Souris
Rôle des effets adverses périnataux dans la rupture de tolérance orale
- Protection de l’environnement
- Recherche appliquée
- Bien-être animal
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
8 640 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures déclarées légères malgré leur nombre. Elles subissent un stress de séparation maternelle, une exposition aux micro et nanoplastiques ou une infection intestinale à Cryptosporidium en période périnatale, puis jusqu'à 28 gavages et des injections sous-cutanées, pour étudier la rupture de tolérance alimentaire. Le porteur qualifie de modérées la diarrhée et la colite attendues, tout en classant l'ensemble en gravité légère. Il affirme que l'étude nécessite un "organisme intégré" qu'aucun modèle in vitro ne remplace.
Objectifs
Les objectifs de ce projet de recherche sont: 1- de caractériser si et comment des événements adverses en période périnatale (stress de séparation maternel (SSM), exposition aux micronano plastiques (MNPL) ou infection a Cryptosporidium parvum (CP)) ont des conséquences à long terme sur la tolérance orale (TO). La tolérance orale est l'absence de réponse immuniatire à un antigène du non soi (aliment par exemple) lorsque celui est administré par voie orale et non systémique. 2- identifier des marqueurs communs aux trois modèles prédictifs d'une rupture de la TO.
Bénéfices attendus
Ce Projet a pour but d’identifier des biomarqueurs de prédisposition aux ruptures de TO à partir de 3 modèles d’Evenements Adverses Perinataux i.e. un stress social, une exposition aux MNPL ou une infection intestinale. L’identification des mécanismes impliqués dans la rupture de TO devrait fournir des pistes pour le développement de stratégies préventives. Dans le projet, 2 stratégies préventives de rupture de TO seront testées, l’enrichissement de l’environnement et l’introduction tardive des potentiels allergènes alimentaires. Ce projet devrait permettre d’identifier des marqueurs précoces de prédiction de la perte de TO, et de fournir des preuves scientifiques pour 2 stratégies préventives.
Procédures
Gavages: les animaux subiront entre 1 et 28 gavages / animaux vigiles. Injection sous cutanées: les animaux subiront entre 1 et 2 injections sous cutanées / animaux vigiles.
Impact sur les animaux
Les nuisances ou effet indésirables attendus sur les animaux sont légers. Ces protocoles sont standards et ont été largement utilisés par la responsable de projet. La diarrhée et la colite attendue dans le protocole de challenge alimentaire sont modérés.
Devenir
Dans le but d'étudier les réponses humorales, cellulaires et intestinales les animaux seront euthanasiés à la fin des procédures.
Remplacement
La règle des 3R sera strictement respectée. Ce travail a pour but d’analyser les conséquences de 3 différents modèles d'effets adverses (infection ou facteurs environnementaux) survenus en période néonatale sur la TO. Cette étude nécessite donc de travailler sur un organisme intégré. L'étude de la tolérance orale ne peut être réalisée sans expérimentation animale. En effet, les études in vitro ne tiennent pas compte de la complexité des coopérations cellulaires.
Réduction
Du point de vue statistique, nous répéterons les expériences trois fois, et nous utiliserons des modèles statistiques mixtes qui tiennent compte à la fois des facteurs à effet fixe (exemple Infection, exposition aux MNPL ou stress de l’animal) et des facteurs à effet aléatoire (répétition des expériences).
Raffinement
Afin de suivre la directive européenne 2010/63/UE, des frisures de papier kraft seront rajoutés comme enrichissement aux animaux. . Selon la durée de l’étude, un deuxième enrichissement pourra être introduit dans l’environnement, tel que des aspen Brick, des tunnels en polycarbonate ou des igloos. Durant toute la période d’expérimentation, l’état général des animaux sera observé quotidiennement. Pour chaque procédure des points limites ont été définis pour limiter la douleur, la souffrance ou l’angoisse de l’animal sera euthanasié s’il présente un de ces points limites d’arrêt de la procédure (SBEA). Les animaux seront surveillés pendant toute la durée de l’expérimentation afin de détecter l’apparition d’éventuels comportements atypiques tels que : • altérations des fonctions normales (impossibilité d’uriner, de s’alimenter…), • vocalisation, tremblements …, • une perte de poids élevé (mais
Choix des espèces
Nous avons choisi de travailler sur un modèle murin car il existe une grande diversité d’outils chez cette espèce permettant l’étude de la réponse immunitaire et de la barrière intestinale. Nous travaillerons sur la lignée C3H/HeN car cette lignée est particulièrement sociable et les femelles portent une grande attention à leur descendance ce qui limite le cannibalisme des petits suite à leur manipulation par les expérimentateurs. La souris est un modèle préclinique largement utilisé pour les études des origines développementales de la santé et des maladies. Nos résultats pourront donc être plus facilement comparés avec la littérature existante. Les différents modèles de fragilisation (SSM, exposition aux MNPL ou CP) seront appliqués en période périnatale (voir procédures expérimentales). La réponse immunitaire et la barrière intestinale seront observées à PND15 et PND21. Les protocoles de Tolérance orale et Challenge alimentaire (voir procédure expérimentales) seront commencés à PND15 et les animaux euthanasiés à PND42 et PND36 respectivement.
Etude des lymphocytes T lors de la dermatite atopique et la marche atopique
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
402 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une dermatite atopique leur est provoquée par micropores au laser dans la peau puis application d'un allergène, une partie étant ensuite exposée à l'allergène par voie respiratoire pour déclencher une réaction de type asthme, et 104 recevant en plus de la toxine diphtérique pour détruire une sous-population de lymphocytes. Le porteur indique attendre une inflammation cutanée et pulmonaire légère et prévoit l'euthanasie selon des points limites. Il décrit la complexité de la réponse immunitaire comme rendant l'expérimentation in vivo nécessaire.
Objectifs
Les allergies (ou maladies atopiques), incluant la dermatite atopique (eczéma), l’asthme, la rhinite allergique et les allergies alimentaires sont des maladies inflammatoires complexes avec des caractéristiques communes, impliquant différents organes du corps. La dermatite atopique précède souvent le développement d’autres allergies, et sa sévérité aggrave le cours de l’allergie respiratoire. Cette évolution de la dermatite atopique vers d’autres maladies atopiques, et en particulier l’asthme, est appelée « marche atopique ». Une meilleure compréhension des mécanismes immunitaires impliqués dans la mise en place de la dermatite atopique est cruciale dans le but de développer de nouveaux traitements ou de nouvelles stratégies de prévention. Les lymphocytes T sont des cellules clés du système immunitaire permettant de se défendre contre les pathogènes. Cependant ces lymphocytes peuvent entraîner différentes maladies s’ils sont dérégulés, comme par exemple les allergies. Plus spécifiquement, deux sous-populations de lymphocytes T sont dérégulées dans la dermatite atopique et la marche atopique. Ces deux populations restent cependant mal définies à ce jour. C’est pourquoi nous nous intéressons au rôle et aux mécanismes impliqués dans la génération de ces populations de cellules immunitaires au cours de la dermatite atopique et de la marche atopique. Pour ce faire, nous utilisons un modèle mimant les caractéristiques de la dermatite atopique chez la souris. Dans ce modèle, nous utilisons une technologie permettant de générer des micropores dans la peau à l’aide d’un laser (technique également utilisée chez l’Homme dans la sphère médicale) puis nous appliquons un allergène sur la peau des souris. Cette étape engendre une dermatite atopique menant une sensibilisation de la souris à l’allergène. Pour étudier la marche atopique, nous appliquons ce même protocole pour induire la dermatite atopique, puis nous allons réexposer les souris à l’allergène au niveau des poumons, ce qui entrainera une réponse allergique similaire à un phénomène asthmatique. Ceci permettra d'étudier l'asthme.
Bénéfices attendus
Ce projet nous permettra de mieux comprendre la pathogenèse de la dermatite atopique et de la marche atopique. Plus précisément, ceci nous permettra de déterminer les signaux induisant les différentes populations de lymphocytes dérégulés dans ces maladies, ainsi que le rôle de ces cellules. Elucider le fonctionnement de ces cellules pourrait permettre d'identifier de nouvelles cibles thérapeutiques dans la dermatite atopique et la marche atopique. De plus, comprendre les signaux et cellules impliqués dans la génération des lymphocytes régulateurs pourrait permettre de trouver un traitement pour booster leur production et leur fonctionnement, ceux-ci ayant normalement pour rôle de contrôler les réponses immunitaires et donc par exemple les réponses allergiques.
Procédures
Pour étudier la dermatite atopique, 252 animaux seront anesthésiés au jour 0 pour la sensibilisation à un allergène au niveau de l'oreille (durée de la procédure : 20 minutes). Cette procédure est effectuée deux fois par semaine pendant deux semaines (durée totale de la procédure : 4x20 minutes = 1h20). Parmi ces 252 animaux, 74 seront également injectés avec de la toxine diphtérique (durée de la procédure : 10 secondes) pour éliminer une sous population de lymphocytes dans le but de déterminer leur rôle dans la dermatite atopique. Le nombre et les dates d'injections seront déterminé dans une expérience pilote. Tous les animaux seront euthanasiés au jour 13 pour collecter les différents organes pour analyses. Pour étudier la marche atopique, 150 animaux seront anesthésiés au jour 0 pour la sensibilisation à un allergène au niveau de l'oreille (durée de la procédure : 20 minutes). Cette procédure est effectuée deux fois par semaine pendant deux semaines (durée totale de la procédure : 4x20 minutes = 1h20). Ces animaux seront ensuite exposés à l'allergène au niveau des voies respiratoires (durée de la procédure : 30 minutes). Cette procédure est effectuée tous les jours du jour 9 au jour 12 (durée totale de la procédure : 4x30 minutes = 2 heures). De plus, les fluides bronchoalvéolaires seront collectés (procédure sans réveil) au jour 13 pour étudier l'inflammation des poumons. Parmi ces 150 animaux, 30 seront également injectés avec de la toxine diphtérique (durée de la procédure : 10 secondes) pour éliminer une sous population de lymphocytes dans le but de déterminer leur rôle dans la marche atopique. Le nombre et les dates d'injections seront déterminé dans une expérience pilote.
Impact sur les animaux
La sensibilisation à l'allergène au niveau de l'oreille des animaux conduira à une légère inflammation de type dermatite atopique sur l'oreille, se traduisant par une rougeur. Par le passé, nous n'avons pas observé d'autres effets avec ce traitement. De plus, nous avons déjà fait des injections de toxine diphtérique sur d'autres modèles, et n'avons observé aucun changement de comportement de la part des animaux traités, cependant une rougeur pourrait survenir au point d'injection. Les animaux traités par instillations intranasales d'allergène développeront une légère inflammation des poumons. Tous les animaux seront surveillés et tout effet indésirable sera traité selon les points limites énoncés dans le but de limiter la souffrance des animaux.
Devenir
Après la procédure "Modèle de dermatite atopique" et "Modèle de dermatite atopique + injection de toxine diphtérique" , les 178 et 74 animaux (respectivement) seront euthanasiés selon la procédure autorisée pour étudier les ganglions lymphatiques et la peau. Le dernier jour de la procédure "Modèle de marche atopique" et "Modèle de marche atopique + injection de toxine diphtérique", les 120 et 30 animaux (respectivement) seront euthanasiés pour analyser les voies respiratoires.
Remplacement
L'étude de la réponse immunitaire, et en particulier au cours de la dermatite atopique et la marche atopique, met en jeu différents organes et réseaux impliquant plusieurs types cellulaires. Cette complexité rend nécessaire l'utilisation d'expériences in vivo pour comprendre cette réponse immunitaire et le rôle de chaque cellule impliquée.
Réduction
Ce protocole sera appliqué à un maximum de 402 souris, permettant de caractériser le rôle des lymphocytes Treg et Tfh dans les allergies, et en particulier au cours de la dermatite atopique et la marche atopique. Selon les expériences, les groupes comporterons 8 souris (modèle de dermatite atopique) ou 15 souris (modèle de marche atopique), ce qui permettra d'avoir des résultats statistiquement interprétables pour les différents paramètres étudiés, à l'aide d'un test de Student (t-test). Dans la partie 4 du projet, dans un but de réduction, l'oreille droite et l'oreille gauche des souris seront traitées différement et seront comparées entre elles. Trois études pilotes seront effectuées lors de ce projet, avec un nombre réduit d'animaux, dans le but de déterminer 1) l'allergène le plus approprié, 2) quand commencer les injections de DT en fonction de l'apparition des lymphocytes Tfh, 3) quand faire les injections de DT et leur nombre.
