Souris
Optimisation de l’imagerie non invasive (IRM et TEP) dans le cadre de tumeurs cérébrales et dans les AVC
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
Rats : 100
200 animaux, 100 souris et 100 rats, vont être utilisés dans des procédures classées de souffrance modérée à sévère, la plupart tués à l'issue et cinquante animaux témoins réutilisés. Les rats reçoivent une tumeur cérébrale et les souris un accident vasculaire cérébral provoqué, la gravité venant de ces modèles et non des séances d'imagerie qui suivent. Le porteur indique que l'objectif est d'optimiser des séquences d'IRM et de TEP fournies par le constructeur, un travail de mise au point technique de la plateforme. Il justifie le recours à l'animal par la nécessité d'étudier ces pathologies dans un "organisme entier".
Objectifs
Le projet consistera principalement à optimiser des séquences en imagerie par resonance magnétique grâce à un imageur à très haut champ. La plateforme dispose également d’un imageur hybride qui réalise des imageries par resonance magnétique couplés à de la tomographie par émission de positons qui permet des imageries à haute résolution. Les séquences et acquisitions à optimiser bénéficieront aux deux imageries. Pour cela nous avons prévu d'étudier les deux pathologies à étude. Les séquences à optimiser seront celles disponibles pour nos imageurs que nous souhaitons optimiser : anatomiques, de diffusion, de perfusion, ... avec injection ou non de produits de contraste ou de produits spécifiques.
Bénéfices attendus
Nous souhaitons optimiser nos séquences d'imagerie à la mailleure qualité possible afin d'assurer aux chercheurs un maximum de signal réalisant des manipulations le plus courtes possibles (techniques moins invasives pour les animaux et moins de frais de temps machine et personnel).
Procédures
Les animaux setont inclus dans les groupes expérimentaux: - rats : tumeurs ou controles. - souris : accident vasculaire cérébral ou controles. Ils suivront donc une des deux procédures ou en seront les controles (sans chirurgie). Modèle tumoral : anesthésie maximum 30 minutes. Modèle d'accident vasculaire cérébral, anesthésie maximum 120 minutes. Dans les deux casn ils suivront les optimisations d'imagerie suivant maximum 3heures d'expérience pour les rats et 1,5h pour les souris, incluant le temps de pose de cathéter quand nécessaire (autour de 5 minutes).
Impact sur les animaux
Les animaux suivront des procédures d'imagerie qui ne sont pas invasives. Les séances se feront sous anesthésie et analgésie. Nous savons de facto qu'une pose de cathéter sera nécessaire pour des challenges en imagerie dynamique par exemple ou pour l'injection simple de contrastes, l'analgésie sera faite en conséquence. Nous avons prévu une analgésie locale (lidocaïne en spray) puis également à la buprénorphine au moment de la sédationLes animaux qui suivront des procédures pour la création d'AVC ou de tumeurs cérébrales auront en plus suivi le modèle propre à la thématique et qui prévoit une analgésie adaptée. La sévérité du protocole ne vient pas des séances d’imagerie mais des modèles utilisés (création de tumeurs et d’AVC) en amont de cette imagerie. Pour le modèle tumoral, d'après notre expérience les animaux ont un comportement social et score clinique normal. Néanmoins, un suivi du volume tumoral et du poids de l'animal est fait pour suivre le bien-être des animaux. Pour le modèle d'AVC, d'après notre expérience les animaux récupèrent de la chirurgie sans problème de comportement ou de score clinique une fois l'analgésie post-opératoire faite. Néanmoins, un suivi du score clinique est réalisé afin de suivre le bien-être des animaux.
Devenir
Les animaux modèle ont eu des procédures chirurgicales qui sont cumulées à l'imagerie. Ils seront mis à mort à la fin de la dernière séance d'imagerie, sous anesthésie (comme décrit dans l'onglet mise à mort). Les animaux contrôle seront réutilisés si possible pour les formations prévues en interne car ils n'auront pas subi d'interventions invasives (les animaux avec contraste auront eu une pose de cathéter veineux à la queue, nous attendrons une récupération totale avant réutilisation, au minimum d'une semaine). Ces animaux que nous prévoyons pouvoir réutiliser sont les 5 controles utilisés par an, donc 25 pour chaque espèce et pour l'intégralité du projet.
Remplacement
Le recours à des animaux est justifié par la nécessité d’étudier les deux pathologies à étude dans un organe spécifique qu’est le cerveau et d’un organisme entier.
Réduction
Pour chaque pathologie, 15 animaux « modèle » et 5 « contrôle » seront utilisés au maximum afin de valider ces séquences d’IRM par an (20 rats et 20 souris par an, donc 100 rats et 100 souris maximum en total pour tout le projet). Nous tenons compte du temps machine disponible en interne pour notre section de recherche et développement et la disponibilité de notre personnel pour réaliser deux séances de test par mois maximum. De plus, ces groupes expérimentaux sont calculés suivant le fait que le constructeur Bruker met à disposition 41 séquences d'imagerie que nous souhaitons optimiser pour assurer aux chercheurs un maximum de signal dans le minimum de temps possible. Cette optimisation ne nécessitera donc pas plus d'animaux que 50 par an maximum.
Raffinement
Tous les moyens sont mis en oeuvre afin de limiter la souffrance animale. En pré-opératoire et lors de la chirurge les animaux seront anesthésiés à l'isoflurane (4% en induction dans l'O2; 2.5% dans un mélange O2/N2O 30/70%). Une anesthésie locale est appliquée aau niveau de la sutire cutanée (xylocaïne 2%). En péri-opératoire, l'analgésie est assurée par l'injection de buprénorphine (0.05mg/kg au moment de l'installation dans la paillasse) et répétée à 6-8h post-chirurgie. Une surveillance post-opératoire est effectuée quotidiennement pour le suivi des points limites avec une pesée pour le suivi de croissance tumorale (3 fois par semaine). Si l'apparition de signes de critères de mise à mort s'avèrent, les animaux seront ethanasiés. Lors des examens d'imagerie par IRM et/ou TEP, les animaux seront anesthésiés de la même manière.
Choix des espèces
D’après l’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire et grâce à l’expérience des plateformes thématiques développant ces modèles, nous avons décidé d’utiliser les espèces choisies : - des rats wistar pour l’implantation intrastriatale de cellules 9L permettant de développer des tumeurs. - des souris swiss dans le cas de l’étude de l’AVC, avec une occlusion de l’artère cérébrale moyenne reperfusées au bout de 20 minutes. Les rats seront âgés d’environ 8 semaines (250g) et les souris 8-10 semaines (30-35g) en début de protocole. Nous effectuons les procédures sur des adultes afin de pouvoir comparer les données de cette étude avec la majorité des données déjà disponibles sur les modèles de tumeurs cérébrales et d’AVC.
Etude d’efficacité comparée des thérapeutiques de traitement des MICI sur les symptômes comportementaux extra-digestifs
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
- Système gastrointestinal
Une colite provoquée par du dextran sulfate de sodium versé dans l'eau de boisson, répétée jusqu'à trois cycles de cinq jours, entraîne douleur, perte de poids et prostration chez des souris étudiées pour les symptômes psychologiques des maladies inflammatoires de l'intestin. 231 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère, avec, pour 90 d'entre elles, des tests comportementaux répétés six fois, un test de nage forcée pour 30, et pour 45 autres trois jours de gavage d'antibiotiques suivis d'une transplantation fécale par gavage. Le porteur promet pourtant un "bien-être optimal tout au long de l'étude". Toutes sont tuées à l'issue de chaque procédure pour l'examen de leur intestin.
Objectifs
Le projet a pour objectif d’étudier l’impact de stratégies thérapeutiques de modulation de l’écologie microbienne intestinale en développement dans le traitement des maladies inflammatoires chroniques de l’intestin (MICI) sur un plan comportemental. Le projet a recours à un modèle murin de référence de MICI : colite au dextran sulfate de sodium (DSS). Cette molécule soluble dans l’eau de boisson des animaux entraine une inflammation de la muqueuse intestinale, reproduisant ainsi les lésions existantes dans la maladie humaine et ses caractéristiques physiopathologiques. Les animaux seront étudiés sur un plan comportemental avec une batterie de tests successifs pour évaluer leur état d’anxiété, leur état de dépression, leur réaction au stress et leur capacité de socialisation. Ces tests seront menés de manière séquentielle pour tous les groupes d’animaux. Enfin, l’administration de thérapeutique sera réalisée et l’évaluation sera faite par une nouvelle séquence de tests comportementaux, afin de montrer un avantage ou non de la thérapeutique sur les aspects comportementaux de la colite au DSS. Ceci répondra à des questions de physiopathologie des symptômes psycho-comportementaux des maladies inflammatoires chroniques de l’intestin, et d‘étudier la réponse de ces symptômes aux stratégies thérapeutiques. Etant donné les expériences nécessaires à la mise en place du projet, un nombre minimal de souris a été fixé permettant une bonne analyse des résultats. Le nombre d’animaux a été réduit au maximum sans entraver l’interprétation des résultats et leur significativité au plan statistique. Ainsi, un maximum de souris sera nécessaire pour une étude scientifique pertinente. Chaque animal bénéficiera d’une attention et de soins de qualité, par du personnel qualifié, pendant les interventions mais aussi en dehors de celles-ci afin d’assurer un bien-être optimal tout au long de l’étude. Par ailleurs, ils seront hébergés en groupes dans un environnement enrichi (copeaux, matériel de nidification, bâtonnets à ronger). Enfin, l'eau et la nourriture sont mises à disposition en permanence.
Bénéfices attendus
Le projet permettra d’améliorer les connaissances sur le modèle de colite au DSS, notamment à court terme sur la faisabilité d’un modèle consistant en une répétition de cycles d’exposition. Le projet consiste en une étude pré-clinique de test d’hypothèse thérapeutique afin d’obtenir des données qui permettront des études en population humaine pour apporter une réponse thérapeutique aux symptômes extra digestifsneuro-comportementaux des MICI. Ces bénéfices du projet sont à long terme.
