Souris
Rôle de la toxicité cellulaire dans le remodelage cardiaque après l’infarctus du myocarde chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
- Système immunitaire
9 830 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Une partie subit un infarctus du myocarde provoqué chirurgicalement, suivi d'échocardiographies sous anesthésie, de prélèvements sanguins par voie sous-mandibulaire sur animal vigile et d'injections répétées, dont certaines par voie rétro-orbitaire. Le porteur affirme que ces modèles murins sont une étape "indispensable" et un préalable absolu à la validation de stratégies thérapeutiques, les modèles in vitro ne pouvant selon lui recréer l'ensemble des interactions cellulaires. Les souris sont mises à mort pour analyses histologiques du cœur.
Objectifs
L’incidence de l’insuffisance cardiaque consécutive à un infarctus du myocarde est en augmentation constante, et la mortalité à court et moyen terme reste élevée, ce qui constitue un enjeu médical et sociétal majeur. Notre projet a pour but de comprendre les mécanismes moléculaires qui contrôlent le rôle délétère de certaines cellules de l’immunité, après un infarctus du myocarde chez la souris. Nous utiliserons des modèles de déplétion cellulaires pour étudier la contribution de ces populations. L’utilisation de modèles de souris génétiquement modifiées nous permettra d’analyser spécifiquement le rôle de ces cellules et de certaines protéines associées. Ces animaux subiront un infarctus du myocarde induit chirurgicalement accompagné d'injection d'anticorps, de cellules ou de molécules pharmacologiques. Nous analyserons la fonction cardiaque des souris par échocardiographie et étudierons également le remodelage cardiaque et la réponse inflammatoire post-infarctus. Ce projet est constitué de 4 procédures impliquant au total 9830 souris sur une durée de 5 ans.
Bénéfices attendus
Ce projet va permettre, à court terme, une meilleure compréhension des mécanismes du remodelage cardiaque après infarctus. En particulier, l’identification des mécanismes moléculaires activés au sein de ces cellules est essentielle pour le développement à plus long terme de stratégies thérapeutiques innovantes visant à limiter les dommages tissulaires après un infarctus du myocarde et par conséquent, limiter le développement de l’insuffisance cardiaque et réduire la mortalité post-infarctus.
Procédures
Ce projet comporte une partie d'élevage de souris déficientes pour certains gènes d'intérêt. Lors du sevrage, ces animaux subiront une biopsie de queue ou d'oreille pour génotypage. Une partie des animaux va subir une procédure chirurgicale de 30 min au cours de laquelle un infarctus du myocarde est réalisé. Quatre injections sous-cutanées d’analgésiques (durée inférieure à 30 secondes pour chaque injection) sont prévues, dont une en préopératoire. A différents temps après l’opération, une échocardiographie non-invasive indolore sera réalisée sous anesthésie générale gazeuse, d’une durée maximale de 15 minutes. Une partie des animaux va subir une injection intrapéritonéale d'une durée maximale de 30 seconde ainsi qu'un prélèvement sanguin hebdomadaire par voie sub-mandibulaire en étant vigile, d'une durée maximale d'une minute (4 prélèvements maximum); une autre partie des animaux va subir des injections intrapéritonéales pour traitement d'une durée maximale de 30 secondes (au maximum une par jour pendant 7 jours soit 7 injections au total) ; une dernière partie des animaux va subir une injection intraveineuse par voie rétro-orbitaire, d'une durée maximale de 30 secondes.
Impact sur les animaux
Effets indésirables liés à l’expérimentation : inconfort lié à la préhension et contention des animaux, potentielle douleur au point d'injection, stress lié à l'anesthésie. Effets de la chirurgie : douleur post-opératoire, mobilité transitoirement réduite suite à l'anesthésie (8 heures). Bien que l'infarctus induise une perte de fonction cardiaque, il n’altère cependant pas la mobilité des souris dans leur cage ni leur comportement.
Devenir
Les animaux issus de la procédure 1 seront utilisés pour constituer les groupes expérimentaux des autres procédure ou au sein de la procédure 1 pour contribuer au maintien de l'élevage des lignées de souris s'ils sont d'un génotype d'intérêt, ils seront mis à mort sinon. Les animaux en fin de procédure 2, 3, et 4 seront utilisés pour réaliser des analyses histologiques ou d'inflammation dans le coeur.
Remplacement
Nous avons évalué nos hypothèses in vitro avant de les étudier dans nos modèles murins. Ces derniers sont une étape indispensable dans la compréhension des mécanismes survenant au cours de l’infarctus du myocarde. En effet, ces événements sont des phénomènes complexes impliquant un grand nombre de types cellulaires, ce que des modèles in vitro ne pourraient pas permettre de recréer dans leur entièreté. Nous voulons, in vivo, comprendre les différentes interactions cellulaires, mais également tissulaires qui sont mises en jeu au cours des phénomènes de réparation tissulaire consécutifs à une atteinte cardiaque. Ces modèles murins pré-cliniques sont également un préalable absolument nécessaire et indispensable pour la validation des stratégies thérapeutiques afin de les mettre en application chez des patients présentant un infarctus du myocarde.
Réduction
Le nombre d’animaux nécessaires à la réalisation de ce projet a été calculé au plus juste. En utilisant des calculs de puissance pour déterminer la taille minimale suffisante des groupes expérimentaux, nous obtenons une taille d’échantillon de 15 souris par groupe. En tenant compte des aléas inhérents à la procédure chirurgicale, nous estimons une taille de groupe à 20 animaux. Les résultats obtenus seront analysés avec des tests statistiques adaptés. Pour réduire le nombre d’animaux, nous analyserons plusieurs paramètres sur le même animal. En ce qui concerne l'élevage, nous aurons une stratégie de croisement des animaux permettant d'optimiser la génération des animaux en fonction des groupes nécessaires pour les expériences et pour la gestion des lignées, à l'aide des tableaux de croisement.
Raffinement
Les animaux seront hébergés en cages enrichies dans l’animalerie où les conditions d'hébergement et d'élevage sont standardisées et contrôlées durant toute la vie des souris. Par ailleurs, il y aura un enrichissement complémentaire dans certains cas particuliers. Lors des procédures expérimentales, la souffrance animale sera réduite au maximum par l'utilisation de protocoles d’anesthésie et d’analgésie adaptées, et par, l’établissement et l'application de points limites stricts et spécifiques au projet. Les animaux feront l’objet d’une surveillance régulière et renforcée par les expérimentateurs confirmés et par le personnel technique qualifié de l’animalerie pour repérer l’éventuelle apparition de signes cliniques de souffrance ou de mal-être. Les grilles de score de suivi des points limites seront remplies sous contrôle de la personne responsable de la mise en oeuvre du projet.
Choix des espèces
La souris est le modèle de choix pour l'étude des maladies cardiovasculaires. De plus, c’est le seul modèle dans lequel ont été générées les lignées déficientes pour l’expression des protéines que nous souhaitons étudier. La souris permet de garantir l’homogénéité des résultats et la possibilité de surveiller le développement des complications vasculaires dans un espace de temps raisonnable. Grace à ces modèles souris, nous pourrons obtenir rapidement des résultats très importants pour notre projet, ce qui ne serait pas le cas avec une autre espèce qui prendrait beaucoup plus de temps à se reproduire et où le nombre de naissance serait nettement moins important. Nous utiliserons des souris adultes non sénescentes, âgées de 10 semaines minium et chez lesquelles le système cardio-vasculaire est arrivé à maturité. En dessous de cet âge, la variabilité est accrue dans le remodelage et la survie est fortement réduite à la suite d’un infarctus du myocarde.
Impact de la malnutrition maternelle sur le risque d’infection par le streptocoque du groupe B chez le nouveau-né, chez la souris.
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
120 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Des femelles gestantes soumises à des régimes de dénutrition ou de suralimentation subissent des prélèvements sanguins hebdomadaires, et leurs souriceaux sont infectés par gavage avec le streptocoque du groupe B avant d'être eux aussi prélevés. Le porteur indique que la dose bactérienne rapportée dans la littérature n'a pas d'incidence grave chez les nouveau-nés, et que le gavage comporte un risque de fausse route ou de perforation de l'œsophage. Femelles et petits sont mis à mort pour collecter leurs organes.
Objectifs
Le Streptocoque du groupe B (SGB) est une bactérie appartenant à la flore vaginale et digestive, présente chez 15 % des individus. Cette bactérie est inoffensive pour l’adulte en bonne santé, mais elle est la première cause d’infection bactérienne néonatale dans les pays industrialisés. La première étape dans l’infection par cette bactérie est le franchissement des muqueuses et notamment de la muqueuse digestive pour atteindre la circulation sanguine. Les infections néonatales avec cette bactérie sont rares (300 cas par an en France), mais sont associées à un taux de mortalité important et à des séquelles significatives, notamment sur le plan neurologique. Les facteurs de risque d’infection par cette bactérie sont peu connus. Ce projet vise à étudier l’impact de la malnutrition maternelle sur le risque de développer des infections d’origine digestive chez le nouveau-né. Plus particulièrement nous étudierons l’impact de la malnutrition maternelle (à la fois sur- et sous-nutrition) sur le risque d’infection par la bactérie. La complexité de la barrière intestinale est difficilement simulable in vitro. De même les modèles in vitro ne permettent pas de reproduire la complexité des interactions hôte/pathogène à différents stades de développement (nouveau-né/jeune vs adulte). Ainsi, seule l’expérience chez l’animal permettra d’étudier les mécanismes permettant à la bactérie de franchir la barrière intestinale chez le nouveau-né. La souris est un modèle animal pertinent et validé pour l’étude des infections à SGB et l’animal de choix pour étudier le franchissement de la barrière intestinale par le SGB. Par ailleurs, nous utiliserons des modèles de malnutrition maternelle validés. Le projet utilisera des souris adultes (femelles gestantes), ainsi que des nouveaux-nés.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d’identifier des facteurs de risque des infections néonatales par une bactérie Streptocoque de groupe B et permettra de sensibiliser aux risques de la malnutrition sur la santé, en particulier pendant la période périnatale.
Procédures
Un prélèvement de sang sera réalisé sur les femelles en gestation, chaque semaine soit 3 fois. Ce geste durera 20 secondes max. Les souriceaux seront gavés 2 fois au total : le 1er gavage durera 10 secondes puis le 2è gavage 6h après prendra également 10 secondes. Ces souriceaux auront 2 prélèvements de sang et ce geste durera 20 secondes max.