Raffinement
Les animaux seront gardés en groupe dans leur cage pour préserver les interactions sociales. La sensibilisation est réalisée sous anesthésie gazeuse pour limiter la souffrance / stress des animaux. Après ces traitements, les animaux seront placés sur une plaque chauffante et surveillés jusqu'à leur réveil. Tout au long du protocole, les animaux seront surveillés de manière visuelle avec un suivi de l'aspect général des animaux (et en particulier des oreilles), de leur posture et de leur comportement. Une grille d'évaluation de la douleur sera utilisée. Si celle-ci est importante, ils seront retirés de l'étude et pourront bénéficier de soins. Si le cas est plus grave, les animaux seront euthanasiés.
Choix des espèces
La souris est le modèle choisi pour étudier la dermatite atopique et la marche atopique car le système immunitaire des souris est proche de celui de l'Homme avec une immunité innée mais également une immunité adaptative, ce qui permet l'étude de la réponse immunitaire spécifique d'un allergène et de la réponse mémoire. De plus, la peau des souris présente des similitudes (épiderme, derme, présence de cellules immunitaires) avec la peau humaine, rendant ce modèle pertinent pour l'étude de la sensibilisation cutanée. Les animaux seront utilisés à partir de 8 semaines de vie afin d'étudier le système immunitaire à l'âge adulte.
Caractérisation et traitement de l’inflammation intestinale dans un modèle murin de Sclérose En Plaques
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
730 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Deux modèles de sclérose en plaques leur sont induits par injections d'un cocktail pro-inflammatoire et de toxine pertussique, avec pose d'un cathéter pour l'imagerie, provoquant une perte de mobilité et des poussées de paralysie sur plusieurs semaines. Le porteur prévoit une mise à mort si la perte de poids dépasse 20 % ou si le score de douleur reste élevé. Il affirme que les expériences in vivo ne peuvent pas être totalement remplacées par des études in vitro et parle de "stricte nécessité".
Objectifs
Nous utiliserons l'imagerie ciblée à l'aide de molécules spécifiques pour visualiser l'inflammation intestinale dans deux modèles de sclérose en plaques. Il s'agit d'un modèle progressif et d'un modèle avec une phase de rémission et une autre phase de récurrence. Pour chacun de ces deux modèles deux objectifs sont prévus : mesurer l’évolution de l’inflammation intestinale au cours de la maladie ainsi que de savoir si une inflammation intestinale apparait avant l’apparition des symptômes moteurs et/ou avant une rechute de la pathologie (réapparition des symptômes après une période de rémission), et si, le cas échéant, une telle inflammation est prédictive d’une déclaration, d’une rechute imminente de la pathologie et/ou de sa sévérité.
Bénéfices attendus
Ce projet a pour but d’approfondir nos connaissances sur le lien entre l’inflammation intestinale et la sclérose en plaques. Ce projet vise également à développer de nouvelles méthodes de diagnostic (imagerie) et de thérapeutique (traitement de l’inflammation intestinale) dans la sclérose en plaques.
Procédures
Injections s.c. à J0 de 50 µl au niveau de chaque hanche et de chaque épaule (soit 200 μl au total pour l’animal) : durée 20 secondes par injection, moins de 2 minutes pour tout + Injection i.p. à J0 et à J2 de toxine pertussique (200ng dans un volume final de 200 µl) 30 secondes en tout à chaque injection. Pose d'un cathéter veineux à la veine caudale pour l'imagerie et injection du contraste (200 µL au total) 5 minutes en tout. Suivi du score neurologique : observation pendant 5 minutes environ et pesées : 30 secondes en tout à chaque pesée après une habituation de quelques minutes une fois la cage déplacée à proximité de la balance.
Impact sur les animaux
Ce projet, sur la sclérose en plaques utilisera deux modèles chez la souris : un modèle progressif et un autre récurrent-intermittant. Des injections seront nécessaires ainsi que la pose d'un cathéter pour l'imagerie. Les animaux auront des injections d'un cocktail pro-inflammatoire qui provoquera une inflammation intestinale suivie en imagerie en plus que les symptomes moteurs. Le temps nécessaire entre le début du projet et l'imagerie est de 12-20 jours pour le modèle progressif et jusqu'à 40 jours pour le modèle récurrent intermittant (le scoring identifiera ce point). Pour le premier modèle, des signes cliniques de la sclérose apparaitront au bout de 8-10 jours et comprendront une perte de la mobilité. Pour le deuxième modèle, les signes cliniques apparaitront au bout de 10-15 jours pour la première poussée, une phase de rémission autour de 15-30 jours avec une deuxième poussée vers 30-40 jours.
Devenir
Procédure 1 : animaux mis à mort et tissus récupérés. Procédure 2 : animaux mis à mort et tissus récupérés. Procédure 3: tous les animaux inclus dans cette procédure seront gardés en vie à la fin afin d’évaluer les effets thérapeutiques des injections des anticorps monoclonaux. La mise à mort sera réalisée aux temps prévus par les procédures 1 et 2.
Remplacement
Ces études seront réalisées en parallèle avec des études in vitro (modèle de barrière hématoencéphalique, modèle de barrière intestinale, culture de cellules immunitaires). La réalisation de ces expériences in vitro est de nature à réduire le nombre d’animaux utilisés dans les procédures d’expérimentation décrites dans ce projet. Toutefois, les expériences in vivo ne peuvent pas être totalement remplacées par des études in vitro pour la bonne réussite de ce projet. En effet, des études dans des modèles animaux intégrés sont nécessaires pour la validation des données obtenues in vitro et pour la future translation à la santé humaine. Ainsi, les procédures expérimentales décrites dans ce projet ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information.
Réduction
Nous ne possédons pas assez de données pour réaliser une analyse de puissance. Le nombre d’animaux utilisés dans ce projet a été évalué au regard de nos données antérieures et de la littérature disponible. Les tests statistiques utilisés comprendront des tests non-paramétriques (test de Kruskall-Wallis suivi d’un test de Mann-Whitney), des tests paramétriques (ANOVA à mesures répétées suivi d’un test de Bonferroni, et tests de Student appariés et non appariés), des tests de régression linéaire ainsi que des tests de Gehan-Breslow-Wilcoxon. Dans chaque phase du projet, le minimum d'animaux a été prévu afin d'arriver à des résultats qui puissent suivre ces tests statistiques.
Raffinement
Un score clinique neurologique sera effectué tous les jours (dès le 1er jour jusqu’au jour de la mise à mort) afin d’évaluer la douleur et l’atteinte neurologique des souris. Les animaux seront également pesés tous les jours pour surveillance du poids et mis à mort si une perte de poids de plus de 20% est observée par rapport au poids initial et/ou si un score sur l’échelle de la douleur (grimace scale) est supérieur à 7 pendant les 48h critiques au modèle. Tout le matériel utilisé dans cette procédure expérimentale est neuf (pour les consommables, comme les seringues et aiguilles) ou soigneusement nettoyé et désinfecté pour les réutilisables (pinces métalliques). Afin de prévenir toute douleur occasionnée par l’injection sous-cutanée du cocktail de protéines et par l’injection intra-péritonéale de la solution de toxine pertussique, une anesthésie générale gazeuse de courte durée sera réalisée (oxygène/protoxyde d’azote 30%/70% + 2.5 % d’Isoflurane) et un patch de Lidocaïne sera posé sur le dos et sur le ventre de l’animal 1h avant les injections. Une application de Lidocaïne par spray sera également réalisée quotidiennement au niveau de chaque point d’injection, du 1er jour de l’induction jusqu’au 5e jour après celle-ci (soit par l’animalier, soit par l’expérimentateur). Les animaux ne présentant pas de signe d’arrêt (voir plus loin : points limites) seront mis à mort 40 jours après l’induction de la maladie. Afin de faciliter l’accès à la nourriture et à la boisson lors des atteintes cliniques neurologiques sévères, une boite de pétri rempli de croquettes humidifiés est déposée dans la cage même et ceci dès le premier jour de l’induction du modèle. Un anesthésique gazeux sera utilisé qui permet une récupération rapide des animaux (isoflurane) et une analgésie est prévue (lidocaine en application locale et buprénorphine en s.c.).
Choix des espèces
La souris (Mus musculus) est l’espèce animale qui a été la plus utilisée pour étudier les mécanismes physiopathologiques de la SEP, grâce à différents modèles bien caractérisés. Elle constitue également une espèce très étudiée dans le domaine de l’inflammation intestinale. L’anatomie de l’intestin et du système nerveux murin ainsi que la physiologie de la souris (notamment en ce qui concerne la barrière intestinale, la barrière hémato-encéphalique et le système immunitaire) sont également bien connues et sont proches de celles de l’homme, ce qui fait des modèles utilisés dans ce projet des approches expérimentales fiables de la pathologie humaine de l’inflammation. Enfin, il n’existe pas de modèle fiable utilisant des vertébrés moins sensibles ou des invertébrés, compte tenu de leur anatomie et de leur physiologie très différentes de l’homme. Les souris utilisées auront 6-7 semaines. En effet, la SEP est une pathologie qui survient principalement dans une population jeune (entre 25 et 35 ans majoritairement).
Etude de l’effet neuroréparateur de la stimulation du nerf vague dans un modèle d’AVC chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
277 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue puisque leur cerveau est prélevé, la plupart sous anesthésie sans réveil et 25 en gravité modérée. Une microchirurgie provoque une ischémie du cortex et pose une électrode autour du nerf vague, les animaux étant gardés jusqu'à 28 jours avec des tests sensori-moteurs quotidiens puis un enregistrement électrophysiologique sous anesthésie. Le porteur affirme que la stimulation du nerf vague est indolore et que le seuil des points limites n'a jamais été franchi lors de projets antérieurs. Il décrit les procédures comme d'une "stricte nécessité" ne pouvant être remplacées par des méthodes in vitro ou in silico.
Objectifs
A ce jour, il n’existe pas de solution thérapeutique capable de protéger ou réparer le système nerveux central après un accident vasculaire cérébral (AVC). Plusieurs laboratoires, dont le nôtre, ont démontré que la récupération fonctionnelle est freinée par un excès d’inhibition par le GABA, un neurotransmetteur inhibiteur, au sein des territoires adjacents à la lésion cérébrale et que la réduction de cet excès d’inhibition favorise la plasticité cérébrale, c'est à dire la formation de nouvelles connexions neuronales, ainsi que la récupération sensori-motrice. La stimulation du nerf vague (SNV) favorise cette récupération, mais son mécanisme d’action reste à démontrer. Ce projet s’inscrit dans la thématique du laboratoire.
Bénéfices attendus
L'objectif est de valider l'hypothèse que la SNV permet d'amplifier l'activité du cortex cérébral lors de la phase de réparation après un AVC expérimental, et ainsi d'améliorer la récupération des fonctions sensori-motrices perdues avec l'AVC.
Procédures
Quatre procédures sont prévues dans cette demande. Ces 4 procédures seront réalisées, (avec des modalités différentes, clairement explicitées dans les paragraphes concernés) pour tous les animaux. A savoir : 1. une microchirurgie permettant de réaliser une ischémie du cortex cérébral ainsi que d'équiper l'animal avec une électrode de stimulation du nerf vague. Les animaux seront maintenus en vie 28 jours au maximum. La chirurgie durera environ 1h. Les performances motrices de l’animal seront sensiblement diminuées pendant les 48h suivant l’intervention, après quoi son état s’amméliorera de jour en jour grâce à la récupération sensori-motice. 2. des tests d'évaluation des capacités sensori-motrices. L'animal sera soumis aux tests sensori-moteurs pendant une quinzaine de minutes par jour de tests. 3. La stimulation du nerf vague (SNV) indolore et sans effet inconfortable pour l'animal sera pratiquée pendant la tâche comportementale ou alors sous anesthésie générale (30 min). 4. L'enregistrement électrophysiologique (2 h) sera pratiqué exclusivement sous anesthésie générale.
Impact sur les animaux
Nuisances : - La microchirurgie au niveau du crâne et la suture de la peau à ce niveau entraînera une plaie sur 1 cm, qui sera traitée. - L'occlusion d'une branche de l'artère cérébrale induira une déficit partiel de la force musculaire du côté opposé à la lésion, le plus souvent réversible au cours des 3 semaines qui suivent. - La pose de l'électrode autour du nerf vague et la suture de la peau à ce niveau (cou) entraînera une plaie sur 1,5 cm qui sera traitée (résorption en quelques jours). Les muscles et les organes ne seront pas endommagés. Au total, notre expérience de plusieurs années sur ce modèle modéré d'AVC montre que les animaux supportent ces procédures sans complication et sans manifester une douleur ou une détresse que nous ne puissions traiter. - La stimulation du nerf vague, à l'intensité choisie, n'entraîne pas d'inconfort, de douleur ou de perturbation métabolique ou physiologique nuisible. Tout au contraire, il s'agit d'une stimulation employée chez l'animal et chez l'homme pour réduire les symptômes de dépression, pour limiter l'épilepsie ou pour inhiber la douleur. Le retour sur les précédant projets autorisés utilisant ces mêmes procédures ont montré que le seuil des points limites n'a jamais été franchi. Nous sommes donc confiant que le présent projet n'occasionnera pas d'effet inattendus.
