Souris

60 souris mâles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection dans le testicule sous anesthésie pour inactiver un gène, suivie d'un prélèvement sanguin puis de tests comportementaux (exploration, prise alimentaire, interaction avec des objets et des partenaires sexuels), avant mise à mort pour prélever les testicules. Le porteur décrit une opération simple et peu invasive, avec analgésie sur 48 heures. Il affirme qu'il est "impossible" de modéliser in vitro le fonctionnement testiculaire et juge la souris "indispensable".

Objectifs

Une meilleure compréhension des mécanismes impliqués dans la régulation de la synthèse de testostérone et la reproduction chez les mammifères est indispensable tant du point de vue de la recherche fondamentale que pour les avancées évolutives et médicales qu’elle pourrait permettre. L’un de ces aspects est la régulation génétique de la synthèse de testostérone. Ce projet repose sur l’inhibition expérimentale de l’expression d’un gène régulateur de l’expression génique dans le testicule adulte, chez la souris, pour en comprendre la fonction. Les effets de ce gène sur la synthèse de testostérone embryonnaire étant connus, il est vraisemblable qu'il régule également la synthèse de la testostérone chez l’adulte. Cette régulation de l’expression génique repose sur une lignée de souris transgénique chez laquelle l’injection d’un vecteur permet l’invalidation locale du gène ciblé. Ce vecteur sera administré sous anesthésie générale couplée à des antalgiques dans les testicules adultes. Les conséquences de la réduction de l’expression du gène cible seront mesurées sur la synthèse de testostérone, le comportement reproducteur et l’anatomie des cellules testiculaires.

Bénéfices attendus

Ces connaissances permettront une meilleure compréhension des régulations du fonctionnement testiculaire, y compris ses dysfonctionnements. Les connaissances nouvelles que nous produirons, outre des avancées dans la compréhension du fonctionnement testiculaire physiologique, pourraient permettre d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques pour agir sur des déficits de synthèse de testostérone et améliorer la fertilité humaine et animale.

Procédures

Ce projet comporte deux procédures de classe modérée qui reposent sur l'invalidation de notre gène d'intérêt dans le testicule. Cette invalidation nécessite l'injection d'un vecteur dans le testicule de souris adulte. Nous étudierons l’impact de cette absence génique sur la production d’hormone et le comportement reproducteur. Ainsi, une injection de 5 minutes sera effectuée au cours d'une anesthésie de 20 minutes, . Après une période de récupération de 2 semaines, un bilan hormonal sera réalisé sur un prélèvement sanguin. Lors de la procédure 2, 3 semaines après injection, les mâles seront inclus dans des analyses comportementales mettant en jeu des comportements naturels : exploration, prise alimentaire, interaction avec des objets et mise en contact avec des partenaires sexuels pour corréler les expériences réalisées avec le phénotype des animaux.

Impact sur les animaux

Le projet repose sur l'injection intratesticulaire d'un vecteur. L’injection nécessaire pour contrôler l’expression de notre gène d’intérêt sera réalisée sous anesthésie avec un contrôle analgésique multimodal pendant 48H assurant une absence de douleur. Cette opération est simple, rapide et peu invasive, ce qui permettra un rétablissement très rapide. Pendant cette période, pour permettre un Raffinement expérimental optimal, les animaux auront accès à une alimentation hydratée à leur hauteur, leur permettant de se nourrir sans effort. Ils seront surveillés quotidiennement pendant leur rétablissement et leur bien être évalué selon une grille de scoring multicritères (posture, alimentation, masse, état du pelage, déplacements). Si les animaux présentaient des signes de douleur persistante, l’expérience serait interrompue et le protocole révisé.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés pour permettre une analyse à postériori de leurs testicules prélevés post-mortem. Cela permettra de corréler l'efficacité du vecteur aux conséquences anatomiques et/ou comportementales induites par l'invalidation génique.

Remplacement

La maturation et le fonctionnement testiculaires (stéroïdogenèse et spermatogenèse) sont des processus intégrés et complexes. Il est impossible de les modéliser ou de les simuler intégralement in vitro. L’utilisation d’animaux est indispensable pour aborder ces questions.

Réduction

Les procédures sont conçues pour réduire le nombre d'animaux inclus dans le projet. La première procédure utilise des contrôles internes, ce qui évite de faire deux groupes distincts. La seconde procédure s'appuiera sur les résultats de la première pour permettre une efficacité optimale des conditions expérimentales pour réduire le nombre d'animaux à inclure. Enfin chaque prélèvement sera scindé en plusieurs séries, ce qui permettra de réaliser de nombreuses expériences sur chacun des prélèvements, sans avoir besoin de traiter de nouveaux animaux.

Raffinement

Les conditions d’hébergement de nos souris sont prévues pour minimiser le stress pendant la croissance et la période expérimentale : hébergement par fratries de même sexe, présence d'ouate et d’igloos dans les cages pour faciliter la construction de nids. Tout au long du projet, le bien-être des animaux sera évalué selon une grille de scoring multicritères dont les critères seront adaptés à chaque procédure.

Choix des espèces

Ce projet propose d'étudier le rôle de l'expression génique dans les fonctions endocrines et exocrines du testicule. -Cette approche génétique nécessite de travailler sur des animaux chez lesquels les outils génétiques sont disponibles et fiables. -L'organisation du testicule est différente d'un clade à l'autre. Cette étude doit donc être réalisée sur une espèce mammifère, pour que les observations soient transposables à l'ensemble des mammifères, y compris l'homme. -Notre projet repose en partie sur des analyses hormonales, comportementale et d’observation de la fertilité ce qui nécessite une espèce avec des tests validés. Seule la souris remplit l’ensemble de ces critères. En particulier, les tests que nous proposons sont validés par de nombreuses publications. Les souris seront étudiées à l’âge adulte, entre 2 et 4 mois, l’âge requis pour avoir pleinement développé un comportement adulte.