Impact sur les animaux
Les régimes alimentaires utilisés dans ce projet sont maitrisés par la communauté scientifique et ont déjà fait l’objet de publications. Cependant, un suivi des femelles gestantes mises sous ces régimes sera réalisé par des personnes qualifiées et expérimentées, tout au long de la gestation (pesée, observation) afin de contrôler les effets pouvant être liés à la malnutrition (stress, agressivité des animaux). Par ailleurs, les expériences d’infection chez le nouveau-né seront très courtes, 24h maximum. La dose de bactéries utilisée pour l’infection est rapportée dans la littérature comme n’ayant pas d’incidence grave chez les nouveaux-nés de souris Balbc. Une attention particulière sera portée sur nos animaux tout au long de l’expérimentation. Les gavages (bactéries ou marqueur fluorescent) seront réalisés par une personne expérimentée en vue de réduire et/ou identifier un risque de fausse route, de perforation de l’œsophage ou un léger stress.
Devenir
A l’issue des premières expérimentations, les souris femelles ayant eue une gestation et sous traitement seront mises à mort pour collecter différents organes et effectuer des analyses ex vivo. Les souriceaux intégreront la suite des expérimentations et seront mis à mort à l’issue de celles-ci pour collecte des tissus (intestins, foie, rate, …) et effectuer des études bactériennes, protéiques et sur l’ADN.
Remplacement
Les modèles in vitro ne peuvent restituer ni la complexité des barrières physiologiques, ni l’intégralité du processus infectieux allant de la colonisation digestive jusqu’à la méningite, ni les interactions bactéries-hôte mises en jeu lors de l’infection. Ainsi, seule l’expérience chez l’animal permettra de déterminer l’impact de l’infection bactérienne sur la perméabilité intestinale et différentes cellules du tissu intestinal, comme le système nerveux entérique. La souris, et en particulier la lignée Balbc, est un modèle animal pertinent et validé pour l’étude des infections avec notre bactérie d’intérêt et l’animal de choix pour étudier le franchissement de la barrière intestinale.
Réduction
Le nombre de souris a été réduit au minimum possible tout en permettant une analyse statistique fiable. Nous prévoyons d'utiliser les mêmes souris mâles pour chacun des cycles de reproduction. Nous estimons à 5 petits par portée. Nous avons prévu 15 animaux/groupe pour la procédure d’infection bactérienne et ce nombre a été déterminé par rapport à notre expérience dans le domaine de l’expérimentation animale (gestation, nombre d’animaux par portée et nombre d’animaux minimum pour effectuer nos expériences).
Raffinement
Les souris seront conservées dans des cages de taille suffisante, avec un accès libre à l'eau et à la nourriture. Un enrichissement sera apporté par l’ajout de frisottis. Le bien-être des souris sera surveillé tout au long de l’étude. La prise de poids sera suivie tout au long de l’étude (3 fois/semaine). Des points limites seront mis en place pour évaluer le mal-être des animaux (douleur, stress, souffrance). En cas d'éventuels signes de souffrance les animaux seront mis à mort par une personne compétente.
Choix des espèces
La souris est un modèle animal pertinent et validé pour l’étude des infections avec notre bactérie d’intérêt et l’animal de choix pour étudier le franchissement de la barrière intestinale. Nous utiliserons des souris femelles de 7-10 semaines au moment de l’accouplement et des mâles de 7-10 semaines également. Les souriceaux issus de ces accouplements seront infectés par voie orale par la bactérie à l’âge de 2 semaines. Ceci est un modèle d’infection néonatale, comme ce qui est rencontré chez l’Homme
Élevage et maintien de modèles murins pour l’étude de la maladie de Huntington à phénotype dommageable (1/2)
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
2 880 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Élevées pour reproduire la maladie de Huntington, elles portent une mutation qui provoque en vieillissant des symptômes neurologiques et moteurs que le porteur décrit comme visibles uniquement lors de tests comportementaux dédiés, sans les détailler. Maintenues sous forme hétérozygote, elles sont mises à mort à la fin de leur vie reproductive, vers huit mois, et leur cerveau est prélevé. Le porteur indique qu'aucune méthode alternative ne reproduit la complexité d'un organisme vivant et revendique la nécessité de générer ces animaux pour plusieurs projets.
Objectifs
Il s’agit d’un projet d’élevage et de maintien dans 2 établissements utilisateur de differents modèles de souris génétiquement altérés avec des mutations qui entrainent l'apparition de la maladie de Huntington comme dommage. Le but de ce projet est donc de générer les animaux nécessaires pour étudier cette maladie. L'utilisation de ces animaux est essentielle pour mener à bien plusieurs projets de recherche, qui vont nous permettre de répondre à des questions majeures sur les mécanismes de mise en place de la maladie de Huntington et aboutissant sur des innovations thérapeutiques.
Bénéfices attendus
L'élevage et le maintien de ces lignées de souris ont pour but de générer le nombre d'animaux nécessaires à plusieurs projets de recherche tout en surveillant l'apparition de phénotypes dommageables et en assurant le bien être animal. Il n’existe pas de méthode alternative, autre que le recours aux modèles animaux, pour atteindre les objectifs des projets visant à mieux comprendre les mécanismes de mise en place de la maladie de Huntington et aboutir à des innovations thérapeutiques permettant de retarder la progression de la maladie, ou d’empêcher l’apparition des symptômes.
Procédures
Les animaux de ce projet seront mis en reproduction et/ou maintenus en vie jusqu'à la fin de leur vie reproductive. Ces animaux vont développer en vieillissant la maladie de Huntington caractérisé par de symptômes neurologiques et moteurs légers qui ne sont observés que lors de certains tests comportementaux conçus à cet effet. Ces symptômes ne deviennent jamais handicapants pour l’animal et n’occasionnent pas de perte d'autonomie ni de perte de poids excessive.
Impact sur les animaux
Les animaux de ce projet ont un phénotype qui peut devenir dommageable avec l’âge. Pour la prise en charge de ce phénotype, les animaux seront toujours maintenus sous forme hétérozygote, qui se caractérise par l’expression de symptômes légers. Les symptômes neurologiques et moteurs associés aux modèles ne sont observés que lors de certains tests comportementaux conçus à cet effet. Ces symptômes ne deviennent jamais handicapants pour l’animal et n’occasionnent pas de perte d'autonomie ni de perte de poids excessive. Nous ne nous attendons donc pas à observer des altérations significatives de la qualité de vie des animaux, ni de morts prématurées dû au phénotype. Nous pouvons identifier 3 nuisances légères potentielles: 1) un stress léger pendant leur transport d'un établissement à l'autre; 2) un stress léger lors de la manipulation par l'expérimentateur pendant la mise en place des croisements; 3) un stress pour les mâles reproducteurs lors de leur isolement pour les mettre en croisement jusqu'à la fin de leur vie reproductive.
Devenir
Étant donné qu'il s'agit d'élevage d'organismes génétiquement modifiés, l'ensemble des animaux sera mis à mort à la fin de leur vie reproductive.
Remplacement
Nous avons précédemment démontré que les modèles murins actuelles reproduisent plusieurs des principales caractéristiques pathologiques de la maladie de Huntington in vitro et in vivo, ce qui nous a permis de répondre à des questions majeures sur les mécanismes moléculaires de la maladie et d'aboutir à des innovations thérapeutiques dans les dernières années. Il n’existe pas de méthode alternative, autre que le recours aux modèles animaux, pour atteindre les objectifs de nos projets de recherche et reproduire la complexité d’un organisme vivant. De plus, nous avons développé de nouveaux modèles murins afin de pouvoir étudier le rôle de la protéine responsable de la maladie de Huntington en conditions physiologiques et pathologiques.
Réduction
Nous allons générer 2880 animaux pendant les 5 années du projet pour le maintien de 3 lignées différentes. Le nombre d'animaux a été determiné de manière à réduire au maximum le nombre d'animaux utilisé tout en gardant suffisamment d'individus pour ne pas compromettre la validité des expériences et nous permettre d’obtenir des conclusions scientifiquement solides pour l’ensemble des projets de recherche. L'ensemble du schéma d'élevage et de maintien des animaux proposé est en accord avec les recommandations des organismes compétents en matière d'élevage de souris. De plus, nous prélèverons le cerveau de tous les animaux générés à la fin de leur vie reproductive. Ainsi, nous pourrons les utiliser afin de mettre au point de futures expériences sans devoir générer d'autres animaux, dans un principe de réduction du nombre d’animaux utilisés pour nos projets.
Raffinement
Ce projet vise à concilier une interprétation fiable des résultats et le respect du bien-être animal. Comme expliqué plus haut, aucun effet indésirable majeur n’est attendu chez l’animal. Les animaux seront hébergés dans des cages équipées d’une litière stérile et d’un enrichissement prévu par l'animalerie permettant aux animaux de fabriquer leurs nids. Tous deux seront changés toutes les semaines. Les cages seront équipées d’un accès illimité à l’eau et à la nourriture standard, changés également toutes les semaines. Le transport des animaux sera effectué en cages occultées avec enrichissement et des croquettes mouillées dans la cage. Les groupes sociaux initialement formés dans les cages seront conservés lors du passage d’une animalerie à l’autre. Pour reduire au maximum leur stress lors de la manipulation pendant la mise en place des croisements, un seul manipulateur (zootechnicien ou utilisateur) réalisera ce geste. L’état de santé des animaux sera surveillé régulièrement par des mesures de leur poids jusqu'à leur mise à mort. En particulier pour les mâles reproducteurs isolés, nous surveillerons plus attentivement l'apparition de signes de stress (comme l'alopécie) et, si nécessaire, ils seront remplacés avant la fin de leur vie reproductive pour minimiser leur stress. L’état de santé des animaux sera surveillé pendant toute la durée de l’étude. Les animaux seront élevés dans des conditions répondant aux critères relatifs aux soins et à l’hébergement des animaux de l’Annexe II du 1er février 2013 de l’arrêté fixant les conditions d’agrément, limitant ainsi les angoisses qui pourraient être induites par l’environnement.
Choix des espèces
Compte tenu de la similarité de son anatomie avec celle de l’Homme, la souris est un modèle de choix pour l’étude in vivo de la maladie de Huntington. Pour cela, nous utilisons des souris issues de la transgénèse classique. Les modèles murins permettent de comprendre le rôle de la huntingtine et de ses interactions au niveau d’un organisme entier. Les mâles et femelles reproducteurs hétérozygotes seront maintenus en vie jusqu’à l'âge de 8 mois, quand leur fertilité diminue de manière considérable. À ce stade, les symptômes neurologiques et moteurs associés aux modèles ne sont observés que lors de tests comportementaux conçus à cet effet mais ne deviennent pas handicapants pour l’animal et n’occasionnent pas de perte de poids excessive.
