Souris

Les souris de ce projet portent des méningiomes, des tumeurs des enveloppes du cerveau, obtenus par modification génétique ou par injection, et les formes malignes peuvent provoquer convulsions, amaigrissement et perte de motricité au point d'empêcher l'alimentation. 540 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour une analyse histologique du cerveau. Elles subissent une chirurgie d'une heure pour une injection dans le cerveau ou sous la dure-mère, et jusqu'à six injections sans anesthésie. Elles sont suivies de 2 à 15 mois, car dans les lignées génétiquement modifiées les tumeurs bénignes apparaissent tard, ce qui impose selon le porteur un suivi d'"au moins 12 mois".

Objectifs

Les méningiomes sont les tumeurs primitives du système nerveux central les plus fréquentes chez l'adulte. Les formes de haut grade ont une fréquence élevée de mutations de certains gènes et représentent un quart des méningiomes avec des récidives multiples associées à une morbidité et une survie réduite sans option disponible médicamenteuse ou d’immunothérapie. Les méninges jouent un rôle clé dans la communication neuro-immunitaire par la diversité de leurs cellules immunes et la présence de vaisseaux lymphatiques méningés. Les données récentes, montrent une infiltration fréquente des méningiomes bénins par des cellules immunitaires. Notre hypothèse est que le microenvironnement immunitaire constitué par les cellules immunes méningées et les lymphatiques méningés, régule la progression histologique maligne des méningiomes et leur comportement d’échappement à la surveillance immunitaire. Nos principaux objectifs sont d’utiliser nos modèles de souris de méningiomes de différents grades de malignité en manipulant le micro-environnement pour déterminer (i) si les lymphatiques méningés régulent effectivement la malignité des méningiomes et (ii) évaluer la participation des populations de cellules immunitaires dans l'initiation et la progression du méningiome. MODIFICATION: sur les 3 ans d'autorisation initiale du projet, nous n'avons pas eu le temps de réaliser l'ensemble des procédures décrites et aurions besoin d'étendre la durée d'autorisation au maximum de 5 ans au total pour pouvoir terminer notre projetsans autres modifications (même nombre d'animaux, mêmes actes que décrit précédemment).

Bénéfices attendus

Notre projet va permettre de caractériser précisément le rôle du microenvironnement immunitaire dans la malignité des méningiomes en manipulant ses composantes lymphatiques et immunitaires dans les méninges, pour pouvoir ultérieurement potentialiser les approches thérapeutiques associées à l'immunothérapie dans les méningiomes agressifs chez l’homme.

Procédures

Les procédures chirurgicales pour réaliser une injection spécifique dans une zone du cerveau (Durée: 1 heure, préparation: 30 min) seront réalisées sous anesthésie générale après une prise en charge première de la douleur par des médicaments, une hydratation et suivies d'un protocole de prise en charge de la douleur en post-opératoire. Ces interventions sont réalisées en conditions stériles chirurgicales. Les autres procédures ne nécessiteront pas d’analgésie ou d’anesthésie de l’animal et consistent en des injections pour la mise en place de notre modèle (Durée : 5 minutes maximum par injection, 6 fois maximum, avec 2 jours minimum entre chaque injection). Les animaux seront euthanasiés par une méthode réglementaire en fin de protocole en vue des prélèvements d'intérêt.

Impact sur les animaux

Les animaux peuvent développer des symptômes cliniques liés à la présence de méningiomes malins, pas bénins. Les symptômes observés chez l’animal peuvent être : une perte de motricité empêchant l'alimentation, un amaigrissement, des crises convulsives. Les gestes pratiqués chez les souris dans ce projet incluent les nuisances suivantes : les risques anesthésiques lors de l’injection sous durale et intracérébrale tels que dépression cardio vasculaire, hypothermie, hypovolémie, sécheresse cornée et les douleurs post-opératoires. Le stress de la contention et la douleur de très courte durée lors de l’introduction de l’aiguille pour les injections intra-péritonéales ou sous-cutanées dans les expériences de modulations des cellules immunitaires.

Devenir

L'euthanasie de tous les animaux à la fin de l'ensemble des procédures est justifié par la nécessité de réaliser une analyse histologique complète du cerveau pour répondre aux objectifs de l'ensemble des procédures expérimentales.

Remplacement

Les modèles in vitro et sur animaux invertébrés ne permettent pas l'obtention de méningiomes avec un aussi grand niveau de complexité et de reproduction de la pathologie humaine que les modèles souris déjà existants. La complexité du cerveau/méninges des souris est nécessaire pour une observation comparative avec le cerveau/méninges humain. L’utilisation d’un modèle murin est donc primordiale pour cette étude.

Réduction

Nous avons réduit au maximum le nombre d’animaux utilisés (Nombre total : 540 animaux) pour nous permettre de générer des données statistiques solides. Afin d'assurer la fiabilité statistique et de limiter le nombre d'animaux, nous avons estimé l’effectif a priori sur la base de travaux antérieurs et sur un calcul de puissance, et il sera nécessaire de procéder à des tests statistiques pour une interpétation fiable des résultats.

