Souris
Imagerie moléculaire des tumeurs métastatiques chez la souris
- Recherche appliquée
- Cancers
800 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections de cellules cancéreuses pour développer des cancers disséminés, puis des séances d'imagerie sous anesthésie, afin de mettre au point des agents de diagnostic des métastases. Le porteur décrit une perte de poids et des signes de mal-être suivis par une grille, l'animal étant tué dès un score supérieur à 6, les autres tués pour prélever les tumeurs. Les retombées annoncées pour les patients relèvent d'une médecine personnalisée future, l'imagerie étant présentée comme réduisant le nombre d'animaux par rapport à une étude classique.
Objectifs
Le cancer est désormais la première cause de mortalité dans les pays développés, devant les pathologies cardiovasculaires. La mortalité des patients atteints de cancer est aujourd’hui principalement médiée par l’évolution des tumeurs primaires en maladies systémiques par l’apparition de métastases. Dans ce contexte, l’objectif de nos recherches est d’abord de mettre en place des modèles de cancers disséminés mimant l’envahissement systémique des métastases, puis de développer de nouvelles techniques d’imagerie pour évaluer la réponse aux traitements anti-cancéreux et permettre d’adapter les traitements de façon la plus individualisée possible à chaque patient grâce à un examen indolore d’imagerie médicale.
Bénéfices attendus
Ce projet aboutira au développement d’agents d’imagerie non invasifs permettant le diagnostic et le suivi des métastases issues de divers cancer. Ces agents permettront une meilleure prise en charge des patients et sera un pas de plus vers la médecine personnalisée en oncologie. De plus, ce projet permettra l’émergence de nouvelles stratégies thérapeutiques pour lutter contre l’apparition de métastases au cours du développement tumoral.
Procédures
Les animaux subiront des injections de cellules par voie IP ou IV. Des traitements seront également administrés à certains animaux par voie IP, IV ou oral (gavage). Enfin, les animaux subiront des imageries in vivo (PET/SPECT/fluorescence/bioluminescence).
Impact sur les animaux
Le développement de modèles animaux de cancer disséminés est susceptible d’induire chez les animaux des signes cliniques tels qu’une perte de poids ou des signes de mal être qui seront très étroitement suivis tout au long des procédures du projet afin de mettre à mort les animaux dès l’apparition de ces signes cliniques indésirables comme décrit dans le tableau 1 en annexe. Si le score obtenu est > 6 points, l’animal sera mis à mort. Des mesures proactives seront systématiquement prises en cas de score compris entre 2 et 6 : notamment une supplémentation en nourriture en gelée si une perte de poids était observée, injection sous-cutanée de sérum physiologique en cas de déshydratation, une augmentation de la fréquence d’observation des animaux si des problèmes respiratoires ou des problèmes comportementaux étaient observés.
Devenir
Les animaux seront mis à mort afin de permettre le prélèvement et l'analyse des tumeurs.
Remplacement
La mise en place de ce projet s’est attachée à respecter la règle des 3R. L’étude préalable des molécules d’intérêt sur culture cellulaire permet de s’affranchir de l’utilisation d’animaux non justifiée.
Réduction
En comparaison avec une étude « classique » qui nécessite l’euthanasie des animaux à chaque point de temps examiné, l’imagerie nous permet de répéter l’imagerie à différents temps chez le même animal et donc de réduire le nombre d’animaux d’autant.
Raffinement
L’imagerie est une méthode non invasive permettant d’obtenir des données anatomiques et fonctionnelles quantifiables se substituant à des méthodes de prélèvements plus traumatiques pour l’animal. La totalité des procédures impliquant les animaux (injection sous-cutanée, intraveineuse et imagerie) est réalisée sous anesthésie suivie d’un réveil sous lampe chauffante, réduisant l’inconfort potentiel à son minimum et permettant ainsi le raffinement de l’étude.
Choix des espèces
Les murins de type souris constituent un modèle de choix en pharmacologie car leurs génomes sont connus et leurs grandes fonctions physiologiques sont comparables à l’Homme (fonction rénale, hépatique). Enfin, elles sont compatibles avec nos systèmes d’imagerie moléculaire eux-mêmes très proches des appareillages humains (SPECT, TEP, IRM et fluorescence), facilitant par là même le transfert à la clinique (recherche translationnelle). Du point de vue scientifique, la souris reste le modèle de choix dans les études d’oncologie. La prise tumorale dans des souris avec un fond génétique stable est homogène permettant une assez bonne reproductibilité. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte. Les molécules étudiées ont pour but d’aider le diagnostic ou le traitement de cancers retrouvés chez les patients adultes. Il est donc justifié de travailler sur des animaux adultes possédant des fonctions physiologiques proches de la future cible humaine.