Procédures
Induction d'une colite inflammatoire par boisson au DSS (exposition de 5 jours par inductions) : - Procédure expérimentale 1 pilote : 6 groupes de 6 souris (un groupe par dosage), une seule induction, mise à morts d'une souris par cage (cages de 3) pour étude histologique et biologique à J5, J10 et J12. - Procédure expérimentale 2 : 6 souris, 2 cycles d'induction avec rémission complète plus repos de 7 jours entre chaque cycle, mise à mort de toutes les souris en fin de procédure pour étude histologique et biologique. - Procédure expérimentale 3 : 9 souris, 3 cycles d'induction avec rémission complète plus repos de 7 jours entre chaque cycle, mise à mort de toutes les souris en fin de procédure pour étude histologique et biologique. - Procédure expérimentale 4 : 45 souris, 3 cycles d'induction avec rémission complète plus repos de 7 jours entre chaque cycle, mise à mort de toutes les souris en fin de procédure pour étude histologique et biologique. - Procédure expérimentale 5 : 90 souris, 2 cycles d'induction avec rémission complète plus repos de 7 jours entre chaque cycle, mise à mort de toutes les souris en fin de procédure pour étude histologique et biologique. Prélèvement sanguin par ponction de la veine mandibulaire avant les mises à mort pour dosage des différents marqueurs inflammatoires dans la procédure expérimentale 1 (36 souris concernées). Test comportementaux léger : 90 souris dans la procédure expérimentale 4, passés à 6 reprises, lors des pics inflammatoire et en fin de rémission pour chaque cycle. Test de la nage forcée : 30 souris dans la procédure expérimentale 4. Gavage antibiotique pour déplétion du microbiote intestinal pendant 3 jours consécutifs, puis gavage pour transplantation fécale le 4ème jour : 45 souris dans la procédure expérimentale 5, entre les 2 cycles d'induction.
Impact sur les animaux
Colite au DSS : douleur, perte de poids, prostration, stress pendant la durée d’exposition au DSS dans l’eau de boisson. Tests comportementaux : stress pendant une période réduite de quelques heures après le test.
Devenir
Mise à mort de toutes les souris à l’issue de chaque procédure pour étude et comparaison histologique et biologique de l'intestin.
Remplacement
Notre projet porte sur l’étude comportementale d’un modèle de colite inflammatoire. Les alternatives expérimentales aux animaux vivants ne permettent pas l’étude comportementale.
Réduction
Le nombre d’animaux destiné au projet a été calculé afin de garantir une puissance nécessaire et suffisante d’analyse statistique. Le nombre d’animaux pour la PE1 et PE2 a été réduit au minimum pour permettre de construire de manière adapté le protocole final. Les PE3 et 4 nécessite un nombre plus important d’animaux du fait de la variabilité importante et inhérente aux analyses comportementales. Les tests statistiques comportent des analyses descriptives et des analyses de comparaisons. Du fait du faible nombre de données les analyses seront menées par des tests non paramétriques.
Raffinement
Les nuisances pour les animaux seront prévenues par une surveillance accrue lors de l’exposition au DSS sur le plan du comportement, du stress, de la douleur et du poids. Afin de limiter le stress lié aux tests comportementaux, les animaux seront habitués aux procédures et au matériel de manière progressive. Concernant le gavage de la PE5, celui-ci sera réalisé par un expérimentateur entrainé. Les cages d’hébergements seront enrichies (nid et bâton à ronger).
Choix des espèces
La souris est l’espèce référencée pour le modèle au DSS. Elle répond aux compétences de l’animalerie PLEXAN où l’expérimentation va être menée. Cette espèce est bien référencée sur les études comportementales et la littérature existante permettra une analyse de qualité. Les animaux seront achetés à l’âge de 6 semaines, et seront utilisé dans le projet à l’âge de 8 semaines. L’âge adulte correspond aux données de la littérature en termes de modèle DSS et d’étude comportementale.
Effets d’une carence gestationnelle en vitamine A sur la transmission dopaminergique mésocorticolimbique dans le contrôle de la prise de décision
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système nerveux
Douze semaines de restriction alimentaire, avec une perte de poids tenue sous 10 %, pour 360 souris soumises à un conditionnement opérant : le projet utilise 936 souris dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger ou menées sous anesthésie sans réveil, toutes tuées à l'issue. Les 216 souris reproductrices sont tuées au sevrage de leurs petits, exposés pendant la gestation à une carence en vitamine A. Le projet doit établir si cette carence altère, chez la descendance, le circuit de la dopamine qui intervient dans la prise de décision. 120 descendantes passent des tests d'anxiété qui, selon le porteur, provoquent un stress aigu, et le RNT ne précise pas lesquels.
Objectifs
La carence en vitamine A au cours de la période périnatale, causée par un régime appauvri en vitamine A, reste un enjeu majeur de santé publique dans les pays en voie de développement. En effet, l’acide rétinoïque (AR), métabolite actif de la vitamine A est indispensable au développement cérébral du foetus et du nouveau-né mais joue également un rôle très important dans les fonctions cérébrales à l’âge adulte. En se fixant sur ses récepteurs nucléaires les RARs (Retinoic Acid Receptors) et les RXRs (Retinoid X Receptors) qui jouent le rôle de facteur de transcription, l’AR régule l’expression de nombreux gènes impliqués dans les processus de plasticité cérébrale. Ainsi, de faibles apports en vitamine A pendant la période périnatale conduiraient à une hypoactivité de la voie de signalisation de l’AR et des modifications d’expression de certains gènes comme le récepteur dopaminergique D2 (D2R) avec des conséquences néfastes sur les fonctions cérébrales associées (fonctions exécutives, planification motrice). Nous faisons l’hypothèse qu’un déséquilibre d’apports alimentaires en vitamine A durant la période périnatale altère le développement de la transmission dopaminergique et pourrait participer à l’étiologie de pathologies neurodèveloppementales qui impliquent des déficits des fonctions exécutives et motrices.
Bénéfices attendus
cette étude vise à proposer de nouvelles stratégies pour la prise en charge des maladies psychiatriques dont l’arsenal thérapeutique reste insuffisant. Ce projet va permettre de tester l’effet potentiellement protecteurs de molécules d’intérêts et donc de proposer de nouvelles stratégies curatives dans le contexte des maladies psychiatriques. Il va aussi permettre d’explorer les mécanismes par lesquels ces métabolites influencent la fonction cérébrale et le comportement. Cela permettra donc d’accroitre les connaissances dans un champ de recherche nouveau et prometteur.
Procédures
216 souris reproductrices seront euthanasiées au sevrage des animaux et 240 souris descendantes seront euthanasiés pour réaliser des enregistrements électrophysiologiques (456 sans réveil). 360 souris descendantes seront soumises à un conditionnement opérant (classe légère). Pour le test de conditionnement opérant, les animaux seront maintenus en restriction alimentaire légère (moins de 10% de perte par rapport au poids ad libitum) pendant toute la durée des expériences comportementales (12 semaines). Afin d’évaluer le comportement de type anxieux, 120 souris descendantes seront soumises à des tests comportementaux qui peuvent engendrer un stress aigü (classe légère). Néanmoins l’état général de la souris n’est pas altéré. 240 souris descendantes (dont 120 soumises au conditionnement opérant) seront perfusées pour réaliser des analyses immunohistochimiques (classe légère). Cette intervention dure 15 min par souris (480 classe legère).
Impact sur les animaux
De part sa nature et son objectif les tests comportementaux évaluant le comportement de type anxieux que nous allons utiliser entraine un stress aigü chez la souris. Néanmoins l’état général de la souris n’est pas altéré. Les souris seront de toute façon suivies comme suit : les animaux en cours de protocole sont surveillés chaque jour par l’expérimentateur et 2 fois par semaine par les animaliers. Pour le test de conditionnement opérant, les animaux seront maintenus en restriction alimentaire légère (moins de 10% de perte par rapport au poids ad libitum) pendant toute la durée des expériences comportementales (12 semaines). Pour cela, les animaux seront pesés chaque jour et la quantité de nourriture ajustée en fonction.
Devenir
En fin de procédure 1, tous les animaux seront euthanasiés et différentes régions cérébrales seront prélevées (comme tissu frais) et congelées pour des analyses moléculaires. En fin de procédure 2, tous les animaux seront euthanasiés pour collecter des tissus fixés afin de réaliser de l'immunomarquage sur les tranches de cerveau. En fin de procédure 3 tous les animaux seront euthanasiés et le cerveau sera prélevé (comme tissu frais) afin de réaliser des enregistrements électrophysiologiques. En fin de procédure 4, tous les animaux seront euthanasiés et différentes régions cérébrales seront prélevées (comme tissu frais) et congelées pour des analyses moléculaires.
Remplacement
L’objectif général du projet vise à comprendre chez l’animal les conséquences comportementales et neurobiologiques d’une carence gestationnelle en vitamine A . Dans ce contexte de recherche, le recours à des modèles animaux pertinents et adaptés à l’étude de la cognition reste donc une nécessité expérimentale afin d’appréhender la réalité physiologique de nos résultats. L’objectif à long terme du projet étant de tester les effets comportementaux d’une supplémentation nutritionnelle en vitamine A dans le contexte des maladies neurodéveloppementales. Une recherche d’alternatives et d’autres méthodes dans des bases de données démontre par ailleurs que les solutions de rechange appropriées à ces procédures ne sont pas disponibles ou applicables.