Raffinement

A la réception des animaux en provenance de l’exterieur, une procédure d’acclimatation d’une semaine aux nouveaux locaux sera réalisée. Pendant toute la durée de l’expérimentation les animaux seront hébergés en cage en portoir ventilé par groupes de 3 afin de fournir un environnement social enrichi. Les animaux auront à disposition des composants de nidification, des bâtonnets à ronger et des maisons sont également disponibles. Ils auront à disposition de la nourriture en permanence et accès à l’eau. Si l’animal a du mal à se déplacer, par exemple juste après une chirurgie, les croquettes seront mouillées et déposé sur la litière et une solution d’hydratation gélifiée sera mis en place. Les paramètres environnementaux (lumière, température, hygrométrie,) seront surveillés quotidiennement. Un suivi de l’ensemble des animaux sera effectué quotidiennement par l’équipe zoothechnique et chaque jour de la semaine par un des membres de l’équipe de recherche (et plus si nécessité). Le poids des souris sera vérifié deux fois par semaine tout au long de la procédure expérimentale à partir de la première expérimentation (à l’âge de 2 mois) jusqu’à l'euthanasie (entre 5 et 15 mois selon les procédures). Le cahier opératoire sera rempli le jour de l’intervention pour renseigner le temps per-opératoire et post opératoire immédiat, aux jours 1 àu 2 et 8 post-chirurgie. Il servira à notifier les éléments de surveillance, ainsi que les administrations d’antalgiques.

Choix des espèces

Le modèle animal est le seul moyen de pouvoir manipuler le micro-environnement des méningiomes bénin ou malin, notamment en raison de l'absence de cultures cellulaires de méningiomes en général et plus particulièrement avec le profil mutationnel désiré et les différents composants du micro-environnement. Les autres expériences prévues dans le projet doivent être réalisées chez la souris car elles utilisent un modèle souris déjà publié et validé par la communauté scientifique internationale. Les animaux seront utilisés de 2 à 15 mois de manière similaire aux précédents modèles de meningiomes publiés précédemment, un suivi d’au moins 12 mois étant nécessaire pour les modèles souris de méningiomes bénin génétiquement modifié où les méningiomes apparaissent de manière tardive

À 3 à 5 jours de vie, des souriceaux reçoivent sous anesthésie une injection dans la plante d'une patte arrière, avec dans de rares cas un rejet par leur mère. Six à huit semaines plus tard, les mêmes souris subissent une chirurgie d'une heure trente sous anesthésie générale pour imager leur moelle épinière, et sont tuées avant tout réveil. 70 souris vont être utilisées ainsi, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le projet a un but "exclusivement pédagogique" : former des doctorants à la microscopie biphotonique, à raison de deux souris par participant, la première avec "un taux d'échec élevé attendu".

Objectifs

Ce projet a un objectif exclusivement pédagogique : former des doctorants en neurosciences à la mise en œuvre et à l'utilisation de la microscopie biphotonique in vivo pour l'étude de l'activité neuronale. L'objectif de la formation est de permettre aux participants d'acquérir des compétences techniques qui ne peuvent être obtenues de manière satisfaisante par un enseignement théorique seul ou par l'analyse de données déjà acquises. La microscopie biphotonique in vivo repose sur la maîtrise simultanée de plusieurs étapes critiques, notamment la préparation de l'animal anesthésié, le positionnement de celui-ci sous le microscope, les réglages du système d'imagerie, l'acquisition des signaux biologiques et l'identification des artefacts expérimentaux. Ces compétences nécessitent une mise en situation pratique permettant aux étudiants d'observer directement les contraintes techniques et biologiques associées à cette approche. Par ailleurs, cette technologie de pointe n'est pas disponible dans la majorité des unités de recherche d'origine des participants. La formation vise ainsi à leur donner accès à une expertise spécialisée et à des équipements qu'ils ne peuvent généralement pas utiliser dans leur environnement habituel de travail. Elle permet également d'harmoniser les pratiques expérimentales et de transmettre les bonnes pratiques nécessaires à la réalisation d'expériences conformes aux standards scientifiques et éthiques actuels. L'approche pédagogique repose sur des démonstrations réalisées par des encadrants expérimentés, suivies de sessions pratiques supervisées. Cette organisation permet aux participants d'acquérir progressivement les compétences nécessaires à la réalisation d'expériences d'imagerie in vivo tout en limitant le nombre d'animaux utilisés et en garantissant un niveau élevé de maîtrise technique avant toute manipulation autonome. L'hypothèse pédagogique est que l'acquisition de compétences opérationnelles en microscopie biphotonique in vivo nécessite une expérience pratique encadrée sur un système expérimental réel, permettant aux participants d'intégrer les contraintes techniques, biologiques et éthiques de cette approche, compétences qui ne peuvent être pleinement acquises par un enseignement théorique ou l'observation passive.

Bénéfices attendus

Ce projet présente des bénéfices à la fois pédagogiques et scientifiques. À court terme, il vise à former de nouveaux chercheurs aux méthodes modernes permettant d’étudier la dynamique des circuits synaptiques in vivo, notamment grâce à des techniques d’imagerie avancées. Une meilleure maîtrise de ces approches expérimentales permettra aux futurs chercheurs d’optimiser la conception de leurs protocoles et de réduire le nombre d’animaux utilisés dans leurs travaux de recherche, conformément aux principes de réduction et de raffinement. Sur le plan scientifique, les circuits neuronaux impliqués dans la transmission des informations sensorielles, telles que la douleur et la température, ne sont pas encore entièrement caractérisés. De nombreuses études s’intéressent à ces réseaux en raison de leur implication dans diverses pathologies, notamment la douleur neuropathique. Une meilleure compréhension de la dynamique de ces circuits pourrait, à plus long terme, contribuer à l’identification de nouvelles cibles thérapeutiques et au développement de traitements plus efficaces. Ainsi, ce projet contribue à la fois à la formation de chercheurs qualifiés et à l’avancement des connaissances dans un domaine présentant des enjeux majeurs pour la santé humaine.