Etude du lien entre les cellules immunitaires intestinales et cutanées dans le développement de tumeur.
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
516 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Génétiquement modifiées pour développer une inflammation puis des tumeurs cutanées vers 8 à 10 mois, elles subissent des fibroscopies par voie rectale, une phalangectomie pour le génotypage et des applications répétées d'adhésif sur l'oreille destinées à provoquer une inflammation. Le porteur affirme qu'aucune méthode sans animaux ne reproduit les échanges entre intestin, microbiote, système immunitaire et peau à l'échelle de l'"organisme entier", et conclut que le recours à la souris est "indispensable". Les retombées annoncées, de nouvelles cibles contre les cancers de la peau, restent renvoyées à une étape ultérieure.
Objectifs
Les tumeurs présentent des caractéristiques et capacités particulières qui sont essentielles à leur développement. Parmi celles-ci, on peut retrouver leur capacité à proliférer indéfiniment, leur capacité à muter et à échapper au système immunitaire. De nouvelles études suggèrent que le microbiote, micro-organismes vivants dans notre corps, impacte aussi la croissance tumorale. Dans le cas du mélanome par exemple, un déséquilibre du microbiote intestinal est lié à une meilleure progression de la tumeur, de plus, le remplacement du microbiote « malsain » par un microbiote "sain" chez les patients atteints de mélanome permet d’améliorer l’efficacité des traitements par immunothérapie. De même, les patients atteints de maladies inflammatoires chroniques de l’intestin (MICI telle que la maladie de Crohn), maladie où le microbiote intestinal joue une rôle important, présentent régulièrement des symptômes cutanés tels que des dermatites, de l’acné, une rosacée. Ceci suggère un lien entre microbiote intestinal, efficacité du système immunitaire et développement tumoral cutané ou d’une inflammation cutanée. Le projet proposé ici vise à étudier le lien qui peut exister entre ces trois acteurs. Pour ce faire, l’utilisation de modèles animaux est nécessaire afin de pouvoir étudier les interactions, échanges et influences du microbiote et système immunitaire sur le développement tumoral à distance.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à mieux comprendre comment notre système immunitaire agit dans nos intestins et sur notre peau. Le but est de découvrir les mécanismes permettant la mise en place d’une inflammation cutanée qui mène au développement de tumeurs ; ainsi que l’impact du microbiote sur ces mécanismes et réponses. Ceci nous permettra ensuite d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques pour le traitement des cancers de la peau et de proposer une nouvelle approche pour soulager les problèmes de peau chez les patients atteints de maladies inflammatoires chroniques de l'intestin (MICI).
Procédures
Une fibroscopie, comparable à une coloscopie chez l’Homme, sera effectuée sur certains animaux afin d’étudier la communication immunitaire entre intestins et peau. Cette fibroscopie ne durera pas plus de 10 min par animal et sera réalisée 1 fois sur les animaux, à l’exception des animaux d’une manipulation où le geste sera répété 3 fois en 20 jours. Avant chaque fibroscopie, une injection d’analgésique sera faite sur les animaux. Celle-ci durera 10 secondes au total par animal. Les animaux seront anesthésiés avant la fibroscopie. Certains animaux seront traités par antibiotiques par voie orale. L'identification et le genotypage des animaux se fera par phalangectomie distale donc en un seul geste avant calcification. Certains animaux auront une application d’adhésif sur l’oreille permettant de mimer l’apparition de lésions cutanées. Cette application sera répétée 3 fois sur une oreille et entrainera une inflammation au site de « l’épilation ».
Impact sur les animaux
Le projet implique l’utilisation d’animaux génétiquement modifiés qui développent une inflammation et des tumeurs cutanées. Ces animaux vivent normalement pendant les 6 premiers mois de vie sans aucun symptôme. Ils commencent à développer une inflammation cutanée vers 6 mois de vie et des tumeurs cutanées vers 8/10 mois de vie. Certaines expérimentations impliquent l’insertion d’une fibre optique par voie rectale dans l’animal. Celle-ci ne devrait normalement pas générer de lésions ou de gêne puisque cela s’apparente à l’insertion d’un thermomètre rectal chez l’Homme. Certains animaux auront un endommagement de la barrière cutanée de l’oreille des souris, à l’aide d’un ruban adhésif.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort soit suite à la fin de la procédure afin de prélever les organes, soit lorsqu’un point limite est atteint et qu’aucun geste ne permet un retour à l’état normal et ce afin d’éviter toute souffrance.
Remplacement
L’étude de la migration des cellules immunitaires entre deux organes ne peut se faire, pour le moment, qu’à l’échelle de l’organisme entier. Aucune technologie actuelle n'est capable de mimer les interactions entre le système digestif, le microbiote, le système immunitaire et la peau. Cette étude ne peut se faire qu'à l'échelle d'un organisme entier. De plus, la complexité du système immunitaire ainsi que son contrôle et sa régulation imposent que cette étude se fasse dans un système intégré, à l’échelle de l’organisme entier. L’utilisation d’animaux est donc indispensable à l’avancée de ce projet.
Réduction
De précédentes études montrent que 100% des animaux développent une inflammation intestinale/colorectale ainsi qu’une transformation tumorale cutanée. L’effet étant indépendant du sexe de l’animal, tous les animaux générés pourront être utilisés. Cela permet donc de réduire le nombre d’animaux utilisés dans ce projet. De plus, lors de la mise à mort des individus, certains organes pourront être collectés afin de servir à un autre projet développé dans le laboratoire, permettant ainsi de ne pas utiliser d’autres souris pour cet autre projet. Également, les animaux des groupes contrôles seront mutualisés, permettant de réduire le nombre d’animaux utilisés ici. Afin de réduire encore plus le nombre d’animaux, une formation au geste de « fibroscopie » a été réalisée en suivant un protocole établi et utilisé en routine par d’autres manipulateurs. Pour le calcul du nombre de souris utilisables par groupe, nous avons réalisé des simulations statistiques afin d’utiliser le nombre minimal d’animaux pour la validation des objectifs.
Raffinement
Des éléments d’enrichissement seront systématiquement mis dans les hébergements afin de favoriser le bien-être animal. Les animaux qui seront anesthésiés feront l’objet d’une surveillance accrue post-anesthésie. Pendant la période d’anesthésie, un gel hydratant et protecteur sera appliqué sur leurs yeux afin d’éviter toute déshydratation et donc toute gêne pour l’animal. Un analgésique sera également administré aux animaux en prévention de tout geste. Afin d’augmenter le raffinement, l’application d’une pommade anesthésique et d’un lubrifiant au niveau anal sera faite pour tous les animaux qui auront une endoscopie/fibroscopie afin de faciliter la fibroscopie (amélioration du protocole). En plus de la surveillance mise en place pour assurer le bon réveil des animaux, une surveillance supplémentaire 1 heure après le réveil des animaux sera faite afin de détecter de potentiels saignements chez les animaux ayant subi la fibroscopie. Si des saignements sont détectés et durent plus d’une heure, les animaux seront mis à mort.
Choix des espèces
La complexité du système immunitaire ainsi que son contrôle et sa régulation font que l’étude ne peut se faire que dans un système intégré et donc à l’échelle de l’organisme entier. L’étude de la transformation tumorale cutanée, sous l’influence du microbiote intestinal, implique que les expérimentations soient menées à l’échelle physiopathologique sur un modèle animal de choix. La souris (mus musculus) correspond à ces critères. Premièrement, les souris présentent un système immunitaire similaire à celui de l’Homme. De plus, le rôle de la molécule d’intérêt est conservé à plus de 97% entre l’Homme et la souris, ce qui permet de transposer facilement les études réalisées sur la souris chez l’Homme et inversement. Également, le microbiote de cette espèce est particulièrement bien caractérisé et peut-être facilement contrôlé et étudié, ce qui est important pour le projet que l’on souhaite mettre en place. Enfin, l’ensemble des outils nécessaires à l’étude, comme les anticorps, protocoles et kits, sont développés sur le modèle murin depuis plus de 20 ans. La souris est donc le modèle le plus adapté pour l’exécution de ce projet. Le but du projet est de comprendre l’impact de la signalisation de la molécule d’intérêt sur la réponse du système immunitaire au microbiote et le lien avec le développement tumoral cutané. Cette transformation peut commencer vers 6 mois de vie mais est complétement visible à 8-10 mois de vie. De plus, la maturité du système immunitaire intestinal est établie après 2 mois et l’intestin de souris est mature après 45 jours de vie. De ce fait, seules des souris adultes seront utilisées. Elles seront utilisées à 2, 6 et 8/10 mois de vie (la sortie des animaux entre 8 et 10 mois de vie dépendra des signes cliniques observés lors de la surveillance quotidienne dont feront l’objet les souris).
Neuroprotection des photorécepteurs à cone chez un modèle murin
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
800 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélèvement des yeux, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Porteuses d'une mutation dégradant les photorécepteurs dès la naissance, elles reçoivent une injection quotidienne pendant trente-deux jours puis un électrorétinogramme sous anesthésie, pour cribler jusqu'à quarante molécules censées protéger la vision. Le porteur indique que les injections répétées peuvent provoquer une inflammation et une douleur, l'animal étant tué s'il souffre. Il précise avoir testé les molécules sur cellules et tissus mais affirme que leur fonctionnalité "ne peut être évaluée que sur un modèle vivant".
Objectifs
La dégénérescence maculaire lié à l’âge (DMLA) est une maladie chronique de la macula, zone centrale de la rétine où sont concentrés les photorécepteurs à cônes. Ces derniers sont indispensables à la vision fine et centrale. S’ils dégénèrent, le patient perd l’information visuelle et aperçoit des scotomes (tâche noire) qui comble ce manque d’information. La DMLA est la première cause de handicap visuel chez les personnes de plus de 50 ans dans le monde. Il existe deux formes de DMLA : sèche et humide. A l’heure actuelle, il n’existe aucun traitement curatif, seulement quelques traitements permettant de ralentir la propagation de la forme humide. Pour la forme sèche, qui représente 80pourcents des cas de DMLA, de nouveaux traitements sont actuellement en phase clinique. Ces traitements sont des antioxydants (vitamine E) ou bien des traitements agissant sur le système immunitaire, mais aucun de ces traitements ciblent spécifiquement le mécanisme de mort cellulaire des photorécepteurs à cônes. Ainsi, le but du projet est de trouver une/des molécule(s) protégeant les photorécepteurs à cônes de la dégénérescence lorsqu’un patient est atteint de DMLA. Avant de passer sur un modèle vivant, des tests préalables in vitro (photorécepteurs en culture et explants de tissus rétinien) ont été réalisés pour évaluer les effets potentiels neuroprotecteurs des molécules.
