Souris
Développement d’hépatocytes humains fonctionnels via leur amplification initiale in vivo MODIFICATION
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
Tuées au plus tard huit mois après une greffe de cellules de foie humain, ou trois mois après le début de l'essai pour les groupes pilotes, 430 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Une partie de leur foie est d'abord détruite chimiquement, par une injection unique ou hebdomadaire pendant neuf semaines, puis jusqu'à 370 d'entre elles sont opérées pour recevoir les cellules humaines sous la capsule d'un rein ou dans la rate, et prélevées jusqu'à deux fois par mois. Le porteur ne décrit aucune nuisance pour la destruction partielle du foie, et choisit des lignées immunodéprimées pour que les cellules humaines s'implantent. Il juge la greffe "indispensable" pour obtenir des lignées de cellules qui diminueraient, au conditionnel, l'usage de souris et d'autres animaux non-humains en toxicologie.
Objectifs
Les atteintes du foie ou atteintes hépatiques sont une des raisons principales du retrait de médicaments du marché et de l’échec de nouvelles molécules en développement au cours des essais cliniques. Les études pré-cliniques de toxicité hépatique et de pharmacocinétique sont des éléments essentiels pour réduire ces retraits et échecs et les conséquences médicales graves parfois observées chez les patients ainsi que pour accélérer le développement de nouveaux médicaments. Le foie est principalement constitué de cellules appelées hépatocytes dont l’une des fonctions est la biotransformation et la détoxification des médicaments et toxines. Ainsi, la culture de cellules de foie humain constitue le modèle de référence pour prédire le métabolisme et la toxicité hépatique des médicaments en développement. Cependant, leur accès est limité et ils présentent l’inconvénient majeur d’une grande variabilité entre donneurs. Ainsi, les laboratoires se tournent vers des modèles animaux ou de lignées cellulaires modifiées éloignés de la physiologie humaine. L’objectif général du projet est de développer des lignées d’hépatocytes humains hautement fonctionnels à la manière de ce que nous avons précédemment réalisé avec des cellules du pancréas actuellement considérées comme un modèle in vitro de référence des cellules sécrétrices d'insuline humaines. Afin de parvenir à cet objectif, le projet nécessite tout d’abord de mettre au point un protocole de greffe d’hépatocytes humains dans la souris. En effet l’amplification et la sélection initiale des cellules dans l’animal a été un élément décisif de la génération des lignées de cellules béta humaines fonctionnelles. Puis dans un second temps le projet consistera à générer plusieurs lignées d’hépatocytes à partir de tissus issus de patients qui seront ensuite caractérisées in vitro afin de sélectionner les lignées d’hépatocytes fonctionnels adaptées aux études pré-cliniques.
Bénéfices attendus
Le développement d’hépatocytes, les cellules actives du foie, humains et fonctionnels, aurait des conséquences directes positives sur la santé humaine tout en diminuant l’utilisation de modèles animaux. Des hépatocytes humains, représentatifs des différences de métabolisme et de toxicité des médicaments entre individus, permettraient la caractérisation fiable et précoce des nouveaux médicaments en développement, réduisant les échecs et accélérant le développement de nouvelles thérapies. De plus cette caractérisation du métabolisme et de la toxicité des molécules en développement faite sur des cellules humaines, permettrait de rendre les médicaments plus sûrs en amont des essais cliniques, augmenterait la sécurité des médicaments mis sur le marché et diminuerait les risques de toxicité chez les patients. Enfin, l’accès à de tels hépatocytes humains prédictifs diminuerait l’utilisation d’animaux dans les études de métabolisme et de toxicité. En effet, alors même que les modèles animaux utilisés en recherche pharmaceutique sont seulement partiellement prédictifs, ils sont utilisés du fait de l’absence d’une alternative. La validation de la capacité de prédiction de la toxicité et du métabolisme des cellules que nous allons générer, qui est prévue comme un objectif principal du projet, aurait pour conséquence immédiate une diminution de l’utilisation d’animaux. Finalement, ces cellules humaines fonctionnelles accélèreraient la recherche sur la physiologie des cellules du foie et sur les mécanismes des maladies du foie. Elles faciliteraient ainsi grâce à leur reproductibilité et au fait que ce soit un modèle humain, l’identification de cibles thérapeutiques.
Procédures
Un groupe de 60 animaux maximum subira une élimination partielle de leurs hépatocytes nécessitant 1 injection (30 animaux) ou 1 injection par semaine pendant 9 semaines (30 animaux), réalisées à l’état vigile. Puis ces animaux subiront des prélèvements sanguins au rythme de 1 prélèvement par semaine pendant 2 semaines puis 2 prélèvements par mois pendant un maximum de 3 mois. Ces prélèvements seront réalisés à l'état vigile. La durée individuelle de ces actes d’injection et de prélèvement est de 30 secondes. Un second groupe de 370 animaux maximum subira l'élimination partielle de leurs hépatocytes nécessitant, selon les résultats des groupes pilotes, 1 injection ou 1 injection par semaine pendant 9 semaines, réalisées à l’état vigile. Les animaux subiront ensuite la greffe d’hépatocytes humains. Cette procédure de chirurgie sera effectuée sous anesthésie et dure environ 15 minutes. Puis les animaux subiront 3 injections d’analgésique post-chirurgie (30 secondes par acte). Ces injections seront réalisées à l'état vigile. Enfin, les animaux subiront des prélèvements sanguins. Le nombre de prélèvements sera de 1 prélèvement par semaine pendant 4 semaines puis 2 prélèvements par mois pendant un maximum de 8 mois. Ces prélèvements seront réalisés à l'état vigile. La durée individuelle de ces actes d’injection et de prélèvement est de 30 secondes.
Impact sur les animaux
Lors de ce projet, les souris seront soumises à une élimination partielle de leurs hépatocytes, induite chimiquement, puis à une chirurgie pour greffe d’hépatocytes humains sous la membrane qui entoure un de leur rein ou par injection dans la rate et enfin à des prélèvements sanguins et échographies afin de mesurer la multiplication des hépatocytes humains. Plusieurs nuisances liées à la procédure de greffe des hépatocytes pourraient être subies par les animaux. Il s’agit de douleur et de stress liés à la chirurgie et de gêne et/ou douleur occasionnée par la plaie. Il pourrait s’agir également d’une hypothermie liée à l’anesthésie ou d’une infection suite à la chirurgie. Par ailleurs les animaux pourraient subir une gêne/douleur de basse intensité et momentanée lors des injections. Enfin les animaux pourraient subir une gêne et du stress lors des prélèvements de sang pour le suivi des cellules implantées. Enfin, il n’y a pas de nuisances décrites induites par l'élimination partielle des hépatocytes. Il n’y a pas non plus de nuisances attendues en conséquence de la multiplication des hépatocytes humains greffés étant donné que la taille du greffon restera très modeste d’après notre expérience sur les précédents types cellulaires générés.
Devenir
Les animaux utilisés pour les études pilotes de déplétion des hépatocytes endogènes seront euthanasiés au maximum 3 mois après la procédure afin de confirmer la déplétion des hépatocytes. Ils ne pourront pas être ré-utilisés pour les expériences de greffe d’hépatocytes humains car ces greffes doivent être effectuées quelques jours après l’induction de la déplétion. Les animaux utilisés pour la greffe d’hépatocytes humains seront euthanasiés au plus tard 8 mois après la greffe, ce qui est le temps nécessaire pour permettre la croissance d’une lignée d’hépatocytes.
Remplacement
Les travaux prévus dans ce projet ne peuvent pas être transposées dans des modèles in vitro par exemple en culture cellulaire. En effet, notre expérience de génération de précédentes cellules humaines fonctionnelles montre qu’une étape essentielle est la greffe des cellules humaines dans l’animal pour une multiplication sélective de cellules qui conservent leur fonction. Ainsi, lors du développement du modèle de cellules sécrétrices d'insuline, aucune stratégie in vitro n’a permis la sélection de cellules qui maintenaient leur fonction. De plus plusieurs travaux décrivant l’immortalisation in vitro de cellules du foie humain ont été publiés par d’autres équipes, mais aucune de ces lignées de cellules n’a abouti à des cellules avec des caractéristiques fonctionnelles proches des cellules du foie, principalement en ce qui concerne leur capacité à détoxifier les toxines, ce qui empêche leur utilisation dans les études de toxicologie et de pharmacologie. Pour ces raisons, la greffe initiale des hépatocytes humains à des souris apparait indispensable pour pouvoir assurer l’obtention de cellules similaires aux cellules présentes dans le foie.
Réduction
Le principe de réduction du nombre d’animaux est appliqué dans ce projet en premier lieu via l’estimation précise du nombre d’animaux permettant de garantir l’interprétabilité des résultats. Le nombre d'animaux nécessaires a été déterminé par une approche statistique. Une analyse précise des protocoles publiés a également été réalisée afin de sélectionner les conditions expérimentales favorables et ainsi réduire le nombre de conditions expérimentales à comparer ainsi que le risque d’échecs et par conséquence le nombre d’animaux qui seront utilisés. Par ailleurs, le projet est construit en incluant des étapes pilotes afin d’éliminer toute utilisation inutile d’animaux. Nous procéderons ainsi lors de l’étape 1 à la comparaison de 2 modèles d'élimination partielle des hépatocytes du foie de l'animal. Seul le modèle permettant l'élimination partielle la plus reproductible sera conservé pour les étapes suivantes. Lors de la seconde étape, deux protocoles de greffe des hépatocytes seront comparés. Seul le modèle permettant la greffe reproductible sera conservé pour la troisième étape de génération des cellules à partir de foie humain. De plus, nous veillons très attentivement à ce que toutes les personnes impliquées dans le projet, que ce soit la partie animale mais aussi les parties cellulaire et biochimique de préparation des cellules et d’analyse, soient parfaitement formées aux procédures employées, ceci de façon à réduire au maximum le risque d’échecs, mais aussi de nuisance pour les animaux en ce qui concerne le travail in vivo, et ainsi le nombre d’animaux qui seront utilisés. Enfin, nous procéderons dans toutes nos étapes à une surveillance des animaux pour les nuisances possibles, de façon à les minimiser et ainsi garantir une plus reproductibilité optimale de nos résultats et conséquemment une diminution du nombre de répétitions des expériences et ainsi du nombre d’animaux nécessaires.
Raffinement
La démarche de raffinement de ce projet implique notamment un personnel précisément formé aux procédures afin de limiter les nuisances ou la survenue de complications, ainsi que la surveillance des nuisances possibles à toutes les étapes afin de minimiser les effets néfastes et la souffrance. Un système de mesure objective du niveau d'inconfort, de stress ou de souffrance des animaux est mis en place pour évaluer le bien-être et prendre des actions au plus tôt. Par ailleurs, différentes actions de raffinement seront également menées. Afin de réduire le stress, les animaux bénéficieront d'une période d'acclimatation avant de les manipuler. Pendant l’hébergement ils auront accès à nourriture et boisson ainsi qu’à différents objets pour enrichir leur environnement. Lors de la chirurgie, avant la procédure, les animaux recevront un traitement analgésique, puis une anesthésie générale. Pour prévenir l’hypothermie, un tapis chauffant sera utilisé et l’animal couvert. Dans la phase de réveil, celui-ci sera placé dans une cage séparée dans un environnement également chauffé par un tapis. Sa température corporelle, son hydratation et l'absence de douleur seront suivies. Et de la nourriture et de l’eau seront fournies. Enfin, un traitement analgésique sera administré en préventif pendant 3 jours. La plaie de l’animal sera surveillée et les agrafes retirées autour de 10 jours après la chirurgie. Après récupération, l’animal sera à nouveau hébergé dans les conditions classiques et surveillé tous les jours. L’apparition d'éventuels signes d’hypothermie, de douleur, stress, perte d’activité, déshydratation ou absence de prise de nourriture, perte de poids, infection ou ulcération de la plaie sera surveillée. Si une limite prévue par le système de mesure objective est atteinte, des actions de traitement seront prises en accord avec la structure chargée du bien-être des animaux et avec le vétérinaire de la zootechnie afin d’éviter la dégradation de l’état de l’animal. Dans les cas où il n’est pas possible de rétablir ou de soulager l’état de l’animal, l’euthanasie sera appliquée.