Procédures

Les nouveau-nés (âgés de 3 à 5 jours) recevront une injection sous anesthésie (durée : 5 minutes). Entre 6 et 8 semaines plus tard les souris suivront une chirugie sous anesthésie generale sans réveil (durée : 1h30).

Impact sur les animaux

Nuisances liées aux injections dans la région plantaire de la patte arrière : douleur, inflammation, stress liés à l’anesthésie, détresse respiratoire, une variation de la pression artérielle ou de la température corporelle. Dans de très rares cas, la mère des souriceaux n’accepte pas de s’occuper des nouveau-nés injectés. Les effets indésirables potentiels liées aux procédures chirurgicales sont une détresse respiratoire, une variation de la pression artérielle ou de la température corporelle, ou une hémorragie.

Devenir

À l’issue de la procédure, les animaux seront euthanasiés par les expérimentateurs habilités en charge du projet. La moelle épinière sera ensuite prélevée pour la réalisation d’analyses post mortem.

Remplacement

Plusieurs phases de ce projet ont été réalisées in vitro sur différentes lignées cellulaires. Actuellement, nous souhaitons étudier la dynamique des circuits synaptiques impliqués dans la perception de la douleur. Cela nous permettra de mieux comprendre la physiologie de ces circuits neuronaux. L’utilisation d’animaux est donc inévitable. Notre formation repose sur une approche pédagogique de type « apprentissage par la pratique ». Les compétences techniques et analytiques visées ne peuvent être pleinement acquises qu’à travers une mise en pratique directe. Les étudiants doivent pouvoir réaliser eux-mêmes les expériences, notamment afin d’imager la moelle épinière in vivo. À la fin de la séance, ils doivent recueillir des échantillons biologiques viables, nécessaires aux analyses de biologie moléculaire. Ces étapes requièrent des matériaux biologiques d’une qualité et d’une intégrité qui ne peuvent être obtenues à partir de modèle informatique, de cadavres ou de démonstrations filmées.

Réduction

Nous faisons un effort particulier pour faire intervenir, lors de ces formations, des spécialistes expérimentés dans les techniques enseignées. Leur haut niveau d’expertise garantit une démonstration précise et efficace, ce qui permet de limiter le nombre d’animaux nécessaires à l’apprentissage. Grâce à la transmission rigoureuse de leur savoir-faire, les étudiants acquièrent rapidement les compétences requises, réduisant ainsi le besoin de répétition inutile des procédures. Nous utilisons le nombre minimal de souris permettant à la fois de démontrer correctement les techniques et d’offrir aux étudiants une opportunité d’entraînement pratique suffisante pour atteindre les objectifs pédagogiques fixés. Cette approche assure un équilibre entre la qualité de la formation et le respect de principe de réduction dans l’utilisation d’animaux vivants. Chaque participant utilisera deux souris. Le premier animal correspond à la découverte du geste, avec un taux d'échec élevé attendu chez un opérateur novice. Le second permet la correction des erreurs identifiées et la consolidation de la compétence : c'est la répétition qui produit l'apprentissage, non la première tentative. Le facteur de 2 animaux par étudiant est un plafond et non une cible. Les étudiants qui maîtrisent déjà le geste ou qui choisissent de ne pas le réaliser n'utilisent aucun animal.

Raffinement

Pendant tous les procédures expérimentales (injection, chirurgie et séance d’imagerie), nos mesures mises en place pour réduire la douleur impliquent une induction et un suivi de l'anesthésie, une mise en place d'analgésie du contrôle de la température par tapis chauffant. Suite aux injections, une surveillance renforcée sera effectuée pendant la période qui suit le réveil (2h) ainsi que pendant les 4 jours suivants. L'évaluation des points limites se fera selon une grille d'évaluation incluant leur adaptation à la courbe de croissance, la mobilité spontané, l’apparence du poil, l’interaction avec les congénères et les signes de douleur. Selon le score obtenu, les souriceaux pourront recevoir une injection d’un antalgique, et de l’aliment hydraté pourra être ajouté au fond de la cage.

Choix des espèces

La souris a été choisie pour cette formation car elle correspond à l’espèce la plus couramment utilisée dans les laboratoires de recherche en neurosciences, notamment pour les études portant sur le système nerveux central. Les techniques enseignées lors de cette formation — incluant la chirurgie, l’imagerie et les analyses moléculaires — sont directement applicables aux modèles murins utilisés dans la grande majorité des projets de recherche académique et préclinique. De plus, la souris présente des avantages pratiques et scientifiques importants : elle est bien caractérisée sur le plan neuroanatomique et génétique, de nombreux outils et lignées transgéniques sont disponibles, et son utilisation est conforme aux standards internationaux en recherche biomédicale. Ainsi, le recours à la souris permet d’assurer la pertinence, la reproductibilité et le transfert direct des compétences acquises par les étudiants vers leurs futures activités professionnelles. Concernant les injections, nous utiliserons des nouveau-nés âgés de J3 à J5. Réalisée durant cette période, l’injection permet de cibler spécifiquement les neurones de la région d’intérêt. Les chirurgies seront réalisées sur des animaux âgés de plus de 6 semaines, ce qui correspond au stade adolescent à jeune adulte chez la souris. À partir de cet âge, les coordonnées stéréotaxiques de ciblage sont stables et correspondent à celles établies pour ce modèle.