Bénéfices attendus
Le projet a pour but d’identifier des molécules qui préviennent la dégénérescence des photorécepteurs à cône. Si une ou des molécule(s) est, sont identifiée(s), un traitement pourra ensuite être envisagé pour soigner les millions de patients atteints de DMLA (dégénérescence maculaire lié à l'âge) dans le monde.
Procédures
Injection intrapéritonéale : Nous allons procéder à des injections intrapéritonéales quotidiennement sur animal vigile, pendant 32 jours. Chaque injection dure moins d’une minute par animal. Anesthésie générale : Au bout du 33ème jours, une anesthésie générale sera effectuée sur chaque animal afin de réaliser l’ERG. L’anesthésie générale sera injectée en intrapéritonéale. Electrorétinogramme (ERG) : Cet examen clinique permet de mesurer l’activité des photorécepteurs suite à un stimulus lumineux. Ainsi, cet examen nous permettra de déterminé si l’animal à une vision restauré ou non selon les molécules injectées. Pour cela, la cornée sera anesthésiée localement et la pupille sera dilatée par médication. Des électrodes seront placées afin d’enregistrer l’activité électrique généré par la rétine suite à un stimulus lumineux. Les deux yeux seront soumis à cette procédure. L’ERG dure environ 40 minutes par animal. Les souris passeront 1 fois par cette étape expérimentale. Les souris seront placées en chambre de réveil chauffée à 32 degrés et seront surveillées jusqu’à leur complet réveil après l’anesthésie. Les souris seront euthanasiées par une méthode réglementaire à la fin de la période de maintien afin de réaliser le prélèvement des yeux et les analyses nécessaires.
Impact sur les animaux
Une inflammation peut être entraînée par les injections intrapéritonéales au niveau abdominal ainsi qu’un léger stress et une douleur de courte durée lors de l’introduction de l’aiguille. Un léger stress peut être engendré lors du changement d’environnement des animaux (mise en chambre noire la veille de l’électrorétinogramme). Risque faible de mauvaise réaction à l’anesthésie générale lors de l’électrorétinogramme.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés et les yeux prélevés (après euthanasie) pour permettre des analyses histologiques complémentaires. Tous les animaux des procédures seront euthanasiés par une méthode réglementaire.
Remplacement
Les molécules qui seront injectées in vivo ont été préalablement sélectionnées. En effet, celles-ci ont été testées sur deux modèles différents : l’un cellulaire et l’autre tissulaire dont tous deux présentaient une dégénérescence des photorécepteurs à cône. Grâce à ces modèles nous avons sélectionné des molécules ayant une double action,1) de protection contre la mort cellulaire et 2) de préservation de la structure des photorécepteurs à cône. La fonctionnalité des photorécepteurs ne peut quant à elle être évaluée uniquement sur un modèle vivant. Dans le cas présent nous effectuerons les tests sur un modèle murin présentant une dégénérescence similaire à celle de l’Homme.
Réduction
Suite à un calcul de puissance, nous estimons que 10 souris par groupe (1 groupe correspondant à 1 molécule ou 1 véhicule) est suffisant pour réaliser des tests statistiques. Nous prévoyons de tester un maximum de 40 molécules sur les 5 ans. Soit un total de 800 souris. Les lots seront composés de la manière suivante : souris et molécule ou souris et véhicule (témoin). Pour une interprétation fiable des résultats, ces derniers seront soumis à des tests statistiques. De plus, dans un esprit de réduction du nombre d’animaux, nous regrouperons les témoins pour les molécules aillant le même véhicule.
Raffinement
Les animaux seront examinés quotidiennement par le personnel qualifié de l’animalerie et/ou les expérimentateurs. Les animaux seront hébergés dans des cages de stabulation avec enrichissement (coton pour le nid, maison en carton), alimentation et abreuvement à volonté. Pour la réalisation des électrorétinogrammes, les animaux bénéficieront d’une anesthésie générale associée à une anesthésie locale de la cornée. Un gel hydratant sera utilisé pour protéger la surface cornéenne pendant la procédure. L’anesthésie pouvant provoquer une hypothermie, les souris seront placées sur un tapis chauffant durant toute la durée de l’anesthésie et en chambre thermostatée jusqu’à leur complet réveil. Une nouvelle aiguille sera utilisée pour chaque animal pour limiter la douleur induite lors d’injections intrapéritonéale. Nous appliquerons une noisette de pommade anti-inflammatoire et antibactérienne à la fin de l’électrorétinogramme. Pour limiter le stress des animaux lors du changement d’environnement (mise en chambre noire la veille de l’électrorétinogramme), les souris resteront dans leur cage habituelle d’hébergement, avec leurs congénères et l’enrichissement habituel (coton pour le nid, maison en carton), ainsi que nourriture et eau à volonté. Une signalétique particulière des animaux en expérimentation est utilisée. Elle permettra une surveillance adaptée des animaux en fonction des points limites définis à chaque procédure afin de s’assurer de leur bien-être. Des critères d’arrêt ou points limites ont été déterminés pour chaque étape de la procédure expérimentale. Les animaux utilisés dans ce projet naissent dans notre animalerie. Les injections intrapéritonéales répétées peuvent induire une douleur chez les animaux. Si cela se produit, l’animal sera euthanasié.
Choix des espèces
La souris utilisée dans ce projet est un modèle lié à une mutation spontanée induisant une dégénérescence précoce des photorécepteurs. Ce modèle est très utilisé par la communauté scientifique dans le cadre de rétinopathie pigmentaire récessive très utilisé par la communauté scientifique. Ces molécules seront injectées sur ces sourisqui , présentent une dégénérescence précoce des photorécepteurs dès leur naissance.. La dystrophie des photorécepteurs à cône débute aux alentours de 14 jours après la naissance (P14) des animaux et se termine à 90 jours après leur naissance. D’après une étude, nous pouvons réduire la fenêtre de dégénérescence de P14 à P45, où moins de 50 pourcents des corps cellulaires et moins de 25 pourcents des segments externes sont encore présent chez les photorécepteurs à cônes. Donc, nous injecterons les animaux entre P14 à P45, soit la période à laquelle les photorécepteurs à cône dégénèrent.
Évaluation de l’innocuité d’une nouvelle molécule, administrée par voie intranasale, chez la souris saine
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Troubles respiratoires
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système respiratoire
160 souris saines vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélèvement d'organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Elles reçoivent une à trois administrations intranasales d'une molécule sous anesthésie, pour évaluer sa tolérance avant des essais d'activité contre une bactérie et le virus de la grippe. Le porteur indique n'attendre aucun effet secondaire, la molécule s'étant montrée non toxique en culture cellulaire, mais prévoit un suivi du poids et de la température. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ne renseigne sur la tolérance d'un "organisme entier", d'où le recours aux souris pour cette étape préalable.
Objectifs
Chaque année, dans le monde, le nombre de cas de grippe est d’environ 1 milliard et le nombre de décès liés à la grippe est estimé entre 290 000 et 600 000. L’émergence d’une pandémie, comme celle de COVID-19, met fortement en évidence l’impact sanitaire, social et économique d’une infection virale incontrôlée. Ainsi, chaque pays est également confronté à des défis de sécurité. Même si la vaccination est la stratégie la plus efficace contre les virus, la courte durée de l’immunité induite par le vaccin, associée à la dérive antigénique intrinsèque des virus, affecte négativement cette protection. En parallèle, l’Organisation Mondiale de la Santé (OMS) alerte aussi sur les maladies résistantes aux médicaments, qui pourraient être responsables de 10 millions de décès chaque année d’ici à 2050. Parmi ces maladies, celles ayant pour origine des bactéries multi-résistantes aux antibiotiques présentent un risque critique, avec une menace particulière dans les hôpitaux, les maisons de retraite, etc. Une liste de bactéries a été publiée et comporte notamment Pseudomonas aeruginosa dont certaines souches sont devenues multi-résistantes aux antibiotiques. Ces souches peuvent entraîner des infections sévères, telles que des pneumonies qui peuvent conduire au décès des patients. De nouvelles molécules antivirales et antibactériennes sont donc à développer de toute urgence. Le projet actuel a pour objectif d’évaluer in vivo l'innocuité d’une molécule que nous appelerons M, pour déterminer les doses auxquelles elle pourra être utilisée ensuite dans une autre demande d'autorisation de projet pour évaluer ses activités antibactérienne et antivirale, dans le contexte d’une infection par P. aeruginosa ou par le virus de la grippe, chez la souris. En effet, cette molécule a déjà montré une activité antivirale et antibactérienne in vitro, sans toxicité aux doses utilisées.
Bénéfices attendus
Notre projet consiste à évaluer l'innocuité d’une nouvelle molécule M prometteuse chez la souris saine. Cette molécule M possède une activité in vitro contre P. aeruginosa et contre le virus de la grippe, à des doses non cytotoxiques. Les expériences montrent que cette molécule ne semble pas favoriser la résistance et propose une solution de traitement avec une administration par voie nasale, ce qui permet d’interagir directement avec la muqueuse nasale et pulmonaire. Les expériences permettront de déterminer la dose la plus appropriée à utiliser pour démontrer son activité antivirale et antibactérienne in vivo. Ceci concernera une autre demande puisque les expériences devront être réalisées dans une animalerie A2 qui permet d'utiliser des micro-organismes de classe de risque 2, c'est-à-dire des pathogènes pouvant provoquer une maladie chez l'homme et pour lesquels une prophylaxie ou/et des traitements sont efficaces. Cette nouvelle molécule permettrait ainsi d’apporter une nouvelle stratégie pour lutter contre Pseudomonas aeruginosa et contre le virus de la grippe.
Procédures
Dans une première expérience, les souris recevront 1 seule administration intranasale de la molécule M ou de solution contrôle, sous anesthésie générale induite par voie intrapéritonéale. Dans une seconde expérience, les souris recevront 2 ou 3 administrations intranasales de la molécule M ou de solution contrôle, sous anesthésie générale induite par voie gazeuse. La durée d’une administration intranasale, anesthésie comprise, dure environ 5 minutes.