416 rats et 444 souris vont être utilisés, tous tués à l'issue par exposition au CO2, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les rats sont infectés par le parasite S. ratti pour entretenir la lignée parasitaire, les souris vaccinées jusqu'à quatre fois puis infectées à deux reprises, avec trois prélèvements sanguins. Le projet teste si des biothérapies anti-allergiques nuisent aux défenses contre les vers parasitaires. Le porteur affirme que cette immunité complexe ne peut être reproduite in vitro et que le maintien du parasite impose le recours aux rats.

Objectifs

Les infections par les vers parasitaires touchent actuellement près de 1/4 de la population mondiale. A l’heure actuelle, les mécanismes innés et adaptatifs de défense contre ces parasites ne sont pas complètement compris. L’immunité « de type 2 » impliquant les IgE, les cytokines IL-4 et IL-13 et les mastocytes joue un rôle très important dans les pathologies allergiques. De ce fait, de nombreuses biothérapies développées actuellement pour traiter les allergies ciblent cette immunité de type 2. Cependant, les mêmes acteurs cellulaires et moléculaires sont également impliqués dans la défense contre certains parasites. Il est donc très important de tester l’effet de ces nouvelles biothérapies anti-allergiques sur les réponses contre des parasites, afin de s’assurer de la sureté de ces approches.

Bénéfices attendus

L'immunité adaptative (principalement la réponse anticorps) joue un rôle fondamental lors d’une réinfection avec le même parasite. Les mastocytes jouent un rôle important lors des infections primaires et secondaires, permettant l’expulsion des parasites. Cependant, les sous-populations de mastocytes (connectifs versus mucosaux) et les mécanismes permettant aux mastocytes de jouer ce rôle de défense ne sont pas bien connus. Notre laboratoire développe des stratégies vaccinales et des biothérapies pour le traitement de l’asthme et des allergies, ciblant principalement les cytokines de type 2 (IL-4 et IL-13), les IgE et les mastocytes. Il est très important de vérifier que ces biothérapies n’auront qu’un effet limité sur les défenses anti-parasitaires afin de s’assurer de la sureté de ces nouvelles approches thérapeutiques.

Procédures

Un total de 416 rats sera infecté en sous-cutané avec le parasite S. ratti afin de collecter des larves dans leurs fèces. Les rats seront mis à mort par exposition au CO2 après 9 jours au plus tard (procédure 1). Un total de 192 souris sera immunisé un maximum de 4 fois aux jours 0, 7, 28 et 49 en intramusculaire dans la cuisse arrière avec une formulation de vaccin dirigé contre l’IL-4, l’IL-13 ou les IgE dans un volume de 50 µL (procédure 2). Un total de 96 souris sera injecté en intrapéritonéal deux fois par semaine pendant 3 semaines (6 injections au total) avec un conjugué SCF-doxorubicine (10mg/kg maximum dans 200 µL de PBS) (procédure 3). A l’issue des procédures 2 et 3, l’ensemble des souris ainsi que 156 souris additionnelles (soit un total de 444 souris) seront ensuite injectées en sous-cutané avec des larves de parasite S. ratti pour un total de deux fois à 28 jours d’intervalle. Nous réaliserons trois prélèvements sanguins à la veine mandibulaire sous anesthésie gazeuse (isoflurane 3%) aux jours 0, 7 et 21 (procédure 4).

Impact sur les animaux

D’après les données de la littérature et notre expérience antérieure avec ce modèle, l’infection avec le parasite S. ratti n’induit pas de signes visibles de douleur ou de comportement anormal chez les animaux.

Devenir

A l’issue de la procédure 1, tous les animaux seront mis à mort par exposition au CO2. L’ensemble des animaux des procédures 2 et 3 seront utilisés dans la procédure 4. Et à l’issue de la procédure 4, l’ensemble des animaux sera mis à mort par exposition au CO2.

Remplacement

Les mécanismes de défense contre les nématodes (parasites) sont complexes et nécessitent l’action concertée de plusieurs types de cellules immunitaires et d'anticorps. Ceci ne peut être reproduit in vitro. De plus, le maintien de ces nématodes ne peut être fait in vitro et nécessite donc l’utilisation de rats pour maintenir la lignée parasitaire.

Réduction

L'expérience du porteur du projet dans l'analyse de ces divers modèles de pathologies et la présence des données préliminaires nous permettent d'anticiper et d'optimiser le nombre d’animaux à analyser dans chaque modèle. Nous utiliserons une moyenne de 4 animaux par groupe de même âge et sexe pour chaque expérience. Les expériences seront répétées 3 fois de manière indépendante afin d’assurer la validité de nos résultats. Les tests statistiques seront effectués avec le logiciel Graph-Pad Prism. En fonction du type d’expérience, du nombre d’échantillons analysés et de la distribution des valeurs nous choisirons un des tests statistiques suivants : 1- way ou 2-way ANOVA, Mann-Whitney ou unpaired 2-tailed Student’s t test ; nous considèreront une valeur de P significative si elle est inférieure à 0.05.

Raffinement

Le bien-être de l’animal est un facteur de variabilité expérimentale que nous prenons en considération grâce au suivi quotidien des animaux. Ce suivi permet d'évaluer l'état général des animaux (prise de nourriture, toilettage, mouvements), l’enrichissement de leur environnement et le respect de l’aspect social du groupe (4 à 5 animaux par cage, pas d’isolement ni de changement de cage). De plus, un enrichissement sera rajouté aux animaux (carrés de coton pur ou du papier absorbant) permettant aux animaux de faire une nidation, selon la directive européenne 2010/63/UE. Pour chaque procédure des points limites ont été définis pour limiter la douleur, la souffrance ou l’angoisse de l’animal et l'animal sera euthanasié s’il présente un de ces points limites d’arrêt de la procédure. Enfin, les personnes responsables du projet ont été formées à l’utilisation des animaux à des fins scientifiques ; elles garantissent de la formation et de l’encadrement des autres expérimentateurs impliqués dans les procédures expérimentales.