Pour étudier le rôle du récepteur AhR dans l'appétit et la vulnérabilité à l'obésité, 420 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Le projet emploie des lignées AhR +/- et AhR -/-, et un régime riche en graisses de 15 semaines qui peut provoquer obésité, résistance à l'insuline, diabète et difficultés à se déplacer. Les souris passent des tests comportementaux sur l'émotion, la cognition et la sociabilité, avec, selon le porteur, une restriction alimentaire temporaire ou un isolement ponctuel. Comme procédure, il ne déclare pourtant qu'une prise de sang terminale, et ne nomme aucun des tests.

Objectifs

Le récepteur nucléaire d’aryl hydrocarbone (AhR) à des substances étrangères et propres à l’organisme, participe dans la régulation du métabolisme énergétique et des réponses immuno-inflammatoires, mais reste plutôt méconnu d’un point de vue comportemental. L’activité d’AhR au niveau oral a été liée à des modifications de la prise alimentaire, et semblerait influencer l’appréciation des aliments et en particulier des lipides. Ce projet vise à étudier la contribution de ce récepteur à la perception des récompenses alimentaires et à l’appétit afin de mieux comprendre son rôle dans la vulnérabilité à l'obésité. L’AhR est ainsi porposé comme une cible prometteuse dans la lutte de cette maladie, dans la perspective d’ouvrir la voie à de nouvelles approches thérapeutiques.

Bénéfices attendus

Les résultats de ce projet devraient permettre (1) d’établir les rôles d’AhR au niveau cérébral et intestinal pour mieux comprendre son implication dans des troubles comme l’anxiété ou la dépression, provoqués par une alimentation trop riche en graisses ; et (2) de déterminer comment des polluants environnementaux influençant l’activité d’AhR participent à la vulnérabilité à l’obésité.

Procédures

Un prélèvement sanguin en terminal sera effectué sous analgésie et anesthésie, et durera moins d’une minute, sur 420 animaux.

Impact sur les animaux

Les tests comportementaux permettent d’étudier les aspects émotionnels, cognitifs et sociaux des animaux. Bien qu’ils puissent causer un stress léger (lié à une restriction alimentaire temporaire ou à un isolement ponctuel pendant les tests), toutes les précautions sont prises pour limiter cet impact : habituation progressive des animaux aux manipulations, environnement contrôlé (température, luminosité, bruit réduit). La durée du régime (15 semaines) qui sera appliquée permet de mettre en place une obésité et potentiellement de provoquer une insulino-résistance et un diabète chez les animaux (temporalité variable et variabilité individuelle importante). Les animaux en régime hyperlipidique peuvent également avoir des difficultés à se mouvoir en raison du surpoids. Une surveillance continue permettra détecter tout signe de détresse. De plus, les animaux sous régime riche en graisses bénéficieront d’un accès facilité à la nourriture et à l’eau pour limiter les inconforts, et l’ajout d’enrichissement dans les cages permettra d’améliorer leur qualité de vie. En fin de l’étude, les animaux seront mis à mort de manière indolore (en moins d’une minute), sous anesthésie et analgésie, conformément aux normes éthiques européennes.

Devenir

A l’issue de chaque procédure, tous les animaux seront mis à mort sous analgésie et anesthésie afin de réaliser des prélèvements sanguins et tissulaires.

Remplacement

Ce projet est couplé à une approche en culture cellulaire (méthode in vitro sans recours aux animaux) pour étudier finement le mécanisme d’action d’AhR, ainsi qu’une approche sur modèle souris, indispensable pour analyser des processus physiologiques complexes impliquant plusieurs organes (cerveau, langue, intestin, tissu adipeux, foie, rate et pancréas). Bien que la culture cellulaire permette de réduire l’utilisation d’animaux, le modèle souris reste nécessaire pour une approche intégrée, notamment pour évaluer les interactions entre ces organes et déterminer l’implication d’AhR dans la vulnérabilité à l’obésité.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés a été réduit au strict nécessaire, tout en permettant d’obtenir des résultats fiables et scientifiquement valables. Pour définir cet effectif, un outil en ligne gratuit a été utilisé afin d’aider à concevoir l’étude de manière rigoureuse. Par ailleurs, des travaux antérieurs ont montré qu’un groupe de 15 animaux permettait d’obtenir des résultats statistiquement pertinents. Les données seront analysées au fur et à mesure de l’étude, afin de pouvoir arrêter les expérimentations dès que le nombre d’animaux requis pour obtenir des résultats fiables sera atteint, limitant ainsi l’utilisation d’animaux au minimum indispensable.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en groupes afin de préserver les interactions sociales naturelles, dans des cages transparentes adaptées et enrichies pour favoriser leur bien-être. Leur état général sera contrôlé quotidiennement. Dans le respect de la règle des 3R et des principes éthiques de l’expérimentation animale, des méthodes non invasives et des tests comportementaux sont privilégiés. Les animaux seront habitués progressivement à une manipulation douce afin de limiter le stress. En cas de signes de détresse ou de dégradation de l’état général, les animaux seront immédiatement retirés de l’étude, replacés dans leur cage de vie avec un accès libre à l’eau et à la nourriture, et surveillés quotidiennement. Si leur état venait à se détériorer de manière irréversible et à atteindre un seuil limite prédéfini, ils seraient retirés définitivement des expérimentations et mis à mort afin d’éviter toute souffrance inutile. Toutes les interventions seront réalisées par un personnel formé et qualifié, en nombre limité, garantissant un suivi attentif et individualisé des animaux.