Devenir
Le cerveau de tous les animaux utilisés dans ce projet sera prélevé pour des exploitations histologiques (analyses histopathologique et immunohistochimique).
Remplacement
Ce projet permettra d’analyser un mécanisme physiologique hautement intégré qui ne peut pas être reproduit de manière satisfaisante par des expériences in vitro ou in silico. Les paramètres physiologiques concernés n'existent que dans la situation "in vivo''. Les procédures expérimentales décrites dans ce projet ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales.
Réduction
Ce projet s’efforce de réduire le nombre d’animaux au strict nécessaire pour que l’étude soit concluante (277 souris mâles adultes), en collectant le maximum d’observations au cours d’une même expérience. Le nombre d’animaux nécessaire a été évalué selon la sensibilité et la spécificité des procédures utilisées, en fonction de l’expérience acquise lors de nos précédentes études et de la littérature en vigueur. L’utilisation d'un modèle d'AVC modéré génère une lésion uniquement corticale de quelques millimètres cube (7 en moyenne) ce qui n’occasionne pas de handicap lourd chez les animaux ni de mortalité, permettant ainsi d’optimiser le bien-être des animaux et de réduire le nombre d’animaux.
Raffinement
Concernant le critère de raffinement, les souris seront systématiquement anesthésiées lors des procédures invasives. Seul du personnel qualifié se chargera de réaliser les expériences, en respectant les règles de bonnes pratiques de laboratoire pour le respect des animaux. Des points limites sont définis au préalable. Tout au long du projet, du personnel qualifié veillera au bien-être des animaux bi-quotidiennement 5j/7 et quotidiennement pendant les week-ends et jours fériés. Les animaux seront hébergés dans des cages standards répondant aux normes européennes actuellement en vigueur (Directive 2010/63/UE). Pour limiter le stress des animaux, les cages seront isolées dans une pièce dédiée, à l'abri du bruit extérieur. Les animaux auront accès à l’eau et la nourriture ad libitum et ils seront sous surveillance constante après le déclenchement de l’AVC expérimental.
Choix des espèces
La souris (mus musculus) est le mammifère non primate le plus proche (phylogénétiquement) de l’Homme : son degré d’homologie avec l’Homme est donc très élevé. De fait, la souris est l’animal le plus couramment utilisé pour modéliser l’ischémie cérébrale et le niveau de connaissance en physiopathologie est très avancé. L’anatomie du système nerveux central et la physiologie vasculaire assez similaire à celle de l’Homme en font un très bon modèle pour cette pathologie. Réaliser ces expériences chez un animal non-mammifère (autres groupes de vertébrés ou invertébrés) ne permettrait pas d’obtenir des données aussi pertinentes et exploitables par la communauté scientifique et médicale. Les animaux seront âgés de 8-15 semaines en début du protocole, ce qui correspond à la maturité cérébrale adulte. Nous effectuerons notre modèle sur des adultes pour comparer les données obtenues avec la majorité des données déjà disponibles sur les modèles d’AVC. De plus, chez l’Homme, les AVC surviennent très majoritairement chez l’adulte.
Evaluation de l’entrée dans le cerveau de protéines et de nanobodies d’intérêt thérapeutique délivrés par un nanobody cargo par imagerie PET
- Recherche fondamentale
- Oncologie
480 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures classées légères, dont 240 génétiquement modifiées pour être dépourvues d'un récepteur du cerveau. Chaque animal reçoit une injection dans le ventre puis passe une imagerie PET/CT sous anesthésie, pour évaluer l'entrée dans le cerveau de petits anticorps issus de lama. Elles sont ensuite tuées par dislocation cervicale ou au dioxyde de carbone. Le porteur affirme, en s'appuyant sur des travaux de collaborateurs, une douleur "non supérieure à celle produite par l'introduction d'une aiguille", et conclut que le recours à l'animal est "inévitable".
Objectifs
Les anticorps constituent des outils thérapeutiques à fort potentiel. Dans le cas des maladies du cerveau, leur développement est malheureusement limité du fait des barrières physiologiques qui protègent l'organe. Ces barrières, notamment la barrière hémato-encéphalique, limitent le passage de molécules du sang vers les tissus cérébraux, et inversement. Franchir ces obstacles permettrait aux biomolécules d'intérêt thérapeutique (protéines tels que des anticorps ou peptides (d'atteindre leurs cibles et d'offrir aux patients de nouvelles approches thérapeutiques. Des anticorps de lama, qui ont la caractéristique d'^tre de petite taille (appelés nanobodies) et spécifiques des récepteurs de messagers chimiques dans le cerveau (le glutamate et l'acide gamma-aminobutyrique, dit GABA) ont été produits au laboratoire. Ils reconnaissent différentes cibles potentielles dans le cadre de plusieurs maladies du cerveau. Nous avons observé que certains de ces petits anticorps sont capables d'entrer dans le cerveau et donc de franchir ces barrières physiologiques. Toutefois, la majorité de ces nanobodies n'a pas été testée in vivo. De ce fait, nous ne savons pas si cette capacité à pénétrer le tissu cérébral est propre à ces quelques nanobodies, ou commune à nombre d'entre eux. Les objectifs de ce projet sont 1) de comprendre leur mécanisme d'entrée dans le cerveau et 2) d'utiliser un des ces petits anticorps comme transporteur pour apporter au niveau cérébral d'autres nanobodies thérapeutiques. Ce projet sera mené conformément à l'application de la règle des 3R.
Bénéfices attendus
Ce projet enrichira nos connaissances sur l'entrée des petits anticorps (nanobodies) dans le cerveau. Il nous permettra également d'évaluer leur utilisation pour administrer des nanobodies thérapeutiques dans cet organe. En perspective, notre nanobody vecteur pourrait servir d'outil pour administrer différentes protéines thérapeutiques ou diagnostiques dans le cerveau.
Procédures
Au cours de la procédure expérimentale, les animaux seront soumis à : - Une injection unique de nanobody par voie intrapéritonéale (durée 2-3 secondes, injection sur la droite de l’abdomen afin d’éviter une injection dans le caecum) à la concentration de 10 mg/kg, soit de 100 à 300µl en fonction de la concentration des nanobodies. Ces injections seront réalisées par du personnel compétent et qualifié. - Une analyse par imagerie PET/CT (30 minutes maximum) sera réalisée à l’aide de nanobodies radiomarqués. De très nombreuses expériences permettent de démontrer que ces radio-traceurs n’influent aucunement sur le bien-être des souris. - L’analyse sera réalisée sous anesthésie gazeuse de la souris (4% isoflurane) avant installation dans le lit de l’imageur PET/CT. La souris sera maintenue endormie avec 2% d’isoflurane pendant le temps de l’imagerie, qui n’excède pas 30 minutes. Le lit de l’imageur est chauffé à 37°C et les yeux de la souris sont protégés avec de l’Ocrygel. - Durant la phase de réveil, la souris sera transférée dans une cage placée sous une lampe chauffante où elle sera surveillée jusqu’à son complet réveil. La souris sera ensuite replacée dans sa cage initiale. - Plusieurs temps d’analyses seront étudiés pour suivre le passage de barrière hémato-encéphalique par les nanobodies : ainsi chaque souris du projet sera analysée par PET/CT à 1h, 4h, 24h, 72h. Toutefois, ces temps pourront être modifiés en fonction des premiers tests. Les animaux seront sacrifiés à la fin de l’expérimentation.
Impact sur les animaux
De précédentes données obtenues via des études sur des souris par des collaborateurs ont montré qu’un traitement aigu avec les nanobodies dirigés contre le récepteur mGluX n’engendrait pas de signe de toxicité ni de souffrance chez l’animal*. *Douleur non supérieure à celle produite par l’introduction d’ une aiguille.
Devenir
Mise à mort par dislocation cervicale ou insufflation progressive de CO2.
Remplacement
Remplacement : Le remplacement de l’animal n’est pas possible pour cette étude. Des données préliminaires montrent une importante accumulation des petits anticorps dans une région où la barrière physiologique cérébrale (barrière hémato-encéphalique), qui est la principale barrière s’opposant à la pénétration des molécules dans le cerveau, est modifiée. Nos données in vitro suggèrent que les anticorps de petite taille (nanobodies) déclenchent un mécanisme particulier faisant intervenir de manière indispensable leur cible mGluX pour passer la barrière physiologique. Un modèle isolé de barrière hémato-encéphalique ne permet pas de représenter exhaustivement les potentielles voies d’entrée dans le cerveau et toute la complexité de cet organe. De plus, il n’existe aucun modèle de la région particulière qui semble impliquée dans le passage des nanobodies. Ainsi, étudier le passage de ces nanobodies in vitro ne pourrait apporter de preuves irréfutables confirmant ou infirmant leur propriété de pénétration dans le cerveau. Le recours à l’animal est donc inévitable.
Réduction
Réduction : l’étude sera réalisée sur un total de 480 souris (240 souris sauvages et 240 souris déficientes en récepteur mGluX ( appelées mGluX KO)). Nos résultats préliminaires ne permettent pas de prédire leur efficacité d’entrée. Le nombre d’animaux utilisés pour pouvoir tester l’ensemble des petits anticorps thérapeutiques que nous voulons tester a été réduit au minimum pour obtenir des données pertinentes d’un point de vue statistique.
Raffinement
Raffinement : cette étude impliquera l’utilisation d’une lignée de souris génétiquement modifiées, déficientes en récepteur mGluX, dont le phénotype n’est pas dommageable. Tous les animaux de cette étude seront placés dans un milieu enrichi, avec un accès à l’eau et à la nourriture à volonté, sous surveillance quotidienne. Les données obtenues par nos précédents collaborateurs suite à un traitement aigu avec les petites molécules dirigées contre mGluX ne montrent pas de signe de souffrance supérieure à celle engendrée par l’introduction d’une aiguille. L’observation d’anomalies chez les animaux dans le cadre de leur suivi quotidien sera reportée sur une fiche de suivi clinique (Annexe I), mise en place par la SBEA. Cette grille de scoring ne nécessite pas de personnalisation particulière car elle tient compte de tous les éventuels points critiques de notre expérience. Les points limites retenus seront donc : - Une perte de poids > 20% du poids initial ; - L’infection au site d’injection ; - L’état général des souris à leur réveil après l’anesthésie à l’isoflurane. Nous surveillerons plus précisément leurs comportements tels que l’hypo ou hyperactivité ; le mode de déplacement ou leur respiration (annexe 1).
Choix des espèces
Les anticorps de petite taille (nanobodies) utilisés dans le cadre de ce projet reconnaissent des cibles (récepteurs) murines. Le choix de l'espèce Mus musculus et du caractère sauvage de la souche de souris utilisée nommée mGluX WT permettra d'évaluer le passage des molécules via une barrière hémato-encéphalique intègre. Les souris mGluX KO seront elles, utiles pour évaluer le rôle crucial que jouerait le récepteur mGluX dans ce transport. Les souris seront traitées à partir de 5 semaines d'âge correspondant à l'âge adulte auquel la formation de la barrière hémato-encéphalique est complètement achevée. Les souris seront acceuillies à l'âge de 4 semaines et seront hébergées pendant une semaine avant le début de l'étude, pour permettre leur bonne acclimation.
Conséquence de l’inhibiton des neutrophiles pro-inflammatoires sur la destruction parodontale dans un modèle de parodontite expérimentale chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
36 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Sous anesthésie, une ligature imprégnée de la bactérie Porphyromonas gingivalis est posée autour d'une dent et renouvelée tous les trois jours pendant 28 jours, pour provoquer une parodontite, suivie d'injections d'une molécule anti-inflammatoire. Toutes sont ensuite tuées par ponction du sang dans le cœur pour prélever les tissus. Le porteur affirme n'observer aucune modification de l'état de santé des souris et présente cette espèce comme la plus utilisée pour l'étude de cette maladie.