Choix des espèces

La souris représente le modèle animal le plus utilisé pour étudier la physiopathologie des maladies humaines. En effet, l’élevage de souris est très productif (avec une variation possible en fonction des fonds génétiques étudiés) et nécessite peu de place. Les connaissances et avancées technologiques actuelles permettent de disposer de nombreux modèles sophistiqués. D’ailleurs, la majorité des animaux transgéniques nécessaires à la réalisation de ce projet sont uniquement disponibles chez la souris et sous un fond génétique bien contrôlé. Enfin, la physiologie des différents organes chez la souris présente de nombreuses similarités avec celle des organes humains, ce qui permet l’induction de modèles pathologiques mimant les maladies humaines observées chez les patients. Les rats Wistar sont utilisés pour la conservation de la souche S.ratti. Comme le rat est l’hôte naturel de S.ratti, les rats de Wistar permettent d’obtenir facilement la quantité de vers nécessaires pour les expériences qui seront réalisées chez la souris. Pour la majorité des expériences, les souris seront utilisées entre 8 et 12 semaines, ce qui correspond à de jeunes adultes qui possèdent un système immunitaire bien développé et mature. Les animaux seront utilisés à 6 semaines uniquement pour les procédures 2 et 3 (vaccination anti-IL4, anti-IL13 ou anti-IgE et déplétion des mastocytes).

630 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque souris reçoit sous la peau une greffe de fragment de tumeur prélevé chez un patient, puis des traitements par voie orale ou sous-cutanée, la tumeur pouvant provoquer de la souffrance. Le porteur teste de nouveaux traitements de lymphomes T avant un éventuel passage à l'humain et affirme que les lignées cellulaires ont un "intérêt très limité". Sa rubrique sur le raffinement se réduit à l'annonce de points limites et d'une grille de surveillance.

Objectifs

Notre projet a pour objectif d’évaluer de nouveaux traitements des lymphomes chez la souris, avant un éventuel passage à l’Homme.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus sont de sélectionner les traitements les plus efficaces (seuls ou en association) et les mieux tolérés chez la souris, puis de mettre en place un essai clinique chez l’Homme afin d’évaluer la tolérance et l’efficacité de ces nouveaux traitements.

Procédures

1) Greffe d'un fragment d'une tumeur humaine primaire, qui sera placée sous la peau des souris après courte incision sous anesthésie générale. 2) Administration des traitements : les souris recevront différents traitements, seuls ou en combinaison, par voie orale ou sous-cutanée. Au total, il y aura 4 expériences pour la procédure 1 et 3 pour la procédure 2. Chaque expérience durera 3 semaines maximum.

Impact sur les animaux

Le principal effet indésirable est lié au développement de la tumeur sous-cutanée, qui peut induire de la souffrance. Nous serons donc très attentifs au bien-être des animaux. Afin de ne pas causer de souffrance, la mise à mort sera pratiquée lorsque le volume de la tumeur atteindra un certain volume ou en cas de signes cliniques. Durant les protocoles expérimentaux, un suivi clinique minimal 2 fois/semaine sera mis en place afin de surveiller l’apparition de signes de souffrance. Le cas échéant, l’animal sera mis à mort. De cette manière, la souffrance liée au développement de la maladie sera réduite au minimum.

Devenir

Mise à mort de l'animal à l'issue de chaque procédure.

Remplacement

Les cellules tumorales des patients sont fragiles et ne peuvent être utilisées au laboratoire pour évaluer de nouveaux traitements. L’utilisation de lignées cellulaires de lymphomes a un intérêt très limité, car les cellules sont différentes des cellules tumorales des patients. Pour être au plus proche de la pathologie humaine, nous greffons directement un fragment de tumeur de patient sous la peau des souris. Ce modèle est difficile à mettre au point et très précieux. Il permet d’évaluer de nouveaux traitements chez les souris, avant leur évaluation chez l’Homme.

Réduction

Ce projet nécessitera 630 souris sur 5 ans. Le nombre d’animaux a été réduit au minimum, après estimation des effectifs, afin de garantir l’obtention de résultats statistiquement significatifs et cliniquement pertinents, à l’aide de simulations informatiques (invivostat).

Raffinement

Tout au long de ce projet, nous serons attentifs au bien-être des animaux et avons défini des points limites précoces, évaluables à l’aide d’une grille que nous avons établie, dans le but de ne pas causer de souffrance animale.

Choix des espèces

Les souris sont très utilisées dans la recherche en général, et spécifiquement dans la recherche contre le cancer. De nombreux modèles ont été développés, proches de la pathologie humaine, permettant d’évaluer de nouveaux traitements contre le cancer. Cela permet aussi de comprendre les mécanismes d’action de ces traitements, et de pouvoir les améliorer pour les rendre plus efficaces et mieux tolérés.

440 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Génétiquement modifiées pour reproduire une mutation liée à l'autisme, elles subissent une chirurgie cérébrale d'environ une heure avec pose de fibres optiques, puis des tests comportementaux courts ou un enregistrement électrique de six heures. Le porteur stimule des zones du cerveau par la lumière pour tenter de corriger le comportement et qualifie cette approche in vivo d'"indispensable". Il déclare des effets indésirables limités à un "léger stress" lié à la chirurgie.

