Souris

3950 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent quatre injections d'un composé supprimant l'autophagie, puis une injection de cellules leucémiques, des prélèvements sanguins répétés, parfois une ponction osseuse, et un traitement oral ou intrapéritonéal, pour étudier le rôle de l'autophagie dans la leucémie aiguë myéloïde. Le porteur indique des effets possibles comme du stress, une perte de poids ou une gêne de mobilité après ponction osseuse. Les souris sont tuées par prélèvement sanguin intracardiaque sous anesthésie pour les analyses.

Objectifs

Malgré un taux élevé de rémission après un traitement conventionnel par chimiothérapie, les rechutes sont fréquentes chez les patients atteints de leucémies aigües myeloïdes (LAM). Comme pour d'autres types de cancer, l'un des mécanisme impliqués dans la résistance des LAM est la reprogrammation métabolique. L’autophagie est un processus catabolique impliqué dans la dégradation et le recyclage des organelles et protéines endommagées pour participer au métabolisme. La dérégulation de l’autophagie est impliquée dans de nombreuses maladies telles que le cancer. Récemment, l’importance de l’autophagie dans les cellules du microenvironnement tumoral a également été mis en évidence. En effet, cette autophagie de l’hôte favorise la croissance des mélanomes, cancer du poumon ou cancer du pancréas en fournissant les substrats nécessaires aux cellules cancéreuses. Ainsi, ce projet s’intéresse à l’étude de l'implication de l’autophagie de l’hôte dans la régulation du métabolisme des cellules de LAM et leur chimiorésistance.L

Bénéfices attendus

Ce projet apportera une meilleure compréhension du rôle de l'autophagie dans le dévelopement et la résistance des LAM et les mécanismes moléculaires exacts impliqués. Cette meilleure compréhension pourra permettre le développement de thérapies ciblant directement l'autophagie ou des voies moléculaires régulées par ce mécanisme. Ce projet permettra également la découverte de nouvelles combinaisons thérapeutiques avec des chimiothérapies ou thérapies ciblées existantes dans le but d'améliorer la prise en charge et le traitement des patients atteints de LAM.

Procédures

Les animaux seront soumis à 4 injections d'un composé permettant d'induire une déplétion de l'autophagie dans l'ensemble des organes de la souris. Les animaux seront ensuite soumis à une injection unique de cellules leucémiques par voie intraveineuse, puis à des prélèvements de sang sous anesthésie espacés de plusieurs semaines afin d'évaluer la prise tumorale et de récolter du matériel biologique (plasma) pour des analyses ultérieures. En cas de non-diffusion des cellules leucémiques, nous ferons une ponction osseuse de cellules sous anesthésie et analgésie adaptée. Une fois l'invasion des cellules établie, les animaux vigiles recevront un traitement de durée variable selon le type de thérapie, allant de une à quatre semaines, par voie orale ou intrapéritonéale. Les animaux seront soumis à une présence humaine quotidienne afin d'observer leur état de bien-être et manipulés de façon hebdomadaire pour un suivi pondéral.

Impact sur les animaux

Les animaux pourraient être confrontés à des effets indésirables tels que du stress, une perte de poids, une gêne physique en cas d'administration orale quotidienne par exemple. De manière plus exceptionnelle, en cas de ponction osseuse, les animaux peuvent ressentir un gêne temporaire au niveau de la mobilité même si la douleur est inhibée avec l'analgésie. En revanche, tout signe de douleur observé mettra fin à l'expérimentation pour l'animal concerné.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés à l'issu de chaque étude contenant plusieurs procédures. Pour les procédures suivantes: injedction intraveineuse, intrapéritonéale, orale ainsi que le prélèvement sanguin mandibulaire et jugulaire, les animaux seront gardés en vie pour continuer l'étude. Pour la procédure de prélèvement de sang par voie intracardiaque sous anesthésie, les animaux seront euthanasiés sans réveil après la procédure.

Remplacement

Dans le but d’évaluer la contribution de l’autophagie dans le développement leucémique et la résistance thérapeutiques, des tests chez l’animal sont nécessaires car il n’existe pas de modèle in vitro permettant d’étudier de façon fidèle les interactions entre la tumeur et son microenvironnement ainsi que son évolution au sein d’un organisme vivant. Bien que certains modèles in vitro (notamment de co-culture) permettent d’obtenir une première compréhension des mécanismes, ils ne sont pas suffisants. Par exemple, nous avons montré une absence de corrélation entre la réponse in vitro et in vivo à l’AraC, rendant nécessaire l’utilisation de modèle in vivo. Afin d’appliquer nos résultats au stade clinique chez l’homme, il est indispensable d’avoir des preuves d’efficacité in vivo.

Réduction

Les effectifs des cohortes seront calculés et limités par un logiciel de simulation et l'outil statistique. Les études antérieurement effectuées permettront d'optimiser le nombre d'animaux et le nombre d'échantillons issu de l'animal.

Raffinement

L'expérimentation fait l'objet d'une procédure de suivi du bien-être des ainmaux adaptée au modèle et aux potentiels effets indésirables des procédures : les animaux seront observés quotidiennement et le milieu sera enrichi avec du papier et des frisottis pour améliorer le bien-être. Les protocoles seront étudiés afin de limiter au maximum le stress ainsi que la douleur subie par l'animal, en optimisant le mode et le volume d'injection et la durée de traitement. Les animaux seront anesthésiés et une analgésie sera effectuée s'il y a un risque plus important de gêne ou de douleur liée à la procédure. De plus, les études antérieures ont permis de mieux appréhender les points limites. La plupart des procédures décrites dans ce projet ont déjà obtenu l'accord d'un comité d'éthique pour l'expérimentation animale.

Choix des espèces

Le modèle souris est à la base de la compréhension du cancer et du rôle de l’autophagie dans de nombreuses pathologies. Du fait de la présence de nombreux gènes équivalents chez l’homme et la souris, ils intègrent les caractéristiques de la pathologie humaine et aident à la compréhension de la résistance des cellules aux traitements et à la compréhension des fonctions de l’autophagie. Ils présentent des avantages pratiques tels que la croissance rapide, le cycle de reproduction court, la facilité de transport, de manipulation et d’adaptation aux différentes conditions expérimentales ainsi qu’un coût peu élevé. Dans l’étude de la LAM, nous utilisons des souris immunodéficientes et immunocompétentes contrôle ou déficiente en autophagie systémique afin d’étudier l’importance de la composante immunitaire. La procédure utilise des animaux âgés d’environ 6 à 8 semaines car les transplantations de cellules cancéreuses sont plus efficaces chez les jeunes adultes et permettent donc une meilleure prise de greffe leucémique. Le traitement au tamoxifène pour induire la délétion est également plus efficace à cet âge-là. De plus, les souris de cet âge sont moins susceptibles de ressentir la douleur, la souffrance et l’angoisse.

255 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit une laparotomie pour accéder au pancréas et y créer une tumeur, ainsi que trois injections intrapéritonéales, pour étudier le stroma de l'adénocarcinome pancréatique. Le porteur indique des risques d'infection, d'hypothermie liée à la durée de la chirurgie et d'effets digestifs de la tumeur. Toutes les souris sont tuées pour prélever des organes vitaux.