Mécanismes et thérapeutiques de la thrombopénie autoimmune
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
2 280 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Elles reçoivent des injections répétées d'anticorps dirigés contre leurs plaquettes et subissent jusqu'à onze prélèvements sanguins, certaines avec implantation d'une pompe osmotique, pour reproduire une baisse des plaquettes d'origine auto-immune. Le porteur déclare n'attendre aucun effet indésirable ni nuisance remarquable, tout en fixant une mise à mort immédiate dès un score de 3 sur sa grille. Il qualifie ses procédures de "stricte nécessité" et affirme qu'elles ne peuvent être remplacées par des méthodes sans animaux vivants.
Objectifs
Identifier les sous-classes d’immunoglobulines G (IgG) humaines et les récepteurs humains responsable de l’élimination des plaquettes dans un modèle murin de thrombopénie autoimmune (ce trouble de la coagulation se manifeste par une diminution du nombre de plaquettes dans le sang, elle-même causée par la production d’anticorps dirigés contre les plaquettes de la personne elle-même. Dans ce modèle, les souris sont injectées par des autoanticorps anti-plaquettes de différentes sous-classes d’IgG de manière répétée. Si une diminution des plaquettes est avérée, des souris sont injectées avec des anticorps antagonistes de certains récepteurs pour identifier s’ils interviennent dans la maladie.
Bénéfices attendus
Notre projet vise à évaluer le rôle des sous-classes d’IgG et des récepteurs pour les IgG, dans la thrombopénie autoimmune afin de mieux en comprendre la physiopathologie et, à terme, pouvoir proposer des nouvelles approches thérapeutiques, ciblant les FcgRs par exemple.
Procédures
Prélèvements sur animaux vigiles : Procédure 1 : 6 prélèvements sanguins de 30uL Procédure 2 : 7 prélèvements sanguins de 30uL Procédure 3 : une implantation d’une pompe osmotique en sous-cutané et 11 prélèvements sanguins de 30uL.
Impact sur les animaux
Pas d’effets indésirables ni nuisances remarquables.
Devenir
Mise à mort en fin de procédure car les animaux ne peuvent pas être réutilisés, replacés ou adoptés.
Remplacement
Le recours à l’utilisation d’animaux est justifié par le fait que les mécanismes moléculaires de la thrombopénie autoimmune sont difficiles, voire impossible, à étudier chez l’homme, vu la rareté et la localisation des cellules impliquées (macrophages de la rate et du foie). Se déployant dans la rate en premier lieu (et le foie) dont les fonctions, la structure et la vascularisation sont uniques, les pathologies et les thérapies objets d’investigations, ne peuvent pas être remplacées par des modèles in vitro: nos procédures expérimentales ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information biologiquement pertinente.
Réduction
Le recours à des lignées consanguines de souris permet entre autres de réduire le nombre d’animaux par groupe expérimental, et de ne pas prolonger les explorations dès lors que sont initiées et mesurables les conséquences biologiques des interactions entre les anticorps et leurs récepteurs (FcgR). Les nombres d’animaux utilisés lors des expériences sont minimalisés, avec la contrainte d’obtenir des données statistiquement significatives. Une analyse de variances de type ANOVA sera réalisée entre les groupes.
Raffinement
Ce modèle de thrombopénie n’induit pas d’effets indésirables ni nuisances remarquables. Les manipulations d’animaux sont restreintes aux injections intraveineuses, et aux prélèvements sanguins, afin de minimiser le stress des animaux durant les 8-15 jours de la durée de l’expérience. L’état général des animaux sera suivi par observation selon une grille animaux témoins/procédure légère mise en place par la structure du bien-être animal en scorant Toilettage, Poil, Respiration, Posture, Mobilité ; chaque signe = 1 point, si score =3 le point limite est atteint et une mise à mort est effectuée immédiatement.
Choix des espèces
La thrombopénie autoimmune est une réaction qui se déploie la rate (et le foie), la pathologie et les thérapies étudiées ici, ne peuvent pas encore être modélisées pertinemment et donc remplacées par des modèles in vitro: nos procédures expérimentales ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information biologiquement pertinente. L’espèce utilisée est la souris de laboratoire. Le recours à des lignées consanguines de souris permet de réduire le nombre d’animaux par groupe expérimental. Les animaux seront utilisés au stade jeune adulte (entre 8 et 15 semaines). Les animaux ne sont pas utilisés à un âge plus avancé (au-delà de 15 semaines), afin que leur masse ne soit pas trop importante et ne nécessite l’injection de doses d’anticorps plus importantes.