Réduction
Pour réduire le nombre d'animaux, nous effectuons plusieurs mesures sur le même animal dans un ordre précis afin qu'une première mesure n'influence pas la seconde. De même, un maximum de mesures biologiques (périphériques et cérébrales) sera réalisé sur chaque animal dans la limite de compatibilité entre les différentes techniques. Ceci permettre de réduire au maximum le nombre de souris nécessaire à l'étude. Aucun dupliqua du travail proposé n'est aujourd'hui identifié
Raffinement
Concernant le raffinement différentes approches seront mises en œuvre. Les animaux seront hébergés en cages collectives avec un environnement enrichi (carré de coton ou maison en carton). Les animaux seront observés quotidiennement et pesés au moins 1 fois par semaine. Les animaux seront inspectés et si des blessures apparaissent, elles seront immédiatement soignées, les animaux recevront une injection d'analgésique si nécessaire et seront surveillés deux fois par jour. Si l’animal apparaît malade ou avoir des douleurs, il sera immédiatement isolé et surveillé. Si l’animal ne montre pas d’amélioration significative, il sera mis à mort dans les 24h. Concernant l’administration des métabolites d’intérêt, nous priviligérons l’utilisation de l’eau de boisson par rapport à des méthodes plus traumatisantes comme les injections intrapéritonéales répétées ou le gavage. L’étude d’acceptabilité aura aussi pour objectif d’éliminer des métabolites ou des dosages qui pourraient entrainer un inconfort chez l’animal. Pour limiter le stress lié au tests comportementaux les souris seront manipulées régulièrement en amont afin de limiter le stress induit par l’expérimentateur. Par ailleurs pour les procédures induisant de la douleur nous utiliserons des associations d’anesthésiques et analgésiques afin de limiter la douleur chez l’animal.
Choix des espèces
Nous utiliserons des souris car ce sont des animaux de petite taille et peuvent donc être facilement hébergés à l’animalerie dans de bonnes conditions d’élevage. Les expériences de comportement et d’électrophysiologie sont facilement mises en oeuvre d’un point de vue technique sur les souris. La souche de souris utilisée (C57/Bl6J) constitue un modèle d’étude particulièrement intéressant et informatif dans le cadre des études sur l'impact des carences gestationnelles de nutriments sur la prise de décision , de ce fait les résultats de ce projet seront donc plus faciles à intégrer dans la littérature déjà existante. Nous choisissons de travailler chez la souris plutôt que chez le rat car de nombreuses souris transgéniques sont disponibles ce qui n’est pas le cas chez le rat, ce qui sera nécessaire pour la continuité du présent projet.
Mécanisme des effets protecteurs d’isoformes de l’Apolipoprotéine E contre la maladie d’Alzheimer
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
192 souris transgéniques vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance légers à modérés. Elles subissent une injection dans le cerveau par chirurgie stéréotaxique ou une injection intraveineuse, puis sont gardées trois mois avant une mise à mort permettant l'analyse des neurones et des synapses. Le porteur affirme qu'aucune méthode autre que ces modèles animaux ne permet d'étudier la perte progressive de neurones adultes. L'étude cherche à savoir si moduler une protéine, l'APOE, protège contre la maladie d'Alzheimer, cible thérapeutique évoquée au conditionnel.
Objectifs
La maladie d'Alzheimer (MA) est caractérisée par une perte de synapses et de neurones, la perte de synapses étant corrélée au déclin cognitif. Des mutations dans les gènes codant pour l’ « Amyloid Protein Precursor » (APP) ou ses enzymes de clivage Presenilins (PS) 1 ou 2 entraînent des formes familiales précoces de MA. A l'opposé, l’isoforme APOE2 de l'Apolipoprotéine E procure une résistance exceptionnelle à la maladie. De plus, un individu homozygote pour la mutation APOE3ch ne présente pas de détérioration intellectuelle à 70 ans en dépit d’une mutation dans PS1 qui entraine normalement un début d’altération cognitive vers 45 ans. Les protéines APOE2 et APOE3ch sont caractérisées par une faible affinité pour leurs récepteurs, et donc une diminution de leur internalisation. Ces données indiquent qu’une réduction de l’internalisation (perte de fonction) ou une augmentation de la concentration extracellulaire d’APOE pourraient exercer un effet protecteur contre la MA. Nous avons pour objectif de déterminer si les pertes de synapses et de neurones observées dans un modèle transgénique murin de MA pourraient être réduite par une perte de fonction de l’APOE induite par une diminution de son expression, ou au contraire par une augmentation de la concentration extracellulaire d’APOE.
Bénéfices attendus
Ces études permettront de déterminer si la modulation positive ou négative des niveaux d'APOE est une cible thérapeutique envisageable pour la MA.
Procédures
Les procédures utilisées reposent sur la réalisation d’une chirurgie unique (injection stéréotaxique) sur animaux anesthésiés/analgésiés, ou sur une injection intraveineuse unique sur animal vigile, et le maintien de l'animal en cage d'habitation pendant 3 mois. La procédure de chirurgie dure une heure, celle d'injection intraveineuse dure 5 minutes.
Impact sur les animaux
La réalisation d’une chirurgie nécessite de placer la souris dans un cadre stéréotaxique (contention au niveau des incisives et des oreilles), puis de réaliser une incision de la peau sur le crane, une fenêtre cranienne, et enfin une suture. Cela est effectué sous anesthésie, mais pourrait entrainer des douleurs post-opératoires. Nous administrons donc un antalgique en pré- et postopératoire.
Devenir
Nous étudions les effets d'une diminution ou d'une augmentation d'APOE sur le maintien des synapses et des neurones chez des souris adultes modèles de MA. Comme ces pertes deviennent significatives à 6 mois, et que nous modifions les niveaux d'expression par des injections d'AAV chez les souris de 3 mois, nous devons attendre 3 mois après chaque procédure pour analyser les effets. Les effets sont analysés suite à une procédure terminale permettant leur mesure. L'euthanasie des souris est nécessaire pour les analyses post-mortem des effets des traitements sur le nombre de neurones et de synapses.
Remplacement
Il n’existe pas de méthode alternative, autre que le recours aux modèles animaux, pour atteindre les objectifs du projet. En effet ces modèles animaux sont les seuls à permettre d’étudier la perte progressive de synapses et de neurones adultes, comme ce qui se produit dans la maladie d’Alzheimer.
Réduction
Nous utiliserons au total 192 souris. Le nombre d’animaux utilisés est réduit au maximum, la taille des groupes d’animaux étant définie en fonction de nos expériences antérieures pour nous permettre de générer des données reproductibles et donc solides
Raffinement
Les méthodes sont choisies pour réduire ou supprimer la douleur, la souffrance et l’angoisse : (i) les souris ont à disposition, comme élément d’enrichissement, des composants de nidification ; (ii) une surveillance quotidienne des paramètres environnementaux (lumière, température, hygrométrie, pH de l’eau) et régulière des animaux (pelage, comportement, locomotion, etc) est effectuée, afin de détecter un état de stress ou de douleur nécessitant un traitement, ou la mise en place d’une procédure d’euthanasie ; (iii) les chirurgies sont réalisées dans les conditions usuelles d'anesthésie-analgésie, avec un traitement analgésique et un suivi post-opératoire. En cas de blessure, de pathologie, d’hypoactivité et de mouvement anormal, de perte de poids importante, l’avis du vétérinaire sera demandé, et si il le recommande les animaux seront euthanasiés.
Choix des espèces
Nous utilisons des souris transgéniques modèles de MA. Il n’existe pas à notre connaissance de modèles autres que les souris transgéniques permettant d’atteindre les objectifs du projet. Chez ces souris adultes les AAVs seront injectés avant que les pertes de synapses et de neurones ne soient observées, et leurs effets seront analysés 3 mois plus tard, quand ces pertes sont significatives.
Etude de la comorbidité entre la douleur chronique et la dépression : analyse anatomo-fonctionnelle
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
1090 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Une chirurgie provoque une douleur neuropathique à la patte, une seconde implante une fibre optique dans le cerveau, et les animaux développent des troubles de type anxieux et dépressif, objets mêmes de l'étude. Le porteur indique que la douleur ne peut pas être soulagée puisqu'elle constitue le sujet de recherche, et que les souris subissent jusqu'à vingt-huit tests de douleur puis des tests comportementaux. Les cibles thérapeutiques évoquées pour l'humain restent renvoyées au conditionnel.
Objectifs
La douleur neuropathique est consécutive à une lésion ou une pathologie du système nerveux responsable des sensations somatiques. Généralement chronique, avec une prévalence de 5 à 7% dans la population, elle s’accompagne d’un fort risque de développement de troubles de l’humeur (anxiété, dépression). En effet, environ 50% des patients présentent ces deux symptômes associés : douleur chronique et troubles de l’humeur. Ceci constitue un enjeu important de santé publique. Malgré les données cliniques, les mécanismes sous-jacents de ce lien entre ces 2 pathologies (douleur et troubles de l’humeur) restent encore inconnus et nécessitent des études précliniques. Chez la souris mâle des données de la littérature suggèrent que plusieurs structures cérébrales clés seraient impliquées dans les conséquences affectives à long terme d’une douleur neuropathique. Les données clinique chez l’homme mais également préclinique chez l’animal montrent que non seulement la dépression majeure mais aussi les situations douloureuses s’accompagnent de changements dans des structures cérébrales bien précises. Mais de nombreuses données de la littérature montrent également d’importantes différences dans la sensibilité à la douleur entre les hommes et les femmes ; données également observées chez les rongeurs. De plus, la prévalence des troubles anxieux et dépressifs, dans la population ainsi que chez les patients douloureux chronique, présente également des différences intersexuelles. De telles différences suggèrent très probablement des mécanismes spécifiques à chaque sexe. Ainsi, bien que les régions cérébrales impliquées dans les troubles de l’humeur provoqués par la douleur chronique soient sans doute les mêmes, les altérations des réseaux que ces structures forment sont sans doute différentes chez des individus mâles et femelles. Le but de ce projet est donc de comparer les changements anatomo-physiologiques éventuels entre mâles et femelles.