Objectifs

L’adénocarcinome pancréatique (ADK) qui a un taux de survie global de 2-9%, est actuellement la quatrième cause principale de décès liés au cancer dans le monde industrialisé et d’ici 2030, il sera considéré comme le deuxième cancer le plus mortel au monde. Ce cancer est très difficilement pris en charge et son diagnostic souvent tardif ne laisse que peu d’opportunités de traitements thérapeutiques. La plupart des approches thérapeutiques jusqu’à présent se sont intéressées à cibler directement les cellules tumorales et ont jusqu’à récemment, ignoré les réactions stromales adjacentes qui sont une des caractéristiques importantes des cancers pancréatiques humains. Depuis quelques années, le dépôt de ce stroma massif a émergé en tant qu'acteur nouveau et contributeur dans l'initiation et la progression pancréatique de la tumeur. Il a été mis en évidence la présence d’une sous-population cellulaire souche péricytaire dans le stroma du pancréas de souris atteintes d’ADK. Ces cellules ont été isolées et mises à proliférer en culture pour établir une lignée permettant son étude. Par ailleurs, il a été montré une augmentation significative de macrophages spécifique dans différents modèles de cancer pancréatique. Cette population a été décrite comme pro-tumoral dans le cancer du sein et du poumon. Nous pensons que ces macrophages spécifique jouent un rôle important dans la mise en place de l’immunosuppression présente dès le début du cancer pancréatique en étant recrutés et programmés par les cellules entourant le cancer, notamment les cellules stromal. Nos objectifs seront 1) de dépléter ces macrophages spécifiques via l’utilisation de souris génétiquement modifiées 2) D’étudier cette déplétion au niveau de la masse tumorale mais aussi de l’infiltrat immunitaire.

Bénéfices attendus

On estime à environ 10.000 le nombre de nouveaux cas de cancer du pancréas en France. L'incidence dans le monde, varie entre 1 et 10 cas pour 100 000 personnes et reste globalement stable dans le temps mais en croissance dans les pays développés. D’ici 2030, il sera considéré comme le deuxième cancer le plus mortel au monde. Le cancer du pancréas est difficile à diagnostiquer et particulièrement compliqué à traiter. Il résiste en effet à plusieurs traitements antitumoraux (Thérapie ciblée, immunothérapie, chimiothérapie). L’accès des traitements antitumoraux au sein de la tumeur est empêché par la nature du microenvironnement qui soutient les cellules cancéreuses mutées. Ce microenvironement est modifié par les macrophages. Ces derniers représentent près de 40% des cellules immunitaires infiltrées, comprendre le rôle d’une population potentiellement immunosuppressive de macrophages permettrait de développer de futur traitement contre le cancer du pancréas.

Procédures

Les animaux seront soumis à des injections intra-péritonéale ainsi qu’une procédure chirurgicale de laparotomie permettant d’accéder au pancréas. Chaque souris sera soumise à 3 injections intra-péritonéale 1 avant la chirurgie, 2 après la chirurgie, chacune dure environ 1 minute. Chaque souris sera soumise à une laparotomie permettant d’accéder au pancréas. La durée estimée est entre 15 et 20 minutes.

Impact sur les animaux

Des effets indésirables dues à l’injection intra-péritonéale peuvent être ressentis. Les autres principaux risques sont l’infection due à la chirurgie ainsi que l’hypothermie due à la durée de l’acte chirurgicale. Également, la tumeur peut avoir des effets sur la souris, notamment sur son système digestif.

Devenir

L’ensemble des animaux étant soumis aux procédures seront mis à mort car notre projet nécessite le prélèvement d’organes vitaux pour analyse.

Remplacement

Des études in vitro ont préalablement été effectué afin de déterminer le rôle des cellules stromal dans la différenciation des macrophages spécifique ainsi que le rôle de ces macrophages spécifique. Ainsi, l'utilisation d'un modèle murin afin de vérifier si ces observations ont lieu dans un environnement complexes ne peut être remplacé.

Réduction

Le nombre de souris sera réduit à minima pour permettre une analyse statistique et l’obtention de conclusions interprétables qui conduiront à ne pas répéter les expériences que nous mettons en place sur les animaux.

Raffinement

Afin de respecter le bien-être animal, les souris sont dans des cages avec un milieu enrichi et du coton pour qu’elles se fassent un nid (quotidien de l’animalerie). Avant la mise en place du protocole les souris seront acclimatées aux expérimentateurs du projet afin de limiter leur stress. Les animaux seront observés au minimum 3 fois par semaine durant la durée de l’expérience afin de pouvoir réduire, supprimer ou soulager leur douleur ou leur détresse et ainsi améliorer leur bien être Afin de maximiser l’obtention des données scientifiques et raffiner nos approches expérimentales, nous établirons un suivi attentif des souris et fixerons des points limites pour réduire au maximum la souffrance des animaux et éviter l’apparition de tout signe de souffrance Dans ce cadre, un analgésique sera également utilisé dans les procédures de chirurgie afin d’enrayer la douleur chez l’animal.

Choix des espèces

La souris est l’espèce animale la plus pertinente pour les études en cancérologie du fait de l’existence de nombreux modèles bien caractérisés. Spécifiquement, il n’existe pas d’autre espèce que la souris permettant une déplétion conditionnelle des macrophages spécifique. Les souris adultes de 6 semaines ayant un système immunitaire compétent et un pancréas développé et fonctionnel seront utilisées pour ce projet.

2700 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Un diabète est d'abord induit chez des souris NOD SCID, puis les mêmes animaux servent à un modèle de cicatrisation cutanée, avec des prélèvements sanguins répétés et une biopsie de peau. Le porteur indique que la biopsie cutanée provoque des douleurs inflammatoires. Les animaux sont tués en fin de protocole pour prélever la peau des plaies et analyser l'effet de molécules candidates.

Objectifs

Le processus de cicatrisation des plaies est complexe et dynamique et souvent multifactoriel qui implique des phases coordonnées et superposées, notamment la coagulation, l'inflammation, la prolifération et le remodelage visant à restaurer la fonction barrière et l'intégrité mécanique de la peau. Nous savons aujourd’hui que le diabète ralentit la cicatrisation des plaies, rendant le processus de guérison plus difficile que la normale. Cet état entraine en même temps une plus grande prédisposition au développement de plaies chroniques (délai de cicatrisation allongé, au delà de 4 semaines). En France, plus de 20.000 patients diabétiques porteurs de plaies, sont hospitalisées chaque année et près de 8.000 seront amputées d’un membre inférieur. L’objectif de ce projet est d’étudier de nouvelles molécules susceptibles d’accélérer la cicatrisation des plaies chez des souris contrôles non diabétiques en comparaison avec des souris diabétiques afin de réduire les complications liées au diabète qui sont couteuses sur le plan humain et économique.

Bénéfices attendus

Nous savons aujourd’hui que le diabète ralentit la cicatrisation des plaies, rendant le processus de guérison plus difficile que la normale. Cet état entraine en même temps une plus grande prédisposition au développement de plaies chroniques. La phase préclinique consiste à étudier l’action des agents pharmacologiques in vivo chez le rongeur qui est une étape essentielle dans le développement de médicaments à visée thérapeutique. Ce projet a pour but d’étudier l’effet de nouvelles molécules sur le processus de cicatrisation (molécules aux propriétés cicatrisantes, réparatrices ou agissant sur le remodelage tissulaire ou la migration cellulaire) chez des souris diabétiques en comparaison avec des souris non diabétiques afin de réduire les complications liées au diabète.