Choix des espèces

De nombreuses études portant sur la thématique du projet ont déjà été réalisées chez la souris, qui constitue un modèle de référence largement utilisé pour l’étude de l’obésité et des organes associés. Le modèle AhR +/- et AhR -/- permet de comparer les résultats obtenus avec ceux déjà disponibles dans la littérature scientifique. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte, car les systèmes biologiques étudiés doivent être pleinement développés. Cet âge permet d’éviter à la fois la période de puberté et les altérations physiologiques liées au vieillissement.

Injection de cellules cancéreuses, chimiothérapie, sept injections d'immunothérapie, dix jours de thérapie ciblée par la bouche, puis ablation chirurgicale de la tumeur : 448 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Le protocole reproduit le parcours de patientes et patients atteints de cancer du sein triple négatif ou du poumon, pour étudier la rechute métastatique après chirurgie. Après l'opération, les métastases peuvent provoquer dyspnée, douleurs osseuses, paralysie ou détresse respiratoire progressive. La dyspnée ou la paralysie déclenche la mise à mort, le porteur parlant de "point final strict".

Objectifs

Les traitements néoadjuvants à base d’immunothérapie sont désormais couramment utilisés pour les cancers du sein triple négatif (CSTN) et le cancer bronchique non à petites cellules (CBNPC) de stade II/III. Le projet vise à développer deux modèles précliniques murins permettant d’évaluer l’efficacité et les mécanismes d’action des combinaisons chimiothérapie‑immunothérapies administrées avant chirurgie, puis en traitement adjuvant, afin de mieux reproduire le parcours clinique des patients et d’étudier la rechute métastatique post‑exérèse. Le laboratoire dispose déjà des modèles 4T1 (CSTN) et CMT‑167 (CBNPC), capables de générer des métastases après injection mammaire ou sous‑cutanée. Ces modèles permettent d’administrer un traitement néoadjuvant sur tumeur établie, de procéder à son ablation, puis de suivre l’impact d’un traitement adjuvant sur la survenue métastatique. Le critère principal d’évaluation est la survie sans progression métastatique. L’équipe maîtrise l’administration des traitements et l’analyse des réponses immunitaires, mais doit désormais intégrer une étape chirurgicale standardisée pour modéliser la prise en charge clinique et étudier la maladie résiduelle minimale. Le premier objectif consiste à développer, optimiser et valider une procédure d’exérèse complète de la tumeur primaire dans des modèles immunocompétents, condition essentielle pour étudier les mécanismes de rechute après traitement néoadjuvant. Le deuxième objectif est d’évaluer l’impact de différentes combinaisons thérapeutiques néoadjuvantes à base d’immunothérapie sur la dynamique de la rechute métastatique après chirurgie, grâce à un suivi longitudinal de la charge métastatique et de la survie sans rechute. Le troisième objectif vise à caractériser les réponses immunitaires induites par les traitements et modulées par la chirurgie, via des analyses multiparamétriques des tumeurs, organes lymphoïdes et sites métastatiques, afin d’identifier les mécanismes associés à la rechute ou à la protection. Enfin, le projet ambitionne d’identifier des biomarqueurs prédictifs de rechute ou de réponse durable pour guider le développement de futures stratégies néoadjuvantes et renforcer la translation clinique.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de développer deux modèles précliniques particulièrement pertinent pour étudier l’impact réel des traitements néoadjuvants/adjuvants sur la dynamique métastatique, en intégrant dans un même protocole : une phase de chimiothérapie‑immunothérapie néoadjuvante, une chirurgie d’exérèse de la tumeur primaire, une immunothérapie adjuvante et un suivi post‑opératoire permettant d’évaluer la rechute métastatique. Ces modèles reproduisent de manière fidèle le parcours thérapeutique des patients atteints de cancers du sein triple négatif ou de cancers du poumon présentant des cancers localement avancés, deux pathologies caractérisées par un risque élevé de dissémination tumorale et de récidive métastatique. L’un des bénéfices majeurs attendus est une compréhension des mécanismes biologiques et immunologiques qui déterminent la réponse ou la résistance aux traitements néoadjuvants et d’évaluer l’intérêt de poursuivre ou non une immunothérapie adjuvante. Les analyses multiparamétriques réalisées sur les tumeurs primaires, les tissus métastatiques et les organes lymphoïdes permettront d’identifier les populations immunitaires modulés par les traitements et impliquées dans les mécanismes d’échappement favorisant la progression métastatique après chirurgie. Ces données sont essentielles pour optimiser les combinaisons thérapeutiques et mieux cibler la maladie résiduelle minimale, principal moteur des rechutes. Le projet permettra également d’identifier des biomarqueurs prédictifs de réponse ou de rechute métastatique, qu’ils soient immunologiques, transcriptomiques ou histologiques. Ces biomarqueurs pourront être transposés à la clinique pour améliorer la stratification des patients, guider le choix des traitements néoadjuvants et affiner les indications des thérapies adjuvantes. L’évaluation de la survie sans rechute métastatique (SSRM), rarement étudiée dans les modèles précliniques, constitue un autre bénéfice important, car elle reflète directement l’efficacité des stratégies thérapeutiques sur la dissémination tumorale. Enfin, ces modèles permettront de tester de nouvelles combinaisons thérapeutiques basées sur des immunothérapies néoadjuvantes. Il contribuera à accélérer le développement de stratégies innovantes visant à réduire la rechute métastatique, principal facteur de mortalité dans ces cancers agressifs.