Bénéfices attendus
Le but de ce projet est d'étudier les modifications d’activité et d’interaction entre ces 5 régions pouvant être à l’origine du lien entre la douleur chronique et les troubles de l’humeur grâce à des techniques de mesure d’activité neuronale in vivo. A l’issue de ce projet, nous serons en mesure de détailler pour la première fois les adaptations d’activité cérébrale liées au développement des comportements de type anxieux et dépressif chez les deux sexes. Cette avancée pourrait permettre de révéler de nouvelles cibles thérapeutiques (structures cérébrales d'intérets mais aussi systèmes de neurotranmissions) spécifiques au sexe et donc potentiellement différentes chez le mâle et la femelle.
Procédures
Les animaux seront soumis à une douleur chronique avec développement de troubles anxio-dépressifs. Ils subiront une chirurgie au niveau de la patte droite de l'animal d’une durée de 5 min environ et une chirurgie stéréotaxique avec injection de virus puis implantation de fibre optique ou plateforme multimode d’une durée de 45 min environ, soit au total 2 chirurgies. Ces deux chirurgies se dérouleront sous anesthésie, soit 2 anesthésies générales. Les animaux subiront 3x le test de douleur avant la chirurgie neuropathique puis deux fois par semaine (délai de 4 jours minimum après la chirurgie avant la reprise des tests) jusqu’à la fin du protocole expérimental soit un total de 28 tests maximum. Ils subiront également 4 semaines après la chirurgie stéréotaxique, 1 test pour évaluer la douleur spontanée et 4 tests anxio-dépressifs (avec 24h minium entre chaque test).
Impact sur les animaux
Il y a présence de douleur qui ne peut être soulagée car c'est l'objet de l'étude. Suite à la chirurgie neuropathique (présente dans toutes les procédures de ce projet), une difficulté dans les déplacements des animaux est attendue mais disparaît dans les 48-72h après la chirurgie. Les animaux vont développer des troubles anxio-dépressifs, objectifs de l'étude.
Devenir
A la fin des procédures, les animaux seront mis à mort.
Remplacement
Au vu de notre thématique d’étude, il nous est malheureusement impossible de remplacer notre modèle in vivo par un modèle in vitro ou in sillico. En effet, l'analyse anatomo-fonctionnelle du développement des troubles anxio-dépressifs dans un modèle de douleur neuropathique nécessite une observation comportementale, uniquement possible chez l’animal vivant et vigile.
Réduction
Afin d’obtenir des résultats fiables et robustes à l’issue de l’étude tout en tenant compte des variabilités entre individus, le nombre d’animaux utilisé a été déterminé statistiquement. Toujours dans l’idée de diminuer au maximum le nombre d’animaux utilisés les animaux subiront un enchaînement de gestes expérimentaux au sein d'une même procédure. Pour cette raison une même cohorte d’animaux sera étudiée et caractérisée au niveau comportemental et émotionnel, puis fera l’objet d’investigations anatomiques.
Raffinement
Les animaux sont hébergés en cohorte de 4 ou 5 individus pour respecter leurs besoins sociaux. Des enrichissements sont placés dans la cage pour favoriser le bien-être animal. Les animaux seront observés tous les jours et leur comportement sera suivi afin de déceler tout signe d’inconfort ou de stress. Les chirurgies seront réalisées sous anesthésie et analgésie. Des points limites ont été établis pour l’ensemble des procédures expérimentales.
Choix des espèces
Le modèle de douleur neuropathique utilisé dans cette étude a été caractérisé et validé pharmacologiquement chez la souris et non dans une autre espèce comme le rat par exemple. De plus, de nombreuses lignées de souris transgéniques existent et sont disponibles ce qui nous permettra de répondre de façon précise aux questions scientifique posées. Etant donné que l’étude de comportements nécessite des systèmes neurobiologiques totalement matures, des animaux adultes seront utilisés (début des procédures à 8 semaines, poids supérieur à 20g). Afin d’éviter tout risque de variabilité liée au vieillissement, notre étude portera sur des animaux adultes de 8 semaines à leur arrivée au laboratoire. Le décours temporel de nos expériences fait que ces animaux seront testés jusqu’à leur ~18-19eme semaine à la fin des expériences.
Identification des mécanismes impliqués dans la fonction pro-tumorale des cellules tuft dans le cancer gastrique causé par Hélicobacter
- Recherche appliquée
- Cancers
- Maladies infectieuses
- Troubles gastrointestinaux
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
1980 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures dont une partie sous anesthésie sans réveil et le reste de gravité légère à modérée. Elles sont infectées par la bactérie Helicobacter felis, qui provoque des lésions gastriques et un cancer de l'estomac avec perte de poids, et reçoivent des gavages et des injections répétés. Le porteur indique suivre l'apparition des lésions sur des durées d'au moins six mois et mettre à mort les animaux dès l'atteinte de scores de souffrance définis. Il qualifie le modèle animal d'"indispensable" faute de méthode reproduisant ce processus, l'objectif restant de comprendre le rôle de certaines cellules dans la tumeur.
Objectifs
L’objectif de ce projet est de découvrir les mécanismes impliqués dans les propriétés inflammatoires et pro-tumorales des cellules tuft en utilisant des modèles murins innovants suite à une infection à Helicobacter.
Bénéfices attendus
Elucider les mécanismes moléculaires impliqués dans les propriétés pro-oncogeniques des cellules intestinales suite à une infection à H. felis. Les analyses moléculaires pourraient permettre l'identification de substances biologiques potentiellement médicamenteuses. Cela mettrait en lumière de nouveaux mécanismes d’interaction entre H. felis, les cellules tuft et la muqueuse gastrique, ouvrant ainsi la voie à des approches thérapeutiques inexplorées.
Procédures
Gavage sur animal vigile : 1100 souris, 1 fois par jour sur 3 jours Injection intrapéritonéale sur animal vigile : 150 souris, 1 fois par jour pendant 5 jours Prélèvement sanguin rétro-orbitaire sous anesthésie générale : 1980 souris, 1 fois en phase terminale
Impact sur les animaux
Perte de poids liée à l’infection à H. felis et au développement de lésions gastriques dans les expériences d’infection d’une durée supérieure ou égale à 6 mois. Souffrance observée.
Devenir
Nous souhaitons faire des analyses sur les prélèvements issus des animaux. Pour cela les animaux seront sacrifiés à la fin de la procédure pour que leurs organes soient prélevés.
Remplacement
Nous souhaitons étudier les propriétés inflammatoires et pro-tumorales des cellules tuft gastriques suite à une infection à H. felis. A ce jour il n’existe pas de méthodes alternatives pour mimer ce processus ce qui rend le modèle animal indispensable.
Réduction
Le modèle d’infection à H. felis est connu et maitrisé par notre équipe. En souris contrôle (dit WT) nous utiliserons les souris non transgéniques issues des accouplements des lignées dans un but de réduire le nombre d’animaux. Nous prévoyons également d’utiliser des mâles et des femelles pour l’objectif 5 dans les expériences de lineage tracing, toujours dans un but de réduction. Pour les autres objectifs, des mâles seront utilisés car la réponse inflammatoire et la carcinogenèse sont maximales chez les mâles d’après les études antérieures du laboratoire et d’après la littérature scientifique. Sur les échantillons prélevés nous prévoyons de réaliser des études statistiques ; pour cela, d’après les publications précédentes de l’équipe et d’après la littérature scientifique sur ces modèles murins d’infection par H. felis qui présentent une certaine hétérogénéité de réponse entre animaux, des groupes de 10 animaux par condition expérimentale sont requis.
Raffinement
Les souris seront suivies en suivant les critères de la feuille de scoring fournie en annexe. Pour un score compris entre 6 et 12 les souris recevront de la nourriture humidifiée dans la cage. Si l’état de l’animal ne s’améliore pas en 48 h il sera immédiatement sacrifié. Si le score est supérieur ou égal à 12, l’animal sera sacrifié sans attendre. Les souris seront pesées (de façon hebdomadaire), si la perte de poids est de 10% par rapport à la semaine précédente l’animal sera sacrifié sans attendre.
Choix des espèces
Le modèle d’infection à H. felis a été mis au point chez la souris. De plus nous disposons de plusieurs lignées de souris transgéniques pour ce projet qui nous permettront de répondre aux objectifs fixés. Les souris seront utilisées à un âge de 6-7 semaines car c’est l'âge optimal pour permettre une infection à H. felis. Après ce stade l’infection ne se met pas en place.
Est-ce que les neurones en contact avec le liquide céphalo-rachidien au niveau thoracique appartiennent au système nerveux sympathique ?
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
124 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une partie subit une chirurgie pour l'implantation d'un capteur sous-cutané porté dix-sept jours, toutes courent ou marchent sur un tapis, puis sont endormies profondément pour des prélèvements de sang et de liquide céphalo-rachidien. Le porteur indique que l'étude vise à savoir si certains neurones de la moelle épinière thoracique participent à la régulation cardiovasculaire, un objectif de connaissance fondamentale sans application annoncée. Les animaux sont mis à mort pour collecter un maximum de tissus.
Objectifs
Cette demande d’autorisation de protocole s’inscrit dans un projet plus large qui vise à déterminer si les neurones présents autour du canal central dans la moelle thoracique et qui sont en contact avec le liquide céphalorachidien (cellules appelées LCR-cNs) font partie du système nerveux autonome sympathique (SNAS) en charge, entre autres, de la régulation cardiovasculaire. L’objectif de ce projet sera donc de regarder la pression artérielle de base et sa modulation lors d’un exercice moteur chez des souris dont les LCR-cNs seront spécifiquement invalidés pour le gène codant pour une protéine appelée PKD2L1 qui leur confère une sensibilité aux déformations mécaniques et aux variations de pH. En parallèle de ces expériences, nous regarderons l’effet d’un exercice physique sur la composition du plasma sanguin et du LCR chez la souris. Les molécules identifiées seront alors testées sur l’activité des LCR-cNs en tranches par des approches électrophysiologiques.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de savoir si l'activité de certains neurones de la moelle épinière thoracique sont capables de moduler la commande nerveuse du système nerveux autonome et de participer à la régulation du tonus cardiovasculaire. Ces neurones constitueraient ainsi un système sensoriel intrinsèque à la moelle épinière qui pourrait informer directement les réseaux neuronaux des changements métaboliques de l’organisme sans obligatoirement passer par les structures présentes dans l’encéphale. Les informations recueillies fourniront de nouvelles données sur l’organisation de la moelle épinière et son implication dans la régulation des fonctions vitales.