Procédures

Prélèvements au jour 0, 5, 10, 15 et 20 au niveau de la veine caudale ou submandibulaire (20μL; durée du prélèvement 5-10 secondes) afin de suivre l'évolution de la glycémie durant 20 jours environ chez les souirs NOD SCID (Procédure 1). Prélèvements de sang rétro orbital (500μL; durée du prélèvement 30 secondes) sous isoflurane (2%) juste avant la mise à mort (Procédure 2)

Impact sur les animaux

Ce modèle induit des douleurs inflammatoires à l'animal liées à la biopsie cutanée. Les animaux sont suivis quotidiennement pendant la durée de l'expérimentation.

Devenir

Les animaux de la Procédure 1 "Induction du diabète de type 1 chez les souris NOD SCID" sont tous réutilisés dans la procédure 2 "Etude de candidats médicament dans un modèle de cicatrisation". Tous les animaux de la Procédure 2 "Etude de candidats médicament dans un modèle de cicatrisation" sont mis à mort à la fin de l’expérimentation afin de prélever la peau au niveau des plaies pour effectuer une analyse histologique, des dosages de cytokines, qPCR. Ces différents dosages et quantifications vont permettre de valider le modèle ainsi que l'analyse de l'efficacité des différentes molécules testées.

Remplacement

Remplacement : le modèle animal est fondamental dans notre cas, puisque l’étude de l’inflammation et de la cicatrisation ne peut se faire que sur un organisme vivant entier. Le processus de cicatrisation des plaies est complexe et dynamique et souvent multifactoriel qui implique des phases coordonnées et superposées, notamment la coagulation, l'inflammation, la prolifération et le remodelage visant à restaurer la fonction barrière et l'intégrité mécanique de la peau. Le système vasculaire et de nombreux types cellulaires, cytokines et médiateurs sont impliqués dans ce processus. Les modèles animaux de cicatrisation sont indispensables pour la compréhension de la physiopathologie de la maladie et la validation préclinique des composés. Des études préliminaires in vitro peuvent être réalisées sur des kératinocytes afin de sélectionner des candidats médicaments mais dans ce projet l'animal est indispensable pour relier cicatrisation et diabète.

Réduction

Réduction : Le nombre d’animaux utilisé sera réduit au minimum nécessaire pour obtenir des résultats pertinents, reproductibles et statistiquement significatifs évitant ainsi de refaire plusieurs fois les mêmes expérimentations. Le test statistique utilisé pour déterminer les différences entre chaque groupe va changer selon la distribution des échantillons : - Si les échantillons suivent une loi Normale : l’ANOVA de rang suivi d’un post test de Bonferroni sera effectué. - Si les échantillons ne suivent pas une distribution normale : le test de Kruskal-Wallis non paramétrique suivi par un post-test de Dunns de comparaison multiple sera utilisé.

Raffinement

Les plaies seront effectuées sous anesthésie générale xylazine/kétamine et une injection de lidocaine sera effectuée quelques minutes avant la réalisation des plaies. Les animaux sont observés quotidiennement pour s’assurer de leur bien-être des animaux et pour détecter au maximum la douleur au moment de l’expérimentation. Si des animaux montrent des signes de souffrance (point limite décrit dans la Procédure), de la buprénorphine ou le la Tolfédine pourront être administrées (si score cumulé de 2 atteint) ou ils seront mis à mort (si score cumulé atteint 4 ou si un des scores atteint 2 pour un même critère). Les souris seront hébergées dans des cages en portoir ventilé enrichies avec du Celuron ainsi que du Sizzle-Nest en continu dès leur arrivée. Elles auront un accès à l’eau et la nourriture ad libitum et suivront un cycle jour/nuit 12h/12h pendant toute la durée de l’expérimentation.

Choix des espèces

La souris C57BL/6 ou BALB/c est un animal pour lequel les outils génétiques, les anticorps spécifiques permettant la caractérisation des réponses immunitaires au niveau cellulaire/moléculaire sont les plus développés. De plus leur génome possède 99% de similitude avec le génome humain, ne présente aucun gène manquant/supplémentaire pouvant modifier l’intensité de l’inflammation obtenu. Ces souches sont mondialement utilisées, permettant une continuité et un moyen de comparaison unique. Les souris BALB/c offrent une réponse immunitaire exacerbée ce qui permet une meilleure quantification des molécules exprimées lors de cette réponse. De plus nous utiliserons des souris NOD SCID rendues diabétiques car il a été démontré l'impact de ce paramètre sur la cicatrisation dans plusieurs articles. Cette lignée immunodéficiente n'a pas de phénotype dommageable autre que le diabète développé après induction au STZ. Notre modèle est développé à partir de données littéraires permettant de réduire le nombre d'études de mise au point. Les animaux sont utilisés au stade adulte (à partir de 7 semaines) dans la procédure 2 "Etude de candidats médicament dans un modèle de cicatrisation" afin de disposer d’un organisme avec un processus de développement terminé et dont le système immunitaire est mature (développement thymique achevé). Les paramètres étudiés étant l’inflammation et son mécanisme, une souris juvénile ou trop âgée induira un biais dans l’expérimentation. Les animaux de la procédure 1 "Induction du diabète de type 1 chez les souris NOD SCID" pourront être utilisés à partir de 5 semaines pour bénéficier d'animaux qui auront minimum 7 semaines dans la procédure 2 "Etude de candidats médicament dans un modèle de cicatrisation".

396 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, puis gardées vivantes pour être réutilisées dans d'autres enregistrements. Rendues épileptiques, elles sont irradiées par microfaisceaux de rayons X sous anesthésie, la tête fixée dans un cadre stéréotaxique, pour tester une alternative à la chirurgie du foyer épileptique. Le porteur indique qu'un animal perdant plus de 20 % de son poids ou présentant une akinésie est mis à mort, et qu'un surdosage d'irradiation entraîne aussi l'euthanasie. Les bénéfices annoncés pour les patients épileptiques restent renvoyés à une éventuelle application chez l'humain.

Objectifs

Le traitement pharmacologique des différents types d’épilepsie est complexe et doit répondre au mieux aux différents types de crises présentées par les patients. Il n’est efficace que chez 70 % des patients. L’épilepsie Mésio-Temporale (MesioTemporal Lobe Epilepsy ou MTLE) est la forme d’épilepsie focale la plus fréquente en clinique parmi celles qui ne répondent pas aux traitements pharmacologiques par les anti-épileptiques de référence. La MTLE est le plus souvent caractérisée sur le plan histologique par une sclérose de l’hippocampe (dispersion des cellules granulaires du gyrus denté et mort des neurones pyramidaux au niveau de la corne d’Ammon, CA1 et CA3). La résection chirurgicale du foyer épileptique ou zone épileptogène (ZE) est l’unique possibilité, à l’heure actuelle, de guérir les patients atteints de MTLE. Cette chirurgie nécessite une craniotomie pour enlever le foyer épileptique. C’est une méthode efficace dans 50 à 70 % des cas, mais qui comporte plusieurs risques (infection, effets secondaires, troubles cognitifs) et représente un coût hospitalier important (plus de 10 jours d’hospitalisation et suivi pendant plusieurs mois). L’irradiation par microfaisceaux de Rayons-X ou « Microbeam Radiation Therapy » (MRT) est de plus en plus étudiée chez l’animal dans le but d’une application à l’homme dans le cas de tumeurs cérébrales ou de maladies neurologiques dans lesquelles un circuit nerveux dysfonctionne (Serduc et al, 2010 ; Studer et al, 2015). Il s’agit d’une technique non invasive, focalisée et avec une très faible toxicité pour les tissus adjacents du fait de sa grande précision. Dans des pathologies comme la MTLE, cette méthode permettrait de s’affranchir d’une chirurgie invasive (Pouyatos et al, 2013). L’objectif de ce projet est donc de développer sur un modèle de MTLE chez la souris (Riban et al, 2002 ; Heinrich et al, 2011) un protocole de MRT qui permette de rendre moins invasive la prise en charge des patient atteints d’une épilepsie focale.