Evaluation de l’intérêt thérapeutique du surnageant des HuMoSC (cellules humaines suppressives d’origine monocytaire) dans un modèle de sclérodermie systémique induite chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Troubles sensoriels
40 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles reçoivent cinq injections hebdomadaires d'un agent chimique, l'HOCl, provoquant une fibrose de la peau et des poumons, ainsi que des injections d'un traitement testé, avant prélèvement du sang, de la peau, des poumons et de la rate. Le porteur décrit des effets possibles de gêne respiratoire et de rigidification cutanée, tout en affirmant n'attendre "aucun signe clinique majeur". Le modèle induit une sclérodermie systémique pour évaluer un candidat thérapeutique.
Objectifs
Les résultats obtenus sur un modèle de fibrose de peau ex vivo montrent qu’en plus de son action anti-inflammatoire, le surnageant de HuMoSC serait efficace dans le traitement de la fibrose. L’objectif de ce projet est de compléter et de confirmer l’intérêt thérapeutique du surnageant de HuMoSC, dans un modèle de fibrose induite par l’injection d’HOCl chez la souris.
Bénéfices attendus
En s’appuyant sur les résultats de nos précédentes études et après avoir identifié la meilleure posologie concernant l’administration du surnageant de HuMoSC, nous pouvons nous attendre à une diminution de l’inflammation ainsi qu’une diminution de la fibrose cutanée et pulmonaire induite par l’HOCl. Aucun traitement curatif n’existe aujourd’hui pour les patients atteints de ScS et la réduction de la fibrose reste un enjeu thérapeutique majeur puisqu’elle représente la principale cause de décès des patients.
Procédures
Les animaux recevront 5 injections d’HOCl en intradermique par semaine durant toute la durée de l’étude, ainsi que 3 injections de surnageant de HuMoSC en sous cutané, par semaine, durant 3 semaines. La fréquence des injections de surnageant de HuMoSC pourra être augmentée jusqu’à 5 fois par semaine, selon les résultats obtenus lors de la première phase de mise au point. L’épaisseur de la peau des souris pourra être mesurée 2 fois par semaine maximum, à l’aide d’un pied à coulisse. Aucun prélèvement sur animaux vigiles ni aucune procédure chirurgicale ne sont prévus dans cette étude.
Impact sur les animaux
Les éventuels effets indésirables sont les suivants : - Risque de lésions au niveau du site d’injection de l’HOCl - Légère difficulté respiratoire possible dû à la fibrose pulmonaire - Légère fatigue possible en lien avec l’inflammation - Inconfort lié à la rigidification de la peau en bas du dos (localisé) - Stress induit par les injections répétées Aucun effet indésirable n’est décrit dans la littérature, il n’y a donc pas de signe clinique majeur attendu.
Devenir
A l’issue de la procédure, c’est-à-dire au bout des 6 semaines d’expérimentation, les animaux seront sacrifiés. Leur sang, la peau, les poumons ainsi que la rate seront prélevés. La régression de la fibrose sera évaluée en comparant les souris traitées avec du surnageant de HuMoSC et celles avec du sérum physiologique.
Remplacement
Nous avons en amont étudié l’effet du surnageant de HuMoSC sur un modèle in vitro de fibrose. Ces résultats préliminaires sont prometteurs et nous incitent à passer dans un modèle plus complet. De nombreux articles scientifiques ont démontré que les injections d’HOCl permettent de mimer chez la souris ce qu’il se passe chez les patients atteints de ScS. Les modèles in vitro disponibles ne permettent pas de reproduire fidèlement la physiopathologie complexe de cette maladie.
Réduction
Le nombre d’animaux a été optimisé, afin d’obtenir des résultats statistiquement interprétables tout en diminuant au maximum la taille des groupes sans négliger quelques étapes de mise au point pour adapter la meilleure posologie du traitement.
Raffinement
Les animaux sont hébergés en groupe afin de pouvoir exprimer leur comportement social naturel. Pour leur bien-être les cages comprennent des éléments d’enrichissements (tunnels, nids). Une période d’acclimatation est prévue pour réduire le stress des animaux (arrivée dans les locaux, manipulations régulières…) ainsi qu’un suivi quotidien de l’état général des animaux. La douleur sera anticipée au maximum par l’application d’un gel anesthésiant sur la peau avant les injections. Néanmoins, si l’animal manifeste de la douleur, celle-ci sera immédiatement prise en charge par un traitement médicamenteux.