Procédures

- Injection sous-cutanée des cellules cancéreuses murines : - Geste réalisé sous anesthésie générale gazeuse - Une seule injection par animal - Durée : 10 minutes - Traitements par chimiothérapie (intrapéritonéal i.p.) : - Geste réalisé sur animal vigil - Une seule injection par animal - Durée : 20 secondes - Traitements par immunothérapie (i.p.) : - Geste réalisé sur animal vigil - 7 injections par animal - Durée : 20 secondes - Traitements par thérapie ciblée (p.o) : - Geste réalisé sur animal vigil - Une administration quotidienne pendant 10 jours consécutifs par animal - Durée : 20 secondes - Traitements par chirurgie (p.o) : - Geste réalisé sur animal anesthésiés - Durée : 20 minutes - Suivi à l’IVIS : - Geste réalisé sur animal vigil : injection i.p de luciférine (substrat luciférase) 20 secondes - Geste réalisé sur animal anesthésiés : analyse à l’imageur IVIS Durée : 5 minutes

Impact sur les animaux

Le projet utilise deux modèles murins métastatiques (4T1 et CMT‑167) associés à des traitements néoadjuvants, une chirurgie d’exérèse et un suivi de la progression métastatique. Ces étapes peuvent entraîner des nuisances dont l’intensité varie selon la phase expérimentale. 1. Implantation tumorale et croissance de la tumeur primaire L’injection orthotopique (4T1‑Luc) ou sous‑cutanée (CMT‑167‑Luc) peut provoquer une douleur transitoire, un stress léger, un faible risque d’hématome ou d’inflammation. La croissance tumorale (J0–J16) peut induire douleur locale, inflammation, sensibilité cutanée, réduction d’activité et gêne locomotrice lorsque la tumeur augmente de volume. Le modèle 4T1‑Luc présente une croissance rapide et inflammatoire ; le modèle CMT‑167‑Luc entraîne une gêne mécanique plus progressive. 2. Effets indésirables des traitements néoadjuvants Les chimiothérapies et immunothérapies (J9–J16) peuvent induire : – Toxicités hématologiques : leucopénie, anémie, thrombopénie, immunosuppression, fatigue et susceptibilité accrue aux infections. – Toxicités digestives : anorexie, baisse de prise hydrique, perte de poids (

Devenir

À l’issue de chaque procédure, le sort des animaux est déterminé en fonction des objectifs scientifiques, des critères d’arrêt prédéfinis et du respect strict du bien‑être animal. Dans ce projet, l’ensemble des animaux sera euthanasié à la fin de leur participation, car les modèles utilisés (4T1 et CMT‑167) impliquent une progression tumorale et métastatique incompatible avec un maintien en vie sans souffrance. Les analyses prévues nécessitent également la collecte d’organes (poumons, foie, rate, ganglions, tumeur résiduelle) pour l’étude de la maladie résiduelle minimale, de la réponse immunitaire et de la dissémination métastatique, ce qui impose une euthanasie programmée. Les animaux atteignant un critère d’arrêt clinique avant la fin de la procédure (perte de poids, altération de la locomotion, détresse respiratoire, score métastatique critique) seront euthanasiés immédiatement afin d’éviter toute souffrance prolongée. Cette euthanasie anticipée est intégrée dans le plan expérimental et ne modifie pas les effectifs prévus. Aucun animal ne pourra être réutilisé, réhabilité ou replacé, car les traitements anticancéreux, la chirurgie et la progression métastatique entraînent des altérations physiologiques majeures incompatibles avec une réutilisation dans un autre protocole ou une adoption. L’ensemble des euthanasies sera réalisé par surdosage d’anesthésique, conformément aux recommandations réglementaires, garantissant une mort rapide et indolore.

Remplacement

Aucune alternative in vitro ou in silico ne reproduit la complexité tumorale, les interactions immunitaires ni la dynamique métastatique. Malgré leur apport, ces approches ne remplacent pas un organisme entier, indispensable pour étudier métastases, immunité, traitements, chirurgie et assurer la pertinence translationnelle.

Réduction

La réduction du nombre d’animaux repose sur une planification précise, l’usage maximal de données existantes, la standardisation des procédures et des approches longitudinales. Les modèles alternatifs sont utilisés dès que possible, et des critères d’arrêt stricts limitent toute utilisation inutile.

Raffinement

Le raffinement repose sur la compétence du personnel, l’optimisation des procédures, un hébergement enrichi et un suivi clinique strict. Anesthésie, analgésie, gestes maîtrisés et surveillance continue réduisent douleur, stress et complications, garantissant un bien‑être maximal. Nous aurons aussi recours à des points limites spécifiques et précoces.

Choix des espèces

Les modèles murins choisis reposent sur une expertise solide et de longue date du laboratoire, qui maîtrise parfaitement les lignées BALB/c et C57BL/6 ainsi que leurs modèles tumoraux syngéniques associés. La souris est l’espèce la plus pertinente pour ce projet, car elle permet de travailler dans un système immunitaire pleinement fonctionnel, indispensable pour évaluer l’impact des immunothérapies, des thérapies ciblées et de la chirurgie sur la maladie résiduelle minimale et la rechute métastatique. Les modèles 4T1 et CMT‑167 sont parmi les plus robustes et les mieux caractérisés pour reproduire respectivement le cancer du sein triple négatif et le cancer du poumon métastatique. Leur cinétique tumorale, leur microenvironnement immunitaire et leur comportement métastatique sont connus du laboratoire, garantissant une interprétation fiable des résultats et une réduction maximale de la variabilité expérimentale. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (entre 6 et 8 semaines d’âge) pour la mise en œuvre de modèles expérimentaux stables et reproductibles avec des animaux possédant un système immunitaire mature et un poids corporel > 20g.