Objectifs
La parodontite est une maladie inflammatoire chronique très fréquente (47% de la population adulte américaine). Elle entraine une destruction des tissus de soutien des dents, générant des édentements précoces et une difficulté à la réhabilitation orale. Elle est déclenchée par un déséquilibre du microbiote (plaque dentaire) avec une infection par la bactérie Porphyromonas gingivalis. Les parodontites sont une source chronique de passage de bactéries dans le sang et d'une inflammation généralisée de faible intensité, favorisant des maladies inflammatoires à distance (ex : maladies cardiovasculaires). Il n'existe pas de cibles thérapeutiques de l'inflammation pour le traitement des parodontites, ni de biomarqueurs pour évaluer précocement et mieux suivre des malades, notamment ceux atteints d'autres maladies inflammatoires chroniques. Les neutrophiles sont les leucocytes les plus abondants dans les lésions parodontales et semblent clés dans le développement des parodontites. Récemment, il apparait qu’il existe des sous types de neutrophiles aux fonctions pro-inflammatoires ou pro-résolutives de l'inflammation. Certaines drogues sont des inhibiteurs d'un facteur de la survie et l’activation du neutrophile, et permettent d’inhiber spécifiquement les neutrophiles pro-inflammatoires. Notre objectif est de déterminer si l’inhibition des neutrophiles pro-inflammatoires par administration d’une telle drogue permet de diminuer l’inflammation et la résorption osseuse dans un modèle de parodontite expérimentale chez la souris. La parodontite sera induite pendant 4 semaines, selon un protocole validé dans la littérature et maitrisé par notre équipe. Nous caractériserons la destruction du parodonte chez des souris injectées par cette drogue en comparaison de souris injectées avec l’adjuvant de la drogue et de souris contrôle (injectées avec un tampon neutre).
Bénéfices attendus
Notre projet est le premier à tester les conséquences d’une inhibition ciblée des neutrophiles pro inflammatoires par la drogue dans la pathogénie de la parodontite. Il pourrait ouvrir sur des pistes thérapeutiques régulant l’inflammation de la parodontite pour laquelle plus de 30% des situations échappent au traitement conventionnel (traitement qui repose actuellement exclusivement sur le contrôle de l’infection). De plus, une modification par lune drogue ciblant des neutrophiles circulants primés (activés) par l’inflammation parodontale et qui peuvent influer sur des processus pathogéniques à distance, tels que l’athérosclérose, sera recherchée et serait très prometteuse en prévention des comorbidités de la parodontite. Enfin, la parodontite est un modèle parfait de maladies inflammatoires choniques au cours de laquelle la régulation des neutrophiles est primordiale. Elle partage des mécanismes pathogéniques communs avec, par exemple, les maladies inflammatoires chroniques de l’intestin ou la polyarthrite rhumatoïde : les résultats de ces travaux permetteraient donc d’ouvrir des perspectives dans l’étude de la pathogénie et de stratégies thérapeutiques d’autres maladies inflammatoires chroniques.
Procédures
Avant chaque expérimentation, les souris sont anesthésiées par une anesthésie générale par voie intra-péritonéale (IP) de Kétamine 100mg/kg-Xylazine 10mg/kg en solution injectable dans du sérum physiologique. L'intervention chirurgicale sera effectuée selon une procédure qui dure environ 10 min/souris. La procédure consiste en la pose répétée d’une suture de soie chirurgicale 6-0 imprégnée d’une solution de 109 CFU/mL de P gingivalis. Après chaque pose de ligature, les souris sont placées dans un environnement chauffé (tapis) et surveillées jusqu’à leur réveil. Cette procédure est répétée tous les 3 jours pendant 28 jours pour induire une inflammation chronique locale et une destruction du parodonte. Entre chaque renouvellement, les souris seront maintenues dans des cages dans un environnement enrichi avec nourriture et eau ad libidum. Au bout de 14 jours ; une destruction parodontale peut etre observée du coté ligature +/- P gingivalis pour tous les animaux. A 14 jours, les groupes recevront des injections de la solution diluante ou de la drogue pendant les 14 jours suivants, en parallèle de la poursuite du modèle de parodontite expérimental. Les groupes contrôles recevront un volume équivalent d’une solution neutre.
Impact sur les animaux
Notre expérience ne nous montre aucune modification observable de l’état de santé des souris suite à la réalisation des anesthésies par isoflurane et examen radiologique de précision micro-Computed Tomography (micro-CT), comme suite aux anesthésies générales et pose de ligature : aucune de perte de poids, de modifications comportementales, ni de modifications de l’apparence physique pour les animaux contrôles comme pour les animaux injectés avec la solution diuante n’ont été observées. Une prise de poids en accord avec les conditions d’élevage est observée démontrant que les souris se nourrissent correctement. La dose de drogue administrée est évaluée en accord avec la littérature scientifique). Une vigilance accrue sera mise en place pour les groupes d’animaux traités avec cette drogue.
Devenir
A l'issue de la procédure,tous les animaux sont mis à mort par exsanguination cardiaque sous anesthésie et analgésie profonde, permettant le prélèvement des tissus nécessaires à nos travaux.
Remplacement
Nous développons une recherche sur modèle expérimental chez le petit animal, car c'est le seul moyen à l'heure actuelle d’étudier les différents aspects de notre projet, c’est-à-dire analyser l’inflammation du tissu parodontal complexe. Il n’existe pas d’autres méthodes alternatives (in vitro, in silico) pour l’étude des parodontites, et la souris est l’espèce la plus couramment utilisée pour l’étude de cette maladie.
Réduction
Une publication sur la comparaison des modèles de parodontite expérimentale avec ligature +/- P gingivalis chez la souris montre une différence significative sur la perte osseuse et l'inflammation parodontale avec 5 souris/groupes (test statistique d’analyse de variance Turkey suivi d’un test t de Student). Le suivi longitudinal par micro- CT sur souris vivante de la perte osseuse induite nous permet aussi de rationaliser le nombre de souris. Une souris supplémentaire par groupe est prévue en cas de mort prématurée au cours de l’expérimentation. Le nombre d’animaux estimé et les tests statistiques sont également basés sur notre expérience pour ce type d’étude. Ce nombre minimum nous permettra d’être certains de répondre aux questions scientifiques de ce projet et de mettre en évidence des différences significatives entre les groupes.
Raffinement
La procédure ne conduit pas à des altérations évidentes des souris. Le suivi quotidien des animaux et la mise en place de points limites permettront d’identifier et de limiter toute souffrance et douleur, d’abord par des antalgiques et par une mise à mort anticipée selon les méthodes réglementaires, si nécessaire. Les animaux seront hébergés en groupe en milieu enrichi pour minimiser leur stress.
Choix des espèces
La souris est l’espèce la plus couramment utilisée pour l’étude de la parodontite et tout particulièrement pour l’approche moléculaire et histologique. De nombreux outils d’analyses, qu'ils soient commerciaux ou dans notre laboratoire, sont développés et adaptés à ce modèle. 3 mois – âge adulte avec croissance des maxillaires achevée
Délivrance d’une chimiothérapie par sonoporation dans un modèle murin de cancer colorectal sous-cutané et métastasique chez la souris
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système gastrointestinal
1 040 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules de cancer colorectal, sous la peau ou par injection dans la rate pour induire des métastases, puis des injections de microbulles et des ultrasons deux fois par semaine jusqu'à l'atteinte des points limites. Le porteur cite parmi les atteintes la douleur de la chirurgie du ventre et la dégradation de l'état général liée à la croissance de la tumeur. Il affirme qu'à cette étape le modèle animal ne peut être remplacé par un modèle in vitro ou in silico.
Objectifs
Evaluer différents types de microbulles pour la délivrance d’un protocole de chimiothérapie, l’irinotécan (libre et encapsulé) par action combinée de microbulles et d’ultrasons (appelé également sonoporation).
Bénéfices attendus
Optimiser le modèle murin de métastases hépatiques de cancer colorectal Optimiser la procédure d’imagerie CT des métastases hépatiques de cancer colorectal Améliorer l’efficacité thérapeutique de l’irinotécan libre et encapsulé pour le traitement du cancer colorectal
Procédures
Procédure 1 Evaluation de microbulles de gaz pour la délivrance d'une chimiothérapie par sonoporation dans un modèle murin de cancer colorectal sous-cutané chez la souris 1- identification par puce – insertion sous cutanée du trocart –anesthésie gazeuse– 480 animaux- pour chaque animal 1 seule fois 2- injection sous cutanée de cellules tumorales – anesthésie gazeuse - 480 animaux- pour chaque animal 1 seule fois 3- i.v. microbulles gaz et/ou chimiothérapeutiques et/ou ultrasons (
Impact sur les animaux
- Le stress lié à la manipulation des animaux - L’hypothermie induite par l’anesthésie générale - La douleur induite par la chirurgie abdominale - La dégradation de l’état général des animaux induite par la croissance tumorale
Devenir
Procédure 1 : A la fin de l'étude, une euthanasie par dislocation cervicale de l'animal après anesthésie gazeuse (Vetflurane 5%) sera réalisée par un des responsables de l’étude. Procédure 2 : A la fin de l'étude, une euthanasie par dislocation cervicale de l'animal après anesthésie gazeuse (Vetflurane 5%) sera réalisée par un des responsables de l’étude.
Remplacement
Dans une première approche expérimentale, nous avons réalisé des expériences sur des cellules cellulaires dont les résultats sont particulièrement encourageants et nécessitent d'être validés avec un modèle préclinique. Par conséquent, à cette étape du projet, le modèle animal ne peut être substitué par un autre modèle d'étude in-vitro ou in silico.
Réduction
Grâce à un plan d’expérience, les groupes contrôles et expérimentaux seront constitués de 20 souris (10 mâles et 10 femelles). Nous réaliserons une étude statistique pour déterminer si ces différentes thérapies permettent une diminution significative de la croissance, du métabolisme et de la perfusion tumorale (Puissance de test: 80%, Seuil de risque: 0.05).
Raffinement
Les nuisances ou effets indésirables des procédures 1 et 2 seront évalués par le personnel de zootechnie et par les responsables de l’étude. Les animaux seront observés une fois par jour afin d’évaluer leur stress/leur douleur après les différentes procédures réalisées sous anesthésie gazeuse (Vetflurane). - Le stress lié à la manipulation des animaux : Les souris seront hébergées en présence d'un objet d'enrichissement (morceaux de carton et/ou tube plastique) en groupe. Le stress est minimisé par l'implication d'un personnel qualifié à l'expérimentation animale. Les souris sont facilement stressées, la contention nécessaire à l’induction de l’anesthésie rajoute une source de stress supplémentaire. Les animaux, après la phase d’acclimatation, seront habitués à être sortis de leur cage. - L’hypothermie induite par l’anesthésie générale : L’animal est réchauffé par une couverture chauffante. - La douleur induite par la chirurgie abdominale : La douleur sera prise en charge par une analgésie adaptée (Buprénorphine 0.05 mg/kg et lidocaïne) en pré- et post-opératoire. - La dégradation de l’état général des animaux induite par la croissance tumorale : Le poids sera mesuré tous les deux jours et les animaux seront observés tous les jours selon les critères ci-dessous : (1) Détérioration générale de l'état sanitaire, altération sévère des comportements physiologiques (prostration, refus de se nourrir et de boire, locomotion réduite, dos vouté et yeux enfoncés). (2) Cachexie associée à une perte de poids de 17% du poids total de l'animal. (3) Symptomologie évocatrice : Saignements, urines ictériques, dyspnées ou sibilances… La manifestation d'un seul de ces signes cliniques conduira à une euthanasie par dislocation cervical après anesthésie au vetflurane (5%) par une des personnes en charge de l'étude. Une analgésie ne pourra pas être administrée aux animaux pendant la croissance tumorale car cette première influence cette dernière.
Choix des espèces
Dans la littérature et pour la lignée cellulaire CCR choisie pour notre étude, l'implantation se fait généralement dans des souris nudes. Dans la littérature et pour les lignées cellulaires CCR choisies pour notre étude, l'implantation se fait généralement dans des souris nudes de 6 semaines environ pour un poids de 20 g.
Développement, homologation et benchmark de formulations d’appâts destinées à la lutte contre les rongeurs nuisibles
- Protection de l’environnement
- Recherche appliquée
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
Rats : 1050
Autres rongeurs : 1050
3 150 rongeurs, soit 1 050 souris, 1 050 rats et 1 050 rongeurs d'autres espèces, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent par gavage des appâts rodenticides, une entreprise cherchant à développer et homologuer ces produits destinés à les tuer. Le porteur reconnaît qu'il est "certain que les rongeurs vont subir des nuisances qui devraient les conduire à la mort", les survivants étant ensuite tués. Il présente ces essais comme une "obligation réglementaire européenne" imposant de tester chaque espèce cible et un nombre minimal d'animaux.
