les animaux seront pris en charge de manière adaptée. L’isolement (dans un environnement enrichit) ne sera utilisé qu’en cas de besoin lié aux soins ou à l’état de l’animal.

Choix des espèces

La souris a été choisie car c’est une espèce largement utilisée en recherche biomédicale pour étudier les interactions entre inflammation, système nerveux et fonction musculaire. Les modèles murins de neuroinflammation sont bien connus et permettent d’obtenir des résultats comparables à ceux d’autres études. La souris est aussi adaptée aux techniques utilisées dans ce projet, comme les injections dans la moelle épinière, le marquage de certaines cellules nerveuses et les analyses des tissus en fin d’expérience. Sa petite taille, son cycle de vie court et la disponibilité de lignées élevées dans des conditions standardisées permettent de bien contrôler les conditions expérimentales et de limiter la variabilité entre animaux. De plus, la souris partage avec l’humain plusieurs caractéristiques importantes du fonctionnement des systèmes nerveux, musculaire et immunitaire, ce qui en fait un modèle pertinent pour ce type de recherche. Les animaux utilisés seront de jeunes adultes mâles, âgés d’au moins 8 semaines. Ce choix permet d’éviter les effets liés à la croissance et au développement, qui pourraient influencer les résultats. Il permet aussi d’étudier ces mécanismes dans une situation plus proche de celle observée chez l’adulte humain.