80 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Âgées de 20 à 25 jours, elles reçoivent sous anesthésie une injection de virus dans le cerveau, au cours d'une chirurgie d'une heure à une heure trente, puis sont mises à mort vers 40 à 45 jours pour découper leur cerveau en tranches. Ces tranches servent à étudier le rôle du claustrum dans les ondes lentes du sommeil, avec des retombées sur l'épilepsie ou la mémoire renvoyées au long terme. Le porteur affirme que l'étude, menée post-mortem, "évite toute souffrance pour l'animal", alors qu'il liste lui-même douleur opératoire ou post-opératoire, dépression respiratoire et risque d'infection liés à la chirurgie.

Objectifs

Le sommeil lent, caractérisé par des ondes lentes et de grande amplitude, est essentiel à la consolidation de la mémoire et à la régulation des fonctions cérébrales. Le claustrum, structure cérébrale connectée à l’ensemble du cortex, est suspecté de jouer un rôle clé dans la coordination de ces ondes lentes, mais les mécanismes neuronaux sous-jacents restent à élucider. La réalisation de notre projet implique de mesurer et contrôler l’activité neuronale avec une résolution spatiale et temporelle qu’il n’est pas possible d’atteindre avec les méthodes non invasives classiquement utilisées chez l’homme. Nous souhaitons donc utiliser le cerveau murin et plusieurs stratégies complémentaires pour étudier l’activité neuronale du cortex et des structures cérébrales profondes à plusieurs échelles allant du neurone unique, jusqu’aux réseaux de neurones. Ces différentes techniques sont appliquées sur des réseaux neuronaux réduits, maintenus ex vivo. En effet, les approches in vivo actuelles chez la souris rencontrent des limites pour disséquer les interactions neuronales fines impliquant le claustrum, qui est une structure cérébrale particulièrement petite et difficile d’accès. Pour pallier à cette difficulté, nous avons développé une approche en tranches de cerveau ex vivo chez la souris qui permet de rejouer les activités du sommeil lent hors de l’animal, et ce pour la première fois simultanément dans le claustrum et le cortex cérébral. Jusqu’à ce jour, nous identifions la localisation anatomique du claustrum dans la tranche grâce aux atlas de cerveau de rongeurs mais une confirmation plus précise est nécessaire et demande une injection intracérébrale chez l’animal vivant. Cette approche permettra de réaliser deux objectifs : 1) confirmer la localisation anatomique du claustrum à l’intérieur des tranches de cerveau de souris ex vivo 2) utiliser ces mêmes outils afin de mesurer et contrôler l’activité de neurones du claustrum projetant vers le cortex et ainsi étudier les interactions claustrocorticales dans le cadre de la génération des rythmes lents du sommeil. La compréhension de ces mécanismes physiologiques permettra également à terme de mieux comprendre des états altérés comme l’épilepsie et l’anesthésie.

Bénéfices attendus

Bénéfices à court terme : Nos travaux ont permis de mettre en évidence une activité cérébrale impliquée dans le sommeil jusqu'à présent inconnue dans une région du cerveau appelée le claustrum. Ce projet permettra de valider une nouvelle approche expérimentale qui réduit fortement le nombre d'interventions réalisées sur les animaux. Des tissus prélevés feront l’objet de l’étude, ce qui limite les manipulations sur les animaux vivants tout en permettant d'obtenir des résultats fiables. Cette approche permettra : • D’identifier avec précision certains neurones du claustrum grâce à des marqueurs fluorescents qui les rendent visibles au microscope. • D’identifier les neurones du claustrum en contrôlant leur activité à l'aide de stimulations lumineuses ce qui permettra de mieux comprendre leur fonctionnement. Bénéfices à long terme : L'objectif principal du projet est de mieux comprendre la physiologie du cerveau pendant le sommeil, en particulier la participation du claustrum dans la genèse des oscillations du sommeil lent et dans la mémorisation. Nous étudierons comment ces mécanismes sont altérés dans des situations telles que : l'épilepsie, l'anesthésie ou durant l'action de médicaments. Ce travail réunit des experts en neurophysiologie et en modélisation et cela pour développer des modèles informatiques du cerveau entier intégrant les connaissances acquises dans notre projet. Ces modèles permettront de mieux comprendre comment le claustrum participe à la coordination de l'activité cérébrale pendant le sommeil. Retombées scientifiques et médicales : Les connaissances obtenues pourront ouvrir de nouvelles pistes thérapeutiques, notamment sur l’épilepsie et les troubles de la mémoire. Elles amélioreront les modèles informatiques du cerveau utilisés pour mieux comprendre ces maladies et à plus long terme, favoriseront le développement d’approches thérapeutiques ciblées novatrices. Diffusion des résultats : Les résultats seront diffusés sous la forme d'articles publiés dans des revues scientifiques et présentés lors de congrès nationaux et internationaux. Des rencontres scientifiques seront également organisées pour promouvoir les échanges entre les équipes de recherche travaillant sur cette région du cerveau. Soutenu par l'Agence nationale de la recherche, ce projet contribuera au développement de collaborations interdisciplinaires et à une meilleure compréhension du fonctionnement du cerveau.

Procédures

Dans ce projet chaque animal recevra une injection intracérébrale sous anesthésie générale. La durée totale de l’intervention sera de 1h à 1h30 maximum.