Objectifs
Il existe un vrai besoin de développement de nouveaux appâts rodonticides à mettre sur le marché de la lutte contre les rongeurs nuisibles. Cette lutte est justifiée par la nécessité absolue de préserver les personnes et les biens (alimentation, bâtiments et matériels) des risques et méfaits induits par ces rongeurs cibles nuisibles. En effet, ces derniers sont porteurs de zoonoses (maladies transmissibles à l’homme) et sont responsables de plusieurs milliers de morts chaque année, via des contaminations directes ou indirectes. Les maladies véhiculées par les rongeurs ont tué plus de personnes au cours des 10 derniers siècles que toutes les guerres. Ce projet a pour objectif d'évaluer l'efficacité de divers appâts rodenticides, depuis leur développement jusqu'à leurs autorisations de mise en marché (AMM), aux renouvellements périodiques des homologations, ainsi qu'à leur benchmark par rapport aux produits du marché. Il permettra également de faire progresser la connaissance scientifique. La société développe et commercialise des produits de lutte contre les rongeurs nuisibles, sous forme d’appâts. Ces appâts doivent répondre à de nombreux critères pour être efficaces et homologués. Ils doivent être appétents pour les cibles visées afin qu’ils soient consommés et que les rongeurs ingèrent la substance active qu’ils contiennent. Ils doivent être adaptés aux conditions d’utilisation variables selon les cas : lieu sec, humide, chaud, froid … et assurer la stabilité de la substance active et de l’appétence au cours du temps. Le besoin de régulation des populations de rongeurs nuisibles et les exigences réglementaires contraignantes imposent le développement et l'optimisation des formulations d'appâts. Pour procéder à leur développement et à leurs homologations, la société a besoin de conduire des essais sur des produits nouveaux. Elle doit également conduire des essais sur des produits connus en vue du renouvellement périodique de leurs homologations. Enfin, elle se doit de benchmarquer les produits concurrents qui arrivent sur le marché. L’objectif de ce protocole doit permettre de développer puis de valider l’appétence et l’efficacité de formulations d’appâts contenant des substances rodonticides en vue de leur homologation sur les 3 espèces cibles. Les animaux seront utilisés au stade adulte et répartis entre mâles et femelles, le plus équitablement possible. Pour être validé, un essai devra afficher une efficacité d’au moins 90%.
Bénéfices attendus
La conduite de ces essais d'efficacité et d'appétence permettra à l'entreprise de progresser dans ses connaissances au niveau de la formulation d'appâts et de finaliser le développement des nouveaux produits, avant d'engager les demandes d'homologation. Dans les dossiers de demande d'homologation, la réglementation européenne impose la présentation de résultats d'essais conduits en laboratoire avec des animaux de chacune des espèces cibles revendiquées dans les demandes d'AMM. La guidance de l'ECHA impose également le nombre minimum d'animaux par essai, afin d'avoir une représentativité suffisante.
Procédures
Lors de la procédure expérimentale n°2, les animaux seront soumis à des opérations de gavage. Ces gavages pourront être uniques : 1dose gavée une seule fois, ou répétés, une fois par jour sur 2 à 5 jours consécutifs. Les opérations de gavages auront une durée limitée d'une minute par gavage. Pour les procédures expérimentales 1 et 2, les animaux pourront être soumis à un prélèvement sanguin (procédure n°3), sous anesthésie terminale, juste avant euthanasie.
Impact sur les animaux
Dans la mesure où les produits à tester sont des rodonticides, il est certain que les rongeurs vont subir des nuisances qui devraient les conduire à la mort. Afin de réduire au maximum ces nuisances, la règle des 3R et le respect de l'atteinte des points limites seront appliqués.
Devenir
Tous les animaux survivants à l'issue des procédures 1 et 2 seront euthanasiés. En effet, l'exposition aux substances actives et la durée des essais ne permettront pas de les réutiliser dans d'autres essais.
Remplacement
La conduite des essais sur les rongeurs cibles : rats (Rattus norvegicus et Rattus rattus) et souris (Mus musculus) répond à une obligation réglementaire européenne et ne peut être remplacée. Pour pouvoir accéder au marché, ces appâts doivent être homologués. Une des conditions requises pour l'obtention de l'homologation consiste à fournir des résultats d'essais d'efficacité, conduits en laboratoire, selon la guidance de l'ECHA (Guidance on the Biocidal Products Regulation. Volume II Efficacy - Assessment and Evaluation (Parts B+C), Version 3.0, April 2018) qui impose que les essais soient conduits sur les espèces cibles. Par ailleurs, il n'existe pas de méthode de substitution pour valider l'efficacité et l'appétence des appâts. Le recours aux animaux est donc obligatoire.
Réduction
Les trois espèces cibles (Rattus norvegicus, Rattus rattus et Mus musculus) ont des comportements alimentaires différents. Elles ne sont donc pas substituables. Selon la réglementation européenne, les essais doivent être conduits en laboratoire sur chaque espèce cible pour l'obtention des AMM. Les guidances mentionnent qu'il est nécessaire d'utiliser au moins 10 animaux par essai afin d'atteindre une représentativité suffisante des résultats. Imposé par la réglementation, ce nombre d'animaux par essai ne pourra être réduit. Il est prévu, pour la première année du projet : Procédure 1 : 10 essais par espèce, puis 15 essais par an les 4 années suivantes, soit(10x12x1+15x12x4=) 840 animaux par espèce, soit 3x840= 2520 animaux au total, pour la procédure 1 sur la durée du projet. Procédure 2 : 5 essais, dont 2 avec groupe témoin, par espèce et par an soit (5x6x5 + 2x6x5=) 210 animaux par espèce cible sur la durée du projet, soit au total 630 animaux pour la procédure 2 sur la durée du projet. Pour la procédure 3, il n'est pas prévu d'animaux supplémentaires. Les animaux intégrant cette procédure seront tous issus des procédures 1 ou 2. Le total d'animaux prévu sur l'ensemble du projet est donc de 2520 + 630 = 3150 animaux sur les 5 ans du projet. Ce nombre est justifié par le besoin d'appâts de formulations variées afin de répondre aux besoins des différents sites à traiter selon leurs caractéristiques.
Raffinement
Les essais seront conduits dans un environnement enrichi - objets susceptibles d’être rongés ou déchiquetés et pouvant servir à la construction de nids (papiers, cartons, etc)-, par des personnels qualifiés formés au respect des conditions du bien-être des animaux, afin de minimiser au maximum le stress et la souffrance imputables à ces essais. Afin de respecter le caractère grégaire des animaux, les rats seront hébergés à 3 par cage et les souris par groupe de 5 ou 6, en veillant à séparer les mâles des femelles. Pour éviter toute souffrance inutile, le concept de Raffinement et de points limites sera mis en œuvre. Un suivi clinique des animaux sera effectué, au moins quotidiennement, afin de relever la présence d’éventuels symptômes de mal-être. Les animaux moribonds ayant atteint des points limites seront euthanasiés, en accord avec la structure en charge du bien-être animal de l’EU. Pour les essais par gavage et pour les prélèvements sanguins, les gestes techniques seront réalisés par des personnels formés et expérimentés.
Choix des espèces
Les 3 espèces (Rattus norvegicus, Rattus rattus et Mus musculus) répondent à une exigence réglementaire européenne (Règlement BIOCIDE au niveau européen, selon guidance ECHA : Guidance on the Biocidal Products Regulation. Volume II Efficacy - Assessment and Evaluation (Parts B+C), Version 3.0, April 2018). En effet, ces trois espèces représentent les 3 cibles majoritaires des produits développés pour la protection des personnes et des biens, contre les rongeurs nuisibles. La réglementation impose que des essais d'efficacité et d'appétence soient conduits en laboratoire sur chacune des espèces cibles. Les animaux des 3 espèces seront utilisés au stade adulte afin de respecter les guidances de l'ECHA (European CHemical Agency) pour ce type d'essai.
Evaluation in vivo de l’efficacité de bactériophages dans le traitement d’une infection à Klebsiella pneumoniae
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
3 000 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures classées légères. Elles reçoivent par gavage sans anesthésie des antibiotiques, une bactérie multirésistante puis des bactériophages, ce geste étant répété jusqu'à dix-neuf fois sur quinze jours, avec prélèvement quotidien de selles. Toutes sont tuées pour prélever leur tube digestif et mesurer l'effet du traitement. Le porteur affirme que la colonisation et le traitement n'induisent pas de symptôme et revendique un modèle vivant "indispensable", le microbiote intestinal ne pouvant selon lui être reproduit in vitro.
Objectifs
La résistance aux antibiotiques des entérobactéries est telle que nombre d’infections sont devenues intraitables et la diffusion des bactéries multirésistantes expose à un risque de prescriptions d’antibiotiques inadaptés. La colonisation digestive à bactéries multi-résistantes est le principal facteur de risque d’infection qui augmente avec le niveau de colonisation. La décolonisation du portage digestif est une priorité pour lutter contre la dissémination et les conséquences de l’antibiorésistance. Klebsiella pneumoniae (Kp), impliquée dans les infections humaines joue un rôle majeur dans le maintien et la dissémination de cette multirésistance. La décolonisation du portage digestif par antibiotiques n’a pas montré son efficacité, il est donc essentiel de développer de nouvelles armes antibactériennes. Les bactériophages pourraient être une de ces armes puisque leur efficacité a été prouvée dans d’autres infections. Les phages sont des virus qui infectent les bactéries et il existe au moins un phage identifié pour chaque bactérie. Notre projet consiste à évaluer l’efficacité d’un traitement par phages dans un modèle murin dont le tractus digestif est colonisé par une souche de Kp. Ce modèle va permettre de modéliser ce qui se produit chez des patients sous antibiothérapie et des porteurs colonisés par des bactéries multi-résistantes. Nous testerons les conditions d’établissement de la colonisation par différentes Kp (n=10) et testerons l’efficacité de la décolonisation par le traitement par 1 jusqu’à 5 phages. Nous utiliserons donc 3 000 souris au total. Règle des 3R : - Remplacement: notre projet s'inscrit en amont d’étude de décolonisation sélective chez l'homme et le modèle animal ne peut être remplacé ; - Réduction : le nombre d'animaux a été réduit au minimum afin de nous permettre d'obtenir une puissance statistique suffisante pour des résultats interprétables ; - Raffinement: La surveillance quotidienne des animaux permettra de détecter un changement de comportement pouvant indiquer une éventuelle souffrance. Les traitements antibiotiques, la colonisation par les Kp et l’injection de bactériophages n’induisent pas de symptômes chez les animaux. Un enrichissement sous forme de copeaux de cellulose, maison en carton et/ou boule de papier kraft type carfil nesting permettant de faire des nids et mis à disposition des animaux.
Bénéfices attendus
La diffusion des bactéries multi-résistantes représente un problème majeur de santé publique. Dans un contexte de faible développement d’antibiotiques réellement innovants et face à des infections qui deviennent non traitables, des alternatives sont nécessaires. Le développement de cocktails de phages pour décoloniser des patients du portage intestinal de Klebsiella pneumoniae multi-résistantes ou diminuer la charge bactérienne, ouvre une perspective intéressante et innovante: diminution du risque de transmissions croisées donc réduction des infections liées aux bactéries multi-résistantes et diminution de la morbidité-mortalité associées. Ce type de modèle est pertinent cliniquement : il permet de modéliser ce qui se produit chez des patients sous antibiothérapie et des personnes porteuses colonisées par des bactéries multi-résistantes. En effet, l’utilisation d’un modèle in vivo est ici indispensable et ne peut être remplacé car tout le microbiote intestinal est susceptible d’interagir avec les phages et il est nécessaire d’en apprécier les effets avant une possible extrapolation du traitement chez l’homme.