Procédures
Certains animaux subiront une chirurgie peu invasive d’une heure environ pour suivre leurs paramètres cardio-vasculaires dans le temps et courront sur un tapis, 15 minutes pendant 4 jours d’affilé (n=28) Ces animaux porteront un capteur en sous-cutané pendant 17 jours. D'autres marcheront (n=24) ou courront (n=48) à 2 vitesses différentes (24 animaux par vitesse), pendant 15 minutes. Enfin les 24 marcheurs, 48 coureurs et 24 sédentaires seront profondément endormis avant des prélèvements de sang et de liquide céphalo-rachidien.
Impact sur les animaux
Les animaux subiront une chirurgie peu invasive mais seront suivis avec une analgésie adaptée. Les animaux marcheront ou courreront pendant 15 minutes sur un tapis roulant après une phase d'entrainement où aucun système aversif ne sera utilisé
Devenir
Les animaux sont euthanasiés à l'issue des procédures car nous travaillons à mieux comprendre des systèmes biologiques aujourd'hui mal connu et il est important de collecter un maximum d'information via les prélèvements de tissus.
Remplacement
Cette étude in-vivo fait suite à plusieurs années de recherche ex-vivo sur des moelles épinières extraites. Malgrès les nombreuses connaissances accumulées, il est impossible de mettre en évidence les interactions entre les populations de cellules de la moelle épinière étudiées ici et le reste de l'organisme sans réaliser des expérimentations in vivo.
Réduction
Afin de cibler très précisément des questions soulevées par le projet, des études préliminaires sur moelles extraites ont été faites et ont permis de grandement limiter le nombre d'animaux utilisés. De plus le nombre d'animaux a été reduit au minimum afin d'avoir des résultats statistiquement viables à exploiter . Enfin pour réduire le nombre d'animaux utilisés, nous allons utiliser un système de mesure de la pression artérielle qui sera implanté (télémétrie ). Ainsi, chacun des animaux sera son propre contrôle (avant et après exercise physique). Le nombre d’animaux a été établi sur la base des minimums nécessaires pour effectuer des tests statistiques robustes et des données bibliographiques dont nous disposons.
Raffinement
La technique de télémétrie permet à l'animal d'être libre de ses mouvements dans la cage. Sauf en cas d'avis vétérinaire pour un soin, aucun animal ne sera isolé afin de préserver le caractère grégaire de la souris. Lors de la chirurgie d'implantation, des soins post-opératoires seront faits (anesthésie et analgésie), les conditions d'asepsies seront respectées (stérilisation du matériel) et le personnel dédié à la chirurgie sera parfaitement formé . Les animaux seront vus quotidiennement et seront évalués suivant une méthode d'évaluation validée avec des points limites gradés et précis. Toutes les cages seront enrichies avec du matériel de nidification et un tunnel en carton.
Choix des espèces
La souris est une espèce dont le génome est parfaitement connu et que l'on peut très facilement manipuler. Ainsi dans le cadre de notre étude, la lignée cellulaire à étudier a été ciblée en supprimant un gène cible. De plus, la souris est une espèce dont la gestation et la phase juvénile est courte, permettant ainsi d'avoir régulièrement des animaux au génotype voulu. Les animaux seront utilisés adultes (autour de 7 semaines). Nous devons attendre que les animaux fassent 22gr pour leur implantation en télémétrie (recommandation du fabriquant) mais nous ne voulons pas avoir des animaux trop âgés par soucis technique (implantation facilitée chez les individus jeunes).
Effet de bactéries de la famille des Christensenellaceae dans la modulation de l’inflammation aigûe dans des modèles précliniques murins d’induction de la colite
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
363 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance légers à modérés. Une colite est provoquée chimiquement par injection intra-rectale de DNBS, puis les animaux reçoivent par gavage la bactérie testée, avec pour effets attendus une perte de poids, des diarrhées et des saignements anaux suivis sur trois jours. Le projet, mené par une entreprise, vise à évaluer une bactérie vivante comme futur médicament contre les maladies inflammatoires de l'intestin. Le porteur affirme que ces modèles d'inflammation induite sont les seuls à reproduire la maladie et qu'un modèle in vitro ne restitue pas la complexité du microbiote.
Objectifs
La maladie de Crohn (MC) touche plus de 2,3 millions de personnes dans le monde, avec une prévalence en constante augmentation, en particulier dans les pays nouvellement industrialisés. L'étiologie de la maladie est liée à de multiples facteurs, notamment des facteurs environnementaux, génétiques, immunitaire et un microbiome intestinal altéré. Les patients sont atteints d’anomalies du système immunitaire intestinal associées à un microbiote intestinal peu diversifié et à une perte de bactéries bénéfiques par rapport aux individus sains. La qualité de vie des patients atteints de MC est fortement altérée car ils souffrent de douleurs abdominales atroces, de diarrhées récurrentes, de douleurs articulaires, etc. Les traitements disponibles - à ce jour (par exemple, corticostéroïdes, molécules immunosuppressives et agents biologiques) ou en développement - ciblent les voies responsables de l'inflammation qui déclenche ces symptômes. Cependant, il existe un fort besoin médical de nouvelles thérapeutiques avec un mode d'action différent, car ces traitements ne guérissent pas la maladie et sont associés à de nombreux effets secondaires. Aujourd'hui, il n'y a pas de nouvelle solution pour guérir la maladie. L’objectif du projet est de proposer un nouveau schéma thérapeutique pour la gestion de maladies inflammatoires de l’intestin, pour ceci nous allons évaluer le potentiel thérapeutique, ainsi que de déterminer le profil toxicologique d’une bactérie vivante Christensenella minuta dans des modèles précliniques bien établie qui reprennent les principaux symptômes de l’inflammation au niveau du colon. Ce projet rentre dans le programme de recherche de l’entreprise qui s’inscrit dans sa lignée de développement de nouveau médicament à base de microbiote.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus du projet sont la détermination d’un nouveau traitement qui aura une activité bénéfique dans la gestion de l’inflammation, basée sur une bactérie vivante de l’intestin, ainsi qu’une amélioration de la composition bactérienne et de ce fait nous pourrons ainsi proposer un nouveau schéma thérapeutique pour les patients atteints de maladies inflammatoires de l’intestin, telle que la maladie de Crohn.
Procédures
Les interventions auxquelles seront soumis les animaux sont : injection intra-réctale de DNBS pour l’induction de la colite sous anésthésie. La durée du geste est de moins d’une minute. Un prélèvement sanguin sera également réalisé sur certains animaux. La durée du geste de prélèvement est évaluée à moins d’une minute. L'administration orale par gavage des traitements sur tous les animaux du projet sera également réalisé. La durée du geste de gavage est évaluée à moins d’une minute. Les différentes interventions sont réalisées par une personne formée et les animaux sont suivis quotidiennement selon les critères mis en place au sein de l'établissement.
Impact sur les animaux
La colite chez les souris sera induite chimiquement par le Dinitrobenzène acide sulfonique (DNBS), afin de créer l’inflammation au niveau du côlon, cette procédure a pour effet une perte de poids des animaux qui sera surveillée attentivement au cours des 3 jours qui suivent l’induction. Une grille d’évaluation associée aux mesures à prendre a été mise en place et sera suivie tout au long de la procédure. De plus, il est important de prendre en considération que l’absence ou une perte de poids moindre chez nos animaux traités est un paramètre important marquant l’efficacité de notre traitement. Des effets sur le transit intestinal peuvent être observés, tel que des diarrhées ou des saignements au niveau de l’anus, qui seront suveillés et scorés sur les 3 jours post-induction (jour du sacrifice).
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort en fin d’expérimentation afin de réaliser des tests et analyses ex-vivo permettant de valider et compléter les données.
Remplacement
L’efficacité et de la tolérabilité d’un médicament en cours de développement doit fait l'objet d'études réglementaires d’évaluation avant toute mise sur le marché, celles-ci exigent l’utilisation de modèles précliniques, qui puissent répondre à des questions toxicologiques. L’ensemble des données générées par ces modèles animaux nous permettront de pouvoir envisager une application thérapeutique chez l’homme. Le recours à des modèles d’inflammation induite chez le rongeur est une étape nécessaire dans notre démarche. Il s’agit des seuls modèles mimant la physiopathologie et la symptomatologie de la colite observées chez les patients atteints de la maladie de Crohn. La réponse immunitaire exprimée suite à l’induction de l’inflammation chez ces modèles précliniques est égalament similaire à celle observée chez l’homme, ce qui nous permet d’évaluer l’impact de notre médicament non seulement d’un point de vue clinique mais également physiologique. Par ailleurs, afin de minimiser au maximum l’utilisation d’animaux, nous avons réalisé au préalable des tests in vitro de criblage sur modèles cellulaires, qui ont permis d’identifier quelques bactéries pertinentes ayant des effets immunomodulateurs et anti-inflammatoires. Nous souhaitons donc tester ces bactéries sur ces modèles animaux et valider l’effet de C. minuta sur la colite induite et sur la modulation du microbiote intestinal, ce paramètre ne pouvant pas être obtenues par des modèles alternatifs ex vivo ou in vitro, car ils ne reconstituent pas de manière optimale la complexité et la diversité des interactions du microbiote intestinal.