Bénéfices attendus

L’irradiation par microfaisceaux de Rayons-X ou « Microbeam Radiation Therapy » (MRT) est de plus en plus étudiée chez l’animal dans le but d’une application à l’homme dans le cas de tumeurs cérébrales ou de maladies neurologiques dans lesquelles un circuit nerveux dysfonctionne (Serduc et al, 2010 ; Studer et al, 2015). Il s’agit d’une technique non invasive, focalisée et avec une très faible toxicité pour les tissus adjacents du fait de sa grande précision. Dans des pathologies comme la MTLE, cette méthode permettrait de s’affranchir d’une chirurgie invasive (Pouyatos et al, 2013).

Procédures

- Pendant l’irradiation les souris seront anesthésiées et, après vérification de l’absence de réflexe du retrait de la patte, elles seront fixées dans un cadre stéréotaxique afin d’éviter tout mouvement de la tête et les précautions suivantes seront prises afin de limiter le stress et la douleur: - Anesthésie générale: Kétamine + Xylazine (voir ci-dessous) d’environ 40 min. - Anesthésie locale: baume à la lidocaïne 2% au niveau des oreilles.

Impact sur les animaux

Comme le développement d’une épilepsie et le traitement par MRT peuvent altérer la prise alimentaire, notre point limite se basera à la fois sur le poids de l’animal et sur son comportement général. Un animal sera immédiatement euthanasié si l’un des signes suivants est observé: perte de poids > 20% du poids mesuré le jour de l’irradiation, akinésie, rotation (voir Annexe 3). La radiothérapie peut être une source de souffrance si la dose délivrée est trop élevée. Les choix concernant les champs d’irradiation et les doses délivrées à la peau ont donc été effectuées en fonction des connaissances actuelles et de notre expertise. En cas d’erreur ou de problème technique au moment de l’irradiation d’un animal et notamment de surdosage, l’animal sera euthanasié immédiatement par surdosage de pentobarbital (150 mg/kg). Après radiothérapie, des effets secondaires invalidants (hyper ou hypo-locomotion, modification de la prise de nourriture, nécrose de la peau, ischémie cérébrale) peuvent apparaitre avec des délais différents selon les animaux

Devenir

L’ensemble des animaux seront gardés en vie à la suite de la manipulation. Ils seront rapatriés dans l’animalerie du GIN afin de réaliser les enregistrements de leurs crises, leur comportement et les contrôles histologiques. Ces procédures font l’objet d’une demande d’autorisation gérée par le comité d’éthique du GIN.

Remplacement

L’utilisation de l’animal dans son intégrité est nécessaire pour répondre à notre question. Il n’existe aucun modèle cellulaire qui permette de mettre en évidence un foyer épileptique dans le cerveau ni de le traiter par irradiation et l’utilisation d’irradiation fractionnée spatialement n’est pas encore possible chez l’homme. Le développement d’une stratégie thérapeutique telle qu’envisagée dans cette étude nécessite d’avoir recours à un modèle animal dans lequel le développement d’un foyer épileptogène a été clairement caractérisé et mis en évidence. Dans cette étude, la souris sera utilisée, malgré sa petite taille, en complément de l’étude effectuée chez le rat en parallèle. En effet, le modèle souris d’épilepsie mésiotemporale présente une plus grande stabilité, une évolution plus rapide de la pathologie, une fréquence de crises plus importante et une plus grande similitude des symptômes avec la clinique humaine. L’utilisation des modèles souris et rat sera ainsi très complémentaire et permettra d’obtenir des résultats plus fiables pour la préparation des essais cliniques.

Réduction

Le nombre d’animaux a été réduit au maximum tout en permettant une exploitation statistique rigoureuse des résultats. Pour cela, en fonction de l’expérience acquise en modélisation animale des épilepsies, nous estimons que 396 animaux au total seront utilisés pendant 5 ans dans les quatre séries d’expériences de ce projet.

Raffinement

Nous veillerons à suivre les animaux quotidiennement de façon à intervenir immédiatement dès qu’un signe évocateur de douleur serait observé. Pour réduire toute douleur, souffrance ou anxiété, ils seront anesthésiés et analgésiés de façon profonde durant toutes les interventions (chirurgie, IRM, irradiation) et les techniques d’imagerie que nous utiliserons dans nos procédures sont sans douleur pour l’animal et permettent de répéter les acquisitions chez le même animal. Les animaux seront maintenus avec de la nourriture et de la boisson à volonté, ainsi que des objets en carton et du coton. Il seront habitués à la manipulation par des expérimentateurs agrémentés. A la fin des expériences, les animaux seront euthanasiés par surdosage de pentobarbital.

Choix des espèces

Le modèle d’épilepsie KA-MTLE chez la souris et chez le rat sont actuellement les modèles de référence les plus proches des conditions observées chez l’homme, aussi bien sur le plan électrophysiologique, histologique que pharmacologique. Malgré sa taille réduite nous souhaitons utiliser l’espèce souris, en complément de l’étude sur le rat, en raison de sa plus grande prédictivité et sa plus grande stabilité dans le temps que le modèle rat. Des animaux adultes seront utilisés dans ce projet. Ils auront 8 semaines en début d’expérience et 12 à 15 semaines lorsqu’ils seront irradiés à l’ESRF. Le modèle de souris KA-MTLE a été développé chez des animaux de cet âge afin de travailler sur un cerveau mature qui restera stable tout au long de la procédure.

5050 souris transgéniques 5XFAD vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des composés en développement par voie orale jusqu'à 50 jours ou par injection, avec des prélèvements sanguins hebdomadaires, avant d'être tuées pour prélever le cerveau et enregistrer l'activité neuronale sur coupes. Le porteur indique n'attendre aucun effet indésirable notable hormis une possible agressivité des mâles. Il précise que les animaux surnuméraires servent à l'entraînement technique du personnel puis sont eux aussi tués.

Objectifs

La maladie d’Alzheimer (MA) est un syndrome neurodégénératif associé à une perte progressive des fonctions cognitives. La MA est corrélée à des modifications cérébrales incluant le dépôt de plaques amyloïdes, des dégénérescences de neurones et la mort neuronale qui conduisent inévitablement à la perte de mémoire et aux déficits dans la transmission synaptique. L’objectif de ce projet est d’étudier les modifications du réseau neuronal par électrophysiologie sur coupes cérébrales dans des modèles animaux transgéniques présentant des déficits cognitifs et de tester l'efficacité de molécules en développement sur ces modifications. Pour ce projet, nous utiliserons le modèle 5XFAD, bien décrit dans la littérature. Ce modèle de souris associe 5 mutations responsables de la MA: trois mutations du gène de l’APP : la suédoise, la « Florida », la londonienne, et deux mutations du gène PS1. La lignée 5xFAD présente une accumulation intracellulaire précoce d'un peptide caractéristique de la MA dès 1,5 mois, suivie à 2 mois d’une perte neuronale importante. Une atteinte de la mémoire de travail, de la mémoire associative et de la mémoire de référence sont observées dès l’âge de 3 mois. Les souris transgéniques 5XFAD présentent les principales caractéristiques de la MA et constituent un modèle de choix pour l’étude de la neurodégénérescence intra neuronale et l’efficacité de composés en développement. Les modèles de souris sur lesquels nous allons travailler ne présentent pas de phénotype dommageable à l'âge auquel nous les utilisons (moins de 6 mois).