Procédures
Prélèvement de selles : la totalité des souris (3 000). Les selles sont récupérées dès émission chez les animaux tenus en contention manuelle. La procédure dure 20 secondes par animal, est effectuée 1 fois par jour pour un maximum de 14 jours. Gavage : (N=3 000 souris). Les animaux recevront des antibiotiques (clindamycine (8,6 mg/kg/jour), les bactéries K. pneumoniae, les bactériophages) dans un volume de 200 µl à l’aide d’une canule de gavage. L’animal est tenu en contention manuelle, sans anesthésie et la suspension lui est administrée à l’aide d’une canule de gavage. Aucune anesthésie n’est mise en place car la procédure consiste en une seule administration par voie orale et la mise en place d’une anesthésie serait plus traumatisante pour l’animal. Le geste de gavage dure en moyenne 15 secondes par animal. Selon les groupes, ce geste sera réalisé un minimum de 1 fois et un maximum de 19 fois sur 15 jours. Euthanasie : la totalité des souris (3000). L’animal est euthanasié par injection létale de pentobarbital à 150 mg/kg (100 μl d’Euthasol ou autre spécialité autorisée à base de pentobarbital dilué à 30 mg/mlpar souris de 20 gr) par voie intra-péritonéale (souris tenue en contention verticale ou légèrement inclinée sur le dos, injection avec une aiguille 25G). L’injection dure 5 secondes par animal. Contention manuelle : la totalité des souris (3 000)
Impact sur les animaux
Deux concentrations différentes de Kp seront inoculées aux animaux afin d’établir un modèle de colonisation stable du tractus digestif. De notre expérience et étude de la litérrature la colonisation par une souche de Kp, même hypervirulente, ne présente pas d’effet indésirable jusqu’à 28 jours post-colonisation (données isssues de la litérrature) voire 50 jours (communication personnelle d’un collaborateur). La deuxième étape de traitement par phages n’engendrera pas de préjudices aux animaux puisque le traitement est à visée décolonisante. Chaque animal de chaque groupe sera identifié par marquage au feutre au niveau de la queue.
Devenir
A l’issue de la période de colonisation par Kp ainsi qu’à l’issue du traitement par les phages, tous les animaux sont euthanasiés afin de procéder au prélèvement de leurs tubes digestifs pour une mise en culture et visualisation de la localisation des bactéries le long du tube digestif. Ces méthodes vont permettre de voir l’efficacité de la colonisation par Kp ainsi que l’efficacité du traitement par les phages, comparativement au groupe témoins non traités et nécessite l’euthanasie des animaux
Remplacement
L’utilisation d’un modèle in vivo est indispensable dans l’étude de l’efficacité du traitement par phages et ne peut être remplacé. En effet, tout le microbiote intestinal est susceptible d’interagir avec les phages et il est nécessaire d’en apprécier les effets avant une possible extrapolation du traitement chez l’homme.
Réduction
Les groupes d’animaux ont été réduits au minimum tout en permettant d’obtenir des résultats statistiquement significatifs, conduisant à un nombre total d’animaux de 3 000 pour ce projet. La taille des groupes a été estimée à partir de logiciel d’analyse statistique. L’utilisation de chaque animal sera optimisée en effectuant sur un même animal au cours du temps différents types d’analyses après prélèvement non invasifs des selles, suivi de coupes histologiques et microscopie en fin d’expérience.
Raffinement
Le projet a été construit en intégrant les mesures permettant de réduire le stress et si possible, la souffrance des animaux (raffinement). Il sera assuré par l'enrichissement mis à disposition des animaux (litière en copeaux de cellulose, maison en carton et/ou boule de papier kraft type carfil nesting permettant de faire des nids). Les animaux sont hébergés par groupe de 6 souris maximum (qui constituent les groupes expérimentaux) dans des cages de type IIL dont la surface répond aux normes de l’annexe II section B paragraphe 2.1 tableau 1.1 de l’arrêté du 1er février 2013 fixant les conditions d’agrément, d’aménagement et de fonctionnement des établissements utilisateurs éleveurs ou fournisseurs d’animaux utilisés à des fins scientifiques et leurs contrôles dans le cas de l’utilisation de souris. Une période d’acclimatation d’une semaine est observée à l’arrivée des animaux avant le début des expériences. Les traitements antibiotiques, la colonisation par les Kp et l’injection de bactériophages n’induisent pas de symptômes chez les animaux. Les gavages seront effectués par des personnes formées et compétentes. Lors du gavage, une surveillance accrue des animaux pendant 10 minutes permettra de détecter d’éventuels signes de souffrance. Si une difficulté respiratoire est observée, l’animal sera euthanasié par disclocation cervicale. La surveillance quotidienne des animaux permettra de détecter un changement de comportement pouvant indiquer une éventuelle souffrance (animal prostré, ne se nourrissant plus, poil piqué, ne se servant plus de l’enrichissement mis à sa disposition). Si un des paramètres cité précédemment est observé, l’animal est euthanasié par injection létale de pentobarbital à 150 mg/kg (100 μl d’Euthasol ou autre spécialité autorisée à base de pentobarbital dilué à 30 mg/ml par souris de 20 gr) par voie intra-péritonéale (souris tenue en contention verticale ou légèrement inclinée sur le dos, injection avec une aiguille 25G). La mort des animaux est confirmée par une vérification de l'arrêt respiratoire et de l'arrêt cardiaque. La vérification de ces paramètres est réalisée pendant une minute.
Choix des espèces
Nous avons choisi le modèle murin (souris SWISS) car celui-ci a prouvé son efficacité dans la mise en place de colonisation par des bactéries mais aussi dans la décolonisation par des phages. Nous avons choisi des souris femelles (afin d’éviter les conflits entre mâles) SWISS (souris immunocompétentes non consanguines). Les animaux seront utilisés à un âge de 7 -12 semaines ce qui permettra d’avoir une flore digestive mature. Chaque animal de chaque groupe sera identifié par marquage au feutre au niveau de la queue.
Effets de la cécité sur le développement et la plasticité du système olfactif chez la souris
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
- Système nerveux
80 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, la moitié des petits naissant aveugles, un phénotype que le porteur qualifie lui-même de "dommageable". Les animaux testés subissent trois chirurgies du crâne sous anesthésie, avec incision au-dessus des bulbes olfactifs pour de l'imagerie optique, répétées à un mois d'intervalle, puis sont tués à la dernière séance. Quinze reproducteurs voyants n'ayant subi aucune chirurgie sont réutilisés dans un autre projet, les souris aveugles ne pouvant l'être. Le projet vise à comprendre la plasticité de l'odorat après une cécité précoce, le porteur affirmant que cette imagerie ne peut s'envisager sur modèle in vitro.
Objectifs
À l’échelle mondiale, environ 2,2 milliards de personnes présentent une déficience visuelle, touchant aussi bien les nouveau-nés prématurés que les personnes de plus de 50 ans (OMS). La théorie du «darwinisme neuronal» stipule que l'absence d'une modalité sensorielle, comme la vision, induit une plasticité cérébrale permettant la potentialisation des autres sens afin d’aider l’individu à s’adapter à son environnement. Si ce phénomène de potentialisation sensorielle a été largement décrit, son évolution au cours du développement et ses mécanismes font encore l’objet de nombreuses questions. Ainsi, une des questions principales est d’étudier comment se met en place au cours du temps cette plasticité chez un individu privé de la vision, à la fois du point de vue comportemental, mais également au niveau des processus cérébraux sous-jacents. À ce jour, l’impact de la cécité sur la fonction olfactive, qui est un sens invisible mais critique dans notre quotidien, reste peu étudié, en particulier au niveau des mécanismes de réorganisation sensorielle cérébrale. L’objectif de ce projet est donc d’étudier le développement et la plasticité fonctionnelle du système olfactif induite par l’absence de système visuel périphérique au cours du développement. Nous avons choisi d’aborder cette question chez les rongeurs, des macrosmates qui utilisent principalement leur sens olfactif pour la perception de leur environnement (interactions sociales, recherche de nourriture, détection des prédateurs). Nous allons ainsi utiliser un modèle murin de cécité congénitale afin d’appréhender les mécanismes liés au développement et à la plasticité des systèmes sensoriels. Grace à la combinaison de plusieurs approches expérimentales, nous allons chercher à quel niveau et avec quel décours temporel interviennent les mécanismes de plasticité cérébrale afin d’apporter de nouvelles données pour mieux comprendre comment cette plasticité se met en place chez l’humain privé d’un sens.
Bénéfices attendus
Ce projet innovant répond à l’un des enjeux clés des neurosciences : la compréhension des mécanismes de plasticité cérébrale. Il est bien établi que la cécité précoce entraîne une amélioration des modalités sensorielles résiduelles non visuelles qui est accompagnée d'une plasticité cérébrale fonctionnelle et anatomique. Alors que les fonctions auditives et tactiles ont été largement étudiées, les données concernant les fonctions olfactives sont moins documentées et les résultats moins cohérents. Le but de la présente étude est d’évaluer, sur un modèle de souris présentant une cécité congénitale, les performances olfactives et de corréler les changements observés à l’activité des aires cérébrales impliquées dans la perception des odeurs. Cette étude sera menée à différents stades de développement afin d’évaluer comment ces modifications se mettent en place au cours du temps. Étant donné que les données concernant les fonctions olfactives chez les humains aveugles sont controversées, ce modèle murin nous permettra d’approfondir nos connaissances de la plasticité du système olfactif et de clarifier, avec des approches de pointe, l’effet de la cécité sur les fonctions olfactives. De nombreuses études ont montré qu’il était possible d’éduquer notre fonction olfactive comme l’illustre parfaitement l’exemple des parfumeurs, mais également de la rééduquer après une perte olfactive. Ce projet, en étudiant comment la plasticité se met en place au cours du développement, pourra fournir des données sur les périodes critiques au cours desquelles on pourrait proposer une éducation olfactive chez les enfants aveugles congénitaux visant à améliorer encore leur perception du monde qui les entoure.
Procédures
La procédure 1 concerne la mise en reproduction des souris et il n’y a donc aucune intervention sur ces dernières. La procédure 2 comprend deux session expérimentale. La première vise à enregistrer la respiration des souris dans un pléthysmographe corps entier. Afin de limiter le stress des animaux lié au changement d’environnement par rapport à leur cage d’hébergement, ils seront habitués à l’appareil pendant 10 minutes les deux jours précédant cette session. La durée totale de cette session sera de 30 minutes. La deuxième session expérimentale a lieu de lendemain de la première. Les animaux seront anesthésiés et analgésiés puis placés dans un cadre stéréotaxique. Suite à un traitement anesthésique local, la peau du crâne sera incisée au niveau des bulbes olfactifs (ouverture de 0,5 cm environ). Une session d’imagerie optique sera alors réalisée pendant 30 minutes et en présentant différentes odeurs. L’anesthésie et l’analgésie seront maintenues tout au long de la procédure. La peau du crâne sera ensuite recousue et l’animal replacé dans sa cage d’hébergement. La durée de cette session n’excédera pas 60 minutes. Cette procédure sera répétée 3 fois pour chaque animal à 9/11 jours post-natal (P9/11) à P30 et à P60. Après chaque session expérimentale, les souris (en particulier les plus jeunes à P9) seront replacés le plus rapidement possible avec leur mère ou leurs congénères. A la suite de la dernière session d’imagerie (P60), les animaux seront mis à mort.
Impact sur les animaux
La procédure 1, qui concerne la reproduction des animaux, va engendrer la naissance (la moitié de la portée) de souris aveugles qui est un phénotype dommageable. La procédure 2 comprend deux sessions expérimentales sur chaque animal. La première, qui concerne l’enregistrement dans la cage de pléthysmographie peut potentiellement générer un léger stress pour le jeune animal séparé de sa mère. La deuxième nécessite une chirurgie de gravité modérée réalisée sous anesthésie qui consiste en l’incision de peau au-dessus des bulbes olfactifs puis a la suture de celle-ci. Cette intervention peut engendrer une douleur post-opératoire. Cette intervention sera répétée à 30 jours d’intervalle.
Devenir
Procédure 1 : les souris reproducteurs et reproductrices voyantes (soit 15 souris) n’ayant subies aucune chirurgie ni geste invasif pourront, comme leur progéniture excédentaire, être réutilisés dans un autre projet de recherche. Il est difficile d’envisager la réutilisation des souris de phénotype aveugle dans une autre procédure, la plupart de celles-ci nécessitant un animal « voyant ». Si nous avons des pertes des juvéniles lors de la procédures 2, nous pourrons considérer utiliser ces animaux pour nos enregistrements chez l’adulte. Procédures 2: les animaux ayant subis 3 chirurgies au cours de leur développement et ayant été testé avec des odeurs dans le pléthysmographe ne pourront pas être réutilisés. Ils seront donc mis à mort à la fin de la procédure après la 3ème et dernière session d’imagerie.
Remplacement
L’étude de l’activité fonctionnelle du bulbe olfactif et du cerveau ainsi que des fonctions respiratoires et olfactives nécessitent l’utilisation d’animaux vivants et ne peut s’envisager sur modèles strictement in vitro. Les enregistrements optiques, s’ils ne sont pas invasifs au niveau cérébral, nécessitent la réalisation d’une fenêtre dans l’os du crane et rendent donc ces expériences non envisageables chez le sujet humain.