Objectifs

Les Troubles du Spectre Autistique représentent un ensemble de pathologies neurodéveloppementales touchant 1 enfant sur 160 dans le monde. Les symptômes sont répartis en 2 grandes catégories : apparition de déficits dans l'interaction et la communication sociale et des comportements moteurs inappropriés, répétitifs et stéréotypés. Ils apparaissent à partir de 3 ans et se prolongent chez l’adulte. Bien que de nombreuses causes tant génétiques qu’environnementales, aient été mises en évidence grâce aux études actuelles, le mécanisme commun expliquant le développement de la pathologie reste encore à utiliser. Pour cela, l’utilisation de modèle animaux reste donc cruciale. Notre équipe étudie notamment l’influence d’un gène identifié chez les patients comme faisant partie des plus fréquemment muté (SCN2A). Il code pour une protéine impliquée dans l’activité électrique des neurones. Ce projet se base sur l’étude d’un modèle de souris portant une mutation du gène SCN2A entrainant une diminution de l’excitabilité neuronale et dont les troubles comportementaux reproduisent ceux retrouvés chez les patients. Ce projet se déroulera sur 5 ans et propose d’identifier les régions cérébrales impliqués dans différents comportements autistiques chez ces souris (communication sociale et anxiété). Pour cela, nous utiliserons une protéine (activable par la lumière) pour stimuler différentes zones cérébrales d’intérêt à l'aide d'un laser pendant les tests. Cela aura pour but de compenser la présence de la mutation et le manque d'excitabilité des neurones, ce qui rétablira le comportement si les zones cérébrales étudiées sont impliquées.

Bénéfices attendus

Une meilleure compréhension des mécanismes menant au développement de l'autisme et/ou de l'épilepsie chez le modèle animal est indispensable pour expliquer l'apparition des symptômes et leur développement au cours du temps chez l'Homme. La mise en évidence de zones cérébrales et de certaines connexions neuronales spécifiquement impliquées dans les différents troubles comportementaux observés permettent à la fois de comprendre le fonctionnement naturel des comportements étudiés (ex: communication dans un contexte social) et d'avoir des cibles précises sur lesquelles avoir une action thérapeutique précoce pour limiter ou empêcher l'apparition des symptômes.

Procédures

Tous les animaux seront soumis à une procédure chirurgicale d'environ 1 heure (injection de l'outil permettant la production de la protéine activable par la lumière dans les zones cérébrales d'intérêt et pose de fibres optiques permettant de l'activer), puis à un test comportemental (de 3 ou 5 min) ou à un enregistrement de l'activité électrique des neurones = électrocorticogramme (6 heures).

Impact sur les animaux

Les effets indésirables liés à ce projet sont peu nombreux. En effet, l'étape de chirurgie est la seule susceptible de causer un léger stress à l'animal. En outre, toutes les mesures seront prises pour éviter toute souffrance à l'animal lors de cette étape. Nos tests comportementaux sont peu stressants car ils sont basés sur des comportements naturels d'exploration, sont de courtes durées (3-5min) et se déroule avec une faible luminosité environnante contrôlée pour ne pas ajouter un stress supplémentaire.

Devenir

Tous les animaux utilisés lors des procédures seront mis à mort pour prélever les cerveaux dans le but de vérifier le bon positionnement des injections de l'outil, des fibres optiques et des électrodes.

Remplacement

Nous avons établi notre projet de recherche en tenant compte de la règle des 3R. Ainsi, afin de répondre au principe de remplacement, nous réaliserons, parallèlement aux expérimentations sur animal vivant, quand cela sera possible, des études sur culture de neurones ou tranches de cerveau. Cependant, les études fonctionnelles basées sur la stimulation des neurones et leur impact sur la réponse comportementale ne peuvent être réalisées que sur animal vigile. Cette approche in vivo est donc indispensable pour modéliser et étudier au mieux le phénotype clinique associé aux Troubles du Spectre Autistique.

Réduction

Le nombre d'animaux utilisés dans ce projet a été réduit au maximum tout en nous permettant d'obtenir des résultats interprétables. Nous comparerons pour chaque test 4 groupes d'animaux : souris sauvages et mutantes, avec ou sans stimulation lumineuse. Nous avons calculé nos besoins en animaux via une méthode statistique adaptée. Un maximum de 20 animaux seront donc utilisés par groupe pour les procédures. Les 2 sexes seront utilisés pour réduire la production nécessaire en termes de nombre d'animaux (mâles pour la communication sociale et femelles pour le test d'anxiété).

Raffinement

Toutes les mesures de raffinement appropriéees seront prises pour éviter toute souffrance ou inconfort à l’animal. Toutes les souris seront élevées dans un environnement enrichi (social et physique) et une manipulation régulière des animaux sera réalisée afin de réduire leur stress. Les procédures chirurgicales seront réalisées par des expérimentateurs habilités à pratiquer la chirurgie dans des conditons optimales pour le bien-être des animaux (prise en charge de la douleur, soins pré/post opératoire, suivi quotidien, etc.). Un autre exemple de mesure de raffinement sera l'administration d'un anti-inflammatoire dans l'eau de boisson pendant la période post-opératoire. Un suivi journalier permettra d’évaluer leur état de santé et ainsi d’intervenir rapidement par rapport aux points limites définis, par application d'une grille de critères. Exemples: Désinfection de plaies, administration d'antalgique, injection de solution saline glucosée pour l'hydratation, manipulation de l'animal, séparation de congénaire agressif ou euthanasie.

Choix des espèces

Nous utilisons une des rares lignées de souris génétiquement modifiées actuellement disponibles pour l'étude de notre mutation in vivo. Nous travaillerons sur des souris ayant une réduction de 50% de la production de notre protéine d'intérêt (espèce très largement utilisée pour les études comportementales) obtenues à partir de croisements de souris mutantes avec des souris sauvages. Les protocoles utilisés ont été choisis par rapport à la littérature basée sur la même espèce. Les animaux seront utilisés à 2 stades de développement : Jeunes et Adultes. Les Troubles du Spectre Autistiques apparaissant chez l'enfant autour de 3 ans et se maintenant à l'âge adulte, ces deux phases sont à étudier pour comprendre les circuits neuronaux impliqués dans l'apparition des comportements autistiques, leur développement ainsi que les possibles adaptations neuronales (changements physiologiques ou pathologiques) se mettant en place au cours du temps.