Bénéfices attendus

Ce projet scientifique associé à notre plateforme d'électrophysiologie ex-vivo (sur coupes cérébrales) permettra de tester les effets neurotoxiques/neuroprotecteurs de composés en développement sur les modifications du réseau neuronal liées à la maladie d’Alzheimer (MA). La technique utilisée sera l'électrophysiologie ex-vivo, c'est-à-dire sur coupes cérébrales.

Procédures

Au cours de ce projet, nous allons tester l'effet de composés en développement sur les modifications de plasticité synaptique observées dans le modèle 5XFAD. Pour cela, des composés seront administrés à des souris 5XFAD, par voies entérales (orale) ou parentérales (intrapéritonéal, sous-cutané, intramusculaire et intraveineux). -voie intrapéritonéale : La durée d’administration consécutive du produit sera fonction de la nature du véhicule utilisé ou de la tolérance du produit et ne pourra dépasser 21 jours, à raison d’une fois par jour. -voie orale : de 1 à 50 jours maximum, une ou deux fois par jour. -voie sous-cutanée : de 1 à 7 jours maximum, une fois par jour. -voie intraveineuse : de 1 à 7 jours maximum, une fois par jour. -voie intramusculaire : 1 à 7 jours maximum, une fois par jour Lors de l’expérimentation, des prélèvements sanguins au niveau de la veine caudale pourront être effectués 1 fois par semaine maximum sur animal vigile selon les méthodes en vigueurs suivantes : - Au niveau de la veine caudale, sur animal vigile maintenu dans une boite à contention ; - Au niveau de la veine sub-mandibulaire, sur animal vigile ; - Au niveau de la veine jugulaire, sur animal anesthésié à l’isoflurane (après induction 3min à 5%). Selon les recommandations, le volume maximum prélevé sera de 7,5% de volume sanguin total (soit 100 à 140µL de sang). Un point de compression sera réalisé pour arrêter tout saignement avant que l’animal ne retourne dans sa cage.

Impact sur les animaux

A priori, aucun effet indésirable n’est attendu sur ces animaux, hormis une augmentation possible d’agressivité chez les mâles. En cas d’agressivité, un isolement des animaux sera mis en place. Une fiche d’observations/points limites (en annexe) permettra d’assurer le suivi des points limites adaptés aux modèles et aux différentes voies d’administration des composés. Les animaux sont évalués sur leur comportement, leur respiration, leur aspect général, si besoin leur poids quotidiennement. Les points limites ainsi que les procédures de soins ou d’hébergement seront affinés en fonction des observations réalisées sur cette lignée. Les recommandations du fournisseur concernant l’hébergement (stabulation, enrichissement…) seront suivies afin d’améliorer le bien-être animal. Le modèle de souris transgéniques 5XFAD que nous utiliserons présentent un phénotype non dommageable à l'âge étudié (moins de 6 mois). Si des phénomènes inattendus, non répertoriés par le fournisseur se manifestaient, les points limites seraient adaptés. Suite à l’administration des composés à tester, il se peut que des signes d’inconfort ou d’intolérance se manifestent (rougeur, gonflement…). L’altération de l’état d’un animal entraînera la mise en place d'interventions précoces et adaptées et des procédures de modifications de soins pourront être mises en œuvre en cas de besoin comme détaillé dans la fiche de suivi. Les animaux exprimant des signes permanents de douleur seront exclus de l’étude et mis à mort immédiatement, sur décision du directeur de l'étude et/ou du vétérinaire désigné.

Devenir

A la fin de la période d'administration du composé, les animaux seront mis à mort afin de réaliser des coupes cérébrales et d'enregistrer l’activité neuronale par la technique d’électrophysiologie ex-vivo. Les animaux surnuméraires seront utilisés pour la formation et le maintien des gestes techniques du personnel et seront mis à mort à la fin de la procédure.

Remplacement

L'organisation des réseaux neuronaux et la plasticité synaptique peuvent être étudiés sur des coupes cérébrales de rongeurs par électrophysiologie. Elles ne peuvent pas être reproduites, ni étudiées dans des modèles de cultures cellulaires in-vitro. L'étude de l'effet de composés en développement et une meilleure compréhension des pathologies du système nerveux central nécessitent donc l'administration de composés sur un organisme entier. Nos expérimentations au sein de la société, même si elles nécessitent l’utilisation d’animaux, sont pratiquées avec un souci permanent de réduction du nombre d’animaux et de bien-être pour nos animaux en expérimentation. Toutes les expériences sont réalisées dans le respect éthique de la règle des 3 R.

Réduction

Le nombre de souris a été réduit autant que possible, tout en étant suffisant pour l'obtention de résultats exploitables. L'évaluation du nombre d'animaux nécessaire a été effectuée par un programme statistique. Les résultats seront analysés avec un logiciel adapté. Nous adapterons les tests statistiques en fonction de la distribution des observables, qu'elle soit normale ou non.

Raffinement

Dès leur arrivée, les animaux seront hébergés dans des cages collectives avec un environnement enrichi (par exemple : igloos, briques de bois à grignoter, ambiance sonore dans la salle, commutation progressive de la lumière, etc.). Suivra alors une période d’acclimatation de 5 jours minimum, pendant laquelle aucun geste technique lié à la procédure expérimentale ne sera réalisé. Les conditions d’hébergement et de soins et les méthodes utilisées ont été choisies et conçues de manière à réduire au maximum toute douleur, angoisse ou dommages durables que pourraient ressentir les animaux. Le contrôle mortalité des animaux sera effectué quotidiennement sans exception (Week-ends & jours fériés inclus) par du personnel compétent et qualifié. Le bien-être des animaux sera évalué par l’observation des signes cliniques. Soins : Des points limites ont été établis afin d’anticiper toute dégradation de l’état de santé général des animaux et, le cas échéant, d’appliquer des protocoles de soins adaptés.

Choix des espèces

Nos expérimentations sont réalisées chez la souris, petit rongeur dont l’étude est extrêmement répandue au sein des laboratoires de recherche en Neurosciences, rendant les résultats pertinents pour une large communauté scientifique nationale et internationale. Ces rongeurs, de petite taille et d’élevage facile, possèdent un système nerveux dont le développement est extrêmement proche de celui du système nerveux humain, et dont l’organisation, certes simplifiée, est suffisamment complexe. Pour l'étude des déficits de la maladie d'Alzheimer, la souris représente un modèle de choix pertinent car il existe des modèles transgéniques, bien décrits dans la littérature et couramment utilisés pour tester l'effet de composés en développement. Les animaux seront utilisés de l'âge de 3 semaines à 24 semaines, âge auquel le phénotype n’est pas dommageable, et ceci afin de couvrir tous les âges, du jeune à l'adulte.

6060 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Après implantation d'électrodes dans le cerveau par stéréotaxie, elles reçoivent des composés en développement par voie orale jusqu'à 50 jours ou par injection, avec un prélèvement sanguin hebdomadaire possible, pour tester des effets neuroprotecteurs ou neurotoxiques sur des modèles de la maladie d'Alzheimer. Le porteur indique que ces souris présentent un phénotype dommageable et que des signes de douleur peuvent persister après la chirurgie malgré les analgésiques. Les retombées annoncées se limitent à mieux comprendre les réseaux neuronaux, l'implantation cérébrale entraînant la mise à mort de tous les animaux pour contrôle histologique.