Réduction
Le plus petit nombre d’animaux nécessaire par groupe a été défini tout en permettant d’obtenir des résultats statistiquement exploitables, en se basant sur la variabilité interindividuelle et de la sensibilité des marqueurs biochimiques, dont les cytokines. Ce nombre tient aussi compte du fait que les expériences seront réalisées trois fois de manière indépendante afin de s’assurer de la reproductibilité des résultats.
Raffinement
Afin de raffiner les procédures et de réduire tout stress, un soin particulier est apporté aux questions relatives au bien-être animal en garantissant un enrichissement de l’environnement et une habituation aux personnes travaillant avec les animaux . Après 7 jours d’acclimatation qui leur permet de s'adapter à leur environnement, ils seront hébergés entre 3 à 5 par cage pour le respect la cohésion sociale de l'espèce, et manipulés quotidiennement jusqu’au début des expériences. Cette période d’habituation permet de réduire leur niveau de stress lors des manipulations ultérieures. Les cages, transparentes, sont enrichies (tunnels de manipulation en carton, carrés de cellulose et bâtonnets) et sont rapprochées les unes des autres, afin que les animaux aient un contact visuel avec leurs congénères. Un suivi des points limites sera mis en place suivant une méthode de prise en charge adaptée au projet. Les expérimentations sont réalisées lorsque cela le nécessite, sous anesthésie générale avec l'utilisation d'analgésiques adaptés. Les animaux sont suivis quotidiennement par du personnel formé et expérimenté, soucieux du bien-être des animaux.
Choix des espèces
La souris est une espèce de référence en toxicologie et immunologie ; disciplines au carrefour desquelles la thématique du laboratoire nous positionne. La souris est un modèle d’étude très largement utilisé dans le cadre de l’étude de pathologies humaines et de leur impact sur le microbiome intestinal. La disponibilité de modèles animaux d’induction de colite murins pertinents pour nos questions de recherche et le besoin ponctuel de travailler en environnement axénique (complétement stérile) , principalement en isolateurs, compatibles avec la taille des animaux, constituent de plus des facteurs important qui en fait l’espèce animale de choix. Les animaux seront utilisés à partir de 6-8 semaines (adultes), afin que le système immunitaire et le microbiote instestinal soient installés, ainsi nous pourrons évaluer l’impact de notre bactérie sur la structure, la composition de l’intestin, ainsi que la gestion de l’inflammation associée à la colite induite, et ce dans l'objectif de proposer aux patients une solution thérapeutique adaptée et efficace.
Etude du rôle d’un facteur de synthèse des ribosomes dans le maintien de l’identité des cellules souches embryonnaires murines
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
16 souris mâles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des cellules souches embryonnaires leur sont injectées dans les testicules par chirurgie pour y former des tumeurs bénignes, analysées ensuite au microscope. Le porteur indique que l'ensemble du projet a jusqu'ici été mené sur cellules en culture, sans animaux, et que le recours à la souris vise à démontrer un résultat réclamé dans la phase de finalisation pour publication. Les souris sont mises à mort au plus tard huit semaines après l'injection ou dès l'atteinte des points limites.
Objectifs
Contexte. Les cellules souches embryonnaires (cellules ES) apparaissent au début de l’embryogénèse et sont à l’origine de la formation de tous les tissus qui constituent les embryons. Les cellules ES peuvent être cultivées en laboratoire indéfiniment, tout en conservant leurs 2 propriétés principales. 1) l’auto-renouvellement qui permet à une cellule ES de se diviser en 2 cellules filles identiques. 2) La pluripotence, c’est à dire la capacité à changer d’identité pour se transformer en toutes les cellules constituant les organes. Comprendre comment les cellules ES conservent leur identité ou en changent est donc essentiel pour différents champs d’application de la biologie et de la médecine car cela contribue aussi bien à améliorer la médecine de la reproduction qu’à mieux comprendre certaines pathologies humaines telles que le cancer. Hypothèse. Depuis 2018, une protéine a été identifiée pour son implication dans un mécanisme biologique essentiel qui aboutit à la fabrication des protéines, appelé traduction. Il a été établi que cette protéine est très exprimée dans les cellules ES et est essentielle pour qu’elles conservent leur capacité à se diviser à l’identique mais pas pour leur capacité à changer d’identité (pluripotence). Toutes les expériences ont été réalisées sur des cellules ES en culture et doivent maintenant être confirmées par des expériences in vivo qui miment le développement embryonnaire. Description du modèle. Toutes les expériences in vitro ont été réalisées sur des cellules ES de souris, aussi les tests in vivo doivent être réalisés chez la souris afin de limiter les biais d’analyse entre différentes espèces. Le test in vivo consiste à injecter des cellules ES dans les testicules de souris mâles adultes. Les cellules ES injectées vont former des tumeurs bénignes non disséminantes et constituées, non pas de cellules cancéreuses, mais de cellules ES qui auront changé d’identité. L’enjeu principal de ces tests est donc d’identifier les types cellulaires différenciés une fois la tumeur bénigne formée, grâce à des analyses au microscope des tumeurs collectées. Objectif. Le projet a pour finalité de déterminer si la perte de la protéine impliquée dans la traduction dans les cellules ES entraîne une modification de leur capacité à changer d’identité in vivo afin de confirmer les nombreuses observations qui ont été réalisées sur des cellules ES de souris in vitro.
Bénéfices attendus
L’étude des processus responsables du développement précoce des embryons chez l’homme et chez les mammifères contribue à l’amélioration de la prise en charge de l’infertilité (par ex., fécondation in vitro). Un des modèles biologiques les plus étudiés pour mieux comprendre ces processus sont les cellules souches embryonnaires (ou cellules ES). Les cellules ES présentent le gros avantage de pouvoir être cultivées en laboratoire tout en conservant leur capacité à former tous les tissus qu’on retrouve dans les embryons qui se développent. Pour améliorer nos connaissances de la biologie du développement des embryons, il est donc essentiel de décortiquer les mécanismes qui contrôlent l’activité des cellules ES et donc les mécanismes qui contrôlent l’expression des gènes dans ces cellules ES. De plus, ces mécanismes fondamentaux peuvent être conservés dans d’autres types de cellules souches à l’origine de pathologies humaines telles que le cancer. En conséquence, approfondir la connaissance des mécanismes moléculaires qui régissent l’identité des cellules ES présente un enjeu majeur aussi bien pour la recherche fondamentale en biologie, pour la médecine de reproduction et pour la cancérologie. Au cours d’une étude portant sur le rôle du mécanisme responsable de la synthèse des protéines dans les cellules ES chez la souris, et un tout nouveau facteur a été identifié comme jouant un rôle essentiel dans ce mécanisme. Grâce à des approches in vitro, c’est à dire, sur des cellules en culture en laboratoire, ce facteur a été montré comme essentiel pour préserver les propriétés des cellules souches. Ce facteur est présent dans d’autres types de cellules souches (cellules ES humaines, cellules souches adultes, cellules souches cancéreuses) et pourrait donc jouer un rôle important dans le développement des embryons humains et dans certains types de cancers tel que le cancer du colon où il est fortement exprimé.
Procédures
Les souris seront soumise à une unique procédure chirurgicale d'une durée de 10-15 min sous anesthésie générale et traitement entalgique pour éviter toute douleur.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables qui sont attendus pour les animaux sont ceux qui peuvent découler : i) de la procédure chirurgicale (inflammation, infection et douleurs localisées), ii) de la présence de sutures cutanées qui peuvent entrainer des blessures cutanées à postériori causées par l’animal lui-même par démangeaisons, iii) de douleurs et de modifications du comportement de la souris (perte de poids) liées à la procédure.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort après une anesthésie générale dès l'atteinte des points limites ou après une période maximale de 8 semaines après l'injection des cellules ES dans les testicules.
Remplacement
Jusqu’à présent, tout le projet a complètement été réalisé grâce à des expériences en laboratoire sur cellules ES de souris, donc sans faire appel à aucun modèle animal. Dans sa phase de finalisation pour publication, il nous est demandé de démontrer par d’autres approches que les cellules ES que nous étudions, maintiennent leur capacité à générer des embryons. Cela ne peut être réaliser sans le recours à des modèles animaux.
Réduction
Le nombre de souris utilisées sera réduit à 16 (2 groupes de 8 souris) pour les raisons suivantes : 1) Le choix des testicules comme site d’injection permet de doubler le potentiel de développement de tumeurs bénignes sans augmenter le nombre d’animaux. 2) Le résultat attendu de ce projet est l’observation qualitative de tissus adultes au sein des tumeurs bénignes mais nous ne recherchons d’effet statistique, permettant ainsi de réduire la taille des groupes d’animaux. Notre expérience antérieure nous permet de prédire que 2 souris sur 3 injectées avec des cellules ES développent des tumeurs bénignes dans les testicules. Ceci, combiné aux données de la littérature, nous permet de réduire le nombre de souris receveuses à 8 par condition pour obtenir un nombre suffisant de tératomes analysables et ne pas reproduire l'expérience inutilement.
Raffinement
Durant toute la procédure, et en particulier dès le réveil post-chirurgie, les souris seront observées régulièrement (2 à 3 fois par semaine) afin de détecter tout signe de souffrance qui conduirait à la mise à mort de ces souris. De plus, anesthésiques et analgésiques seront utilisés pendant l’expérimentation avant, pendant et après la procédure opératoire.
Choix des espèces
L’ensemble du projet est focalisé sur l’étude de la biologie des cellules souches embryonnaires de souris. Bien que nous ayons montré que le rôle de la protéine candidate est conservé dans les cellules souches embryonnaires humaines et dans les cellules souches pluripotentes induites (iPSC) de souris, il nous apparaît donc plus opportun de réaliser les expériences de formation de tératomes chez la même espèce afin de récapituler au mieux les voies de signalisations qui vont induire la différenciation des cellules souches embryonnaires dans les tératomes. Toutes les expériences seront réalisées avec des souris adultes de 6 à 8 semaines, qui est l'âge habituellement utilisé pour l’induction de tératomes.