304 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections de plaquettes dans le sinus rétro-orbital et subissent des prélèvements sanguins répétés à la queue, puis un prélèvement terminal à l'aorte abdominale sous anesthésie. Le porteur étudie l'élimination des plaquettes transfusées chez un receveur devenu réfractaire et affirme que ces processus "ne peuvent être étudiés qu'in vivo". Il croise deux lignées de fonds génétiques différents pour reproduire la différence entre donneur et receveur.

Objectifs

Les plaquettes sanguines jouent un rôle fondamental dans les processus d’hémostase. C’est ce qui nous permet d’éviter les hémorragies en cas de blessures ou de lésions. Quand le taux de plaquettes circulantes chute en dessous de 10.000 plaquettes par μL de sang chez un patient, le risque d’hémorragie interne devient important et une transfusion peut être envisagée. Une complication post transfusionnelle connue est la production d’anticorps anti¬plaquettes par le receveur dirigés contre les plaquettes du donneur. Ainsi, si receveur développe de tels anticorps de nouvelles transfusions seront inefficaces sur un plan thérapeutique puisque les plaquettes du donneur seront détruites par ces anticorps et très rapidement éliminées de la circulation : on dit alors que le patient est en état réfractaire. Cette problématique est particulièrement importante chez des patients dont les pathologies nécessitent des transfusions plaquettaires récurrentes. Objectif : Des études préliminaires ont permis d'avancer dans la compréhension du mode d'action des anticorps produits par le receveur et responsables de l'élimination des plaquettes transfusées. Ce projet nous permettra d'évaluer une approche pharmacologique ayant pour but d'éviter que les plaquettes transfusées soient éliminées trop rapidement de la circulation du receveur.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus de ce projet sont d'apporter des connaissances sur les mécanismes d'élimination des plaquettes transfusées lorsque le receveur rejette sa transfusion et qu'il y a donc une inefficacité thérapeutique transfusionnelle appelée également état réfractaire. Les perspectives de ce travail sont denvisager des solutions thérapeutiques chez l'homme et une meilleure prise en charge des patients multitransfusés.

Procédures

Les animaux subiront des prélèvements sanguins à l'aorte abdominale (prélèvement terminal sous anesthésie) ou des prélèvements sanguins à la queue (petits volumes prélevés, sous anesthésie ). Les prélèvements à l'aorte sont des prélèvement terminaux donc unique par définition. Prélèvements sanguins répétés sur animal anesthésié : Les prélèvements sanguins à la queue sont réalisés 5 min, 30min, 2h, 24h et 48h après la transfusion de plaquettes, soit 5 prélèvements de 10 µL sous anesthésie gazeuse sur le même animal.

Impact sur les animaux

Pour réaliser ce projet, 304 souris au maximum devront être utilisées et mis à mort à la fin du projet. Cependant, les procédures réalisées sont modérées et seront effectuées dans le strict respect des règles mises en place pour veiller au bien être des animaux. Les animaux subiront un stress au moment de l'anesthésie (contention de l'animal pour lui injecter l'anesthésiant) mais ce geste n'est pratiqué que par des expérimentateurs habilités à réaliser ce geste (donc rapidement). Une douleur peut être ressentie au niveau du site d'injection des plaquettes dans le sinus rétro-orbital d'où l'utilisation d'un collyre contenant de la tétracaine pour limiter la douleur.

Devenir

Les animaux de la PE n°1 seront soit mis à mort (lot n°1: prélèvement sanguin terminal à l'aorte abdominale) soit utilisés pour la PE n°2 (lot n°2) Les animaux utilisés dans les PE n°2 et n°3 seront mis à mort à la fin des procédures.

Remplacement

Les événements initiaux conduisant à la production d’anticorps anti-plaquettes et aux états réfractaires ne peuvent pas être étudiés chez des patients transfusés. Nous voulons évaluer l'effet d'une stratégie thérapeutique. Ces processus mettent en oeuvre simultanément des interactionsentre les vaisseaux, le sang et la circulation sanguine. Ces événements sont intégrés et ne peuvent être étudiés qu’in vivo.

Réduction

Les mises au point réalisées en amont pour vérifier que ce protocle d'alloimmunisaton conduit à un état réfractaire permettra de n’utiliser que le minimum de souris dans les groupes de souris immunisées. Les nombres d'animaux utilisés lors des expériences seront minimalisés avec la contrainte d'obtenir des observations suffisamment représentatives. Des expériences préliminaires au laboratoire nous ont permis de fixer à 5 le nombre de souris par conditions testées, ce chiffre tient compte de la variabilité inter-individus.

Raffinement

Les conditions d’environnement sont optimisées par l’enrichissement des cages avec du coton et de la frisure, ce qui leur permet de compartimenter leur environnement selon leurs besoins. Ils ont un accès permanent à l’eau de boisson et à la nourriture. Les individus sont hébergées par groupe de 6 par cage. Un soin particulier sera apporté afin de diminuer le stress et la douleur de tous les animaux utilisés dans ce projet : - Hébergement dans des cages munies de particules de bois et enrichie avec un carré en coton compressé afin de permettre aux animaux de réaliser un nid conformément à leurs besoins comportementaux.-Accès permanent à l’eau de boisson et à la nourriture -Anesthésie de l’animal afin de limiter l’angoisse, l’inconfort, le stress et la douleur associés. -Injection d’analgésique le cas échéant. -Mise en place d’une fiche de suivi pour suivre l’état des animaux et veiller à leur bien être tout au long de l’expérimentation. Pendant toutes les expérimentations, les animaux sont surveillés par du personnel entrainé. Ils veilleront au bien être des animaux grâce à l'utilisation d'une grille de scoring et à la défintion de points limites permettant d'éviter toutes douleurs ou souffrances inutiles de l'animal. Ce projet nécessitera 304 souris au maximum

Choix des espèces

Puisque nous souhaitons mimer la différence qui existe entre un donneur et un receveur qui conduit à la production d'anticorps par le receveur, nous devons travailler avec des souris de fond génétique différents et très bien caractérisés au laboratoire (C57BL6/J et BALB/c). De plus, le modèle d’alloimmunisation post transfusionnelle est bien caractérisé et maîtrisé au laboratoire ce qui rend l’utilisation de la souris dans ce projet très pertinente. Les animaux sont utilisés au stade adulte, pubère âgé de 7 à 12 semaines afin de pouvoir étudier l'effet des anticorps sur un individu au système immunitaire mature.