Choix des espèces
Le choix d'utiliser des souris est lié à l’existence de protocoles de greffe d’hépatocytes humains chez cet animal, à la disponibilité de lignées de souris immuno-déprimées qui favorisent l’implantation des cellules humaines ainsi qu’à notre expérience passée de génération de lignées de cellules humaines hautement fonctionnelles via la greffe de cellules primaires immortalisées dans des souris. Les lignées cellulaires que nous avons précédemment générées (principalement cellules béta pancréatiques) ont depuis été adoptées par plusieurs centaines de laboratoires travaillant sur le diabète ou sur la physiologie du pancréas dans le monde. La même stratégie sera appliquée ici à l’amplification et à la maturation d’hépatocytes humains pour lesquels il n’existe pas de modèle cellulaire humain complet. La procédure expérimentale de dérivation de cellules fonctionnelles n’a été testée que sur la souris rendant nécessaire le choix de la souris pour mener le projet concernant les hépatocytes. Enfin, les souris qui seront utilisées auront entre 7 et 12 semaines au moment de l’implantation des cellules ou tissus humains transduits, ceci afin que l’animal ne soit pas trop petit et pour ainsi faciliter et garantir la réussite de la procédure de chirurgie.
Rôle spécifique du récepteur de l’ocytocine dans des neurones impliqués dans les troubles du neurodéveloppement chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système nerveux
Pucées par incision, opérées pour une injection de vecteurs dans le cerveau pour une partie, puis isolées deux à trois jours, 1 492 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, toutes tuées à l'issue pour prélever sang et cerveau. Certaines reçoivent des médicaments dans l'eau de boisson pendant douze semaines ou par le nez pendant dix jours, parfois dès la naissance. Le projet cherche à comprendre pourquoi l'ocytocine donnée par le nez a déçu dans les essais cliniques sur l'autisme et le TDAH, et évalue les comportements jusqu'à une heure par jour pendant trois semaines, sans nommer les tests. Le porteur qualifie d'"optimisé" l'effectif de 1 492 souris, qui tomberait à 564 si aucun effet du sexe n'apparaît et si la dose faible de méthylphénidate suffit.
Objectifs
Les troubles du neurodéveloppement (TND), comme l’autisme ou les troubles déficitaires de l’attention avec ou sans hyperactivité (TDAH), sont liés à des perturbations du développement et du fonctionnement du cerveau. Ils peuvent avoir des conséquences importantes sur la vie quotidienne des patients. Des modifications du système de l’ocytocine ont été observées dans plusieurs TND. L’ocytocine régule les comportements sociaux et émotionnels, et l’anxiété. Pour agir, elle se fixe sur une protéine appelée récepteur de l’ocytocine. Ce récepteur est présent dans différentes régions du cerveau et types de cellules, notamment dans les neurones qui produisent l’ocytocine et ceux de la cavité nasale. Cependant, les essais cliniques utilisant de l’ocytocine administrée par voie intranasale ont donné des résultats décevants. Une meilleure compréhension des mécanismes d’action de l’ocytocine sur ses récepteurs pourrait permettre de comprendre ces résultats. Ce projet collaboratif, financé par l’Agence nationale de la recherche et réunissant quatre équipes de recherche, vise à mieux comprendre le rôle de l’ocytocine et de son récepteur dans les différents types de cellules du cerveau et de la cavité nasale, leur implication dans les TND et les raisons pour lesquelles l’administration d’ocytocine par voie intranasale ne produit pas les effets attendus chez les patients. Cette étude se concentre sur deux populations de neurones : les neurones du cerveau qui produisent l’ocytocine et ceux de la cavité nasale, qui sont les premiers exposés à l’ocytocine lors de son administration par voie nasale. La première partie de cette étude consiste à déterminer le rôle du récepteur de l’ocytocine dans les cellules qui produisent l’ocytocine, notamment dans les comportements et altérations des mécanismes associés aux TDAH. La deuxième partie consiste à établir si une modification des niveaux d’ocytocine peut entraîner ou, au contraire, améliorer certaines des altérations comportementales associés aux TND. Enfin, la troisième partie consiste à comprendre si les récepteurs de l’ocytocine présents dans les neurones produisant l’ocytocine et ceux de la cavité nasale participent de manière positive ou négative aux effets de l’ocytocine par voie intranasale sur les comportements associés aux TND.
Bénéfices attendus
Cette étude, intégrée au projet collaboratif dans son ensemble, permettra d’avancer les connaissances sur le rôle de l’ocytocine et de son récepteur dans différentes cellules du cerveau et de la cavité nasale. Elle contribuera notamment à mieux comprendre pourquoi l’administration d’ocytocine par voie intranasale n’a pas produit les effets attendus dans plusieurs essais cliniques chez des personnes présentant des troubles du neurodéveloppement. Les travaux permettront également d’étudier plus précisément le lien entre le fonctionnement du système de l’ocytocine et certains troubles du neurodéveloppement, notamment les troubles de l’attention et les troubles du spectre de l’autisme. Ils pourraient notamment permettre d’identifier de nouveaux mécanismes pathologiques impliqués dans ces troubles. À plus long terme, les connaissances obtenues pourraient contribuer à identifier de nouvelles pistes de traitement ou à améliorer les stratégies utilisant l’ocytocine. Ces travaux pourraient ainsi participer au développement de traitements plus efficaces et mieux adaptés aux personnes présentant des troubles du neurodéveloppement.
Procédures
Les souris seront implantées sous anesthésie locale et générale avec une puce d’identification par radiofréquence à l’aide d’une petite incision (une seule fois, 5 minutes par animal). Cette puce permettra d’identifier chaque animal et de suivre ses interactions avec les autres souris lors des tests de comportement. Certaines souris seront soumises à une intervention chirurgicale (
Impact sur les animaux
La manipulation des souris, les injections et les tests comportementaux peuvent entraîner un léger stress temporaire chez l’animal. L'implantation des puces peut provoquer une légère douleur minorée par l'administration d'antalgiques. L’intervention chirurgicale, réalisée sous anesthésie générale et locale accompagnée d’un analgésique, pourrait entraîner une diminution modérée et transitoire de leur bien-être.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à l’issue des procédures pour réaliser des prélèvements de différents tissus (sang et cerveau) et faire des analyses moléculaires, biochimiques ou histologiques.
Remplacement
Il n’existe pas de méthode alternative permettant de reproduire la complexité du développement et du fonctionnement du cerveau, des comportements, des circuits de neurones de multiples régions du cerveau et la communication avec le reste du corps, ni leur modulation par des médicaments comme l’ocytocine nécessitant dans un organisme entier de la naissance à l’âge adulte. L’utilisation d’animaux est donc indispensable pour atteindre les objectifs scientifiques du projet.
Réduction
Le nombre de 1492 animaux a été optimisé pour obtenir des résultats pertinents, reproductibles et statistiquement valides. Si aucun effet sexe n’est observé dans les premières expériences, le nombre de souris sera réduit de moitié pour les autres expériences. De plus, si la dose la plus faible du médicament methylphenidate permet d’obtenir des résultats satisfaisants, la dose plus élevée ne sera pas testée. Si ces deux mesures de réduction peuvent être appliquées, le nombre total d’animaux nécessaires sera limité à 564.
Raffinement
L’environnement des souris est enrichi et renouvelé régulièrement pour optimiser le maintien de leur comportement naturel, leur chaleur corporelle et de leur bien-être. Les injections et les tests de comportement seront réalisés dans une pièce calme et faiblement éclairée, dans des dispositifs adaptés et seront les plus brefs possibles afin de minimiser l’inconfort et l’anxiété des animaux. De plus, les animaux seront habitués à cette pièce et au contact des expérimentateurs, tout en permettant de vérifier leur état de santé. Les lignées génétiques des souris et les croisements utilisés ont été adaptés afin de limiter l’apparition d’effets indésirables pouvant affecter leur bien-être. Les souris soumises à une incision pour inmplanter les puces d’identification ou à une intervention chirurgicale seront traitées avec des antidouleurs jusqu’à leur rétablissement pour limiter leur douleur et, comme pour tout changement chez un animal, feront l’objet d’une surveillance renforcée. Des points limites adaptés à chaque procédure ont été mis en place et seront appliqués. Après l’intervention chirurgicale, l’isolement des souris est de très courte durée et temporaire permettant d’éviter des morsures des congénères au niveau de la plaie et une meilleure cicatrisation. Pendant cette période, l’enrichissement des animaux sera doublé, avec un accès visuel, auditif et olfactif à leurs congénères.
Choix des espèces
Les souris sont de petits animaux sociaux, et dont les comportements sont proches de ceux de l’homme. Elles constituent ainsi un modèle pertinent pour étudier les troubles du neurodéveloppement qui ont un impact important sur la qualité de vie des personnes atteintes. De plus, les lignées génétiques nécessaires à ce projet sont disponibles uniquement chez la souris. Les expériences seront réalisées à un stade précoce (0-15 jours) après la naissance et chez la souris jeune adulte (2-3 mois) ayant un cerveau mature et adapté à l’étude des comportements. Les animaux recevront des médicaments depuis la naissance ou directement chez l’adulte, au moment de l’évaluation de leurs comportements.
Obtention de sérum polyclonaux de lapins et de souris à usage de Travaux pratiques de Licence
- Enseignement supérieur
Lapins : 4
44 animaux non-humains, 40 souris et 4 lapins, vont être utilisés, tous tués une fois la quantité d'anticorps jugée suffisante, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les souris reçoivent jusqu'à deux injections dans l'abdomen et quatre prises de sang sous anesthésie gazeuse, les lapins jusqu'à quatre injections intradermiques et quatre prises de sang sous crème anesthésiante, avant un prélèvement de sang final. Leur sérum sert à des travaux pratiques d'immunologie en licence, les étudiants ne manipulant que les sérums. Il s'agit de "tests classiques" d'enseignement : selon le porteur, les quatre lapins fournissent environ huit ans de travaux pratiques, les quarante souris environ cinq ans.
Objectifs
Mise en œuvre de tests classiques comparatifs pour mettre en évidence la spécificité des anticorps et les éventuelles réactions croisées à l’aide des sérums de lapin ainsi que des tests d’hémagglutination en utilisant les sérums de souris immunisées.
Bénéfices attendus
Ce projet entre dans le cadre de la formation des étudiants en immunologie, durant les secondes et troisièmes années de leur cursus. Les étudiants travailleront uniquement avec les sérums. La préparation des sérums sera réalisée au préalable par du personnel compétent. Les travaux pratiques visent à une meilleure compréhension de la spécificité des anticorps (L2, tests sur sérums de lapin) et à la mise en évidence de la cinétique de la réponse immunitaire (L3 sur sérums de souris).