Utilisation de l’imagerie par résonance magnétique (IRM) pour la caracterisation des glioblastomes
- Recherche appliquée
- Diagnostic des maladies
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système nerveux
250 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles reçoivent une greffe de cellules tumorales dans le cerveau, puis des séances d'IRM sous anesthésie et des prélèvements sanguins hebdomadaires, avant l'euthanasie pour prélever le cerveau. Le porteur indique que l'imagerie n'ajoute pas de douleur mais qu'elle sera réalisée malgré l'observation préalable de signes de souffrance liés à la tumeur, les souris perdant plus de 20 % de leur poids étant mises à mort. L'objectif reste de valider l'IRM comme outil de suivi tumoral, les retombées pour les patients étant renvoyées à un stade ultérieur.
Objectifs
Le glioblastome multiforme (GBM) est le type de tumeur cérébrale le plus fréquent et le plus mortel. En principe, les médicaments peuvent atteindre les tumeurs via les vaisseaux, mais l’environnement cellulaire au sein duquel évoluent les cellules cancéreuses joue le rôle d'un antagoniste à toute délivrance efficace de médicaments. Les traitements récents associent la chimiothérapie à des médicaments, qui visent à renormaliser les vaisseaux de la tumeur en réduisant l'angiogenèse, c'est-à-dire la ramification de nouveaux vaisseaux à partir de vaisseaux existants. Cependant, il n'existe pas encore de facon de distinguer les différents effets du traitement sur les cellules cancéreuses. Le but de ce projet est d’utiliser l'imagerie par résonance magnétique (IRM) afin d'évaluer chez la souris 1) la taille de la lésion tumorale suite à l’implantation de cellules tumorales dans le cerveau 2) les modifications des propriétés visqueuses et élastiques du cerveau qui permettent d'évaluer l'intégrité des tissus et l'organisation vasculaire, 3) la circulation du sang dans les vaisseaux et leur organisation.
Bénéfices attendus
Disposer d’un marqueur biologique identifiable par imagerie robustes et non-invasifs pour évaluer les composants individuels de la t umeur, c'est-à-dire la composition des tissus et l'organisation du réseau des vaisseaux. Ces approches d'imagerie sont donc le moyen idéal pour évaluer les effets de la thérapie sur les tumeurs et l’environnement cellulaire au sein duquel évoluent les cellules cancéreuses.
Procédures
Tous les animaux seront soumis a: 1) Imagerie par résonance magnétique au temps J7, J14, J28, J40 après implantation des cellules tumorales dans le cerveau (J0) pour une duree de 2h par souris (réalisé sous anesthésie gazeuse ) 2) prélèvement sanguin (qui dure environ 5 sec) afin d’évaluer la lésion tumorale 1 fois par semaine sans anesthesie pendant toute la duree du protocole 3) euthanasie pour prélever le cerveau.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables ne sont pas spécifiques à la procédure car l’IRM n’induit pas de douleur supplémentaire. Néanmoins, en cas d’observation de la douleur des mesures seront prises telles que l’administration d’ analgésiants. La procédure IRM, qui n'induit pas de douleur, sera réalisée malgré l'observation préalable de signes de souffrance liee à l’implantation des cellules tumorales ou a la croissance de la tumeur. Pendant la procédure d'IRM, l'animal est endormi avec un gaz anesthésiant pendant l’intégralité de la procédure, la fréquence respiratoire est surveillée et l'animal est placé sur un lit chauffé.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de la procédure a fin de recuperer les cerveaux pour les analyses biologiques.
Remplacement
Dans ce projet, l'expérimentation animale sera mise en place pour étudier une modification locale de l’environnement cellulaire au sein duquel évoluent les cellules cancéreuses, qui serait difficile à étudier par des moyens alternatifs (par culture cellulaires ou en modélisation par logiciel).
Réduction
Les groupes ont été conçus de manière à minimiser le nombre d'animaux utilisés. Un calcul statistique du nombre de sujets nécessaires a été effectué afin d'évaluer le nombre d'animaux à inclure pour obtenir des résultats significatifs tout en minimisant le nombre d'animaux. Ces calculs ont été rendus possibles par les résultats antérieurs obtenus avec ces modèles animaux.
Raffinement
Le stress et la douleur seront limités pour garantir le bien-être de l'animal et des résultats fiables. Le stress a un impact important sur le comportement biologique de la réponse immunitaire. Par conséquent, la manipulation des animaux sera réduite au minimum. Toutes les manipulations seront effectuées sous anesthésie. Les soins et le suivi des animaux seront effectués par des personnes compétentes et expérimentées. De facon systematique, du coton est ajoute dans les cages pour que les souris fassent leurs nids. Les critères d'évaluation de la douleur ne sont pas spécifiques à la procédure car l’IRM n’induit pas de douleur supplémentaire. La douleur observée peut être due à l’implantation des cellules tumorales. Neanmoins, en cas d’observation de la douleur des mesures seront prises. Les points les plus précoces sont les troubles du comportement (repli dans un coin, poil hérissé, etc.), l'altération de l'apparence physique (grattage, poil terne, etc.) puis l'anorexie, perte de poids > 20%. Si les points limites sont atteints, l'animal sera euthanasié et ne sera donc pas soumis à la procédure IRM. La procédure IRM, qui n'induit pas de douleur, sera réalisée malgré l'observation préalable de signes de souffrance liee à l’implantation des cellules tumorales ou a la croissance de la tumeur. En effet, si le score comme indiqué ci-dessous indique des signes de douleur et donc la nécessité d'utiliser un analgésiant, celui-ci sera administrée avant de se rendre sur le site de l'IRM. Pendant la procédure d'IRM, l'animal est endormi avec un gaz anesthésiant pendant l’intégralité de la procédure, la fréquence respiratoire est surveillee et l'animal est placé sur un lit chauffé.
Choix des espèces
L'utilisation des animaux pour etudier le cancer présente de nombreux avantages par rapport à l'utilisation des cellules in vitro (n’utilisant pas de modèle animal). Plus de 80 % des gènes de la souris sont similaires à ceux de l'homme, ce qui a conduit à l'adoption de la souris comme organisme pour etudier la biologie et la thérapie du cancer du cerveau. Beaucoup d'etudes scientifiques ont démontré que les tumeurs dans les animaux, reproduisent mieux les caractéristiques des vaisseaux et des cellules des tumeurs cérébrales humaines. Dans ce contexte, les souris (âge adulte, agées 9-11 semaines) sont soumises à une transplantation dans le cerveau des cellules tumorales, et puis les souris sont soumises au protocole d’IRM pour étudier les propriétés des tissus et développer de nouvelles stratégies diagnostiques.
Effet de deux traitements sur la maladie Waldenström, pathologie maligne caractérisée par une production anormale d’anticorps.
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
576 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Génétiquement modifiées pour reproduire la maladie de Waldenström, elles reçoivent un gavage quotidien pendant trente jours et des prélèvements de sang hebdomadaires, sur une durée pouvant atteindre neuf mois, pour tester l'effet combiné de deux molécules. Le porteur indique ne prévoir aucune analgésie, au motif qu'elle fausserait l'étude du système immunitaire, et s'en remet à une grille de score stricte. Il affirme qu'aucune méthode de remplacement n'est connue et qu'un "organisme vivant entier" est nécessaire.
Objectifs
La maladie de Waldenström est une pathologie hématologique maligne (cancer) qui se caractérise par une production anormale et excessive d’anticorps (élément impliqué notamment dans la réponse immunitaire suite à une infection). Les patients présentent alors une anémie (diminution de la production normale des globules blancs, rouges et des plaquettes) caractérisée par une fatigue et une pâleur de la peau notamment. Cette maladie est associée à deux mutations génétiques retrouvées fréquemment chez ces patients. A ce jour, le traitement le plus utilisé chez ces patients cible l’une de ces mutations. Cependant même s’il est efficace, il ne conduit pas à une rémission complète. Un essai clinique actuellement en cours, utilise une molécule agissant spécifiquement sur la seconde mutation. Le but de ce projet est de tester l’effet thérapeutique combiné de ces deux molécules sur cette pathologie en utilisant un modèle de souris et obtenir des informations sur le mécanisme d’action de ces traitements en vue de leur amélioration.
Bénéfices attendus
Ce projet de recherche nous permettra de mieux comprendre les mécanismes d'action de deux molécules pouvant être utilisées dans le traitement de cette maladie. Cela pourrait nous permettre également d’ouvrir de nouvelles pistes thérapeutiques pour aider les patients souffrant de cette maladie encore incurable.
Procédures
Afin de tester l’effet combiné des deux traitements, nous utiliserons un modèle de souris génétiquement modifiées exprimant les deux mutations génétiques retrouvées chez les patients atteints de la maladie de Waldenström. Les connaissances actuelles sur ce modèle murin ne montrent pas d’altération de leur bien-être. Nous utiliserons comme contrôle des souris normales (sans mutation génétique) ainsi que des souris exprimant l’une ou l’autre de ces mutations (pas d’altération du bien-être observée chez ces animaux). Toutes les souris seront soumises à un protocole de traitement consistant à administrer par gavage les deux types de molécules thérapeutiques seules ou combinées (soit quatre groupes expérimentaux dont un recevant uniquement une solution saline). Cette administration non douloureuse durant moins d'une minute (réalisée sur souris éveillées avec des sondes adaptées afin de ne pas générer de blessures) sera quotidienne pendant 30 jours. Le traitement pourra être répété une seconde fois avec un intervalle d’un à six mois entre les deux cycles. Afin de suivre l’effet des traitements sur le développement de la maladie, des prélèvements sanguins (au niveau de la joue, geste non douloureux d'une durée de 30 secondes réalisé sur souris éveillées) seront effectués chaque semaine sur toute la durée de la procédure expérimentale (durée pouvant allant de 30 jours à 9 mois). Dans la première expérience, les animaux seront euthanasiés immédiatement après la fin du traitement (au bout de 30 jours). Dans la deuxième série, les animaux seront maintenus en vie jusqu’à l’âge de 12 mois maximum (soit 8 mois après la fin du traitement) afin de caractériser l’éventuelle reprise de la maladie. Enfin, nous procéderons à deux cycles de traitement, le second étant initié dès réapparition des symptômes (au plus tôt un mois après la fin du premier cycle de traitement). L’ensemble des souris inclus dans ces deux séries d’expériences seront euthanasiées au plus tard à l’âge de 12 mois.