Objectifs

La neurodégénérescence avec perte progressive des structures et fonctions neuronales est le facteur causal clé de troubles neurologiques dévastateurs tels que la maladie d'Alzheimer (MA). Malgré les progrès significatifs de la recherche en neurobiologie, la prévalence de ces pathologies continue d’augmenter en raison du manque de traitements curatifs. La MA est un syndrome neurodégénératif associé à une perte progressive des fonctions cognitives. Elle est corrélée à des modifications incluant des plaques amyloïdes, des dégénérescencesde neurones et la mort neuronale. Les premières lésions apparaissent dans une zone du cerveau impliquée dans l'apprentissage et la mémoire, l'hippocampe. L’apprentissage et la mémoire reposent sur la plasticité des circuits de notre cerveau, c’est-à-dire la capacité des neurones à modifier de façon durable l’efficacité de leur transmission synaptique. De plus, un nombre croissant de données épidémiologiques a démontré un lien entre le diabète de type 2 et la MA. Cette découverte a permis d’ouvrir de nouvelles perspectives de recherche pour mieux appréhender la physiopathologie des maladies neurodégénératives et ouvrir de nouvelles approches thérapeutiques. Dans ce projet, nous proposons d'étudier dans des modèles de souris transgéniques de la MA et mutantes du diabète présentant des altérations de l’apprentissage et de la mémoire : -les modifications des réseaux neuronaux liées au génotype par des enregistrements électrophysiologiques in-vivo (animal vigile ou anesthésié). -l'efficacité / toxicité de composés en développement sur les modifications des réseaux neuronaux. Pour ces études, des enregistrements électrophysiologiques (animal vigile ou anesthésié) permettront d’étudier les modifications du réseau neuronal induites par administration unique ou répétée de composés en développement par voie entérale (orale) ou parentérale (intraveineuse, intrapéritonéale, sous-cutanée, intramusculaire).

Bénéfices attendus

Ce projet scientifique associé à notre plateforme d'électrophysiologie in vivo (sur animal vigile ou anesthésié) permettra de mettre en évidence les modifications des réseaux neuronaux associés à des modèles de la MA et de tester les effets neurotoxiques/neuroprotecteurs de composés en développement sur les modifications du réseau neuronal liées à la MA.

Procédures

Au cours de ce projet, nous allons tester l'effet de composés en développement sur les modifications de plasticité synaptique observées dans des modèles animaux de la maladie d'Alzheimer, après implantation d'électrodes par stéréotaxie au cours d'une unique chirurgie. Pour cela, des composés seront administrés à des souris, par voies entérale (orale) ou parentérales (intrapéritonéal, sous-cutané, intramusculaire et intraveineux). -voie intrapéritonéale : La durée d’administration consécutive du produit sera fonction de la nature du véhicule utilisé ou de la tolérance du produit et ne pourra dépasser 21 jours, à raison d’une fois par jour. -voie orale : de 1 à 50 jours maximum, une ou deux fois par jour. -voie sous-cutanée : de 1 à 7 jours maximum, une fois par jour. -voie intraveineuse : de 1 à 7 jours maximum, une fois par jour. -voie intramusculaire : 1 à 7 jours maximum, une fois par jour Si nécessaire, un prélèvement sanguin par semaine de moins de 7.5 % du volume sanguin circulant sera effectué.

Impact sur les animaux

Les modèles de souris que nous utiliserons présentent un phénotype dommageable. Leur bien-être sera attentivement suivi durant toute la durée du projet grâce à des fiches d'observation/points limites adaptées aux modèles. Des procédures de prise en charge adaptées seront mises en place. En cas d’administration de composés, il se peut que des signes d’inconfort ou d’intolérance se manifestent. Pour les études sur l’animal vigile, suite au placement par chirurgie des électrodes, il se peut que les animaux présentent des signes de douleur malgré les précautions prises pendant la chirurgie (analgésiques, anesthésiques) et en post-opératoire (antibiotiques). Dans tous les cas, des points limites préalablement définis et adaptés permettront d’assurer un suivi de l’état général des animaux et de mettre en place des interventions précoces et adaptées en cas de souffrance animale.

Devenir

Une chirurgie permettant l'implantation des électrodes nécessaires aux enregistrements électrophysiologiques sera effectuée sur tous les animaux de ce projet. A la fin des procédures expérimentales, tous les animaux seront donc mis à mort. Un contrôle histologique permettant de vérifier l'emplacement des électrodes pourra être réalisé.

Remplacement

L'organisation des réseaux neuronaux et la plasticité synaptique peuvent être étudiées sur animaux vigiles ou anesthésiés par électrophysiologie in vivo. Elles ne peuvent pas être reproduites ni étudiées dans des modèles de cultures cellulaires in vitro. L'étude de l'effet de composés en développement nécessite l'administration de ces composés sur un organisme entier. La souris représente un modèle de choix car il existe des protocoles bien établis permettant d'étudier la plasticité synaptique, l'activité oscillatoire et les taux de décharge, couramment utilisés par la communauté scientifique d'après les données bibliographiques. Nos expérimentations au sein de la société, même si elles nécessitent l’utilisation d’animaux, sont pratiquées avec un souci permanent de réduction du nombre d’animaux et de bien-être pour nos animaux en expérimentation. Toutes les expériences sont réalisées dans le respect éthique de la règle des 3 R.

Réduction

Le nombre de rongeurs utilisé a été réduit autant que possible, tout en étant suffisant pour l'obtention de résultats exploitables. Sur un même animal, nous pourrons enregistrer simultanément différents paramètres électrophysiologiques (plasticité synaptique, transmission synaptique, activité neuronale). L'évaluation du nombre d'animaux nécessaire a été effectuée par l'utilisation de tests statistiques. Les résultats seront analysés avec un logiciel adapté. Nous adapterons les tests statistiques en fonction de la distribution des observables, qu'elle soit normale ou non.

Raffinement

Avant la chirurgie, une période d’acclimatation des animaux d’au moins 5 jours sera respectée. Pendant la chirurgie, des mesures seront mises en place afin de réduire au maximum la douleur : anesthésiques et analgésiques, gel ophtalmique, maintien d'une température constante... Pour les études sur animal vigile après la chirurgie, les animaux seront isolés afin d'éviter tout dommage au niveau des implants ou l'apport de germes susceptibles de provoquer une infection. Les animaux recevront une antibiothérapie adaptée. Un suivi renforcé des animaux sera réalisé après la phase d’opération. Une période de récupération post-chirurgicale d’au moins 7 jours sera respectée. Dès réception des animaux, une observation journalière sera mise en place. Des points limites préalablement définis et adaptés permettront d’assurer un suivi de l’état général des animaux (souffrance, angoisse…) et de préserver leur bien-être. En cas d’altération de l’état de l’animal, la surveillance sera rapprochée et les animaux seront soignés en fonction de la sévérite de la douleur observée.

Choix des espèces

Nos expérimentations sont réalisées chez la souris, petit rongeur dont l’étude est extrêmement répandue au sein des laboratoires de recherche en Neurosciences, rendant les résultats pertinents pour une large communauté scientifique nationale et internationale. Ces rongeurs, de petite taille et d’élevage facile, possèdent un système nerveux dont le développement est extrêmement proche de celui du système nerveux humain, et dont l’organisation, certes simplifiée, est suffisamment complexe. Pour l'étude des déficits de la maladie d'Alzheimer, la souris représente un modèle de choix pertinent car il existe des modèles transgéniques, bien décrits dans la littérature et couramment utilisés pour tester l'effet de composés en développement sur le fonctionnement cérébral. Les animaux seront utilisés de l'âge de 4 semaines à 40 semaines afin de couvrir tous les âges, du jeune à l'adulte et tous les stades de la pathologie.