Procédures
- Injections Intra péritonéales sous anesthésie gazeuse pour les souris (2 maximum pour une durée d’une minute), Intra dermiques sous crème anesthésiante pour les lapins (4 maximum pour une durée de 3 à 4 minute). - Prélèvements de sang sous anesthésie gazeuse pour les souris (4 maximum pour une durée de quelques secondes) , sous crème anesthésiante pour les lapins (4 maximum, pour une durée d’environ 1 minute). - Anesthésie gazeuse (souris) ou chimique (lapin) pour le prélèvement sanguin final
Impact sur les animaux
La contention lors des prélèvements et des injections peut causer un léger stress. Une inflammation au niveau des sites d’injections peut être observée. Il peut y avoir une légère douleur à l’injection. Nous resterons vigilants à tous autres effets imprévus qui pourraient survenir.
Devenir
Lorsque la quantité d'anticorps sera suffisante, tous les animaux seront mis à mort.
Remplacement
Le remplacement du modèle in-vivo ne peut être envisagé car la réponse immunitaire est un phénomène complexe impliquant des coopérations multiples entre différents types cellulaires, pour lequel il n’existe pas d’équivalent in-vitro. Les méthodes type phage display ne sont pas envisageables pour l’obtention de sérums polyclonaux.
Réduction
Un nombre minimal de 4 lapins permet d'obtenir un nombre suffisant d'anticorps pour assurer 8 ans de travaux pratiques environ. Ce nombre est réduit au minimum et est déterminé par a quantité d’anticorps nécessaires. Concernant les souris, un nombre minimal est également nécessaire pour suivre la cinétique de la réponse contre un Ag donné. Cette cinétique repose, ici, sur 5 points espacés dans le temps. Un minimum de 8 souris par point permet d’obtenir une quantité suffisante de sérums pour 5 ans de travaux pratiques environ.
Raffinement
Les animaux ont un enrichissement dans leur cage. Les animaux sont habitués au personnel pour réduire le stress. Le personnel est formé et sensibilisé à une manipulation douce des animaux. Si l’animal présente une souffrance qui ne diminue pas avec l’arrêt des injections et les soins apportés, et que les points limites sont atteints, alors l’animal sera mis à mort pour éviter des souffrances.
Choix des espèces
Le lapin et la souris sont les animaux de laboratoire les mieux adaptés au développement d’anticorps polyclonaux pour la recherche et l’enseignement. Ils montrent en effet une très bonne réponse immunitaire humorale. Par ailleurs, ils permettent de récolter une quantité de sérum conséquente pour les applications qui nous importent. Les animaux sont immunisés à l’âge adulte lorsque le système immunitaire est mature (15 semaines pour les lapins et 8 semaines pour les souris)
Rôle d’AhR et de MCP1 dans les processus de sténose et de thrombose de la fistule artério-veineuse -MODIFICATION
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
288 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, et chacune subit trois chirurgies en trois semaines, à 8, 9 et 11 semaines de vie. Les deux premières visent à provoquer une maladie rénale chronique, la troisième relie une veine à une artère pour créer une fistule, et une partie des souris reçoit en plus 24 gavages en sept semaines. Chez les souris malades des reins, le porteur attend une perte de poids et une atteinte plus précoce des points limites : poils hérissés, dos courbé, prostration. Les bénéfices pour les patients dialysés restent au stade de "proposer des cibles thérapeutiques".
Objectifs
Au stade terminal de maladie rénale chronique (MRC) les patients bénéficient d’un traitement par dialyse qui consiste à épurer le sang en remplacement des reins qui ne fonctionnent plus. La fistule artério-veineuse (FAV) qui consiste à relier chirurgicalement une veine superficielle du bras à une artère, est indispensable pour épurer le sang par dialyse. Cependant, il arrive fréquemment que la FAV rétrécisse ou se bouche amenant à son dysfonctionnement. C’est une complication majeure qui est responsable de 30% des hospitalisations des patients en dialyse et les mécanismes liés à cette dysfonction ne sont pas décrits à ce jour. Notre hypothèse est que des toxines, dont la concentration est élevée dans la circulation sanguine de ces patients, provoquent ce dysfonctionnement amenant à l’échec de fistule artério-veineuse. Notre objectif est d'étudier in vivo, dans un modèle animal de maladie rénale chronique et de FAV, le rôle des toxines et de leur récepteur dans l’échec de création de fistule artério-veineuse (FAV). Nous testerons : 1) Si la maladie rénale chronique augmente le taux d’échec de FAV, et 2) si l’inhibition du récepteur aux toxines permet d’augmenter le taux de réussite de création de FAV.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de mettre en évidence des mécanismes liés à l'échec de création de fistule artério-veineuse (FAV) et de proposer des cibles thérapeutiques afin d'améliorer la qualité des séances de dialyse et par conséquent la qualité de vie des patients atteints de maladie rénale chronique.
Procédures
Dans la première procédure, les animaux seront soumis à des 2 interventions chirurgicales pour reproduire une maladie rénale chronique, sous anesthésie générale, espacées d'une semaine et chaque interventionchirurgicale durera 20 minutes. Deux semaines après, ces mêmes animaux seront soumis à une 3ème intervention chirurgicale pour la création de la fistule artério-veineuse (FAV) qui durera 20 minutes également. Les animaux de la procédure n°2 seront soumis aux mêmes interventions chirurgicales que ceux de la première procédure à savoir 3 chirurgies de 20 min (à 8, 9 et 11 semaines de vie). Ces mêmes animaux seront également soumis à un gavage oral toutes les 48h pendant 7 semaines et chaque gavage durera quelques secondes, soit 24 gavages sur animaux vigiles.
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues sont liées aux différentes procédures chirugicales (douleur et/ou risque infectueux), aux gavages par voie orale (stress), ainsi qu'à la détérioration de la fonction rénale des souris qui aurons une maladie rénale chronique (MRC). Chez ces souris MRC, nous nous attendons à observer une perte de poids et une apparition plus précoce des points limites par rapport à l’apparence physique (poils hérissés, dos courbé ou posture anormale), aux signes cliniques (augmentation de la fréquence respiratoire par exemple) et aux comportements non provoqués (attitude prostrée par exemple).
Devenir
A l’issue de chaque procédure, tous les animaux seront euthanasiés pour réaliser des prèlèvements de tissus à des fins d'histologie. Ceci permettra de comprendre les mécanismes liés aux échecs de fonctionnement des fistules artério-veineuses.
Remplacement
Les animaux de ce projet ne peuvent pas être remplacés. Il n'existe pas de modèles in vitro suceptibles d'apporter le même niveau d'information sur les mécanismes de dysfonctionnement des fistules artério-veineuses (FAV) qui sont fréquentes chez les patients traités par dialyse. Il est donc nécessaire d'utiliser des animaux sauvages et génétiquement altérès afin d'envisager des approches thérapeutiques transposables à l'homme.
Réduction
Dans ce projet, nous utiliserons tous les animaux, à savoir 288 souris (MODIFICATION). Seules les expériences considérées comme absolument indispensables seront réalisées afin d’utiliser le moins d’animaux possibles : rédaction d'un protocole expérimental avant toute expérimentation, utilisation des statistiques lors de la conception du protocole expérimental pour une estimation préalable du nombre d'animaux nécessaire et suffisant à l'obtention de résultats statistiquement exploitables. Afin de réduire le nombre d'animaux, le partage d'organes ou de tissus d'animaux mis à mort sera également effectué, avec d’autres d’équipes du centre de recherche et d'autres équipes s'intéressant à la maladie rénale chronique.
Raffinement
Les conditions d'élevage, d'hébergement, de soins et les méthodes utilisées seront les plus appropriées pour réduire le plus possible toute douleur, souffrance, et angoisse que pourraient ressentir les animaux. Les animaux resteront sous surveillance journalière pendant la durée entière du projet. La douleur ou la détresse de l’animal sera évaluée sur les paramètres suivants : poids, apparence physique externe, signes cliniques, changement dans les comportements non provoqués, réponses comportementales aux stimuli externes. Des scores seront établis en fonction de ces observations et grâce à une grille d’évaluation de la douleur. Des mesures seront prises en fonction de ces scores pour éviter tout inconfort de l’animal. Nous serons particulièrement attentifs à la perte de poids qui est un symptôme lié à la détérioration de la fonction rénale et aux suivis postopératoires. Le contrôle quotidien des animaux sera réalisé par un technicien animalier et la mesure du poids sera réalisée au moyen d'une petite balance de paillasse deux fois par semaine. Les animaux seront hébergés par groupes de 5 individus au maximum par cage et un enrichissement sera mis en place par l’ajout de dômes ou de matériaux de nidification de type « Nestlets ». Les quantités de nourriture et d'eau de boisson seront aussi vérifiées quotidiennement. Concernant la chirurgie, l’utilisation de l’anesthésie gazeuse est établie comme permettant une induction rapide des animaux, un ajustement facile de l’anesthésie pendant les chirurgies en fonction de la fréquence respiratoire, et permettant un réveil plus rapide et plus facile pour les animaux. La température des animaux sera maintenue grâce à un tapis chauffant pendant et après chirurgie et une analgésie avant et après les chirurgies sera mis en place pour permettre un rétablissement rapide. L’augmentation du nombre de visites après la chirurgie est prévue. Pour l'administration d'un composé par gavage, des canules en plastique seront utilisées afin de réduire le risque de blessure et cette procédure d'administration sera réalisée par une personne expérimentée à cette technique.
Choix des espèces
Les modèles animaux de maladie rénale chronique (MRC) sont essentiels pour l’étude des évènements physiopathologiques permettant ainsi des études translationnelles dont le but est d’améliorer la prise en charge des patients présentant une MRC. L'espèce animale utilisée sera la souris car c’est le modèle le mieux maitrisé pour générer des animaux génétiquement altérés. Les animaux utilisés pour notre projet seront utilisés à partir de 8 semaines car nous souhaitons que la période de la puberté soit révolue (vers 4-6 semaines chez les mâles, 6-7 semaines chez la femelle). Toutes les expérimentations seront réalisées avec des souris au stade adulte. En effet, la maladie rénale chronique est une pathologie qui touche principalement les sujets humains adultes. Il faut donc utiliser un modèle murin adulte pour ce projet. Par ailleurs, il est beaucoup plus aisé de réaliser les procédures chirurgicales sur des souris de taille adulte et ainsi d’effectuer les bons gestes, ce qui justifie également d'utiliser les souris au stade adulte.
Etude des mécanismes épigénétiques de la douleur chronique et de ses conséquences anxio-dépressives chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Opérées deux fois à deux semaines d'intervalle pour déclencher une douleur chronique, 1 620 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour des analyses post-mortem. Elles passent ensuite quatre tests de douleur et cinq tests d'anxiété et de dépression, l'un après 24 heures de jeûne, un autre après 24 heures d'isolement. Le porteur écrit que la douleur et le phénotype anxio-dépressif "ne peuvent pas être soulagées car c'est l'objet de l'étude", pour chercher des mécanismes épigénétiques et, au conditionnel, de nouvelles cibles thérapeutiques. Il ne nomme aucun des neuf tests, ni la technique chirurgicale employée pour provoquer la douleur.