Impact sur les animaux
Les contentions engendrent du stress pour l'animal et l'injection intrapéritonéale pour l'anesthésie générale peut entraîner une légère douleur au niveau du site de l'injection. L’administration de la molécule M ne devrait pas provoquer d’effets secondaires car les tests en culture cellulaire ne montrent pas de cytotoxicité aux doses efficaces, mais les souris feront l’objet d’un suivi bi-quotidien et nous mesurerons notamment la température corporelle et le poids et nous observerons attentivement leur comportement.
Devenir
Toutes les souris seront mises à mort à la fin de chaque plan expérimental afin de prélever des organes et d’analyser les différents paramètres de la tolérance.
Remplacement
Dans notre étude, les expériences que nous souhaitons réaliser sur les souris ne peuvent pas être remplacées par des méthodes alternatives car actuellement, aucun modèle in vitro ou ex vivo ne permet de connaître la tolérance d’un organisme entier. Par conséquent, les modèles animaux sont nécessaires à notre étude. Nous souhaitons rajouter que la molécule a déjà démontré in vitro son efficacité antibactérienne et antivirale à des doses non cytotoxiques en culture cellulaire.
Réduction
Chaque procédure a été conçue pour utiliser le minimum de souris, en utilisant les tests statistiques adaptés. De plus, les expérimentations sont également conduites en recherchant un éventuel « effet sexe ». Ainsi, un total de 160 souris est donc nécessaire pour ce projet.
Raffinement
Les souris seront élevées en communauté dans des cages enrichies avec du sopalin, des fragments de boîtes d’œufs et des jouets en plastique. Toutes les manipulations sur les souris ne seront effectuées que par du personnel qualifié ayant suffisamment d’expérience avec les procédures décrites pour minimiser toute douleur et inconfort possible pour les animaux. Tout au long du déroulement des expériences, une observation systématique de leur état clinique sera réalisée de façon pluriquotidienne par les animaliers et les expérimentateurs, afin de détecter au plus tôt une éventuelle souffrance animale. Les souris seront habituées aux manipulations les jours précédant l’expérimentation, en les sortant de la cage et en associant la manipulation à un renforcement positif en donnant une récompense alimentaire (bout de biscuit, pomme, etc.). De plus, l'administration intranasale sera effectuée sous anesthésie générale suivie d’une analgésie éventuelle (paracétamol 200 mg/kg). Afin d’identifier la souffrance et la douleur, nous avons établi une grille permettant d’évaluer différents paramètres et de prendre en considération différents points limites.
Choix des espèces
Lors de ce projet, nous utiliserons la même souche de souris qui sera ensuite utilisée pour étudier l’inflammation et les réponses immunitaires. De plus, la souris, de par sa petite taille, permet une logistique aisée, et constitue un bon support pour tester les nouvelles approches thérapeutiques dans les modèles précliniques. Ainsi, cette souche de souris limite de ce fait le nombre d’animaux utilisés pour des études préliminaires. Les animaux seront utilisés à l'âge adulte (entre 8 semaines et 12 semaines) pour avoir un système immunitaire mature mais non vieillissant en vue des doses à utiliser dans un contexte infectieux pour tester l'activité antivirale et antibactérienne de la molécule M. De plus, les expériences seront conduites en utilisant des souris mâles et de femelles afin de rechercher un éventuel « effet sexe ».
Role intrinsèque de l’enzyme AspNAT dans l’expansion des cellules souches hématopoïétiques 2/2
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
1 080 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélèvement des tissus hématopoïétiques, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une irradiation ou un traitement détruisant leur moelle, une greffe de cellules par voie intraveineuse ou intra-fémorale, puis des prélèvements de sang et de moelle répétés pendant un an. Le porteur indique que le conditionnement peut faire chuter le poids et que les prélèvements intra-fémoraux peuvent provoquer un boitement. Il affirme qu'aucun test ne remplace l'injection de ces cellules dans une souris hôte et conclut à "aucune possibilité de remplacement", ce volet étant la seconde partie d'une étude sur une enzyme des cellules souches du sang.
Objectifs
La fabrication des cellules du sang (globules blancs, rouges et plaquettes) dont la durée de vie est limitée dans le temps se fait à partir de cellules souches (appelées CSH). Ce processus se passe dans la moelle osseuse où sont localisées les CSH (chez la souris il se déroule également dans la rate). L'objectif ce projet de recherche fondamentale est de déterminer le rôle d'une enzyme dans le processus de fabrication des cellules sanguines en particulier si en agissant sur cette enzyme il est possible d’augmenter le nombre et d’améliorer la fonction des CSH.
Bénéfices attendus
Il est à noter qu'à ce jour pour certaines hémopathies la greffe de cellules souches hématopoïétiques est la seule option thérapeutique curative mais l'une des limites à cette approche reste le faible nombre de cellules ; il est donc essentiel de mieux comprendre leur mode de régulation et de trouver des moyens d'augmenter leur nombre. 40 000 greffes de CSH ont été faites en Europe en 2018 et les chiffres montrent que ce nombre est en augmentation.
Procédures
Les animaux subiront les mêmes procédures que celles utilisées aujourd'hui en clinique. Tout d'abord une irradiation ou un traitement myéloabatif: pour l'irradiation il y aura un transport d'une animalerie à l'autre. La procédure d’irradiation (trajet inclus) durera moins de 1h30. Pour le traitement myéloablatif, il y aura une injection par jour pendant 5 jour en IP sur animal vigile (temps du geste 1 minute). Ensuite les animaux subiront une greffe de cellules : cela se fait par injection en intra veineux dans la veine de la queue sur animal vigile (le geste dure moins d’une minute) ou par injection intra-fémorale sur animal anesthésié (le geste dure moins de 10 minutes). Enfin le suivi de la prise de greffe se fait par prélèvement. Le prélèvement sanguin submandibulaire : 50μL de sang prélevé une fois par mois pendant 1 an maximum. Ce geste, de moins d’une minute, est réalisé sur animal vigile et dure moins d'une minute. Le prélèvement intrafémoral : 25µL de moelle osseuse, prélevée tous les 3 mois et nous alternerons les genoux donc genou droit 2 prélèvements à 3 et 9 mois, gauche 1 prélèvement à 6 mois. Ce geste réalisé sous anesthésie dure moins de 5 minutes. Le prélèvement sanguin rétro-orbitaire : 200µL de sang prélevé une seule fois avant l'euthanasie. Ce geste réalisé sous anesthésie dure moins d'une minute.
Impact sur les animaux
L'étape de conditionnement peut entrainer une baisse transitoire (1 à 2 semaines) de prise de poids. L'injection ou le prélévement intra-fémoral peuvent entrainer un léger boitement sur 12h maximum. Le prélèvement sanguin en mandibulaire nécessite une contention qui peut engendrer un stress.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés afin de collecter les tissus hématopoïétiques (moelle osseuse, rate et thymus) pour les analyser.
Remplacement
Pour analyser les CSH il n'existe qu'un seul test, qui consiste à injecter ces cellules dans une souris hôte et regarder comment ces cellules participent à la production des cellules sanguines de cet hôte. Pour cela, les CSH ont besoin d'être dans leur organe physiologique et à ce jour, il n'est pas possible de recréer cet environnement complexe in vitro, il n’y a donc aucune possibilité de Remplacement.
Réduction
Dans le respect de la règle des 3R, comme il n’existe pas de possibilité de Remplacement, nous combinerons nos lots témoins dans le but de Réduire le nombre d'animaux. Nous avons réduit le nombre de souris à 6 dans les lots pour lesquels nous attendons une faible variabilité des résultats. Pour les lots où il y a une étape de culture cellulaire nous aurons besoin de 12 souris par lot car la variabilité des résultats sera plus forte. Ces nombres ont été calculés afin que les résultats obtenus puissent être analysés par des tests statistiques appropriés.
Raffinement
Afin de respecter la notion de Raffinement, le bien-être de nos animaux sera pris en compte de leur naissance jusqu'à leur mort (enrichissement de la nourriture lors de l’élevage et de l’expérimentation per se, enrichissement de l’environnement avec ajout de laine de peupliers pour "faire des nids" et présence d'une structure en plexiglace rouge transparente dans lequel la souris peut se cacher...). Les souris étant des animaux grégaires ils seront élevés en groupe. Les souris seront suivies quotidiennement par les animaliers. Enfin nous avons mis en place une grille de score qui nous permet d'évaluer la "bonne forme" des animaux et déterminer ainsi si un animal atteint un point limite: sont ainsi évalués, la bonne forme générale, le comportement, l'état de la peau, le poids ainsi que des critères plus spécifiques à la procédure comme l'état de l'oeil, de la veine caudale et du genou (les sites d'injection/prélèvement). L'étape de conditionnement peut entrainer une baisse transitoire (1 à 2 semaines) de prise de poids. Les animaux seront donc soumis à un régime de nourriture enrichie. Des anesthésiques et analgésiques seront utilisés pour les gestes pouvant générer de l'inconfort.
Choix des espèces
La souris est le modèle classiquement utilisé pour étudier les cellules souches hématopoïétiques. Les souris seront utilisées à l'âge adulte entre 8 semaines et 15 semaines. À cet âge-là, la taille de la souris facilite la manipulation expérimentale et l'injection de cellules. De plus il a été démontré que la prise de greffe était optimale à cette age-là. Le suivi des souris greffées se fera sur du long-terme (jusqu'à 1 an) afin de s'assurer de la pérennité de la reconstitution hématopoiétique.
Développement de stratégies pharmacologiques pour limiter la sévérité des Accidents Vasculaires Cérébraux survenant en contexte de Maladie Rénale Chronique
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
- Système urogénital
Rats : 920
3 180 souris et rats vont être utilisés, tous tués à l'issue pour prélèvement des organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère pour la plus grande partie d'entre eux. Ils subissent une chirurgie provoquant un arrêt transitoire de la circulation cérébrale, équivalent d'un AVC, ou l'ablation de cinq sixièmes de la masse rénale, une maladie rénale pouvant aussi être induite par un régime enrichi en adénine. Le porteur reconnaît que ces interventions provoquent "indubitablement" douleur, altération de l'état général et stress. Il affirme que la communication entre rein et cerveau est "impossible à modéliser autrement que [par] l'animal", le bénéfice pour les patients restant présenté comme une possibilité.