Impact sur les animaux

La seule procédure expérimentale utilisée dans ce projet est une chirurgie permettant l’injection stéréotaxique de virus qui peut, en théorie, avoir quelques effets indésirables sur le bien-être des animaux. Les principaux effets indésirables identifiés sont les suivants : 1) Risques liés à l’anesthésie : Dépression respiratoire ou cardiaque, hypothermie, impact sur le tractus digestif ; 2) Douleur opératoire ou post-opératoire ; 3) Suture qui s’ouvre et/ou infection.

Devenir

Les animaux seront mis à mort en vue de prélèvement pour des expériences Ex Vivo.

Remplacement

Notre projet vise à étudier le fonctionnement des neurones du claustrum au cours d’oscillations globales de l’activité du réseau cérébral. A part l’injection stéréotaxique préalable, cette étude est entièrement réalisée post-mortem sur des réseaux neuronaux isolés maintenus In Vitro, ce qui évite toute souffrance pour l’animal. En effet, les expériences sont menées sur des tranches de cerveau maintenues en conditions physiologiques, sans intervention invasive sur l’animal vivant. Alternatives non animales en neurosciences : • Approches computationnelles (simulations par ordinateur) et in vitro (culture cellulaire, organoïdes cérébraux) existent, mais elles ne permettent pour l’instant pas de reproduire fidèlement la complexité des réseaux neuronaux du claustrum. • Approche In Vitro : Bien que nécessitant la mise à mort d’un animal, cette approche permet d’étudier le claustrum en maintenant la complexité des interactions neuronales et donc une fidélité biologique supérieure aux modèles de neurones en cultures In Vitro. Justification de l’utilisation d’animaux : • Nécessité technique : Il n’est pas possible de cibler spécifiquement les neurones de projection du claustrum sans l’utilisation d’animaux vivants, seul système permettant la migration du matériel génétique injecté vers les neurones d’intérêt qui seront ainsi visualisables au bout de 3 semaines. • Intégration dans des modèles computationnels : Ce qui justifie nos travaux en électrophysiologie sur des réseaux biologiques intacts est que ces derniers permettent d’obtenir des données expérimentales robustes en conditions physiologiques réelles. Ces données seront ensuite utilisées comme base pour paramétrer le plus fidèlement possible le fonctionnement du claustrum dans des travaux de modélisation à grande échelle (modèle de cerveau virtuel) qui représenteront une alternative de remplacement.

Réduction

Notre projet claustrum comprend déjà des mesures pour réduire le nombre d’animaux utilisés dans nos expériences qui seront maintenues dans le cadre de cette demande d’autorisation de projet. Ainsi lors de nos expériences, les tranches de claustrum prélevées sur un animal, sont partagées pour une utilisation en parallèle par deux chercheurs utilisant chacun leur propre poste expérimental d’électrophysiologie In Vitro. Ceci nous permet de réduire le nombre de souris utilisées en maximisant ainsi l’obtention des résultats. Par ailleurs, la reproduction des souris transgéniques utilisées pour ce projet n’étant pas complètement contrôlable, nous obtenons parfois des portées plus larges que nécessaire pour notre expérimentation. Dans ce cas, avant de mettre à mort les animaux en surnombres, ces derniers sont plutôt proposés pour une utilisation dans d’autres protocoles expérimentaux. Enfin, l’utilisation de notre technique d’enregistrement extracellulaire multiples (64 enregistrements en parallèles) reste plus facile à mettre en œuvre que les enregistrements intra-cellulaires et autorise de ce fait, une utilisation d’animaux qui peuvent être plus âgés. Cette stratégie, même si elle a ses limites, permet donc d’utiliser une portée beaucoup plus longtemps et d’avoir moins d’animaux en accouplement, ce qui réduit le nombre total d’animaux utilisés.

Raffinement

• Utilisation d’une anesthésie gazeuse contrôlée et d’une analgésie locale est systémique pour minimiser la douleur pendant et après l’injection de virus. • Protection oculaire avec du gel ophtalmique (Ocry-gel) pendant l’injection de virus pour éviter le dessèchement. • Aide à la régulation thermique : tapis chauffant avec thermostat pendant la chirurgie et lampe chauffante au réveil. • Administration d’un bolus de NaCl 0,9 % tiédi (10 mL/kg, voie sous-cutanée) en post-opératoire pour compenser les pertes hydriques après la chirurgie. • Surveillance rigoureuse de la température corporelle, de la respiration, et du comportement postopératoire et suivi quotidien du bien-être des animaux par un personnel qualifié. • Enrichissement environnemental (matériel de nidification, lampe chauffante) pour réduire le stress. • Hébergement social avec congénères (sauf en cas de comportement de dominance agressive) dans la limite du nombre maximum d’individus par cage, pour éviter l’isolement.

Choix des espèces

L’espèce animale choisie est la souris car le projet requiert un modèle animal possédant une structure neuroanatomique proche de celle du cerveau humain. En particulier, le claustrum et les zones corticales qui en sont la cible (ex : cortex insulaire, cortex rétrosplénial). Les souris doivent recevoir l’injection de virus entre 20 et 25 jours après la naissance ce qui permet le prélèvement de leur cerveau pour les expériences ultérieures In Vitro vers 40 à 45 jours soit, après la vingtaine de jours nécessaire à l’expression du matériel génétique injecté. Les injections de virus ne seront pas réalisées sur les animaux de plus de 30 jours.