Objectifs
La douleur chronique touche environ 7 à 10 % de la population. Elle est souvent résistante aux traitements actuellement disponibles et a un impact important sur la qualité de vie des personnes concernées. Elle est fréquemment associée à des troubles émotionnels, notamment l’anxiété et la dépression. Des données scientifiques récentes suggèrent que des mécanismes dits « épigénétiques », qui régulent l’expression des gènes, pourraient contribuer au développement et au maintien de la douleur chronique ainsi qu’à ses conséquences émotionnelles. Toutefois, ces mécanismes restent encore insuffisamment caractérisés. L’objectif de ce projet est d’étudier ces mécanismes dans un modèle murin de douleur chronique associé à des troubles émotionnels. Une meilleure compréhension de ces processus pourrait permettre d’identifier de nouvelles cibles et stratégies thérapeutiques afin d’améliorer la prise en charge de cette comorbidité.
Bénéfices attendus
Les résultats attendus permettront de mieux comprendre les mécanismes épigénétiques impliqués dans cette comorbidité. Une meilleure compréhension de ces mécanismes pourrait conduire à l'identification de nouvelles cibles thérapeutiques, contribuant ainsi à améliorer la prise en charge de la douleur neuropathique chronique ainsi que de ses conséquences émotionnelles.
Procédures
- Les animaux sont soumis à une douleur chronique avec développement de troubles anxio-dépressifs. -les animaux subissent deux chirurgies espacées de 2 semaines. - Les chirurgies se déroulent sous anesthésie générale pour une durée maximale de 45 minutes - Les animaux subissent 4 tests évaluant la douleur (15-30 minutes en moyenne - stimulation courte de maximum 20 secondes) et 5 tests évaluant l'anxio-dépression (durée de 5 minutes par test) , avec un délai minimal de 48h entre chaque test . - Les animaux subissent un jeûne unique de 24h pour un test comportemental et un isolement unique de 24h pour un autre test. - Les animaux subissent une chirurgie terminale pour prélèvement de tissus sous anesthésie profonde pour une durée de 10 minutes.
Impact sur les animaux
- la présence de la douleur et l’apparition du phénotype anxio-dépressif chez le modèle animal sont inévitables et ne peuvent pas être soulagées car c'est l'objet de l'étude. - Suite à la chirurgie, une légère difficulté dans les déplacements des animaux est attendue mais qui disparaît rapidement dans les 24 à 48h. - La douleur post-chirurgicale est aigue, transitoire et inflammatoire. - Les animaux subissent un stress aigu ainsi qu’une douleur transitoire et de faible intensité lors des tests de comportement.
Devenir
A la fin des procédures, les animaux sont mis à mort pour des analyses post-mortem.
Remplacement
Au regard des objectifs de cette étude, il nous est impossible de remplacer le modèle animal par une approche in vitro ou in silico. En effet, l'étude de la douleur et de sa comorbidité anxio-dépressive nécessite l'évaluation intégrée de réponses sensorielles, émotionnelles et comportementales, qui ne peut être réalisée que chez un animal vivant et vigile. Les modèles in vitro et in silico ne permettent pas de reproduire la complexité des interactions entre les différents systèmes biologiques et les circuits neuronaux impliqués dans ces processus, ni d'évaluer les manifestations comportementales associées.
Réduction
Les expériences seront réalisées avec la volonté de réduire autant que possible le nombre d’animaux par condition expérimentale, mais toujours dans l’optique d’obtenir le maximum d’information scientifique par test. Le nombre d'animaux a été déterminé pour obtenir des résultats statistiquement valides tout en se basant sur des données de la littérature, de notre expérience et de la variabilité phénotypique interindividuelle.
Raffinement
Les animaux sont hébergés en groupe sociaux pour respecter leurs besoins sociaux. Des carrés de coton seront placés dans la cage pour favoriser la nidation, et des barreaux de bois à ronger pour limiter les comportements d’agressivité. Avant le début des procédures et sur une période d’une semaine, les animaux sont manipulés quotidiennement par l’expérimentateur et acclimatés à l'environnement où les tests se dérouleront afin de réduire l'état de stress et d'angoisse chez l'animal. Les animaux seront observés tous les jours et leur comportement sera suivi afin de déceler tout signe d’inconfort ou de stress. Durant les chirurgies, des méthodes d’anesthésie et d’analgésie sont systématiquement utilisées. Un suivi post-chirurgical rapproché sera réalisé. Des points limites sont mis en place pour l’ensemble des procédures expérimentales. Si de nouvelles approches moins stressantes ou douloureuses pour l’animal venaient à être mises au point après le début de ce projet, une concertation avec la SBEA (structure chargée du bien-être des animaux) pourra être réalisée afin d’intégrer ces nouvelles pratiques dans nos procédures.
Choix des espèces
Ce projet sera réalisé sur le modèle animal - Souris adulte (à partir de l'âge de 8 semaines post-naissance). Il nous est indispensable de travailler sur un modèle animal, social, entier avec un système neurobiologique mature afin d’être dans les conditions les plus proches de la complexité humaine. Le modèle murin adulte présente une forte homologie structurale du cerveau avec l’Homme le rendant incontournable dans la recherche en neurosciences.
Etude de la biocompatibilité de dispositifs médicaux : essai réglementaire de toxicité systémique aigue
- Tests réglementaires
- Toxicologie et autres tests de sécurité
22 000 souris vont être utilisées pour contrôler la toxicité de dispositifs médicaux avant leur mise sur le marché, dans des procédures d'un niveau de souffrance léger pour les témoins et sévère pour les souris exposées. Chacune reçoit une injection d'extrait de dispositif ou de solvant, puis est examinée et pesée chaque jour. Selon le produit, les effets vont d'une perte de poids et d'une baisse d'activité jusqu'aux tremblements, aux convulsions, aux hémorragies et à la mort. Les souris exposées au produit sont mises à mort à la fin du test, et les témoins sans signe clinique, 7 400 selon le champ structuré, peuvent être réutilisés dans d'autres procédures. Pour ces essais commandés par un donneur d'ordre, le porteur affirme que la norme ISO 10993 impose la souris et qu'il n'existe "aucune méthode alternative".
Objectifs
Dans ce projet, le paramètre évalué est le potentiel de toxicité systémique aigue (i.e. la toxicité/effets néfastes au niveau du corps survenant à tout moment dans les 72 heures suivant une exposition unique, multiple ou continue pendant 24 heures) des dispositifs médicaux chez la souris. Ces études réglementaires, requises par la loi, ont pour objectif d’évaluer le risque biologique de toxicité systémique considérant que ces dispositifs médicaux sont susceptibles d’introduire des constituants ou des particules dans le corps humain.
Bénéfices attendus
Ce projet participe à l’autorisation de mise sur le marché de dispositifs médicaux en vérifiant que leur utilisation ne compromet ni l’état clinique et la sécurité des patients, ni la sécurité et la santé des utilisateurs. Ce projet permet spécifiquement d’évaluer les risques éventuels de toxicité systémique aigue liés à l’utilisation de dispositifs médicaux et s’assurer le cas échéant qu’ils constituent des risques acceptables au regard des bienfaits/bénéfices apportés aux patients et sont compatibles avec un niveau élevé de protection de la santé et de la sécurité des patients comme des utilisateurs. Les résultats seront disponibles à l’issue des études et leur incorporation dans les dossiers de soumissions aux autorités de santé compétentes avant leur mise (ou pour leur maintien) sur le marché pourront en découler à court terme.
Procédures
Les animaux recevront une injection intra-veineuse ou sous cutanée ou intrapéritonéale. La durée de cette injection est de moins d’une minute et se fait sur animal vigile, avec une contention appropriée. Les animaux sont manipulés quotidiennement afin de les examiner et de les peser. Cette manipulation dure également moins d’une minute à trois minutes.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables pouvant être observés sont principalement dus à l’administration, avec par exemple, un stress léger de courte durée lié aux contentions (pour l’injection et les observations), une douleur locale liée à l’injection ou à des réactions tissulaires locales (inflammation : rougeur, gonflement, douleur). En cas de toxicité du produit testé, les effets indésirables attendus sont des effets systémiques dépendant du produit, pouvant être par exemple une atteinte métabolique, avec des signes généraux comme une baisse d'activité ou d'appétit, une perte de poids et/ou un poil piqué, une atteinte neurologique, une atteinte digestive... Une baisse d’activité et une difficulté respiratoire transitoire (1 à 2 minutes) est également attendue avec certains produits. Tout signe clinique sera observé et pourra servir de point limite précoce.Dans certains cas, le produit peut également provoquer des effets plus sévères tels que des tremblements, des convulsions, des hémorragies etc… pouvant aller jusqu’à la mort de l’animal.
Devenir
Mise a mort de tous les animaux tests car il ne peuvent être réutilisés dans une nouvelle procédure (car déjà mis en contact avec un produit ou son extrait). Réutilisation possible des animaux témoins n'ayant montré aucun signe clinique anormal et aucune perte de poids significative au cour du test, pour d'autres procédures jugées scientifiquement compatible. La procédure est de degré prospectif sévère pour les animaux tests ayant été injectés avec un produit pouvant conduire à des signes cliniques pouvant aller jusqu'a la mort des animaux. Les animaux témoins étant injectés uniquement avec du solvant témoin (Sérum physiologique ou Huile de sésame) auront une gravité réelle légère autorisant la réutilisation.
Remplacement
L’utilisation d’animaux est requise dans la réglementation pour répondre aux exigences de la norme ISO 10993. Il n’existe actuellement aucune méthode alternative permettant d’évaluer le potentiel de toxicité systémique aigue. De ce fait, l’utilisation d’animaux est toujours requise par la règlementation et par les autorités.
Réduction
Le donneur d'ordre demandant la réalisation de ces tests s'engage à ne pas renouveler à l'identique un essai déjà mené précédemment. Le nombre minimal d'animaux requis par les textes de références (norme ISO 10993-11) est pris en compte afin de permettre la détection d'un risque toxique (5 animaux par groupe (test et témoin)). Les animaux témoins négatifs sont, dans la mesure du possible, mutualisés entre les différents essais (un même groupe d’animaux "témoin" pour plusieurs groupes d’animaux "test" recevant des produits à tester différents mais préparés dans les mêmes conditions). Des études de faisabilité sur un nombre d’animaux restreint (par exemple 2 animaux) peuvent être conduites avant de réaliser l’essai pour les produits à tester pour lesquels des effets secondaires sont craints pour des raisons autres qu’une toxicité du produit (e.g. si l’extrait ou le produit pur présente des caractéristiques physicochimiques inhabituelles (en pH, osmolarité, présence de particules...), si les résultats d’autres tests déjà menés le supposent...). Cela permet d’adapter la dose et la voie d’injection avant de procéder à une injection de 5 animaux.
Raffinement
En cas de détection de signes de douleur ou d'anomalie clinique pouvant laisser penser que l’animal présente une souffrance lors des suivis quotidiens ou des observations attendues dans l’étude, un examen par l’équipe vétérinaire est réalisé si nécessaire, afin d’assurer une prise en charge adaptée de l’animal (e.g. en intensifiant la fréquence de suivi de l’animal). En cas d’anomalie persistante et dès que les points limites tardifs sont atteints, l’animal est euthanasié.
Choix des espèces
La souris est l’espèce animale définie dans le (ou les) texte(s) de référence(s). De plus il s’agit d’un modèle connu, largement utilisé, rendant disponibles de nombreuses données dans la littérature et permettant ainsi une interprétation robuste des effets observés. Le choix du stade de développement est décrit dans le(s) texte(s) de référence qui recommande(nt) généralement l'utilisation d'animaux adultes. Les textes de référence mentionnent également l’utilisation de souris pesant entre 17 et 23 g au début du test. Ce stade est recommandé pour les études de toxicité systémique selon la norme ISO 10993- 11, car il permet une évaluation fiable et reproductible des effets systémiques, sans interférence liée à la croissance ou au vieillissement, et limite la variabilité biologique.