Réduction
Pour mener ce projet, nous aurons besoin d’utiliser 80 souris pendant la durée du projet. Le nombre d’animaux a été réduit au minimum et choisi en fonction 1) du calcul de la puissance statistique (avec alpha =0.05 et puissance statistique de 0.8) et 2) de nos travaux antérieurs et des données bibliographiques d’autres groupes. Les tests statistiques seront basés sur des ANOVA factorielles (aveugle VS voyant) (comparaison des fréquence respiratoires, surface des aires activées en imagerie optique) et des ANOVA à mesures répétées (test d’habituation/cross habituation). De plus et de façon critique, les approches expérimentales choisies (pléthysmographie et imagerie optique) permettent une approche longitudinale sur les mêmes animaux au cours du développement, réduisant ainsi le nombre total d’animaux utilisés. De plus, nous allons utiliser les mêmes animaux pour les mesures physiologiques (mesure de la respiration) et l’imagerie optique dans la procédure 2. Pour limiter tout effet de portée, seules 2 souris par phénotype seront testées à l'intérieur de la même portée, soit 2 souris aveugles (1 femelle et 1 mâle) et 2 souris voyantes (1 femelle et 1 mâle) pour un total de 4. Les animaux surnuméraires seront proposés pour être réutilisés dans d’autres procédures au sein de l’établissement. Si ce nombre idéal n’est pas possible dans une portée (par exemple une femelle aveugle et 2 mâles, 1 aveugle, 1 voyant), nous inclurons ces animaux dans notre procédure et inclurons 1 animal supplémentaire d’une autre portée pour compléter notre groupe).
Raffinement
Nous avons choisi d’enregistrer la respiration de façon non-invasive en utilisant une cage de pléthysmographie. Cette technique permet d’étudier très finement un ensemble de paramètres respiratoires comme la fréquence et les volumes inspiratoires et expiratoires de manière spontanée ou en présence d’une stimulation odorante. Ces enregistrements ont lieu sans aucune contrainte chez l’animal comme c’est le cas, par exemple, avec l’utilisation d’une ceinture placée autour de la cage thoracique. L’animal est libre de ses mouvements. Pour les expériences d’imagerie optique, l’anesthésie et l’analgésie seront maintenues tout au long de la chirurgie ou de l’enregistrement. La douleur post-opératoire sera quantifiée et une couverture analgésique sera mise en place. Étant donné que la moitié des souris présentera un phénotype dommageable dû à l’absence de perception visuelle, un milieu d’hébergement ultra-enrichi est préconisé. Le matériel utilisé sera le suivant : une grande cage, hébergement en groupe, la nourriture est mélangée avec la litière, un tunnel et une roulette / cage, et du matériel de nidification. Cette souche de souris, en offrant la possibilité d’avoir nos deux phénotypes d’intérêt au sein d’une même portée, permet de ne réaliser qu’un seul élevage.
Choix des espèces
Les rongeurs et en particulier les souris sont un modèle de choix pour l’étude du système olfactif en général et pour cette étude en particulier pour plusieurs raisons : (1) Les souris nouveau-nées naissent sans entrées auditives et visuelles (jusqu'aux jours 9 et 14-15, respectivement); Elles sont donc d'abord guidées par la chimioréception; (2) Le système olfactif de la souris fonctionne avant la naissance, contribuant ainsi très tôt à l'induction expérientielle de phénotypes comportementaux ; (3) Après la naissance et à l’âge adulte, les souris utilisent de façon critique les indices olfactifs pour guider leur comportement ; (4) Des tests comportementaux standardisés sont conçus pour évaluer les fonctions cérébrales et le comportement chez les souris adultes et en développement ; (5) L'accès à de nombreux génotypes obtenus par mutation ou par manipulation génétique permettent de disséquer de nombreuses fonctions cérébrales et notamment la plasticité. Pour répondre à la question des effets de la cécité sur la plasticité cérébrale et les performances sensorielles non visuelles, nous avons choisi d'utiliser une souche de souris mutante (la souche de souris ZRDBA). Lors de la reproduction, cette souche permet d’obtenir, au sein d’une même portée, une moitié de congénères aveugles et l'autre moitié voyants normalement. C’est un critère majeur lorsque l’on étudie le développement puisque l’on peut comparer des animaux de phénotypes différents issus d’une même portée. Ces animaux ont donc reçu les mêmes soins maternels et ont été exposés aux mêmes stimuli lors de leur développement. L’objectif est de tester l’impact de l’absence du système visuel périphérique sur l’activité du système olfactif au cours du développement. Nous utiliserons donc des souris à 3 stades développementaux différents : avant qu’elles n’ouvrent les yeux à un âge post-natal compris entre P9 et P11, quand elles ont ouvert les yeux et sont séparées de leur mère entre P30 et P32 et à l’âge adulte (>P60).
Etude de l’efficacité anti-tumorale de différents formats d’anticorps anti-B7-H3
- Recherche appliquée
- Cancers
10 950 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 9 950 dans des procédures classées sévères. Elles reçoivent des injections répétées et des greffes de cellules tumorales sous la peau ou dans le sang, pour tester différents formats d'anticorps anti-B7-H3 en cancérologie. Le porteur indique que les greffes peuvent provoquer nécrose, saignement, ulcération et perte de poids, et que les animaux sont tués à l'atteinte des points limites ou en fin de protocole par dislocation cervicale. Il conclut au "besoin de nouveaux traitements innovants" et affirme que l'efficacité ne peut être évaluée que dans un modèle vivant, impossible à reproduire in vitro.
Objectifs
Chaque année, environ 18 millions de cancers sont diagnostiqués à travers le monde, responsables de plus de 9 millions de décès. L’immuno-oncologie est aujourd’hui une approche thérapeutique prometteuse. Sa particularité n’est pas uniquement de cibler la tumeur comme les autres stratégies thérapeutiques mais aussi d’aider le système immunitaire à reconnaitre et détruire les cellules tumorales. L’utilisation d’anticorps dans le traitement des cancers est l’une des stratégies approuvées et en continuel développement. Différents formats d’anticorps ont été approuvés en clinique : les anticorps monoclonaux présentant une action cytotoxique par ADCC via l’engagement des récepteurs Fc sur les cellules cytotoxiques (Rituximab, Cetuximab,…) ; les anticorps multi-spécifiques liant les cellules tumorales et les cellules effectrices de l’immunité, favorisant l’élimination des cellules tumorales par les cellules immunitaires (Blinatumomab) ; les anticorps conjugués à un agent cytotoxique appelés ADC (Antibody Drug Conjugate) qui est libéré au niveau du site tumoral (Padcev, Enhertu..). Notre laboratoire travaille sur le développement d’anticorps thérapeutiques équivalents sur les formats monoclonaux (mAb), ADC mais également sur le format multi-spécifiques. Les anticorps multi-spécifiques développés par notre laboratoire engagent les cellules effectrices de l’immunité anti-tumorale ainsi que les cellules tumorales (via un antigène tumoral). Dans le cadre de ce projet, l’antigène ciblé est une molécule que l’on retrouve exprimée à la surface des cellules présentatrices d’antigène ainsi qu’à la surface de cellules tumorales. Des anticorps de la concurrence, dirigés contre cette molécule, sont actuellement en cours d’évaluation clinique. Les premiers essais montrent des signes d’efficacité, ce qui nous conforte dans le choix de cibler cette molécule. L’objectif de ce projet consistera à évaluer chez la souris l’efficacité d’anticorps anti-antigène tumoral sous différents formats (ADCC, multi-spécifique ou ADC).
Bénéfices attendus
Chaque année, environ 18 millions de cancers sont diagnostiqués à travers le monde. Malgré de nombreuses avancées dans les traitements proposés, on dénombre plus de 9 millions de décès par an. Ce chiffre démontre le besoin de nouveaux traitements innovants. Les bénéfices à court terme de ce projet sont la validation de l’efficacité anti-tumorale de nouveaux anticorps dans des modèles pré-cliniques, une meilleure connaissance de leur mode d’action et de leur potentiel d’efficacité en combinaison avec des traitements de références. Tout ceci afin d’amener ces anticorps dans des phases de tests cliniques sur des patients atteints de cancer. Le bénéfice à long-terme est le traitement et l’augmentation de l’espérance de vie de patients atteints de cancer exprimant la cible à la surface de leurs cellules tumorales.
Procédures
Pharmacodynamie / pharmacocinétique : a. 1 injection IV de composés thérapeutiques avec aiguille 30G 1/2 via la veine caudale sur animaux vigiles ou via le sinus rétro-orbital sur animaux anesthésiés par voie gazeuse. Volume ≤100 µL et pouvant aller jusqu’à 200 µL ; b. 1 injection IP de composés thérapeutiques avec aiguilles 30G 1/2, sur animaux vigiles, volume ≤400 µL. Test fonctionnel ex-vivo : a. 1 injection en IP de poly(I:C) avec aiguille 26G, sur animaux vigiles, volume ≤400 µL ; b. prélèvement de rate post-mortem après dislocation cervicale. Test d’efficacité modèle sous-cutané (SC) : a. injection sous-cutané de cellules tumorales avec aiguille 26G, sur animaux vigiles, une à deux injections SC par animal, volume ≤200 µL par injection ; b. prélèvement de tumeurs et/ou organes en post mortem après dislocation cervicale. Test d’efficacité modèle intra-veineux (IV) : a. 1 injection intra-veineuse de cellules tumorales via veine caudale avec aiguilles 30G 1/2, sur animaux vigile, volume ≤100 µL pouvant aller jusqu’à 200 µL ; b. prèlèvement de poumons et/ou foie post-mortem après dislocation cervicale ou surdosage chimique d’anesthésique. Test d’efficacité modèles SC et IV : a. injections IV de composés thérapeutiques ou de composés déplétant 1 population immunitaire avec aiguille 30G 1/2 via la veine caudale sur animaux vigiles ou via le sinus rétro-orbital sur animaux anesthésiés par voie gazeuse (isoflurane). Volume ≤100 µL et pouvant aller jusqu’à 200 µL. A doses et fréquences variables. Si les injections IV sont réalisées via le sinus rétro-orbital, maximum de 1 injection par œil et par jour sera réalisé avec un maximum de 5 injections par œil ; b. injections IP de composés thérapeutiques ou de composés déplétant une population immunitaire avec aiguilles 30G 1/2 ou 26G, sur animaux vigiles. Doses et fréquences variables dans un volume ≤400 µL ; c. injections per os de composés thérapeutiques avec sondes de gavage, sur animaux vigiles. Volume ≤200 µL et pouvant aller jusqu’à 400 µL. A doses et fréquences variables. Etude de pharmacodynamie et pharmacocinétique + test d’efficacité dans modèles SC et IV : a. prélèvement de sang au sinus rétro-orbital sur animaux anesthésiés par voie gazeuse (isoflurane). Volume de sang prélevé par animal < à 7.5% du volume sanguin total par semaine. Si prélèvements à la fin de la procédure expérimentale, volume prélevé pouvant aller jusqu’à 600µL et l’animal sera sacrifié par dislocation cervicale avant réveil.
Impact sur les animaux
Les gestes réalisés sur les animaux inclus dans les études de pharmacodynamie et pharmacocinétique sont de gravité légère. Aucune incidence significative sur le bien-être ou l’état général ne devrait être observée. Les gestes réalisés sur les animaux inclus dans les études de pharmacodynamie et pharmacocinétique, les études d’efficacité en modèle sous-cutané et les études d’efficacité en modèle intra-veineux bien que répétés et/ou multiples, sont de gravité modérée. Cependant, les composés thérapeutiques injectés dans études de pharmacodynamie et pharmacocinétique, les études d’efficacité en modèle sous-cutané et les études d’efficacité en modèle intra-veineux peuvent induire une toxicité dans les jours suivant l’administration. Celle-ci se traduisant par une perte de poids sur 4-5 jours. Les animaux revenant en phase de prise de poids et donc à un état général normal au maximum 7 jours après l’injection. Les modèles de greffe réalisés lors des études d’efficacité en modèles sous-cutané peuvent induire une incidence significative sur le bien-être ou l’état général de l’animal se traduisant par une perte de poids, une nécrose importante et/ou saignement et/ou ulcération et/ou inflammation très importante, une tumeur altérant la mobilité des animaux, signes d’isolement ou posture de dos voûté et/ou prostration et/ou difficulté à respirer (dyspnée) et/ou cachexie (affaiblissement profond de l’organisme). Les modèles de greffe réalisés lors des études d’efficacité en modèle intra-veineux peuvent induire une incidence significative sur le bien-être ou l’état général de l’animal se traduisant par une perte de poids, signes d’isolement ou posture de dos voûté et/ou prostration et/ou difficulté à respirer (dyspnée) et/ou cachexie (affaiblissement profond de l’organisme).