60 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque souris subit une chirurgie avec implantation d'une pompe de diffusion, puis huit jours d'isolement, et présente une perte de neurones et un déficit de mémoire évalué par un test de labyrinthe en Y. Le porteur utilise une lignée 5xFAD, qu'il décrit à la fois comme modèle d'Alzheimer et de la maladie de Lafora, pour tester une molécule enzymatique. Les souris sont expédiées vers une société privée qui les tue à réception, et le bénéfice annoncé se limite à une "meilleure compréhension" de la maladie.

Objectifs

La maladie de Lafora (ML) représente une forme fréquente et particulièrement grave d’épilepsie myoclonique progressive. Ses premières manifestations surviennent à l’adolescence : la personne perd soudainement conscience et tombe avant de présenter des contractions musculaires généralisées. Cette première phase est suivie d’une seconde période durant laquelle le patient présente des spasmes rapides des quatre membres suivie d’une décontraction généralisée des muscles. Après un délai variable d’inconscience, la personne se réveille. L’évolution est dominée par une détérioration cognitive majeure et rapide, dont les premiers symptômes peuvent précéder les troubles moteurs. Le décès survient généralement 4 à 10 ans après les premiers symptômes dans les formes typiques. L’utilisation d’un modèle rongeur, vertébré présentant des structures cérébrales comparables à l’Humain, permet l’étude de ces dernières et des circuits neuromusculaires associés afin de développer de nouvelles cibles thérapeutiques pour la maladie de Lafora. L’objectif de ce projet est de tester une molécule enzymatique thérapeutique (VAL) sur ce modèle murin. Pour le modèle murin utilisé (souris 5xFAD : MMRRC Strain #034840-JAX) : Ces souris transgéniques 5xFAD surexpriment la protéine mutante humaine précurseur bêta-amyloïde (A4) 695 (APP) avec les mutations suédoises (K670N, M671L), de Floride (I716V) et de Londres (V717I) de la maladie d'Alzheimer familiale (FAD) avec la préséniline humaine 1 (PS1) hébergeant deux mutations FAD, M146L et L286V. Les deux transgènes sont régulés par le promoteur Thy1 de la souris pour entraîner une surexpression dans le cerveau. Les souris 5XFAD récapitulent les principales caractéristiques de la pathologie amyloïde de la maladie d'Alzheimer et peuvent constituer un modèle utile de neurodégénérescence intraneuronale induite par Abeta-42 et de formation de plaque amyloïde. De plus ces animaux présentent des formes d’épilepsie similaires à la maladie de Lafora, ce pourquoi nous les utilisons.

Bénéfices attendus

Meilleure compréhension de la maladie de Lafora.

Procédures

Tous les animaux subiront une opération chirurgicale sous anesthésie de 20 minutes.

Impact sur les animaux

Pour l’étude de la maladie de Lafora, le modèle murin utilisé est le modèle 5xFAD. Ces souris lorsque reproduites en hémizygotes (un organisme est dit hémizygote pour un gène particulier si ce dernier n'est présent qu'à une seule copie) sont viables et fertiles et présentent des déficits cognitifs et de mémoire ainsi que des épisodes d’épilepsie. Ces animaux subissent une chirurgie avec implantation d’une pompe de diffusion et sont isolés pendant 8 jours à la suite de cette chirurgie. Ces animaux présentent une perte de neurones et une déficience de la mémoire dans le test du Y-maze (test du labyrinthe en Y). Les souris transgéniques 5xFAD possèdent les principales caractéristiques de la pathologie amyloïde de la maladie d'Alzheimer et peuvent être des modèles utiles de la neurodégénérescence intraneuronale induite par l'Abeta-42 et de la formation de plaques amyloïdes. Pour limiter la souffrance, un analgésique [Meloxicam (Metacam™), 0.03 ml, 5mg/kg] est administré par voie intrapéritonéale avant la chirurgie et pendant les 3 jours (si nécessaire) suivant les actes chirurgicaux qui sont réalisés sous anesthésie gazeuse. Concernant le stress et l’anxiété, les animaux voient et sentent leurs congénères même s’ils sont isolés. La cage est enrichie avec un nid végétal. Les animaux sont manipulés avant et après la chirurgie pour minimiser le stress et l’anxiété.

Devenir

A la suite des opérations de chirurgie, les animaux seront envoyés à la société Neuroservices Alliance localisé à Aix en Provence. Les animaux seront envoyés à cette société avant l’apparition du phénotype dommageable. Cette société s’occupera de l’euthanasie des animaux dès leur réception ainsi que des prélèvements.

Remplacement

Ce protocole nécessite l’utilisation d’animaux. En effet, l’identification des structures cérébrales et des circuits neuromusculaires impliqués dans la maladie de Lafora nécessite l’utilisation d’un cerveau intact chez l’animal vigile. Des méthodes in vitro telles que la culture cellulaire ou bien les coupes de cerveau ne contiennent pas les connections neurones qui sont le sujet de nos travaux. Il n’existe donc pas de méthodes alternatives.

Réduction

Le nombre d’animaux a été calculé par l’estimation de la variance observée avec ce type de données permettant d’atteindre une signification statistique. Ce nombre est de 15 souris par groupe mais par expérience 10 animaux par groupe sont suffisant et seront utilisés, soit un total de 60 animaux pour la réalisation de ce protocole.