Mise au point d’un vaccin délivré par voie nasale contre la grippe chez la souris (1/2)
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Vaccinées par le nez sous anesthésie ou par injection dans le muscle, puis infectées par la grippe pour une partie, 984 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour le prélèvement de leurs organes. Elles reçoivent deux ou trois administrations à quinze jours d'intervalle, et certaines passent des séances d'imagerie sous anesthésie. Il s'agit de tester une formulation de vaccin antigrippal sans injection, l'infection pouvant provoquer perte de poids, baisse d'appétit et pelage ébouriffé, des signes que le porteur qualifie de "transitoires". Il écrit que la souris est "nécessaire" pour étudier la réponse immunitaire, et qu'elle a été choisie parce qu'elle est "largement utilisée en recherche".
Objectifs
Le virus de la grippe évolue régulièrement, ce qui réduit l’efficacité des vaccins actuels et nécessite une vaccination annuelle. De plus, ces vaccins sont le plus souvent administrés par injection intramusculaire et protègent principalement l’ensemble de l’organisme, mais moins efficacement les voies respiratoires, qui constituent pourtant la principale porte d’entrée du virus. L’objectif de ce projet est de développer un nouveau vaccin contre la grippe qui serait administré par voie nasale. Cette approche vise à stimuler plus efficacement les défenses immunitaires directement dans les voies respiratoires, afin de mieux empêcher le virus de s’y installer et d’offrir une protection plus durable. Dans ce projet, une nouvelle formulation vaccinale sera testée afin de déclencher une réponse immunitaire efficace contre le virus de la grippe. Le vaccin sera évalué chez la souris, un modèle couramment utilisé pour l’étude des infections respiratoires. Le projet permettra d’analyser la capacité du vaccin à activer le système immunitaire, à induire une protection durable dans les voies respiratoires et à protéger contre différentes formes du virus de la grippe. Ce projet sera réalisé dans deux établissements utilisateurs. Les études d’imagerie visant à analyser la distribution du vaccin seront menées dans le second établissement.
Bénéfices attendus
Ce projet a pour objectif de développer un vaccin contre la grippe administré par voie respiratoire (sans injection), capable d’induire une mémoire immunitaire au niveau des poumons et de protéger contre différentes souches du virus. La stratégie vaccinale mise en place pourrait également être appliquée à la conception de nouveaux vaccins ciblant d’autres agents pathogènes respiratoires.
Procédures
Certaines souris recevront des administrations de substances sous anesthésie générale, afin d’éviter toute douleur. Chaque administration durera environ 2 à 3 minutes et sera réalisée deux fois à 15 jours d’intervalle. Pour certaines souris, une troisième administration pourra être réalisée. D’autres souris recevront des injections sur animaux vigiles. Chaque injection durera moins d’une minute et sera réalisée deux fois à 15 jours d’intervalle. Certaines souris recevront une injection supplémentaire. Cette injection sera réalisée une ou deux fois à 15 jours d’intervalle et durera moins d’une minute. Un prélèvement sanguin sera effectué chez certaines souris vigiles. Cet acte durera environ une minute et sera réalisé une seule fois. Enfin, certaines souris participeront à des séances d’imagerie sous anesthésie générale. Chaque séance durera moins de 25 minutes.
Impact sur les animaux
Certaines souris recevront des injections dans le muscle, qui peuvent provoquer une douleur brève au moment de l’injection ainsi qu’une légère inflammation locale. Dans de rares cas, une irritation du tissu musculaire peut survenir. D’autres souris recevront des administrations de substances par le nez, réalisées sous anesthésie générale. Cette procédure peut entraîner une gêne respiratoire passagère après le réveil. Une partie des animaux recevra également, par cette même voie, le virus de la grippe afin d’évaluer l’efficacité du vaccin. L’utilisation de l’anesthésie générale peut être source de stress temporaire pour les animaux. Les injections nécessaires à l’anesthésie ou à certaines analyses peuvent provoquer une légère douleur au point d’injection. Chez certains animaux, un prélèvement sanguin sera effectué avant la fin de l’étude, ce qui entraînera une douleur locale modérée et de courte durée. L’infection par le virus de la grippe peut provoquer des signes cliniques transitoires tels qu’une diminution de l’activité, un aspect ébouriffé du pelage, une perte de poids et une baisse de l’appétit.
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort à l’issue des interventions, car il est nécessaire d’analyser la réponse immunitaire dans plusieurs organes, à l’aide de techniques nécessitant le prélèvement précis de ces organes
Remplacement
La réponse immunitaire après une vaccination est très complexe et implique de nombreuses cellules et molécules. Les méthodes en laboratoire utilisant des cellules ne permettent pas de la reproduire correctement. La souris est donc nécessaire pour étudier la production d’anticorps, l’activation des cellules immunitaires et les interactions entre organes. De plus, l’infection respiratoire par le virus de la grippe chez la souris reproduit des mécanismes importants observés chez l’humain, impossibles à modéliser en laboratoire ou sur ordinateur.
Réduction
Le nombre de souris a été calculé à partir de données existantes et d’analyses statistiques. Avant de les utiliser, les formulations vaccinales seront testés en laboratoire pour ne garder que les plus prometteurs. Chaque souris sera exploitée au maximum : plusieurs analyses seront faites sur les mêmes tissus, et certains échantillons seront conservés pour des études futures.
Raffinement
La santé des souris sera suivie régulièrement (chaque semaine, et quotidiennement si leur état de santé se dégrade). Des critères précis permettront d’interrompre l’expérience si un animal présente un état critique. À la fin de l’étude, les souris seront mises à mort afin d’analyser la réponse immunitaire. Certaines souris recevront des injections dans le muscle sur des animaux vigiles. Elles seront surveillées afin de détecter d’éventuelles lésions ou signes de douleur et, si nécessaire, une analgésie sera mise en place par administration de buprénorphine. Les administrations par voie respiratoire ainsi que les mesures de bioluminescence seront réalisées sous anesthésie générale. Un tapis chauffant sera utilisé afin de maintenir les animaux au chaud pendant les procédures.
Choix des espèces
La souris a été choisie car elle est largement utilisée en recherche et que son système immunitaire est bien connu. Elle permet d’obtenir des résultats fiables grâce à des méthodes d’analyse déjà disponibles et maîtrisées. Les animaux utilisés sont de jeunes adultes, un âge auquel leur système immunitaire est suffisamment développé pour garantir des observations pertinentes dès le début des interventions.
Effets thérapeutiques d’un précurseur de lipide dans le vieillissement ou dans les lésions précancéreuses chez la souris. 2/2
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
Une biopsie de 2 mm de la queue, un gavage à six semaines, quatre mois de régime obésogène et une prise de sang à la joue toutes les deux semaines : 29 080 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Une partie est transportée vers un second établissement pour des tests de mémoire que le résumé dit "non invasifs" sans les nommer, la veille de leur mise à mort étant consacrée à un jeûne de 12 à 15 heures. Le projet doit confirmer l'intérêt d'un gène dans le vieillissement et dans des lésions précancéreuses, avec des souris gardées jusqu'à 20 mois. Toutes sont mises à mort, pour prélever leurs tissus ou pour renouveler les reproducteurs.
Objectifs
Confirmer in vivo l’effet thérapeutique de la modulation d’un gène qui pourrait être une cible thérapeutique intéressante dans un contexte de maladies liées au vieillissement ou dans l’induction de lésions prétumorales présentant l’activation d’un oncogène. Ce projet pourra servir de base pour de nouvelles pistes thérapeutiques pour atténuer l’agressivité de certains types de cancer. Le projet se déroule dans 2 Etablissements utilisateurs.
Bénéfices attendus
Trouver une nouvelle cible thérapeutique dans un contexte de vieillissement et des lésions pré-tumorales.
Procédures
L'élevage et les expériences sans analyse de la mémoire se feront sur le premier établissement utilisateur : biopsie de queue invasive de 2 mm (1 fois, 10 secondes) - gavage oral à 6 semaines de vie (1 fois, avec 1 minute par gavage) - induction d’un régime obésogène (1 fois, 4 mois) -prélèvement de sang à la joue (1 fois toutes les 2 semaines, quelques minutes) Les expériences avec analyse de la mémoire par des tests comportementaux non invasifs se feront sur le 2e établissement utilisateur: Tests comportementaux non invasifs (
Impact sur les animaux
-Le gavage oral peut engendrer des risques de fausse route. -Une baisse de l’appétit, un amaigrissement ou une diminution de l’activité pourront survenir en cas de vieillissement accéléré. Les prélèvements sanguins répétés par voie sous-mandibulaire sont répétés avec une aternance joue gauche et droite suivie d’une compression locale après prélèvement
Devenir
Les animaux seront mis à mort pour exploration des tissus d'intérêt ou pour renouvellement des reproducteurs.
Remplacement
Dans un contexte de recherche physiopathologique sur les effets du vieillissement et des lésions prétumorales, les expérimentations chez la souris ne peuvent en aucun cas être remplacées par des expériences sur un modèle cellulaire unique, où les cellules sont sorties de leur environnement. Les analyses cellulaires ne sont pas utilisables dans ce contexte car trop de paramètres physiopathologiques entrent en jeu. Les résultats obtenus sur des modèles cellulaires ont permis d'identifier un gène d'intérêt.
Réduction
Les expériences sont réalisées avec le nombre minimum d'animaux nécessaires à l'obtention d'un résultat significatif déterminé par des tests statistiques adaptés, et qui satisfait à l’objectif de réduction du nombre d’animaux exposés dans ce projet.
Raffinement
Les souris bénéficieront d'un enrichissement. Les souris seront hébergées par 5 maximum en cage ventilée. Cependant, tout animal en souffrance sans possibilité de le soulager sera mis à mort par dislocation cervicale. Une surveillance accrue sera mise en place tout au long de la procédure, au moment où les symptômes apparaissent. Le transport des souris entre les 2 sites sera confié aux zootechniciens des 2 sites utilisateurs, garantissant un trajet direct de courte durée (10 minutes maximum). Les animaux seront logés dans des boîtes de transport adaptées, dotées d'un enrichissement (matériel de nidification), de nourriture et d'un gel d'hydratation en quantité suffisante. À leur arrivée, une période d'acclimatation et de récupération d'au moins 7 jours sera strictement respectée dans l'animalerie d'accueil avant toute inclusion dans un test de comportement afin de permettre le retour à l'homéostasie.
Choix des espèces
Le projet met en jeu des approches d’explorations fonctionnelles et comportementales sur animal vigile qui ne peuvent donc pas être substituées par des approches in vitro. Des animaux âgés de 6 semaines (jeune adulte) seront utilisés pour les traitements des animaux de 2.5 mois et 8 mois seront utilisés pour ce projet axé sur les lésions précancréeuses cdu à l'activation d'un oncogène. Des animaux âgés de 8 , 12 mois (adulte jeune) et de 20 mois (adulte âgé) seront utilisé pour ce projet axé sur le vieillissement. La souris est préférée comme espèce car elle présente l’avantage de facilité d’élevage et de reproduction. Ces souris sont particulièrement intéressantes pour la compréhension des mécanismes physiopathologiques. De nombreux outils d’analyses ont été développés et bien caractérisés dans cette espèce animale. Les jeunes souris de six semaines sont utilisées pour l’induction car il est nécessaire que les organes soit suffisamment matures et fonctionnels jusqu’à 20 mois, maximum.