4320 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit une greffe de cellules tumorales sous la peau, puis des injections répétées d'anticorps et d'inhibiteurs deux à trois fois par semaine, avec un risque de nécrose de la tumeur, de cachexie et d'isolement. Le porteur, une société, indique évaluer l'efficacité anticancéreuse de ses anticorps monoclonaux en combinaison, et affirme qu'aucun modèle in vitro ne permet ce test faute de système immunitaire fonctionnel. Les animaux dont la tumeur ne prend pas sont eux aussi mis à mort.

Objectifs

Ces dernières années l’immunothérapie a connu un essor important dans la prise en charge des cancers. Elle a montré une efficacité conséquente dans diverses indications, cependant un certain nombre de patients présentes des résistances spontanées ou acquises. Notre société développe des anticorps monoclonaux à visée thérapeutique dans le cancer. L’objectif principal de cette étude est d’évaluer l’efficacité anti-cancéreuse des anticorps monoclonaux en combinaison avec des inhibiteurs de point de contrôle dans des modèles de souris. L’objectif secondaire est d’appréhender les mécanismes d’action de ces anticorps par l’évaluation des modulations du système immunitaire.

Bénéfices attendus

Notre hypothèse est que nos cibles thérapeutiques jouent un rôle dans le développement tumoral. Notre société évalue l’effet anti-tumoral de thérapies ciblées seules ou en combinaison avec des inhibiteurs de point de contrôle dans le cadre de plusieurs projets cliniques. Les travaux présentés dans ce projet permettront une meilleure compréhension du fonctionnement des candidats médicaments et de leur fonctionnement en association avec des inhibiteurs de point de contrôle. Ils permettront également de mieux définir le profil des patients éligibles au traitement et susceptibles d’y répondre.

Procédures

Toutes les souris prévues dans le protocole subiront des injections intrapéritonéales d'anticorps ciblés (2 injections par semaine sur toute la durée du suivi tumoral, soit du jour d'inclusion dans un groupe de traitement jusqu'à l'obtention d'un point limite) et/ou inhibiteurs de point de contrôle (3 injections espacées de 4 jours à partir de l'inclusion des animaux dans les groupes de traitement). Une injection sous-cutannée de lignées cellulaires est réalisée lors de la greffe (une seule fois). Toutes les injections sont réalisées dans un volume de 100μL. Elles sont faites sur animal vigile dans un délais de 20 secondes à partir de la contention.

Impact sur les animaux

Dans les deux procédures il est possible d’observer des phénomènes de nécrose des tumeurs à la surface de la peau. Les individus concernés seront mis à mort. Des signes de fatigue, cachexie et d'isolement sociale sont également possibles. Des mesures d'enrichissement du milieu et de nourriture semi-liquide dans la cage seront mises en œuvre dans un premier temps. Si les point limites sont atteints, les animaux seront mis à mort et une autopsie sera effectuer de manière à évaluer la présence potentielle de métastases. Si de telles observations sont avérées, les surveillances des animaux restants seront accrues.

Devenir

Tous les animaux porteurs de tumeurs seront donc mis à mort en fin de procédure expérimentale selon les critères décrits dans le projet. Des prélèvements tumoraux postmortem seront effectués afin d'analyser le mécanisme d'action des différentes combinaisons de traitements. Etant donné la variabilité de prise de greffe des différents modèles cellulaires, certains animaux peuvent ne pas présenter de tumeur. Ayant subi une injection de cellules, il ne peuvent être considérés comme naïfs de traitement et réutilisés dans d'autres procédures.Les animaux ne présentant pas de prise tumorale seront mis à mort 2 mois après la greffe, en fin de procédure. Des prélèvements biologiques postmortem pourrons également être réalisés sur ces animaux afin d'obtenir des tissus contrôles sains en référence de nos expérimentations

Remplacement

La présence de tous les acteurs micro-environnementaux est nécessaire à la compréhension des mécanismes biologiques qui impliquent l’activité de nos anticorps monoclonaux. Il n'existe pas de modèles d'étude in silico ou in vitro permettant l'évaluation de l'efficacité des inhibiteurs de point de contrôle car ils nécessitent la présence d'un système immunitaire fonctionnel.

Réduction

Nous avons calculé le nombre minimum de souris à inclure, en prenant en compte notre expérience, les études déjà publiées utilisant ces modèles ainsi que pour de disposer de suffisamment de matériel biologique pour rendre nos résultats interprétables. Pour les procédures 1 et 2) D'après notre expérience la variabilité des modèles de greffes sur souris immunocompétentes traitées avec ces composés ne permet pas de voir l'effet de ces drogues seules ou en combinaison au-dessous d'un effectif de 12 souris. Compte tenu des aléas de prise tumorales, nous envisageons des groupes de 15 souris. Dans l’analyse des résultats, nous porterons une attention à la fréquence des animaux répondeurs. Une réduction a été opérée dans les différentes procédures en mutualisant les bras contrôle pour plusieurs lignes de traitement. Une réduction sera opérée dans la procédure 2 sur la base des réponses observées en procédure 1.

Raffinement

Tout au long de notre expérience, le suivi rigoureux des animaux permettra la recherche de tout signe de souffrance. Dans toutes les procédures le volume tumoral sera évalué 2 fois par semaine avec un pied à coulisse. Le poids des animaux sera évalué 1 fois par semaine. Pour l’ensemble des procédures, les signes de souffrance (prostration, propreté, amaigrissement, isolement social) seront surveillés à chaque mesure tumorale ou pesée soit 2 fois par semaine. Des signes de fatigue, cachexie et d'isolement sociale sont également possibles. Des mesures d'enrichissement du milieu et de nourriture semi-liquide dans la cage seront mises en œuvre dans un premier temps. Si les point limites sont atteints, les animaux seront mis à mort et une autopsie sera effectuer de manière à évaluer la présence potentielle de métastases. Si de telles observations sont avérées, les surveillances des animaux restants seront accrues.

Choix des espèces

Certaines de ces molécules sont des anticorps dirigés contre des cibles de souris. La souris compétente est le modèle le plus approprié pour greffer du tissu de cette même espèce tout en permettant de faire des suivis de pharmacocinétique et pharmacodynamie dans le cadre de traitements avec des anticorps monoclonaux et de inhibiteurs de point de contrôle. Par ailleurs les schémas d'administration des anticorps sont bien standardisés (voie, doses, posologies, ...) contrairement à d'autres modèles tels que le zebrafish. Par conséquent, les modèles immunocompétents tels que les souris BalbC ou C57b6 sont nécessaires à la réalisation de cette étude. Les expérimentations seront effectuées sur des souris adultes (âge supérieur à 7 semaines) conformément aux modèles établis.

75 souris immunodéficientes vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des cellules tumorales humaines leur sont greffées dans le cerveau, suivies d'un suivi par bioluminescence, de séances de radiothérapie et d'une injection sous ultrasons, les animaux présentant en fin de protocole des symptômes neurologiques. Le porteur indique tester une molécule, l'AsiDNA, contre des tumeurs cérébrales pédiatriques qu'il décrit comme incurables, et affirme qu'il faut évaluer in vivo le passage de la molécule dans un cerveau entier. Les retombées pour les enfants malades sont présentées comme un espoir à court terme.