Objectifs
L’objectif de ce projet est de caractériser les atteintes cérébrales au cours d'une maladie rénale chronique, et après un Accident Vasculaire Cérébral survenant dans un contexte de Maladie Rénale Chronique, particulièrement sur la dysfonction de la barrière-hémato-encéphalique (barrière biologique séparant la circulation sanguine du système nerveux) et de neuroinflammation (inflammation au niveau cérébral), dans différents modèles murins. En complément, nous développerons une approche pharmacologique afin d’identifier des voies impliquées et proposer des cibles thérapeutiques innovantes dans ce contexte.
Bénéfices attendus
La possibilité d'améliorer la prise en charge et le pronostic neurologique des patients atteint d'une maladie rénale chronique présentera un bénéfice en santé humaine.
Procédures
Les animaux seront soumis à une chirurgie (acte chirurgical d'environ 30 minutes) visant à induire un arrêt de la circulation cérébrale transitoire (équivalent à un accident vasculaire cérébrale) ou une néphrectomie (retrait de 5/6 de la masse rénale totale). Les animaux seront soumis à une administration d'un candidat médicament. Les imageries (jusqu'à 4 par animal) seront espacées d'au moins 24h pour une durée maximale de 30minutes. Enfin une quantité de sang des animaux sera prélevée à la fin de l'étude.
Impact sur les animaux
L'ablation de 5/6e de la masse rénale totale, l'occlusion de l'artère cérébrale moyenne et l'induction d'une maladie rénale par un régime riche en adénine provoquent indubitablement une douleur, une altération de l'état général et un stress de l'animal : douleur provoquée par la procédure chirgurgicale - une alétration de l'état général : une perte de poids, une déshydratation - hémorragie per-opératoire (rare). L'imagerie et l'injection de traceurs nécessiteront une anesthésie et pourront engendrer un stress. Les tests comportementaux pourront induire un stress par des manipulations quotidiennes.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort au terme de la procédure.Les organes seront prélevés pour réaliser des analyses histologique et biochimique
Remplacement
Partant de nos résultats observés chez le rat et la souris. Nous étudions une communication entre des organes qui sont le rein et le cerveaux et qu'il est impossible de modéliserautrement que pour l'animal. De plus, pour caractériser les atteintes neurologiques fonctionnelles lors d'une maladie rénale chronique, nous réalisons des évaluation neuro-comportementales des animaux, qui n'est pas modélisable in vitro ou in silico.
Réduction
Comme évalué dans des expériences précédentes notamment concernant les études neurocomportementales, des lots de 9 animaux sont nécessaires afin d’obtenir la puissance suffisante pour mettre en évidence les différences significatives entre les groupes d’animaux, et s’assurer de la reproductibilité de ces résultats d’une série à l’autre et ainsi obtenir un échantillon de taille suffisante pour l’étude de nos résultats. Chaque procédure sera effectuée deux fois sur des lots indépendants pour s’affranchir d’une variabilité liée au lot.
Raffinement
Pour assurer le bien-être des animaux pendant et après la chirurgie, tous les actes chirurgicaux seront réalisés sous anesthésie et s'accompagneront d'une prise en charge peri-opératoire de la douleur (injection d'analgésique avant, pendant et après la chirurgie). Après chirurgie de la nourriture humidifiée sera mise à disposition des animaux à volonté pour anticiper des difficultés de mobilité de l'animal. Le bien-être des animaux sera également assuré par une surveillance quotidienne, par du personnel qualifié et formé, de l’aspect et de la motricité ainsi que d'une pesée quotidienne pendant toute la durée du protocole. Les critères d’arrêt sont la prostration, la présence de plaies ne cicatrisant pas, ou la perte de 20% du poids initial.
Choix des espèces
Les modèles de MRC proposé ont été développé et validé chez le rongeur. De plus, ces espèces permettent également le recours à des techniques validées d’évaluation neurocomportementale, d’imagerie cérébrale, et d’immuno-histochimie cérébrale, permettant de répondre à nos hypothèses. Tous les rats sont livrés à l'âge de 5 semaines. Une période d'acclimatation d'une semaine est respectée avant le début des procédures. Les rats sont donc soumis aux procédures à l'âge de 6 semaines. Toutes les souris sont livrés à l'âge de 7 semaines. Une période d'acclimatation de 2-3 semaines est respectée avant le début des procédures. Les animaux sont donc soumis aux procédures à l'âge de 9-10 semaines. Des animaux jeunes sont utilisés pour éviter l'accumulation de tissu adipeux autour du pédicule rénal, qui peut géner l'interruption de la circulation.
Etude des comportements de prise de décision et de leurs bases neuronales chez la souris
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système nerveux
250 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour extraction du cerveau, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles subissent une à deux chirurgies crâniennes pour fixer une barre d'acier, implanter une fenêtre de verre ou insérer des fibres optiques et des sondes, puis un entraînement d'un à cinq mois sous restriction hydrique à 85 % de leur poids, la tête fixée pendant les tests. Le porteur reconnaît l'isolement, la restriction d'eau, les risques d'hémorragie ou d'infection et la gêne des implants. Il affirme qu'aucune méthode in vitro ou informatique ne remplace le modèle et écarte la drosophile, ces techniques invasives ne pouvant être menées sur des humains sains.
Objectifs
Ce projet vise à comprendre comment notre cerveau est capable de changer nos actions rapidement. Nous pensons que le cerveau peut imaginer et préparer différentes décisions en même temps, ce qui facilite le changement de décision lorsque la situation évolue. Pour étudier cela, nous utiliserons des tâches comportementales avec des souris dans un environnement virtuel. Nous allons également utiliser des techniques spéciales pour enregistrer et manipuler l'activité des cellules cérébrales, combinant l'électrophysiologie, l'imagerie et la stimulation lumineuse. Notre objectif est d'observer comment des centaines de neurones travaillent ensemble dans le cerveau pour contrôler nos actions et prendre des décisions. Nous nous concentrerons sur un comportement important, la recherche de ressources alimentaires ou en eau, appelée "foraging".
Bénéfices attendus
Ce projet va générer une grande quantité de données précieuses pour différentes études scientifiques. Une fois les résultats publiés, ces données seront partagées avec la communauté scientifique, pouvant ainsi être utilisées pour répondre à diverses questions scientifiques. En particulier, les découvertes de ce projet pourraient apporter une nouvelle perspective sur la façon dont nous pensons et prenons des décisions. De plus, le projet nous aidera à comprendre pourquoi les gens prennent des décisions différemment, ouvrant la voie à une meilleure compréhension de la diversité des comportements et ses dysfonctionnements cognitifs.
Procédures
Pour enregistrer les cellules du cerveau pendant une tache de comportement, des méthodes invasives sont nécessaires. Une première procédure chirurgicale s’effectuera sur tous les animaux (250 au total) sous anesthésie générale pour poser une barre en acier sur la tête des animaux. Cet implant est nécessaire pour stabiliser les enregistrements de cellules. Pour observer l’activité du cerveau au microscope dans un groupe de 50 animaux, les cellules seront rendues fluorescentes grâce a une injection de virus. Une petite fenêtre en verre sera ensuite implantée pour visualiser la fluorescence. Pour activer les cellules du cerveau avec de la lumière dans un autre groupe de 100 animaux, de fines fibres optiques seront délicatement insérées dans leur cerveau. Chaque opération dure entre 1 et 3 heures par animal. Les animaux sont ensuite soumis à des entrainements quotidiens dans une plateforme expérimentale et ils sont récompensés par des gouttes d’eau sucrées. Cette phase dure entre 1 et 5 mois, en fonction de la performance de l'animal. Environ 225 animaux déjà entraînés subissent une seconde opération sous anesthésie générale pour réaliser de petites ouvertures dans le crâne ce qui permet d’insérer des petites sondes d’enregistrement. Cette intervention est rapide, d'environ 20 à 30 minutes. Les enregistrements sont alors répétés quotidiennement pendant plusieurs jours (maximum 15) pendant 1h. Tous les animaux sont euthanasiés à la fin de la procédure.
Impact sur les animaux
Plusieurs effets plus ou moins nuisibles à la santé des animaux peuvent être attendus. 1) Isolement : pour leur protection, les animaux devront être hébergés individuellement dans leur cage 2) Restriction hydrique : les animaux seront maintenus à 85% de leur poids originel 3) Interventions chirurgicales sous anesthésie : les conséquences de ces interventions sont parfois néfastes (hémorragie, infection, détresse respiratoire, douleurs post-opératoires) 4) Implants : potentielle gêne occasionnée par un corp étranger 5) Stress lié à la manipulation : les animaux seront manipulés durant les phases de tests 6) Restriction des mouvements : les animaux auront la tête fixée durant les périodes de tests
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de cette procédure dans le but de procéder à l'extraction du cerveau à des fins histologiques.
Remplacement
Pour évaluer la complexité des comportements adaptatifs, comme proposé dans ce projet, il est fondamental d'utiliser un modèle animal approprié qui ne peut être facilement remplacé par des expériences in vitro ou des modèles informatiques. D’autre part, l'étude des bases neuronales de la prise de décision par l’enregistrement et la manipulation sélective de l’activité des neurones nécessitent des techniques invasives qui ne peuvent pas être réalisées chez des sujets humains sains et extrêmement rarement chez des sujets malades. Certaines espèces d'invertébrés, telles que la mouche des fruits (drosophile), pourrait sembler adaptées à l’étude du comportement de foraging et aux manipulations génétiques des systèmes cérébraux. Cependant, l'anatomie du circuit neuronal de la drosophile est considérablement différente de celle des mammifères. Ainsi, les résultats scientifiques obtenus chez ces espèces ne sont pas facilement généralisables aux questions abordées dans ce projet. En l'absence de méthode de remplacement possible, il s’avère donc nécessaire d'avoir recours au modèle animal murin dans ce projet.
Réduction
Le nombre d'animaux utilisés sera réduit au minimum nécessaire pour pouvoir obtenir des résultats statistiques fiables et significatifs. L'utilisation de méthode d’enregistrement a grande échelle réduira aussi considérablement le nombre de sessions d'enregistrement et d'animaux nécessaires pour obtenir des statistiques fiables. Par ailleurs, les données comportementales et neuronales seront extraites des mêmes individus pour réduire encore d’avantage le nombre d’animaux. D’après nos études précédentes, nous estimons que 45 souris par groupe sont nécessaires (5 groupes, soit 125 animaux au total). Etant donné la difficulté technique qu’implique la réalisation des enregistrements et la bonne performance des animaux dans la tâche, un pourcentage de perte de l’ordre de 10% ou plus est à prévoir, ce qui augmente l’estimation finale à 250 animaux pour les 5 ans.