Évaluation du potentiel thérapeutique de composés brevetés dans un modèle murin préclinique d’addiction à la cocaïne
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Pour tester deux inhibiteurs brevetés censés réduire les effets de la cocaïne, 784 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, toutes tuées à l'issue pour l'étude de leur cerveau. Chacune reçoit de 7 à 17 injections, désignées seulement comme des administrations de composés, sans que le résumé précise si la cocaïne en fait partie. Les souris explorent ensuite pendant 10 à 20 minutes une cage à deux compartiments. Des points limites sont dits définis "afin de garantir l'absence de souffrance", mais aucun n'est décrit.
Objectifs
La toxicomanie constitue un problème majeur de santé publique, avec d'importantes conséquences sanitaires, sociales et économiques. En France, la consommation de cocaïne est en constante augmentation et, à ce jour, aucun médicament n'est approuvé spécifiquement pour le traitement de la dépendance à cette substance. L'une des caractéristiques de cette pathologie est l'association persistante entre la drogue et les stimuli environnementaux, qui favorise la consommation et les rechutes. Nous avons précédemment montré que l'exposition à la cocaïne augmente les interactions entre les récepteurs synaptiques. Leur inhibition locale dans le striatum, à l'aide de vecteurs viraux exprimant des peptides interférents, réduit les adaptations comportementales induites par la cocaïne sans altérer les comportements motivés par des récompenses naturelles, ce qui en fait une cible thérapeutique prometteuse. Ce projet vise à déterminer si de nouveaux inhibiteurs des interactions entre récepteurs synaptiques, récemment développés et validés in vitro et ex vivo, sont capables, après administration systémique, de cibler ces interactions dans le cerveau et de limiter les adaptations cellulaires, moléculaires et comportementales induites par la cocaïne, tout en préservant les comportements guidés par des récompenses naturelles
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d'évaluer le potentiel thérapeutique de deux nouveaux inhibiteurs des interactions entre récepteurs synaptiques dans un modèle préclinique de dépendance à la cocaïne. Il apportera des informations sur leur capacité à réduire les effets renforçants de la cocaïne après administration systémique tout en préservant les comportements motivés par une récompense naturelle. Les résultats obtenus pourraient contribuer au développement de nouvelles stratégies pharmacologiques pour le traitement de la dépendance à la cocaïne, pathologie pour laquelle aucun traitement médicamenteux spécifique n'est actuellement disponible.
Procédures
Les animaux recevront des administrations de composés, correspondant à un minimum de 7 et un maximum de 17 injections. Chaque injection dure moins d'une seconde. Les animaux réaliseront des test de comportements durant lequels ils exploreront pendant 10 à 20 minutes librement une cage avec deux compartiments.
Impact sur les animaux
Les principales nuisances attendues sont liées aux manipulations expérimentales. La manipulation des animaux par l’expérimentateur ainsi que l’exposition à un nouvel environnement (cage de test comportemental) peuvent engendrer un stress transitoire. Les injections répétées peuvent provoquer une douleur de très courte durée au niveau du site d’injection
Devenir
A l'issue de chaque procédure, tous les animaux seront euthanasiés afin d'étudier au niveau cérébral les mécanismes des effets observés au niveau comportemental
Remplacement
Les études in vitro et sur invertébrés ne permettent d’étudier les comportements de type addictif car la neuropathologie de ces troubles psychiatriques est complexe, évolutive et multicellulaire. L’utilisation de lignées cellulaires ne permet pas d’appréhender ces études, ni de développer des stratégies à visée thérapeutique pour obtenir des preuves de concepts en vue d’une application translationnelle. Cependant, avant chaque procédure décrite dans ce projet, des résultats obtenus sur des cultures de cellules ont permis d’obtenir des résultats préliminaires solides afin de limiter les études in vivo chez la souris.
Réduction
Le projet impliquera un nombre maximum de 784 animaux. Les résultats publiés nous ont permis de déterminer précisément le nombre d’animaux par groupe expérimental permettant de générer des données statistiquement solides. Il est nécessaire de travailler avec des cohortes de 14 animaux par groupe afin de mesurer et confirmer par test statistique les effets prédits par l'hypothèse.
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans des conditions conformes à la réglementation en vigueur. Lors de leur arrivée au laboratoire, une période d’acclimatation d’au moins 1 semaine sera respectée. Les animaux sont habitués progressivement afin de réduire le stress pouvant être induit par la manipulation, la contention et l’injection. L’injection est réalisée avec une aiguille très fine pour limiter la douleur. Les animaux font l’objet d’un contrôle quotidien de leur arrivée jusqu’à l’euthanasie. Des points-limites ont été définis afin de garantir l’absence de souffrance. En cas de blessures cutanées qui pourraient arriver du fait d'agressions entre congénères (compportement naturel spontané) une crème médicamenteuse sera appliquée après avis du vétérinaire-référent. Les applications seront poursuivies jusqu'à la cicatrisation.
Choix des espèces
La souris est reconnue comme modèle animal idéal pour l'expérimentation et la translation vers les thérapies. Les régions cérébrales, les types de neurones et les circuits neuronaux ainsi que les mécanismes cellulaires de l'addiction sont largement conservés entre le rongeur et l'être humain. Les souris seront utilisées à un âge compris entre 8 et 15 semaines. L’âge adulte représente le mieux les individus souffrant d’addiction à la cocaïne. De plus, cet âge est utilisé dans la majeure partie des études réalisées dans notre domaine d'étude, ce qui nous permet une comparaison directe avec les études réalisées par la communauté́ internationale
Évaluation in vivo de vecteurs-médicaments ciblant TfR et CD98hc pour la délivrance ciblée de molécules thérapeutiques
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système nerveux
Toutes tuées en fin de procédure pour des prélèvements de tissus et de sang, 2 160 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Sans anesthésie, chacune reçoit jusqu'à quatre injections intraveineuses ou sous-cutanées, jusqu'à quatre prises de sang et dix à quinze prises de température rectale sur trois à cinq heures, avec une hypothermie induite qui peut descendre à 32 °C. Il s'agit de tester des vecteurs-médicaments conçus comme un "cheval de Troie" pour franchir la barrière du cerveau, sur des lignées de souris génétiquement modifiées porteuses de cibles humaines. Le porteur affirme que la souris reste le "seul système physiologique" capable d'intégrer ces paramètres, et renvoie les "avancées majeures" pour les patients au conditionnel et au long terme.
Objectifs
Les maladies et troubles neurologiques sont la première cause mondiale de handicap. À l'heure actuelle, les besoins médicaux restent malheureusement très insatisfaits, sans aucun traitement curatif, ou palliatif. Une des raisons majeures réside dans l’inefficacité de nombreux médicaments à passer la barrière protectrice du cerveau et ainsi à accéder aux régions à traiter. Dans ce contexte, nous avons développé un savoir-faire qui consiste en l’association de molécules à des pro-drogues ou médicaments, capables de passer les barrières biologiques protectrices de l’organisme et ainsi atteindre plus efficacement les tissus cibles (cerveau, muscles…). Notre technologie repose sur une stratégie de cheval de Troie : Nos médicaments sont capables de reconnaître des partenaires spécifiques, au niveau des barrières protectrices de l'organisme et utilisent leurs mécanismes naturels de passage cellulaire pour atteindre le tissu cible. À travers cette demande de projet, nous souhaitons développer et optimiser de nouveaux médicaments afin d’améliorer la délivrance d’agents au fort potentiel thérapeutique. Par différentes voies d'administration, nous tenterons de potentialiser l’effet de nos médicaments sur des modèles murins humanisés pour des récepteurs et ou transporteurs d’intérêt.
Bénéfices attendus
La transposition de nos recherches sur un modèle murin humanisé pour notre cible permet d’appréhender les futurs développements pré-cliniques de nos molécules et les possibles effets secondaires ou toxicités associées. De plus, elle assure de développer au maximum les études sur le modèle souris avant la phase préclinique et la transposition à l’homme, qui aurait nécessité des séries de tests sur divers modèles animaux. D'un point de vue médical, sur du plus long terme, le potentiel de ciblage thérapeutique de nos vecteurs-médicaments constitue l'objectif majeur de nos recherches, avec à terme, un bénéfice attendu qui pourrait permettre des avancées majeures dans le milieu médical et sur le quotidien des patients.
Procédures
Les manipulations expérimentales seront réalisées sur animaux vigiles et de manière précises et rapides (≤ 2min). Elles incluent : - L’annotation des queues au moyen d’un marqueur spécifique permettant l’identification des individus (1 fois /semaine). - Les pesées : Une pesée sera réalisée avant chaque administration et une, avant l’euthanasie des animaux. - La prise de température rectale (10 à 15 prises espacées de 15 à 30 minutes sur une durée de 3 à 5 h). - La mise en contention avant toutes administrations intraveineuses (1 à maximum 4) ou prélèvements intermédiaires (maximum 4). - Les administration(s) intraveineuse(s) ou sous-cutanée(s) : 1 à maximum 4. A noter : Dans le cas d’administration répétées, un délai de minimum 24 à 48h sera respecté entre deux administrations. - Les administrations intrapéritonéales : 1 seul/individu (euthanasie). - Les prélèvements intermédiaires : Des prélèvements sanguins intermédiaires seront réalisés en cours de cinétique (maximum de 4 prélèvements de 50μl/semaine, ≤10% de la volémie sur 14 jours). Cette procédure ne présente pas d’anesthésie, pas d’analgésie, ni de chirurgie avec réveil.
Impact sur les animaux
Les nuisances ou effets indésirables sont les suivants : Un stress physique peut être induit lors de la mise en contention des animaux, la réalisation des différentes administrations intraveineuses, sous-cutanées (deux à quatre maximum par individu à une dose de 5.5ml/Kg ou 10ml/Kg respectivement) ou intrapéritonéale (dose unique de 0.1 ml de mélange d’anesthésiques/10g de souris), l’introduction d’une sonde rectale (prise discontinue sur 5h maximum) lors du monitoring de la température et lors de la réalisation de prélèvements sanguins intermédiaires (au maximum 4 prélèvements (≤50µl) /individus, n’excédant pas 10% de la volémie sur 14 jours). Un stress thermique peut quant à lui être généré par l’hypothermie induite (jusqu’à 32°C).
Devenir
En fin de procédure, les animaux seront mis à mort pour réaliser les prélèvements tissulaires et sanguins finaux. Si, en cours de cinétique, un individu atteint un point limite, l'animal sera également mis à mort en urgence après validation du vétérinaire et porteur de projet.
Remplacement
Pour mener à bien nos projets, nous réalisons en amont de nos procédures toute une série de tests in silico et in vitro. Cette première série de tests permet notamment de vérifier le maintien des interactions avec les récepteurs cellulaires mais en aucun cas de prendre en compte l'intégralité des paramètres physiologiques (mécanistiques, immunitaires, métaboliques et d'éliminations) qui conditionnent le succès de nos vecteurs médicaments. Pour faire face à cette sélection physiologique, nous envisagerons donc de réaliser nos expériences sur le petit animal de laboratoire, ici la souris, 1er modèle animal disponible se rapprochant de l’homme pour l’étude des mécanismes physiologiques in vivo. Il n'existe à l'heure actuelle aucun modèle prédictif de bio-informatique capable d'apporter toutes les réponses aux problématiques de la pharmacocinétique. Le modèle vivant, ici la souris, reste pour l'instant le seul système physiologique qui intègre la complexité de l'ensemble des paramètres mécanistiques et homéostasiques précédemment cités, indispensables à l’étude d’une efficacité pharmacologique chez les mammifères.