Raffinement

Afin de réduire au minimum la souffrance des animaux, nous appliquons systématiquement un traitement antalgique avant et trois jours suivant les actes chirurgicaux qui sont réalisés sous anesthésie gazeuse. L’évaluation du poids de l’animal est effectuée de façon journalière à partir du moment où il est isolé en cage individuelle et rentre dans la phase expérimentale. Ces mesures ont lieu lors de la manipulation journalière des animaux en même temps que la vérification de l’état général de l’animal. Ces mesures sont consignées dans un cahier d’expérience prévu à cet effet. Pour identifier les dommages et contraintes subis par l’animal, nous avons définis des points limites au nombre de 5. Ces cinq aspects évalués au cours de nos expériences nous aident à déterminer un point final à l’expérimentation. Chaque critère est évalué de 0 à 3 et si un critère obtient le score maximal, ceci induit un arrêt immédiat de l’expérience.

Choix des espèces

La souris est un bon modèle pour les études comportementales. Son utilisation est généralisée dans le domaine des neurosciences et en particulier pour l’étude des circuits neuronaux impliqués dans diverses maladies myocérébrales. De plus, nous utilisons ici un modèle transgénique présentant un fort intérêt scientifique. Les animaux seront utilisés entre 4 et 9 mois post natal fin de permettre une comparaison avec des résultats précédemment publiés.

280 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ces souris immunodéficientes reçoivent une greffe de cellules tumorales sous la peau, puis des médicaments deux fois par semaine pendant sept à neuf semaines, avant d'être tuées par dislocation cervicale pour prélever les tumeurs. Le porteur teste une trithérapie contre l'hépatoblastome, cancer du foie de l'enfant, et prévoit de répéter voire de refaire l'ensemble de l'étude, ce qui porte l'effectif à 280. Il affirme qu'aucune méthode alternative ne reproduit la complexité de la tumeur in vivo.

Objectifs

L’hépatoblastome est le cancer primaire du foie le plus fréquent chez l’enfant de moins de 5 ans. Le traitement de référence par chimiothérapie est inefficace dans 20 % des cas. Nos données en laboratoire montrent que l’action combinée de 2 drogues en sus de cette chimiothérapie de réfèrence permet d’éliminer très efficacement les cellules tumorales du foie en laboratoire. Dans ce projet, nous souhaitons tester l’efficacité de cette trithérapie chez l’animal. Ces travaux de recherche nous permettrons aussi d’étudier pourquoi certaines drogues sont efficaces et pas d’autres et comment les cellules tumorales arrivent à résister à chacune de ces drogues lorsqu’elles sont utilisées seules. En effet, ces informations sont cruciales pour comprendre comment fonctionnent ces molécules et quelles propriétés les rendent efficaces. La découverte et la validation de nouveaux traitements des tumeurs du foie chez l’enfant permettront de faire un pas important pour soigner les enfants souffrant de ce cancer, en particulier ceux en rechute ou en échec thérapeutique.

Bénéfices attendus

Démontrer que l’association de ces trois médicaments bloque la formation de tumeur d’hépatoblastome chez la souris plus efficacement que chaque drogue utilisée seule ou combinée deux à deux.

Procédures

Implantation de cellules tumorales en sous-cutanée sur 280 animaux. Suivi des animaux pendant 7 à 9 semaines. Administration de médicaments 2 fois par semaine. Mesure de la tumeur au pied à coulisse 3 fois par semaine. Pesée des souris deux fois par semaine.

Impact sur les animaux

Les principaux effets indésirables attendus sur les animaux sont l’injection de cellules tumorales en sous-cutanée et la pousse de la tumeur pendant plusieurs semaines.

Devenir

Les 280 souris de ce projet seront euthanasiées par dislocation des vertèbres cervicales afin de procéder au prélèvement des tissus tumoraux et à leur analyse pas des approches moléculaires et histologiques.

Remplacement

Il n’existe pas de méthode alternative à la réalisation de ce projet, c’est-à-dire un système biologique qui reproduit partiellement ou entièrement les conditions cliniques, analytique et/ou moléculaire de notre objet d'étude. II est impossible d'obtenir les informations fournies dans cette étude sans l'utilisation de cette souche de souris (souris immunodéficience, NOD/LtSz-scid IL2R gamma, NSG). Sources bibliographiques consultées (PubMed, CEVMA). Les conclusions recherchées ne peuvent être obtenues par des modèles alternatifs d'étude in vitro, qui ne reconstituent pas de manière optimale la complexité, l’interactivité et la diversité des compartiment stromales et tumorales en action in vivo chez la souris.

Réduction

Le test statistique utilisé sera le test l’ANOVA (test très généralement utilisé pour ces études). Le nombre d’animaux nécessaire par lot pour détecter 50% de différence interlots avec 50% d’écart type intra lots est de 10. Pour renforcer la puissance statistique de nos données, nous prévoyons de réaliser l’expérience deux fois. Si la dose d’utilisation d’une des drogues doit être réajusté, l’étude sera refaite une fois. Nous prévoyons d’utiliser 280 souris dans ce projet du fait que nous avons 7 groupes de 10 souris (7 conditions de traitements), que l’expérience sera refaite deux fois et que l’étude globale sera refaite une fois si la dose d’une drogue doit être réajustée. Nous allons bien sûr tout faire pour que les doses choisies des trois drogues soient les bonnes dès la première série d’analyses et que l’étude ne soit pas refaite, ce qui aurait comme conséquence une réduction de moitié du nombre de souris.