Raffinement
Des méthodes de raffinement seront mises en place dans le but d’atténuer les nuisances provoquées par les procédures expérimentales. Le poids des animaux sera surveillé quotidiennement et la poursuite du protocole de restriction hydrique sera décidée en fonction du bien-être des animaux. L’eau naturelle ad-libitum sera remise à disposition pour assurer la récupération totale du poids si la perte de poids est supérieure à 20%. Afin de réduire le stress, les animaux seront habitués, par étapes, à la présence et aux interactions avec l’expérimentateur plusieurs jours avant le début des tests. L’angoisse éventuellement ressenti par l’animal due à la contention sera atténuée par une habituation renforcée positivement via des récompenses (eau sucrée). Pour prévenir la douleur et les inflammations, nous administrerons à chaque chirurgie des médicaments aux propriétés antalgiques, antipyrétiques et anti-inflammatoires.En cas de sècheresse ou rougeur légère de la peau autour de l’implant, l’animal sera traité localement par une solution dermatologique. Dès l’apparition de comportements anormaux (ex : absence de toilettage, perte de plus de 20% du poids) ou autres signes de souffrance (évalués sur une grille d’évaluation de la douleur) survenant après l’implantation, l’animal recevra un traitement analgésique en sous cutané. Si des signes de souffrances persistent plus de 72h l’animal sera mis à mort.
Choix des espèces
La souris (Mus musculus) est le modèle animal le plus approprié pour ce projet et il n'existe pas d'alternative méthodologique. Tout d’abord, l'organisation du néocortex chez la souris comporte des similitudes avec d'autres espèces de mammifères, y compris les humains, et peut donc être utilisée pour révéler des principes généraux de prise de décision. Les souris peuvent aussi être entraînées à effectuer des tâches assez complexes dans des environnements expérimentaux contrôles. Les outils génétiques pour cibler et moduler des populations spécifiques de neurones sont également très bien développés chez la souris et relativement faciles à utiliser. Comme les souris ont un cerveau relativement petit, il est aussi possible d’enregistrer plusieurs régions cérébrales simultanément. Le fait que toutes ces procédures soient devenues l'état de l'art chez la souris facilitera et accélèrera donc grandement l'avancement du projet. Nous utiliserons de jeunes adultes au moment de l’implantation (âgées de 8 à 12 semaines). Il est important que les animaux soient relativement jeunes pour un apprentissage plus rapide et une meilleure performance dans la tâche. Cependant, les animaux doivent avoir terminé leur croissance pour éviter que la taille de la boite crânienne ne change au cours de l’expérience.
Identification des neuroadaptations suite à l’administration de drogues d’abus chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
1 600 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélèvement des structures cérébrales, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour 1 280 et modéré pour 320. Elles reçoivent des injections répétées de cocaïne, d'héroïne ou de THC, une chirurgie de délivrance de nicotine ou une exposition à des vapeurs d'alcool, pour chercher des adaptations moléculaires communes à cinq drogues. Le porteur indique que les injections répétées provoquent un stress et que les animaux peuvent développer des symptômes d'addiction. Il affirme que ces effets ne peuvent pas être étudiés sur des modèles cellulaires et "nécessite[nt] l'analyse d'organismes vivants et entiers", et souligne que la souris partage 99 % de son génome avec l'humain.
Objectifs
Ce projet de recherche s’intéresse aux troubles liées à l’usage de substances psychoactives et particulièrement à la toxicomanie et vise à identifier les mécanismes moléculaires et épigénétiques ( c’est-à-dire l’étude des changement dans le contrôle de l’expression des gènes n’impliquant pas de changement dans la séquence d’ADN ) impliqués et participant au développement de ces troubles cérébraux. Bien que chaque substance psychoactive ait des profils pharmacologiques et des cibles distincts dans le cerveau, leur symptomatologie commune reflète l'hypothèse générale selon laquelle elles recrutent des mécanismes physiopathologiques convergents. Les processus et adaptations moléculaires communs de ces diverses drogues d'abus restent très peu étudiés. L’objectif de ce projet est de combiner des études post mortem sur l'homme et des études sur les rongeurs, afin de caractériser de façon moléculaire les tissus cérébraux et d’identifier les adaptations spécifiquement associées à l’exposition à 5 drogues d’abus : alcool, cocaïne, THC, héroïne et nicotine. Les études portées chez la souris consisteront à réaliser une administration de chaque drogue d'abus séparément, permettant alors de décomposer leur contribution respective aux effets moléculaires précédemment observés chez les polytoxicomanes humains.
Bénéfices attendus
Les études sur les souris devraient nous permettre d'identifier les adaptations épigénétiques épigénétiques ( c’est-à-dire l’étude des changement dans le contrôle de l’expression des gènes n’impliquant pas de changement dans la séquence d’ADN ) spécifiquement associées à l'exposition aux quatre principales drogues d'abus, et les comparer à ceux parallèlement observer chez des patients polytoxicomanes. Afin de caractériser les adaptations moléculaires la polytoxicomanie dans le cerveau.
Procédures
les aniLes animaux seront soit soumis à des injections de cocaïne (10 injections), d’héroïne (11 injections) et de THC (10 injections), à une chirurgie permettant la délivrance de la nicotine (durant 6 jours), ou seront exposés à des vapeurs d’alcool (durant 9 jours). Durée maximale des injections est de 30 secondes.
Impact sur les animaux
Les animaux pourront présenter un état de stress en lien avec les injections répétées avec une douleur considérée comme légère, et des risques de nuisance dues aux actes chirurgicaux vec une douleur considérée comme modérée. De plus, les animaux pourront présenter des symptômes d’addiction, entrainant une douleur considérée comme légère.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de l’expérience afin de réaliser le prélèvement des structures cérébrales d’intérêt.
Remplacement
"Remplacer" : les effets moléculaires des drogues d’abus, sur le cerveau et d’autres tissus de l’organisme, ne peuvent pas être étudiés en utilisant des modèles cellulaires, qui par nature ne récapitulent ni la complexité de l’organisation cérébrale en réseaux complexes de structures interconnectées, ni les communications inter- tissulaires. L’étude de ces effets nécessite donc l’analyse d’organismes vivants et entiers.
Réduction
"Réduire" : Les animaux utilisés étant consanguins, la variabilité phénotypique est limitée, ce qui permet de réduire le nombre d’animaux tout en mettant potentiellement en évidence un effet statistiquement significatif. Ainsi, au regard des données de la littérature et de la variabilité interindividuelle attendue, les groupes expérimentaux destinés à caractériser les comportements liés aux effets de récompense seront constitués de 20 souris chacun (par sexe) identifié comme étant le minimum d’animaux nécessaires pour un résultat statistiquement significatif fiables et robustes.
Raffinement
"Raffiner" : nous avons choisi d’utiliser des protocoles expérimentaux qui minimisent au maximum l’inconfort des animaux tout en permettant néanmoins d’étudier les propriétés des drogues d’abus. Les conditions d’hébergement sont optimisées en fonction des comportements naturels des rongeurs : les souris sont hébergées en groupe sociaux, et chaque cage est enrichie avec un barreau à ronger et des papiers absorbants pour faire un nid. De plus, lors de la réalisation de procédures chirurgicales, les animaux seront sous anesthésie générale et recevront un traitement antidouleur (anesthésique local autour du site de chirurgie et traitement par un anti- inflammatoire non stéroïdien), et la température corporelle de l’animal sera maintenue grâce à un tapis chauffant thermostaté jusqu’au complet réveil de l’animal Enfin, des points limites seront déterminés après les procédures chirurgicales et après les injections répétées afin d’apporter un suivi individuel à chaque animal permettant de limiter ou arrêter la souffrance de l’animal. Pour cela nous utiliserons une grille d’évaluation jusqu’à leur mise à mort incluant des signes d’apparence (inactif, moins actif, ataxique, pelage hirsute, regard morne, animaux blottis, isolé, paupières mi-closes, absence de toilettage) et des signes lors de la manipulation (agressif, réticent à se déplacer, vocalisations, hyperactif, perte de poids corporel). Avant de commencer les expérimentations les animaux seront pris en mains afin d’être habitués aux manipulateurs.
Choix des espèces
La souris est aujourd’hui utilisée comme modèle standard pour l’étude de la plupart des pathologies de son génome (99 % identique à celui de l'humain) et permet de contrôler l’administration de drogues ce qui n’est pas possible chez l’humain. De plus ces études complèteront des études antérieures et parallèles effectuées chez la souris. Pour ce projet, des animaux adultes, âgés de 8 semaines au début de l’expérience, seront utilisés puisque l’étude repose sur l’exploration de comportements complexes qui nécessitent des systèmes neurobiologiques matures.
Etude de l’efficacité d’un traitement capable de ralentir la dégénérescence rétinienne chez la souris.
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
852 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélèvement des organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère pour 240 d'entre elles et modéré pour 612. Porteuses d'une mutation provoquant une dégénérescence de la rétine, elles reçoivent des injections répétées et des examens ophtalmologiques sous anesthésie, pour tester un composé censé ralentir cette dégénérescence. Le porteur indique que l'un des modèles présente un retard de croissance, des difficultés à se mouvoir et une mort prématurée. Il précise avoir mené des études préalables sur cellules mais affirme qu'aucun modèle cellulaire ne reproduit une rétine, l'efficacité clinique du composé restant à établir.
Objectifs
L’objectif de ce projet est d’évaluer l’efficacité thérapeutique d’un composé dans le traitement de la dégénérescence rétinienne et des atteintes rénales et neurologiques associées, due à la mutation d’un gène, dans des modèles murins porteurs de cette mutation.
Bénéfices attendus
L’ensemble des résultats de ce projet devrait permettre de valider l’efficacité in vivo d’un composé chimique pour traiter la dégénérescence rétinienne ainsi que les atteintes systémiques provenant de mutations génétiques connues et représentant une cible thérapeutique majeure pour la dystrophie rétinienne chez l’enfant. Ce composé a déjà montré des résultats prometteurs in vitro in vivo pour une autre maladie similaire.