Réduction
L'optimisation de nos molécules permet d'améliorer leur efficacité tout en réduisant les doses administrées. Cette approche contribue à limiter les effets indésirables potentiels pour les animaux (raffinement) et à réduire le nombre d'animaux nécessaires pour obtenir des résultats fiables (réduction). Les animaux seront répartis en groupes de 6 (3 mâles et 3 femelles), correspondant au plus faible effectif permettant d'obtenir des résultats scientifiquement valides et robustes. Au total, jusqu'à 2160 souris pourraient être utilisées sur la durée de l'autorisation (5 ans). Ce nombre correspond au scénario maximal envisagé et tient compte de l'évaluation de plusieurs molécules dans différentes lignées de souris génétiquement modifiées nécessaires pour répondre aux objectifs du projet. Les tissus prélevés en fin d'étude seront sélectionnés de manière à maximiser les informations obtenues à partir de chaque animal et à éviter l'utilisation d'animaux supplémentaires. De plus, de très petits prélèvements sanguins réalisés au cours de l'étude permettront de suivre la présence des molécules dans l'organisme sans nécessiter de nouveaux animaux. Plusieurs analyses pourront ainsi être réalisées à partir d'un même animal. Cette stratégie contribue à réduire le nombre total d'animaux utilisés tout en garantissant la qualité scientifique des résultats.
Raffinement
Les animaux sont répartis à raison de 4 individus maximum par cage (de même sexe) et maintenus dans un environnement familier (même cage pour les odeurs, taille standard pour portoir ventilé + couvercle filtrant), litières (copeaux de bois) avec un triple enrichissement. Toutes les administrations sont réalisées par un personnel formé, expérimenté et pratiquant en routine les études de biodistribution chez la souris, tout en respectant les recommandations de volume injecté en fonction des voies d’administration. Les prélèvements intermédiaires de sang sont réalisés après asepsie de l’extrémité de la queue. Une compresse de gaz imbibée d’eau oxygénée est appliquée immédiatement après le prélèvement. Les prélèvements terminaux sont réalisés sur des souris sous anesthésie générale profonde et ayant préalablement étaient analgésiées.
Choix des espèces
Des études in silico et in vitro sont réalisées en amont afin de sélectionner les candidats les plus prometteurs. Toutefois, ces approches ne permettent pas de reproduire la complexité du fonctionnement d'un organisme vivant, indispensable pour évaluer le devenir et l'efficacité d'un candidat thérapeutique. À ce jour, aucun modèle alternatif ne permet de reproduire l'ensemble de ces mécanismes. La souris est un modèle de référence pour l'étude des mécanismes physiologiques in vivo. Elle permet d'évaluer les interactions complexes entre les différents systèmes de l'organisme, indispensables à l'étude de l'efficacité d'un candidat thérapeutique. L'utilisation de souris humanisées est particulièrement pertinente dans ce projet, car elles permettent d'étudier des mécanismes impliquant des protéines humaines et d'obtenir des résultats plus représentatifs de la physiologie humaine. Les lignées utilisées seront constituées de souris jeunes adultes âgées de 8 à 12 semaines (27 à 30 g). Ce stade de développement correspond à une maturité physiologique permettant de limiter la variabilité entre les animaux et d'obtenir des résultats plus homogènes.
Rôle de la réponse inflammatoire dans la récupération fonctionnelle après traumatisme cérébral et lésion médullaire chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système immunitaire
- Système nerveux
Une partie des souris porte des modifications génétiques de la réponse inflammatoire, dont le porteur veut mesurer l'effet sur la récupération après une lésion du système nerveux. 960 souris mâles et femelles vont être utilisées, dans des procédures que le porteur classe toutes au niveau de souffrance sévère. Sous anesthésie, elles subissent un traumatisme crânien ou une lésion de la moelle épinière, qui peut laisser des déficits locomoteurs et une difficulté à atteindre l'eau et la nourriture. Pendant trois mois, elles passent des tests de locomotion spontanée, de coordination motrice et de course sur tapis roulant, puis toutes sont tuées pour prélever le cerveau et la moelle épinière.
Objectifs
Le projet vise à étudier l’impact de la modification génétique de la réponse inflammatoire sur la récupération fonctionnelle après lésion traumatique du système nerveux central, incluant la lésion médullaire et le traumatisme cérébral, chez la souris adulte mâles et femelles. L’objectif principal est de déterminer comment certaines modifications génétiques associées à l'inflammation influencent la récupération motrice et la réparation des tissus endommagés par une lésion du système nerveux central. Les animaux subiront soit une lésion de moelle épinière, soit un traumatisme crânien sous anesthésie générale adaptée. Des évaluations fonctionnelles longitudinales seront réalisées à l’aide de tests fonctionnels standardisés, notamment des tests de locomotion spontanée, de coordination motrice et de course sur tapis roulant. Des analyses complémentaires seront effectuées à différents temps post-lésionnels afin d’étudier les mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués dans la récupération fonctionnelle.
Bénéfices attendus
Le projet permettra de mieux comprendre les mécanismes inflammatoires impliqués dans la récupération fonctionnelle après ces lésions traumatiques du système nerveux central. Plus précisément, il vise à identifier le rôle de certaines voies inflammatoires et de modifications génétiques dans les processus de neuroinflammation, de réparation tissulaire et de récupération motrice. Les résultats attendus permettront d’améliorer les connaissances fondamentales sur les interactions entre cellules inflammatoires et tissu nerveux lésé après traumatisme du système nerveux central. Le projet pourrait également permettre d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques susceptibles de limiter les déficits neurologiques et d’améliorer la récupération fonctionnelle. À plus long terme, ces travaux pourraient contribuer au développement de stratégies thérapeutiques innovantes ciblant la réponse inflammatoire post-traumatique, avec un potentiel intérêt translationnel pour les pathologies neurologiques traumatiques humaines. Le projet permettra également de générer des données précliniques utiles pour de futurs développements thérapeutiques et pour une meilleure compréhension des mécanismes de plasticité et de réparation du système nerveux central après lésion.
Procédures
Les animaux subiront soit un traumatisme cérébral expérimental, soit une lésion médullaire expérimentale sous anesthésie générale et analgésie adaptée. Des injections intrapéritonéales ou sous-cutanées seront réalisées au cours du protocole. Les animaux participeront également à des évaluations locomotrices, motrices et comportementales répétées pendant une période maximale de 3 mois. Les procédures chirurgicales dureront environ 20 à 45 minutes selon le modèle expérimental. Les tests comportementaux dureront entre quelques minutes et une quinzaine de minutes selon les évaluations réalisées. À l’issue du protocole, les animaux seront euthanasiés afin de réaliser des analyses histologiques, cellulaires et moléculaires.
Impact sur les animaux
Les animaux inclus dans ce projet pourront subir différentes nuisances liées aux procédures chirurgicales, aux injections, aux évaluations comportementales et aux prélèvements biologiques réalisés dans le cadre de ces modèles. Les principales nuisances attendues sont associées aux procédures chirurgicales réalisées sous anesthésie générale. Ces interventions peuvent entraîner une douleur postopératoire modérée, une diminution transitoire de l’activité spontanée, une perte de poids, une fatigue, une altération temporaire du comportement alimentaire ainsi que des déficits neurologiques et locomoteurs variables selon la sévérité de la lésion. Dans le modèle de lésion de moelle épinière, des troubles locomoteurs plus marqués, une diminution de la mobilité et une difficulté d’accès à la nourriture ou à l’eau peuvent être observés durant la période postopératoire. Les injections répétées (intraperitonéales, et sous-cutanées) peuvent provoquer un stress transitoire lié à la manipulation et à la contention, ainsi qu’une gêne locale limitée au site d’injection. Les tests comportementaux, locomoteurs et d’effort peuvent induire une fatigue transitoire et un stress modéré lié aux manipulations et à l’environnement expérimental.
Devenir
Mise à mort pour le prélèvement des tissus (cerveau, moelle épinière) en vue des analyses moléculaires ultérieures.
Remplacement
Il n’existe actuellement aucune méthode alternative permettant d’étudier de façon intégrée les interactions entre la réponse inflammatoire, les mécanismes neurologiques et la récupération fonctionnelle après traumatisme cérébral (TBI) ou lésion médullaire (SCI). Les approches in vitro, ex vivo ou in silico ne reproduisent pas la complexité des interactions entre le système immunitaire, le système nerveux central et les fonctions locomotrices. La souris, notamment grâce à l’utilisation de lignées génétiquement modifiées, constitue un modèle indispensable et largement validé pour répondre aux objectifs scientifiques du projet. En l’absence de méthode substitutive adaptée, le recours à l’animal est justifié.
Réduction
Le nombre d’animaux a été limité au strict nécessaire grâce à une analyse de puissance statistique a priori (α = 0,05 ; puissance = 80 %). Une approche longitudinale permettra de réaliser plusieurs évaluations chez un même animal afin de réduire les effectifs. Les animaux seront randomisés entre les groupes expérimentaux et des analyses statistiques adaptées aux mesures répétées seront utilisées. Plusieurs analyses seront réalisées à partir des mêmes tissus lorsque cela est possible. Des cohortes indépendantes restent toutefois nécessaires pour certaines analyses moléculaires et histologiques en raison de contraintes techniques liées aux différents modes de préparation des tissus.
Raffinement
Une période d’acclimatation de 7 jours sera respectée avant le début des expérimentations. Les animaux seront hébergés en groupes sociaux compatibles et bénéficieront d’enrichissements environnementaux adaptés. Une surveillance clinique quotidienne sera réalisée à l’aide d’une grille d’évaluation du bien-être et des points limites prédéfinis seront appliqués. Les procédures chirurgicales seront réalisées sous anesthésie générale avec analgésie préventive et postopératoire systématique. Les animaux bénéficieront d’un maintien de la température corporelle, d’une protection oculaire et d’une surveillance renforcée après chirurgie. Une alimentation adaptée sera mise à disposition si nécessaire. Les animaux seront progressivement habitués aux manipulations et aux dispositifs expérimentaux, et les tests locomoteurs seront réalisés selon des protocoles non aversifs. Toute fatigue excessive, blessure ou aggravation neurologique entraînera l’arrêt immédiat de la procédure concernée et une prise en charge adaptée.
Choix des espèces
Le choix de la souris permet donc de répondre à ces contraintes et nous permet aussi d’envisager l’emploi d’animaux transgéniques. Les animaux seront soumis au TBI à partir de p60 (âge adulte) et leur évolution sera suivie sur une période de 3 mois pour observer d'une part les effets à long terme du TBI et SCI au niveau comportemental et moléculaire et d'autre part l'impact des traitements proposés sur la récupération post-lésionnelle.
Approche innovante du traitement du syndrome d’apnées obstructives du sommeil dans un modèle murin
- Recherche fondamentale
- Système respiratoire
À deux mois, une partie des souris passe à un régime riche en graisse, d'autres appartiennent à une lignée qui devient obèse d'elle-même, et les souris concernées peuvent développer une obésité et un diabète qui gênent leurs déplacements. Elles passent quatre fois 24 heures en pléthysmographie, quatre échocardiographies sous anesthésie, des mesures de pression et des prises de sang, puis vers quatre mois et demi une chirurgie pour implanter dans les voies aériennes un dispositif contre l'apnée du sommeil. 160 souris mâles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Toutes subissent en dernier une seconde chirurgie, sans réveil, avant d'être tuées pour l'analyse de leurs tissus.