Objectifs

Les tumeurs cérébrales constituent la première cause de mortalité et de morbidité par cancer chez l'enfant et l'adulte jeune. Les gliomes infiltrant de la ligne médiane (ou DMG), qui représentent 10 à 15% des tumeurs cérébrales pédiatriques, sont les formes les plus graves et les plus mal connues sur le plan biologique. Ces tumeurs sont inopérables en raison de leur nature infiltrante et de leur localisation profonde dans le tronc cérébral. Elles sont chimiorésistantes et la radiothérapie, traitement standard, n'est efficace que transitoirement. En cela, ces tumeurs sont universellement incurables et constituent le plus grand défi thérapeutique de l'oncologie pédiatrique à ce jour. Les AsiDNA sont des molécules composées de courts ADN. Lors de l'absorption, les cellules perçoivent les AsiDNA comme un dommage à la cellule et déclenchent une activation aberrante des voies de signalisation de réparation à l'ADN. Ce large mécanisme d'action en fait un radio- et chimiosensibilisateur efficace dans un large éventail de tumeurs malignes, y compris les tumeurs cérébrales, telles que le glioblastome. Dans ce projet, nous souhaitons mettre en évidence un effet antitumoral des AsiDNA en combinaison à la radiothérapie dans nos modèles de xénogreffes de DMG. Dans une première étude cinétique et pharmacodynamique, nous confirmerons le passage de ces molécules à travers la barrière hémato-encéphélique (BHE) et l’effet potentialisant d’un système d’ouverture de la BHE par des ultrasons sur ce passage. Puis, dans le cas où le passage est suffisant pour atteindre la tumeur et provoqué une réponse dans celle-ci, nous évaluerons l’effet antitumoral des molécules sur un modèle de xénogreffes de DMG par un suivi longitudinal de la croissance tumorale couplée à une étude de survie. Dans le cas où ses objectifs seraient atteints, les molécules seront directement transférées en clinique chez des patients pédiatriques en phase I.

Bénéfices attendus

Les DMG sont des tumeurs pédiatriques universellement incurables et constituent le plus grand défi thérapeutique de l'oncologie pédiatrique à ce jour car aucun traitement à ce jour ne permet d’améliorer de façon importante la survie des patients. Le traitement par des AsiDNA est un nouvel espoir thérapeutique pour traiter ses tumeurs. Nous espérons pouvoir améliorer la survie de ces enfants à court terme.

Procédures

Greffes intracérébrales stéréotaxiques sous anesthésie générale thermostatée à 37°C, durée 20 minutes, une fois. Suivis en bioluminescence sous anesthésie générale thermostatée à 37°C, durée 15 minutes: 1 à 3 fois. Irradiation de radiothérapie localisée à 4 kGy guidée par l'image (SARRP), sous anesthésie générale thermostatée à 37°C, durée 2 minutes, maximum 8 fois. Injection intranveineuse sous stimulation ultrasonique sous anesthésie générale, durée 15 minutes, une fois.

Impact sur les animaux

Les animaux seront greffés avec des tumeurs directement en intracérébral. Bien que nous contrôlions la croissance tumorale, en fin de protocole, les animaux présenteront des symptômes neurologiques (principalement apathie) qui correspondront à la fin de la procédure et à l'arrêt de la procédure. Les doses de radiothérapie utilisées ici sont très bien tolérées chez l’animal et n’engendrent aucun effet secondaire. Les doses utilisées d’AsiDNA pour traiter les souris sont bien inférieures aux doses maximales tolérées. Les ultrasons à faibles intensités (stimulation ultrasonique) n'induisent aucun effet secondaire chez l'animal à court ou à long terme.

Devenir

Afin de pouvoir étudier les effets des traitements sur les tumeurs et le tissu cérébral, nous devrons mettre à mort l'animal afin d'étudier son cerveau.

Remplacement

L’efficacité des AsiDNA développées par la société Onxeo a été évaluée dans un 1er temps in vitro, avec un bénéfice supérieur lorqu’ils sont utilisés en combinaison avec de l’irradiation. Toutefois, il est reconnu que la BHE est un réel frein quant aux passages de molécules dans les tumeurs cérébrales. Il est donc nécessaire d’évaluer dans un contexte in vivo le passage et la pharmacodynamique des AsiDNA dans un cerveau vivant entier. De plus, pour le soutien du passage de la molécule vers un essai clinique humain, il est nécessaire d’avoir des données précliniques chez l’animal démontrant l’efficacité et la non toxicité des médicaments.

Réduction

Nos xénogreffes sont suivies par bioluminescence. Ce suivi longitudinal permet d'extrapoler le volume tumoral sans avoir besoin de sacrifier des animaux. Cela permet donc de diminuer le nombre des animaux par procédures et de prévoir au plus tôt la souffrance des animaux. De plus, les animaux développent des tumeurs de façon homogènes et reproductibles (100% de prise tumorale). Pour la procédure 1, nous utiliserons uniquement 3 animaux par conditions pour confirmer le passage de la molécule dans le tissu cérébral. Nous ne ferons pas statistiques sur cette partie. Pour la procédure 2, nous avons calculer le nombre optimum de souris afin d'avoir un résultat statistiquement fiable, soit l'utilisation de 60 souris pour 6 conditions différentes testées.

Raffinement

Pour limiter la souffrance liée à la progression tumorale, les animaux seront suivis chaque jour pour observer leur comportement, et dès l'apparition d'un signe clinique, les animaux recevront un antalgique (0,1 mg/kg de buprénorphine par voie souscutanée (10mL/kg)). Toutes les procédures sont réalisées sous anesthésie générale pour limiter la douleur et le stress des animaux. Les injections seront réalisées après anesthésie locale (Lidocaïne). Les animaux seront hébergés en groupe dès leur réveil et recevront nourriture et boisson ad libitum. Les procédures dureront entre 1 et 6 mois suivant la croissance tumorale du modèle et la réponse au traitement. La dose du médicament évalué est inférieure à la dose maximale tolérée chez l’homme, 1300mg et des études d’efficacité chez la souris dans d’autres types tumoraux n’ont montré aucun effet toxique à la dose quenous utiliserons. Nous n’attendons donc pas à avoir de la toxicité. Les études précliniques utilisant les AsiDNA, n'ont pas rapporté de toxicité supplémentaire de ces médicaments seuls ou en association avec des agents génotoxiques. De plus, les résultats récents de l'essai clinique de phase I/II du DRIIM ont démontré que l'administration locale d'AsiDNA améliorait la réponse radiologique des métastases cutanées du mélanome, sans toxicité cutanée supplémentaire. Les doses d’irradiation ont été déterminées par l’étude de la radiorésistance in vivo dans nos modèles et n’engendre aucun effets secondaires. Des point limites adaptés et des critères d'arrêt précoces de souffrance ont été définis et seront strictement appliqués.

Choix des espèces

La souris est l'espèce privilégiée en oncologie. Dans ce projet, des cellules humaines seront greffées à des souris immunodéficientes nudes, modèle sur lequel les chercheurs en cancérologie ont un très grand recul, ce qui permet d'obtenir des résultats fiables et comparables. Les animaux utilisés auront entre 4 et 6 semaines correspondant à l’âge du jeune adulte. Nos études préalables nous ont montrées qu'il n'y avait pas de différences de prise de greffe chez des animaux juste sevrés (4 semaines) et des animaux adultes (plus de 6 semaines). Cependant, le développement de la tumeur étant lent (entre 2 mois et 6 mois), nous utiliserons des animaux jeunes afin de ne pas avoir un état général dégradé qui pourrait être dû à la dégénérescence du modèle en fin de protocole.