Procédures
Les animaux de ce projet seront soumis à un génotypage et une identification (6 secondes) à l’âge de 3-5 jours afin de permettre leur bonne répartition dans les groupes expérimentaux. Les animaux seront soumis à entre 4 et 8 injections (environ 5-10 seconde/injection) tous les 3 jours pour une durée allant de 12 à 24 jours. Les animaux seront soumis à une évaluation de l’état des yeux par un examen ophtalmologique réalisé de façon hebdomadaire pendant 1 à 3 semaines, donc entre 1 et 3 examen(s) par animal, sous anesthésie générale et sur un tapis chauffant (environ 15min/examen).
Impact sur les animaux
Aucun effet indésirable n’est attendu suite aux injections du composé ou des diluants. Une cataracte peut être observée par suite des examens ophtalmologiques, mais sans effet indésirable sévère sur les animaux et elle est transitoire, elle disparait quelques heures après les enregistrements. L’un des modèles murins étudiés présente un retard de croissance, une difficulté à se mouvoir, et une mort prématurée.
Devenir
A l’issue du protocole thérapeutique, les animaux seront mis à mort afin de collecter les organes post-mortem pour analyses histologiques et moléculaires.
Remplacement
Les recherches préliminaires in vitro ayant permis l’identification de la molécule thérapeutique qui fait l’objet de cette étude ont été menées sur des lignées de cellules afin de limiter le recours à l’expérimentation animale. Néanmoins, compte tenu de l’absence de modèle cellulaire permettant l’étude d’une rétine, il n’a pas été possible de substituer des approches cellulaires aux modèles murins impliqués dans ce projet à visée thérapeutique. Par ailleurs, nous souhaitons également évaluer le potentiel thérapeutique de la molécule au niveau systémique, ce qui fait nécessairement intervenir l’usage de modèles animaux, seuls à même de reproduire la complexité du métabolisme et de l’organisation des divers organes potentiellement atteints.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisé est réduit au minimum permettant d’atteindre des résultats statistiquement significatifs en utilisant un test approprié pour comparer les groupes d’animaux deux à deux. Les croisements permettant de générer les animaux sont optimisés pour obtenir les animaux nécessaires à l’étude. Par ailleurs, un seul groupe d’animaux contrôles sera utilisé comme référence pour les 2 doses de composé.
Raffinement
Les souris seront surveillées quotidiennement par les membres qualifiés de l'animalerie afin de détecter tout signe de douleur ou de maladie. Tout comportement anormal sera directement communiqué à la personne en charge du projet. Les souris avec une atteinte sévère et généralisée seront surveillées et pesées tous les 3 jours par les personnes en charge du projet. Afin d'assurer aux animaux les meilleures conditions d'hébergement, nous ajouterons dans la cage du coton, des maisonnettes en carton ou des tunnels ainsi que des bâtonnets de bois à ronger. Les souris seront hébergées par 5 en cage ventilée. Tout animal en souffrance sans possibilité de le soulager sera mis à mort. Afin de prévenir une déshydratation et une malnutrition des souris avec l'atteinte sévère et généralisée, nous ajouterons dans leur cage un complément alimentaire hydraté. Les examens ophtalmologiques seront réalisés sous anesthésie générale après injection d’un mélange de produits anesthésiques adaptés sur une surface chauffante.
Choix des espèces
La souris est préférée comme espèce car elle présente l’avantage de facilité d’élevage et de reproduction et elle permet l’étude d’animaux génétiquement modifiés particulièrement informatifs pour la compréhension des mécanismes physiopathologiques. De plus, de nombreux outils d’analyses ont été développés et bien caractérisés dans cette espèce animale. Enfin, l’oeil est un organe facilement accessible et l’organisation structurale de la rétine d’une souris est très proche de celle de l’homme. La validation thérapeutique du composé sera initiée à 6 jours de vie (avant l’ouverture des yeux et le début de la dégénérescence rétinienne) et sera poursuivie jusqu’à un stade suffisamment évolué de la maladie pour différencier les souris contrôles des souris porteuses de la maladie, mais suffisamment précoce pour observer un effet thérapeutique, soit 18, 21 ou 30 jours pour les modèles présentant une atteinte rétinienne isolée progressive ou précoce. Pour le modèle présentant une atteinte généralisée, le traitement sera poursuivi jusqu’à 30 jours qui correspond au stade de survie le plus avancé observé chez ces souris, afin d’évaluer l’effet du composé sur la viabilité de ces souris.
Role intrinsèque de l’enzyme AspNAT dans l’expansion des cellules souches hématopoïétiques 1/2
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
1 080 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélèvement des tissus hématopoïétiques, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une irradiation ou un traitement détruisant leur moelle, une greffe de cellules par voie intraveineuse ou intra-fémorale, puis des prélèvements de sang et de moelle répétés pendant un an. Le porteur indique que le conditionnement peut faire chuter le poids et que les prélèvements intra-fémoraux peuvent provoquer un boitement. Il affirme qu'aucun test ne remplace l'injection de ces cellules dans une souris hôte et conclut à "aucune possibilité de remplacement", pour étudier une enzyme des cellules souches du sang.
Objectifs
La fabrication des cellules du sang (globules blancs, rouges et plaquettes) dont la durée de vie est limitée dans le temps se fait à partir de cellules souches (appelées CSH). Ce processus se passe dans la moelle osseuse où sont localisées les CSH (chez la souris il se déroule également dans la rate). L'objectif ce projet de recherche fondamentale est de déterminer le rôle d'une enzyme dans le processus de fabrication des cellules sanguines en particulier si en agissant sur cette enzyme il est possible d’augmenter le nombre et d’améliorer la fonction des CSH.
Bénéfices attendus
Il est à noter qu'à ce jour pour certaines hémopathies la greffe de cellules souches hématopoïétiques est la seule option thérapeutique curative mais l'une des limites à cette approche reste le faible nombre de cellules ; il est donc essentiel de mieux comprendre leur mode de régulation et de trouver des moyens d'augmenter leur nombre. 40 000 greffes de CSH ont été faites en Europe en 2018 et les chiffres montrent que ce nombre est en augmentation.
Procédures
Les animaux subiront les mêmes procédures que celles utilisées aujourd'hui en clinique. Tout d'abord une irradiation ou un traitement myéloabatif: pour l'irradiation il y aura un transport d'une animalerie à l'autre. La procédure d’irradiation (trajet inclus) durera moins de 1h30. Pour le traitement myéloablatif, il y aura une injection par jour pendant 5 jour en IP sur animal vigile (temps du geste 1 minute). Ensuite les animaux subiront une greffe de cellules : cela se fait par injection en intra veineux dans la veine de la queue sur animal vigile (le geste dure moins d’une minute) ou par injection intra-fémorale sur animal anesthésié (le geste dure moins de 10 minutes). Enfin le suivi de la prise de greffe se fait par prélèvement. Le prélèvement sanguin submandibulaire : 50μL de sang prélevé une fois par mois pendant 1 an maximum. Ce geste, de moins d’une minute, est réalisé sur animal vigile et dure moins d'une minute. Le prélèvement intrafémoral : 25μL de moelle osseuse, prélevée tous les 3 mois et nous alternerons les genoux donc genou droit 2 prélèvements à 3 et 9 mois, gauche 1 prélèvement à 6 mois. Ce geste réalisé sous anesthésie dure moins de 5 minutes. Le prélèvement sanguin rétro-orbitaire : 200μL de sang prélevé une seule fois avant l'euthanasie. Ce geste réalisé sous anesthésie dure moins d'une minute.
Impact sur les animaux
L'étape de conditionnement peut entrainer une baisse transitoire (1 à 2 semaines) de prise de poids. L'injection ou le prélévement intra-fémoral peuvent entrainer un léger boitement sur 12h maximum. Le prélèvement sanguin en mandibulaire nécessite une contention qui peut engendrer un stress.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés afin de collecter les tissus hématopoïétiques (moelle osseuse, rate, thymus) pour l'analyser.
Remplacement
Pour analyser les CSH il n'existe qu'un seul test, qui consiste à injecter ces cellules dans une souris hôte et regarder comment ces cellules participent à la production des cellules sanguines de cet hôte. Pour cela, les CSH ont besoin d'être dans leur organe physiologique et à ce jour, il n'est pas possible de recréer cet environnement complexe in vitro, il n’y a donc aucune possibilité de Remplacement.
Réduction
Dans le respect de la règle des 3R, comme il n’existe pas de possibilité de Remplacement, nous combinerons nos lots témoins dans le but de Réduire le nombre d'animaux. Nous avons réduit le nombre de souris à 6 dans les lots pour lesquels nous attendons une faible variabilité des résultats. Pour les lots où il y a une étape de culture cellulaire nous aurons besoin de 12 souris par lot car la variabilité des résultats sera plus forte. Ces nombres ont été calculés afin que les résultats obtenus puissent être analysés par des tests statistiques appropriés.
Raffinement
Afin de respecter la notion de Raffinement, le bien-être de nos animaux sera pris en compte de leur naissance jusqu'à leur mort (enrichissement de la nourriture lors de l’élevage et de l’expérimentation per se, enrichissement de l’environnement avec ajout de laine de peupliers pour "faire des nids" et présence d'une structure en plexiglace rouge transparente dans lequel la souris peut se cacher...). Les souris étant des animaux grégaires ils seront élevés en groupe. Les souris seront suivies quotidiennement par les animaliers. Enfin nous avons mis en place une grille de score qui nous permet d'évaluer la "bonne forme" des animaux et déterminer ainsi si un animal atteint un point limite: sont ainsi évalués, la bonne forme générale, le comportement, l'état de la peau, le poids ainsi que des critères plus spécifiques à la procédure comme l'état de l'oeil, de la veine caudale et du genou (les sites d'injection/prélèvement). L'étape de conditionnement peut entrainer une baisse transitoire (1 à 2 semaines) de prise de poids. Les animaux seront donc soumis à un régime de nourriture enrichie. Des anesthésiques et analgésiques seront utilisés pour les gestes pouvant générer de l'inconfort.
Choix des espèces
La souris est le modèle classiquement utilisé pour étudier les cellules souches hématopoïétiques. Les souris seront utilisées à l'âge adulte entre 8 semaines et 15 semaines. À cet âge-là, la taille de la souris facilite la manipulation expérimentale et l'injection de cellules. De plus il a été démontré que la prise de greffe était optimale à cette age-là. Le suivi des souris greffées se fera sur du long-terme (jusqu'à 1 an) afin de s'assurer de la pérennité de la reconstitution hématopoiétique.