Devenir
Les animaux de la procédure 1, ayant subit un nombre répété de gestes techniques (injection et prélèvement), seront sacrifiés afin de limiter les nuisances sur le bien-être des animaux et éviter tout effet indésirable. Les animaux de la procédure 2 doivent être sacrifiés pour prélèvement de rate post-mortem. Les animaux de la procédure 3 seront sacrifiés lors de l’atteinte des points limites afin de réduire les nuisances sur le bien-être des animaux et d’éviter tout effet indésirable. Les animaux exclus lors de la randomisation seront sacrifiés avant atteinte des points limites et pour certains un prélèvement d’organes/de sang sera effectué pour des analyses ex-vivo et de caractérisation du mode d’action du composé thérapeutique. Les animaux n’atteignant pas les points limites à la fin de la procédure expérimentale mais ayant été greffé avec des cellules tumorales seront sacrifiés afin de limiter les nuisances sur le bien-être des animaux et éviter tout effet indésirable. Les animaux de la procédure 4 seront sacrifiés lors de l’atteinte des points limites afin de limiter les nuisances sur le bien-être des animaux et éviter tout effet indésirable. Les animaux n’atteignant pas les points limites à la fin de la procédure expérimentale mais ayant été greffé avec des cellules tumorales seront sacrifiés afin de limiter les nuisances sur le bien-être des animaux et éviter tout effet indésirable.
Remplacement
Evaluer des stratégies d’immuno-oncologie implique d’être dans un système biologique complexe qui rassemble tumeur, environnement tumoral et système immunitaire. Compte tenu de l’interaction étroite entre ces différents systèmes, qu’il n’est pas possible de reproduire in vitro, il est nécessaire d’obtenir des preuves de concept chez l’animal dans le processus de développement d’anticorps thérapeutiques. Le remplacement des animaux est donc impossible à mettre en place du fait de la nécessité d’étudier l’efficacité dans un modèle vivo complexe, impossible à mimer in vitro.
Réduction
Le nombre nécessaire de souris a été calculé afin de couvrir les différentes études qui permettront d’investiguer les effets anti-tumoraux des anticorps développés par notre laboratoire et de fournir des résultats statistiquement significatifs. Les données obtenues pour chaque paramètre sur des animaux traités seront comparées aux données obtenues sur des animaux ayant reçu un traitement placebo et/ou traitement de référence et permettre ainsi l’évaluation précise de l’efficacité de nouveaux candidats médicaments. Pour les études d’efficacité, le nombre moyen de 10 souris par groupe a été préalablement déterminé sur la base des moyennes et déviations mesurées pour chaque paramètre. C’est le nombre minimum de souris nécessaire afin d’obtenir des données statistiquement interprétables. Si plusieurs composés candidats ou plusieurs doses du même composé doivent être testés dans le cadre de la même série expérimentale, les groupes contrôles ne seront réalisés qu’une seule fois. Pour l’utilisation des souris transgéniques, animaux mâles et femelles d’âges différents pourront être utilisés, afin de réduire le nombre d’animaux générés.
Raffinement
Une période d’acclimatation de 5 jours sera respectée à la réception des animaux. Les animaux seront hébergés de 2 à 5 par cage avec un minimum de 2 enrichissements de milieu. Dans la mesure du possible, aucun animal ne sera maintenu seul dans sa cage en cours d’expérimentation, sinon un enrichissement supplémentaire sera ajouté dans la cage. Les prélèvements sanguins seront réalisés sous anesthésie générale (gazeuse à l’isoflurane) et les volumes ainsi que les fréquences de prélèvement suivront les recommandations du CEEA et de la SBEA. Les schémas d’injections des traitements de déplétion de populations immunitaires seront établis et l’absence de toxicité vérifiée lors de mise au point préalable sur un petit nombre d’animaux. Dans la mesure du possible, des aiguilles de diamètre 30G 1/2 seront utilisées afin de limiter la douleur lors des injections. Le poids des animaux sera suivi une fois par semaine. Certains composés thérapeutiques peuvent induire une perte de poids transitoire des animaux intervenant généralement entre 1 à 6 jours après le traitement. Lorsqu’une perte de poids sera initiée (10% de perte de poids), les souris seront pesées 3 fois par semaine. Dès l'atteinte de 15% de perte de poids, les animaux seront pesés quotidiennement. Cette surveillance renforcée sera maintenue jusqu'à ce que leur poids ne diminue plus sur 2 pesées successives. De plus, dès l'atteinte de 15% de perte de poids, il sera ajouté de la nourriture humidifiée ou gélifiée, au fond de la cage, afin de faciliter l’accès à la nourriture. L’aspect général de l’animal (apparence, comportement, aspect des tumeurs) sera suivi lors des mesures de poids ou de volume tumoraux (classiquement deux fois par semaine). Si une tumeur commence à montrer des signes de nécrose modérée (inflammation importante et/ou croute), les souris seront surveillées tous les deux jours. Dans le cas d’un modèle agressif avec signe de nécrose modérée, les souris seront surveillées quotidiennement. De plus, si l’aspect général et le comportement de l’animal se dégrade (yeux plissés, oreilles rabattues, prostration, isolement) mais ne nécessitant pas son euthanasie, la surveillance des animaux sera réalisée tous les deux jours. Les points limites relatifs à la perte de poids, à l’apparence et au comportement des animaux, à l’aspect et aux volumes des tumeurs sont des critères qui justifieront l’euthanasie des animaux.
Choix des espèces
La majorité des modèles animaux en immuno-oncologie ont été développés chez la souris. De plus, l’analogie fonctionnelle des systèmes immunitaires murin et humain font de la souris un modèle pertinent pour analyser l’efficacité d’anticorps thérapeutiques et l’activation du système immunitaire. Des modèles murins de tumeurs solides et hématologiques sont à disposition dans différentes souches. Dans les souches de souris immuno-déficientes : xénogreffes pour tester le candidat médicament sur des cellules tumorales humaines. Le système immunitaire de ces souris bien que déficient, possède tout de même des macrophages ainsi que des cellules NK permettant l’évaluation de nos molécules. Dans les souches de souris immuno-compétentes : modèles syngéniques via la greffe de cellules tumorales murines exprimant l’antigène humain permettant ainsi de tester le candidat médicament en évaluant l’impact de la réponse immunitaire. Les animaux utilisés dans le cadre de ces études auront un âge minimal de 7 semaines, âge auquel le système immunitaire est décrit comme mature.
Nouvelles associations thérapeutiques dans le traitement du cancer du pancréas
- Recherche appliquée
- Cancers
480 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de tumeur du pancréas sous anesthésie, puis des gavages et des injections dans le ventre deux fois par semaine pendant quatre semaines, pour tester une association de chimiothérapie et d'un inhibiteur de réparation de l'ADN. La tumeur est laissée croître jusqu'à un volume de 1 500 mm³, seuil déclenchant la mise à mort. Le porteur affirme n'attendre "aucun effet indésirable dû au traitement" et conclut qu'aucune méthode alternative ne remplace ces expériences de preuve de concept in vivo.
Objectifs
Le cancer du pancréas est un cancer digestif diagnostiqué à un stade avancé avec un des plus mauvais pronostics, moins de 8% des patients survivent au-delà de 5 ans. Au moment du diagnostic, 80% des patients ont déjà des métastases, rendant la chirurgie impossible. Actuellement, très peu de therapies sont proposées, seulement la gemcitabine et deux combinaisons de chimiothérapie (FOLFIRINOX et Gemcitabine/Nabpaclitaxel) sont disponibles. De plus, ce cancer résiste à la chimiothérapie. Ces échecs peuvent être expliqués par les caractéristiques de la maladie (présence d’un microenvironnement très dense) ainsi que par le manque de biomarqueur permettant la sélection des patients traités. Pour augmenter les chances de surive des patients, de nouvelles thérapies plus ciblées sont en développement, dont des inhibiteurs de la réparation de l’ADN suite à des cassures induites par la chimiotherapie. C’est dans ce contexte que nous avons montré un très fort effet anti tumorale de l’association du FOLFIRINOX, à un inhibiteur de réparation de l’ADN dans des modèles de co-culture cellules tumorales pancréatique et cellules du micro environement. L’efficacité de cette association est étudiée in vitro lors de test de viabilité et confirmé in vivo sur différents modèles de souris avec ou sans système immunitaire. Les mécanismes impliquées dans cette réponse anti-tumorale sont étudiées au niveau de la mort cellulaire, du dialogue (protéines) entre les différents types cellulaires et des cellules immunitaires. Ce projet, qui est important pour le devenir des patients atteints de cancer du pancréas, est réalisé en collaboration avec les services cliniques de l’ICM notamment la chirurgie et l’anatomopathologie
Bénéfices attendus
Nous avons déjà démontré in vitro l’efficacité de l’association du FOLFIRINOX avec un inhibiteur spécifique de la réparation des lésions de l'ADN (ATR) dans différents modèles de cancer du pancréas et ceci à de faible dose de drogue. Il s’agit maintenant de démontrer cette synergie dans 2 modèles de souris nudes xénogreffées chacun avec une tumeur de cancer pancréatique issues de tumeur de patient (PDX : Patient-Derived Tumor Xenografts) et 2 modèles de souris immuno compétentes greffées avec une tumeur murine pancréatique, ces derniers modèles permettront de mettre en évidence les mécanismes immunitaires impliqués dans la réponse.
Procédures
Les animaux seront soumis à une anesthésie générale courte pour la procédure chirurgicale de greffe de PDX (15 minutes maximum / souris). Les traitements à raison de deux fois par semaine sur 4 semaines seront des injections intrapéritonéales ( 5 secondes/ injection/souris, contention comprise) et des gavages (10 secondes/gavage/souris, contention comprise). Les prélévements seront uniquement des prélèvement terminaux sur animaux eutanashiés.
Impact sur les animaux
De nombreuses études ayant déjà été élaborés dans notre institut et dans d'autres, nous maitrisons les doses administrées aux animaux et de ce fait n'attendons aucun effet indésirable dû au traitement. Les nuisances qui pourront être engendrées par la croissance tumorale chez ces animaux seront parfaitement surveillées et maîtrisées afin de limiter toute souffrance animale.
Devenir
Les animaux en sortie de procédure 1 seront directement intégrées dans la procédure 2. A l'issue de celle ci les niamaux seront euthanasié et les tumeurs seront récupéré pour des tests d'immunohistochimie, immunophénotypage et western blot.
Remplacement
Ces associations de drogues ont montré une efficacité in vitro. Il n’existe pas de méthodes alternatives à ces expériences de preuve de concept in vivo. Des modèles précliniques sur souris immunodéprimées et compétentes sont impératifs pour valider l’efficacité de nos traitements, ceci afin d’envisager la translation vers la recherche clinique.
Réduction
D’après nos expériences précédentes et la littérature, la variabilité de prise de greffe nécessite des groupes de 10 animaux. L’analyse statistique sera réalisée avec une Unité de Biométrie. L’étude de l’effet des traitements sur la croissance tumorale permettra de faire deux types d’analyse. 1 : Modélisation de la croissance tumorale et comparaison entre les groupes en utilisant un modèle linéaire mixte. 2 : Analyse de survie en considérant le délai nécessaire pour atteindre une taille de tumeur de 1500 mm3. Le point limite est donc une taille de tumeur de 1500 mm3. Les courbes de survie seront ensuite estimées par la méthode de KaplanMeier et comparées par le test du logrank. Pour confirmer le nombre de souris nécessaire, nous avons calculé la puissance statistique en utilisant le logiciel STATA 13. La puissance a été vérifiée en se fondant sur des hypothèses posées à partir de résultats in vivo et selon une des méthodes proposées par Frison et Pocock (1992) qui considère des résultats de mesures continues répétées. Sous les hypothèses alpha:0,05, delta:1,5 (à J17:moyenne du groupe contrôle attendu ~17 et moyenne du groupe traite attendu ~15,5), écart type : 1,6, la prise en compte de 8 mesures répétées, une corrélation de 0,5 entre ces mesures, et une taille d'échantillon égale a 10 pour chaque groupe, la puissance statistique estimée est de 80%.
Raffinement
La première mesure prise afin de limiter le stress chez nos animaux est une semaine de stabulation à leur arrivée dans des conditions
Choix des espèces
Pour l’évaluation de cancers d’origine humaine, il est indispensable d’utiliser des animaux immunodéprimés , et la souris présente de nombreux modèles adaptés, notamment les souris athymic nudes. L’étude de l’effet des thérapies des modèles possédant un système immunitaire demande l’utilisation de souris immunocompétente gréffées avec une tumeur murine. Age 5 semaines, âge où l’on observe une bonne prise de greffe, et suffisamment âgées pour permettre une récupération dans les meilleures conditions après la greffe.