Objectifs
Le syndrome d’apnées obstructives du sommeil (SAOS) est une maladie fréquente touchant près d’un milliard de personnes dans le monde. Il se caractérise par une occlusion répétée au cours du sommeil des voies aériennes supérieures entraînant une chute du taux d’oxygène, une augmentation du dioxyde de carbone ainsi qu'une fragmentation du sommeil. Le SAOS est associé à une importante morbi-mortalité d’origine cardiovasculaire. En effet, il favorise la survenue de maladies comme l’hypertension artérielle, l’insuffisance cardiaque ou encore l’accident vasculaire cérébral. Le traitement de cette pathologie représente donc un véritable enjeu de santé publique. Si des traitements efficaces du SAOS existent (traitement de référence : pression positive continue), leur utilisation au long cours est limitée. Ainsi, en France, à 3 ans de l’initiation du traitement du SAOS, plus de la moitié des patients ont arrêté son utilisation en raison des effets secondaires trop fréquents. Les principales raisons d’abandon sont : des douleurs liées au port du masque ou à l’orthèse d’avancée mandibulaire, une sécheresse buccale, une obstruction nasale, ou encore des déplacements dentaires. Des approches médicamenteuses sont également en cours d’évaluation mais sont associés à des effets secondaires importants et à une efficacité moindre. Ces effets secondaires comprennent des sensations de nausées ainsi que des difficultés d’endormissement particulièrement délétères dans les maladies du sommeil. Une des limites des approches médicamenteuses est le fait qu’elles visent à traiter une maladie localisée (aux voies aériennes supérieures) par un traitement systémique. Au regard de ces éléments, il existe un besoin important d’alternatives thérapeutiques pour favoriser l’adhésion des patients aux traitements. Une approche localisée, dépourvue d’effets secondaires est donc nécessaire pour répondre aux besoins de santé des 1,5 millions de français diagnostiqués d’un SAOS et sans traitement. Ce projet vise à proposer une alternative à la pression positive continue au travers de l’insertion d’un dispositif médical dans les tissus des voies aériennes supérieures.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus reposent sur le traitement du SAOS (syndrome d’apnées obstructives du sommeil) et donc les patients atteints d’un tel syndrome dont le nombre est actuellement estimé à près d’un milliard dans le monde. Dans un premier temps, le produit développé et validé sera proposé en seconde ligne thérapeutique. En effet, la pression positive continue est une thérapeutique éprouvée et installée de longue date et restera l’indication première dans le traitement des apnées hypopnée obstructives du sommeil. Mais, en France, 50 pour cent des patients l’interrompent soit près d’un million cinq cents milles patients. Les raisons de cette interruption sont les contraintes liées au port d’un masque chaque nuit et l’entretien du matériel ainsi que les effets secondaires ressentis par les patients. Aussi, ce dispositif pourrait être proposé aux patients réfractaires en premier lieu. D’autre part, une première étude auprès d’une cohorte de patients atteints de SAOS a montré qu’y compris chez les patients ayant maintenu leurs traitements, la quasi-totalité serait volontaire pour avoir une alternative thérapeutique aussi efficace mais moins contraignante. En effet, notre solution permettrait de s’affranchir des contraintes inhérentes au traitement actuel, cette dernière ne nécessitant l’application d’aucun masque sur le visage, d’aucun matériel lourd difficile à transporter, et de source d’énergie pour fonctionner. Dans un second temps, le traitement pourra être proposé en première intention, initialement dans les formes modérées puis, dans les formes sévères du syndrome d’apnées obstructives du sommeil. Il existe ensuite des perspectives de traitement chez les patients ayant des formes légères de SAOS avec un traitement précoce de prévention du risque cardiovasculaire. Enfin, la technologie développée pourra trouver d’autres champs d’application médical dans les pathologies respiratoires ayant des mécanismes physiopathologiques similaires : trachéobronchomalacie ou dans d’autres pathologies d’organes caractérisées par des occlusions intermittentes de structures anatomiques.
Procédures
Certains animaux auront un phénotype dommageable pendant toute la durée du projet (obésité, diabète). Certains animaux auront ce phénotype suite à la mise en place d'un régime alimentaire riche en gras (à partir de 2 mois de vie et pendant toute la procédure). La composition corporelle sera évaluée au début de la procédure (animal vigile, 3 fois, 3 minutes). Des prélèvements sanguins seront réalisés (animal vigile, 4 fois, 1 minute). Plusieurs enregistrements seront effectués au cours du projet : 1)mesure de la pression artérielle (animal vigile, 4 fois, 10 minutes), 2)mesure respiratoire par pléthysmographie (mesure des paramètres respiratoires) (animal vigile, 4 fois, 24h), 3)mesure de la saturation en oxygène (animal vigile, 4 fois, 1h) et 4)echocardiographie (animal sous anesthésie générale, 4 fois, 20 minutes). Tous les animaux auront une chirurgie pour l'implantation du dispositif médical à évaluer (animal sous analgésie et anesthésie locale et générale, 1 fois, 30 minutes). Enfin les animaux auront un prélèvement sanguin sans réveil (animal sous analgésie et anesthésie générale, 1 fois, 2 minutes) et une chirurgie sans réveil avant l'euthanasie (animal analgésié et anesthésié, 1 fois, 30 minutes).
Impact sur les animaux
Certains animaux inclus dans ce projet auront un phénotype dommageable et pourront développer un diabète et une obésité pouvant altérer leur déplacement. La mise en place d'un aliment mou pourra provoquer une pousse excessive des incisives. Les mesures de la composition corporelle ainsi que les différents enregistrements réalisés (mesure de la pression artérielle, mesure du volume pulmonaire, mesure de la saturation en oxygène) pourront engendrer un stress chez les animaux. Les prélèvements sanguins pourront provoquer un hématome et un rare risque d'infection. Les échographies cardiaques seront réalisées sous anesthésie générale ce qui peut provoquer une hypothermie et une détresse cardiorespiratoire dans de très rares cas. Une chirurgie implantatoire et une chirurgie sans réveil seront réalisées sur tous les animaux, en plus des nuisances liées à l'anesthésie, les animaux pourront également ressentir de la douleur modérée en péri-opératoire ainsi qu'un risque d'infection ou de cicatrisation au niveau de l'incision.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés selon les méthodes réglementaires en vigueur afin de réaliser les prélèvements tissulaires nécessaires aux analyses histologiques et biologiques. Ces analyses permettront d’évaluer l’intégration du dispositif implanté, la tolérance tissulaire et les mécanismes associés aux effets observés lors du suivi respiratoire.
Remplacement
Le développement du dispositif médical est réalisé en plusieurs étapes. Une version adaptée aux essais sur souris est conçue en parallèle d'une version destinée aux essais sur banc. Les essais sur banc permettent de vérifier le bon fonctionnement du dispositif, notamment sa réponse à une activation magnétique, et d'ajuster sa conception avant son utilisation chez l'animal. Cette phase d'optimisation permet de limiter les essais in vivo en validant au préalable les principales caractéristiques techniques du dispositif. Ensuite, un organisme vivant est nécessaire pour évaluer la faisabilité, la tolérance, la stabilité et l'efficacité du dispositif implantable. Il n'est pas possible de reproduire in vitro la complexité des interactions entre le dispositif, les tissus cervicaux, les mouvements respiratoires et les voies aériennes supérieures. L'évaluation de l'implantation, de son intégration tissulaire, de son activation et de son effet sur la perméabilité des voies aériennes nécessite l'utilisation d'un modèle murin in vivo. Ces paramètres ne peuvent être étudiés de manière pertinente que chez un organisme vivant, dans lequel les interactions anatomiques et physiologiques sont préservées.
Réduction
Le nombre d'animaux a été déterminé afin d'obtenir des résultats statistiquement exploitables tout en limitant leur utilisation. Une étude pilote sera d'abord réalisée sur un nombre restreint de souris (groupes de 5 souris) ne présentant pas de phénotype dommageable afin d'optimiser et de maîtriser la technique chirurgicale d'implantation. Une seconde étude pilote sera réalisée sur des animaux avec un phénotype induit similaire. La taille des groupes expérimentaux a été calculée à l'aide d'un logiciel avec des critères prédéfinis afin de déterminer la taille finale de l'échantillon nécessaire pour détecter des différences statistiquement significatives. L'effectif minimal est donc de 8 animaux par groupe. Cet effectif a été porté à 10 animaux par groupe afin de tenir compte des pertes potentielles liées à la zootechnie, aux complications chirurgicales ou à d'autres aléas expérimentaux, tout en garantissant une puissance statistique suffisante. Au total, 160 souris seront utilisées pour l'ensemble du projet.
Raffinement
Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation. Les animaux sont hébergés avec leurs congénères (l’hébergement individuel est limité au maximum) en portoirs ventilés avec un système d’abreuvement automatique et un accès ad libitum à la nourriture et l’eau. Le milieu est enrichi avec deux enrichissements minimum et les animaux sont vérifiés quotidiennement. Le projet a été mis au point afin de permettre une interprétation fiable des résultats dans le respect du bien-être animal. Tout d'abord, le diabète des animaux sera contrôlé hedomadairement afin de le déceler précocement, le change des cages pourra également être augmenté en cas d'augmentation de la miction. Un bâton à ronger sera disponible dans les cages des animaux sous régime alimentaire mou. Pour limiter le stress des animaux, ils seront habitués aux différents tests réalisés et quand cela est nécessaire, ils seront sous anesthésie. Pour les chirurgies, les animaux seront sous analgésie et anesthésie afin de prévenir stress et douleur. Les animaux sous anesthésie seront maintenus sur tapis chauffant pour limiter l'hypothermie et un gel ophtalmique sera déposé sur les yeux pour limiter l'assèchement occulaire. Pour une meilleure récupération post-opératoire, les animaux seront placés sur litière douce et un gel appétant sera disposé dans leur cage. Ainsi, la douleur et le stress sont limités en apportant des soins adaptés ainsi qu’une surveillance attentive accompagnée de points limites suffisamment prédictifs et précoces.
Choix des espèces
Des souris sans mutation seront utilisées pour réaliser les études préliminaires permettant la mise au point et la validation de la chirurgie d'implantation. Ces souris ont une bonne sensibilité aux effets des régimes riche en gras (prise de poids et modifications métaboliques reproductibles). Le modèle obèse de souris utilisé ensuite est un modèle pertinent pour l'étude du syndrome d'apnées obstructives du sommeil (SAOS) associé à l'obésité. Contrairement aux modèles reposant sur une obstruction artificielle des voies aériennes, elle développe spontanément une obésité polygénique, un syndrome métabolique et des altérations anatomiques des voies aériennes supérieures proches de celles observées chez l'Homme. Elle présente également des caractéristiques cliniques du SAOS, telles qu'une augmentation des épisodes d'apnée-hypopnée, une fragmentation du sommeil et des désaturations en oxygène. Ces similitudes physiopathologiques et anatomiques font de cette souris un modèle translationnel particulièrement adapté pour évaluer l'efficacité de nouvelles approches thérapeutiques visant à maintenir la perméabilité des voies aériennes supérieures. Des animaux adultes seront utilisés car le SAOS augmente avec l’âge, nous avons caractérisé notre modèle préclinique avec des animaux mâles de 5-6 mois donc les animaux entreront en procédure à 2 mois de vie et la chirurgie aura lieu à 4 mois et demi de vie.