Raffinement

Concernant l’objectif de réduction de la souffrance, la douleur et l’angoisse infligées aux animaux. Les souris seront hébergées en animalerie A2, suivies quotidiennement pour détecter d’éventuels signes cliniques par du personnel qualifié. Ces animaux sont hébergés en cages de type 2L à raison de 5 souris par cage. Les conditions d’hébergements sont adaptées à la forte immunodépression de ces animaux : cages, nourritures et litières sont stérilisées. De plus, chaque cage reçoit un enrichissement du milieu en l’occurrence des nids de « woodwoll ». En ce qui concerne les données de comportement et de physiologie, l’estimation de la souffrance est réalisée par le personnel de l’animalerie. Les critères utilisés sont ceux définis par un chercheur référent en 1998. Le score limite est de 12. Au-delà, l’animal sera euthanasié sans attendre. En tenant compte de ces points limites adaptés et conformément à la directive européenne 2010/63 CE, nous proposons comme classement pour l’ensemble de nos procédures le degré modéré. Les critères prépondérants ainsi que les mesures conservatoires en fonction du score de cette grille sont détaillés dans les procédures.

Choix des espèces

1. La souche de souris NSG est appliquée dans la recherche sur le cancer en raison de sa capacité à développer le processus étudié du fait de sa forte immunodépression. 2. La capacité d’extrapoler les résultats. 3. L’expérience d’utilisation des chercheurs demandeurs. 4. L’existence des équipements nécessaires à l’étude. 5. La pertinence des installations de l’Animalerie. Les souris seront utilisées à l'âge adulte de 8 semaines à 12 semaines de vie. À cet âge la taille de la souris facilite la manipulation expérimentale et l’inoculation de cellules. Les souris seront utilisées à l'âge adulte de 8 semaines à 12 semaines de vie. À cet âge la taille de la souris facilite la manipulation expérimentale et l’inoculation de cellules. Les points limites adaptés pour le modèle de souris utilisé sont décrits dans l’annexe 1.

170 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Génétiquement modifiées pour développer un mélanome, elles reçoivent des injections intrapéritonéales jusqu'à trois fois par semaine et portent une tumeur dorsale qui peut s'ulcérer ou se nécroser. Le porteur étudie les mécanismes de résistance à une immunothérapie anti-PD1 et affirme que seul un modèle in vivo reproduit les interactions entre tumeur et système immunitaire. Toutes sont tuées faute d'entrer dans une nouvelle procédure.

Objectifs

Le mélanome métastatique est le cancer de la peau le plus agressif. Malgré l’essor récent des immunothérapies dans le traitement du mélanome, des problèmes de résistance sont observés. Identifier de nouveaux acteurs impliqués dans la résistance permettra de développer de nouvelles approches de combinaison thérapeutique. La plasticité des cellules cancéreuses, c’est-à-dire leur capacité à s’adapter notamment aux traitements anti-cancéreux, est régulée par un ensemble de facteurs dont l’expression est fréquemment dérégulée dans le mélanome. Les objectifs de ce projet sont d’étudier dans des modèles murins de mélanome, les caractéristiques des cellules tumorales et du microenvironnement immunitaire au cours du traitement par immunothérapie.

Bénéfices attendus

Le mélanome métastatique est le cancer de la peau le plus agressif. Malgré l’essor récent des immunothérapies dans le traitement du mélanome, des problèmes de résistance sont observés. Identifier de nouveaux acteurs impliqués dans la résistance permettra de développer de nouvelles approches de combinaison thérapeutique.

Procédures

Les animaux seront soumis à des niveaux de douleur modérés. Des injections en intra-péritonéal seront réalisées maximum 3 fois/semaine dans des zones différentes du péritoine.

Impact sur les animaux

Ces modèles de mélanomes n’étant pas métastatiques, les nuisances attendues sur les animaux sont l'apparition de tumeur localisée sur le dos mais qui n'entravera pas le déplacement de l'animal. Dans de rare cas, il peut y avoir apparition de plaie ou de nécrose au niveau de la tumeur.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort car ils ne rentreront pas dans une nouvelle procédure.

Remplacement

Seul un modèle in vivo chez l’animal peut permettre d’étudier les interactions complexes entre les cellules tumorales et les cellules immunitaires présentes au sein du stroma. En effet, les interactions entre les différentes cellules du système immunitaire et les cellules tumorales présentent un fort niveau de complexité qui ne peut être reproduit in vitro. De plus, l'efficacité de traitement par immunothérapies ne peut être évaluée in vitro. Pour cela, la souris est l’espèce animale la plus pertinente du fait de l’existence de modèles murins de mélanomes qui reproduisent la pathogenèse chez l’homme et les caractéristiques histologiques. En parallèle des analyses complémentaires seront réalisées in vitro dans des lignées de mélanome, et sur des prélèvements tumoraux de patients, permettant ainsi de réduire le nombre d’animaux utilisés.

Réduction

Le nombre maximal de souris utilisées dans ce projet (n=170) a été réduit au minimum nécessaire et suffisant pour obtenir des résultats statistiquement interprétables et reproductibles. Pour chacune des procédures expérimentales présentées, le nombre de souris par groupe a été défini a minima afin de permettre une analyse statistique des résultats adaptée selon le cas.

Raffinement

Une définition précise des points limites permettra de limiter au maximum toute souffrance animale. De plus, la bonne connaissance des modèles expérimentaux, le suivi adapté des points limites précoces et prédictifs et la manipulation des animaux sans stress par des personnes compétentes en expérimentation animale permettent de limiter au maximum toute douleur ou souffrance des souris. Nous évaluerons l'état de bien-être ou de souffrance des animaux au minimum 2x/semaine. L'environnement sera enrichi avec du coton cardé.

Choix des espèces

La souris est l’espèce animale la plus pertinente pour l’étude du mélanome. Bien qu'il existe certaines différences entre l'immunologie murine et humaine, d'innombrables découvertes chez la souris sont transposables chez l'homme. Les modèles murins de mélanome que nous utilisons représentent la majorité des mutations retrouvées chez l'Homme et miment bien la pathologie humaine. D'autre part, la richesse des réactifs disponibles (notamment immunothérapie) permet une compréhension très approfondie des phénomènes mis en jeu du niveau moléculaire au niveau de l'organisme, un atout déterminant dans notre projet.