Impact sur les animaux
Les procédures de ce projet peuvent générer un stress important des animaux du fait de leur fréquence (administration par gavage quotidiennement pendant 30 jours, irritation possible du tube digestif, apparition des signes cliniques de la maladie). Nous y serons particulièrement vigilant (expérimentateur aguerri au geste de gavage et prenant soin de minimiser le stress lors de la manipulation des animaux).
Devenir
Tous les animaux de ces procédures seront euthanasiés à l’issu de chaque procédure et les différents organes liés au système immunitaire seront prélevés pour analyse.
Remplacement
Les pathologies caractérisées par des dérèglements des cellules du système immunitaire sont complexes et mettent en jeu différents acteurs. L’étude de molécules thérapeutiques impliquent un système regroupant cet environnement. Aucune procédure de remplacement permettant d’éviter le recours à l’expérimentation animale n’est connue à ce jour. Il est donc nécessaire d’avoir un organisme vivant entier pour cette étude. De plus la distribution des molécules à visée thérapeutique ne peut pas être modélisée à ce jour dans un système non animal.
Réduction
Grâce à une analyse statistique et à notre expertise sur ce type d’expériences, nous avons réduit le nombre de souris utilisés au maximum tout en s’assurant d’obtenir des résultats statistiquement significatifs. De plus, nous optimisons nos expériences pour réaliser le plus d'analyses possibles sur les cellules obtenues à partir d'un même animal (récupération dans une seule expérience d’un grand nombre d’organes du système immunitaire afin de réaliser le maximum d’analyse et de conserver des prélèvements pour des études ultérieures.).
Raffinement
Afin de réduire au minimum la douleur et la souffrance qui pourraient être ressenties par les souris, nous prévoyons la mise en place de différentes actions. Les souris seront hébergées dans un environnement enrichi (présence de papier kraft pour la création de nid et de buchette en bois à ronger). Un suivi quotidien (par les animaliers et/ou les expérimentateurs) des animaux est réalisé. Trois fois par semaine, nous réaliserons un suivi clinique des animaux à l'aide d'une grille de score permettant de déterminer des points limites précoces qui conduiront à l'euthanasie des animaux. L'analgésie des souris n’est pas prévue. En effet, ces animaux étant utilisés pour des procédures visant à étudier le système immunitaire, les analgésiques créeraient un biais expérimental rendant les résultats inexploitables, de ce fait notre table de score est stricte pour éviter toute souffrance animale.
Choix des espèces
La souris a été choisie pour réaliser les expériences de ce projet. Ce modèle animal est pertinent dans notre étude, car il existe un modèle transgénique servant de modèle à la maladie de Waldenström. Les souris utilisées dans le cadre de ce projet seront des souris adultes avec un système immunitaire totalement développé et fonctionnel.
Création des lignés primaires de muscles lisses bronchiques à partir du modèle de l’asthme chronique murin allergique
- Recherche fondamentale
- Système respiratoire
90 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont sensibilisées à un allergène par injections intrapéritonéales puis intranasales sous anesthésie, avant des mesures respiratoires réalisées après trachéotomie sans réveil, pour produire des lignées de cellules de muscle lisse bronchique. Le porteur indique un risque de dyspnée corrigé par nébulisation de salbutamol. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ne rend compte du remodelage bronchique, tout en présentant ces cultures cellulaires comme un moyen de réduire à terme le nombre de souris.
Objectifs
L’asthme est une maladie très fréquente des voies respiratoires qui touche 300 millions de personnes dans le monde. Le terme « d’asthme sévère » s’applique aux patients présentant un asthme dont le contrôle est impossible malgré des traitements inhalés à fortes doses. Un des besoins non couvert dans l’asthme sévère est la prévention efficace des exacerbations. Ces exacerbations sont des épisodes caractérisés par une majoration des symptômes d'essoufflement, de toux, de respiration sifflante ou d'oppression thoracique et par une diminution de la fonction respiratoire. L'asthme est caractérisé par une hyperréactivité, une inflammation et un remodelage bronchique. Le remodelage bronchique est un changement structurel qui comprend entre autre des altérations de l’épithélium, des modifications de la matrice extracellulaire, un épaississement de la membrane basale, une hyperplasie des cellules à mucus, et une augmentation de la taille du muscle lisse bronchique (MLB). La taille du muscle lisse bronchique est une valeur très importante car son augmentation est associée à une fonction respiratoire dégradée et à un taux d’exacerbation plus élevé. Les muscles lisses des bronches d’asthmatique se caractérisent par l’excès de prolifération cellulaire dont les mécanismes sont encore inconnus. Les travaux de notre laboratoire ont déjà mis en évidence un lien entre la taille du muscle lisse bronchique et l’augmentation de la masse mitochondriale. L’augmentation de la masse mitochondriale est un support pour la prolifération des cellules du muscle lisse bronchique. L’étude sur les cellules musculaires lisses bronchiques en culture offre une possibilité de mieux déceler les mécanismes sous-jacents à l’augmentation de la masse mitochondriale des MLB et à son influence sur le remodelage bronchique. Le but de ce travail est de produire les lignées primaires de MLB à partir des bronches de souris témoins et asthmatiques sensibilisées soit à l’ovalbumine soit aux acariens. Ces cellules primaires seront analysées avec les techniques très variées. Les résultats ainsi obtenus seront comparés avec ceux obtenus avec les lignées primaires de MBL humaines de témoins et asthmatiques. Cette approche nous indiquera les mécanismes communs jouant le rôle primordial dans l’asthme. Cela permettra également d’apercevoir les différentes caractéristiques des MLB suite au fait d’être allergique aux acariens ou à l’ovalbumine.
Bénéfices attendus
L’obtention des cultures primaires des MLB des souris asthmatiques et témoins permettra considérablement élargir le champs techniques d’études de remodelage bronchiques. Les résultats ainsi obtenus seront comparés avec ceux obtenus avec les lignées primaires de MBL humaines des témoins et asthmatiques. Cette approche in vitro nous indiquera les mécanismes communs jouant le rôle important dans l’asthme. Cela permettra également de repérer la différence dans les caractéristiques des MLB suite au fait d’être allergique aux acariens ou à l’ovalbumine.
Procédures
Les animaux seront soumis à deux injections intrapéritonéales de l’allergène et à 9 injections intranasales sous l’anesthésie gazeuses (2 minutes). A la fin de protocole les mesures des paramètres respiratoires seront effectuées sur les animaux trachéotomisés (protocole sans réveil sous anesthésie).
Impact sur les animaux
Le risque de dyspnée chez les animaux suite à l’instillation de l’allergène sous anesthésie gazeuses existe. Après l’anesthésie, les animaux seront observés par l’opérateur et la dyspnée éventuelle sera corrigée par la nébulisation de salbutamol.
Devenir
L’objectif de ce projet est la récupération des bronches des animaux asthmatiques et témoins afin de produire les lignées primaires de MLB. La première phase nous permet de développer l’asthme murin. Lors de la seconde phase, les mesures des paramètres respiratoires seront faites et les animaux seront euthanasiés pour le prélèvement des organes d’intérêt.
Remplacement
En raison de la complexité de la communication intercellulaire menant à la maladie, il n’existe pas de modèle in vitro qui permet d’estimer l’évolution du remodelage bronchique dans l’asthme. L’utilisation du modèle d’asthme chronique murin dans nos études nous donnera une meilleure compréhension des phénomènes. Les lignées primaires des MLB nous permettront d’utiliser plusieurs techniques additionnelles pour déceler les causes de la maladie. Au final, cela permettra de réduire le nombre des souris de l’expérimentation animale dans l’étude de l’asthme.
Réduction
Se souciant de réduire le nombre des animaux en expérimentation, comme pour chaque test statistique, nous avons défini le nombre de souris par groupe pour obtenir des résultats significatifs, et nous réaliserons de multiples études ex vivo sur différents organes et selon différentes techniques. Ainsi, nous utiliserons 10 souris dans chacun des trois groupes pour trois productions des lignées primaires en question. Le nombre défini est le nombre minimal de souris qui peut être utilisé pour l'obtention de données scientifiques robustes.
Raffinement
Afin de diminuer la souffrance et l’angoisse des animaux, des dispositifs sont prévus (anesthésie pour les instillations, analgésie et anesthésie pour les mesures des paramètres respiratoires), raffinement des conditions d’hébergement (hébergement en groupes sociaux, copeaux et bâtons), vérification par la structure en charge du bien-être des animaux et nous avons soigneusement décrit des points limites en relation avec notre protocole (critères de perte de poids, comportement anormal ou difficulté respiratoire). La dyspnée éventuelle induite par les instillations intranasales d’allergène, peut être traitée par la nébulisation pendant 15 s d’un broncho-dilatateur d’action rapide (salbutamol 1g/ml). La dernière phase du projet, comporant les mesures des fonctions respiratoires est réalisée sous anesthésie générale avec une couverture analgésique adaptée, sans réveil pour l'animal.
Choix des espèces
La souris est une espèce classiquement utilisée pour l’étude de la réactivité des voies aériennes normales et pathologiques. De plus, le laboratoire utilise cette espèce depuis plusieurs années, et dispose donc dans cette espèce, de nombreuses données sur lesquelles s’appuie la présente étude. Les animaux utilisés pour commencer le protocole sont des jeunes adultes âgés de 5 à 10 semaines. La plupart des études scientifiques dans le domaine pneumologique sont réalisées sur les animaux de cet âge.