Choix des espèces
L’espèce choisie est la souris BALB/c. Nous utiliserons de jeunes souris femelles adultes, âgées de 6 semaines. Dans ce modèle, les injections d’HOCl permettent d’obtenir des effets similaires (inflammation et fibrose) à ceux que l’on retrouve chez les patients atteints de sclérodermie systémique. Ce modèle est largement documenté dans la littérature
Imagerie spécifique des propriétés de la myéline par IRM de transfert d’aimantation inhomogène quantitatif (qihMT)
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Rats : 70
440 souris et rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à sévère, dont 250 en gravité sévère. Ils servent de modèles de démyélinisation, génétiques ou induits par la cuprizone, passent des examens d'IRM, puis leur système nerveux central est prélevé par perfusion intracardiaque de fixateur suivie de décapitation. Le porteur met au point une technique d'IRM censée être spécifique de la myéline, à valider par comparaison histologique. Les retombées cliniques annoncées restent conditionnées à la réussite du projet.
Objectifs
Introduction : La myélinisation des axones est une composante fondamentale du fonctionnement du système nerveux central (SNC), puisque qu’elle assure d’une part l’isolation axonale et permet d’autre part la propagation efficace du signal électrique le long des fibres nerveuses. Ainsi, pouvoir accéder in vivo à l’intégrité de la myéline permettrait une meilleure compréhension du développement du SNC chez le sujet sain, ainsi qu’une meilleure caractérisation des pathologies neurologiques de la substance blanche (e.g. Sclérose en Plaques). Aucune technique IRM actuelle n’est réellement spécifique de la myéline et plusieurs facteurs confondants limitent ou empêchent les diagnostics précis. Les techniques basées sur le transfert d’aimantation offrent pourtant des potentialités très intéressantes. Récemment, nous avons développé une nouvelle technique dérivée du transfert d’aimantation, le transfert d’aimantation inhomogène (ihMT), dont la sélectivité du signal pour la myéline s'avère remarquable. Les objectifs majeurs de ce projet sont de développer une technique ihMT quantitative (qihMT) et de valider ses métriques quantitatives comme marqueurs spécifiques des différentes propriétés de la myéline (organisation, composition, structure, dynamique) dans des modèles pathologiques (e.g. modèle d’encéphalomyélite auto-immune expérimentale (EAE), modèle de démyélinisation cuprizone, modèles de dysmyélinisation) et dans le suivi de la maturation cérébrale.
Bénéfices attendus
En cas de réussite, ce projet aura pour vocation de fournir un outil non-invasif quantitatif dont les métriques seront spécifiques des différentes propriétés de la myéline (structure, composition, fonction). Cet outil permettra un diagnostic in vivo plus précis ainsi qu’une levée des limitations des techniques actuelles. De plus, grâce à la transversalité de l’IRM, le protocole validé sur petit animal pourra être appliqué à l’homme sur la base des résultats obtenus en préclinique.
Procédures
A la fin des analyses IRM, le système nerveux central des animaux controles/modèles (nombre total de 440) sera être prélevé pour analyses histologiques par des techniques de référence d'imagerie de la myéline afin de valider les données qihMT. Le système nerveux central des animaux sera prélevé selon le protocole de perfusion intracardiaque suivant (durée 30 minutes): Administration analgésique Buprénorphine (buprecare, 0.3mg/ml) à la dose de 0.1mg/kg. La buprénorphine aura été préalablement dilué (X20) avec une solution de NaCl 0,9 %. Le volume injecté pour une souris de 25 g est de 160 microlitre. Injection d’euthasol en ip à la dose de 140mg/kg. L’euthasol aura été préalablement dilué (X40) avec une solution de NaCl 0,9 %. Le volume injecté pour une souris de 25 g est de 350 microl (seringue de 0,3 ou 0,5 ml, aiguille de 29 G) L'animal aura sa cage thoracique ouverte en vue d'effectuer une perfusion intracardiaque de 20 ml de PBS - Héparine 100U/ml puis de 50 ml de PFA 4%. A la fin de la perfusion, l'animal sera décapité et son cerveau sera prélevé puis post-fixé dans du PFA 4% à 4°C pendant 24 h.
Impact sur les animaux
Des nuisances temporaires de stress, liées à l'environnement relativement bruyant des IRM est attendu pour tous les animaux lorsqu'ils seront sortis de l'armoire de stabulation pour l'examen IRM (2heures). Une perte de poids temporaire (-5% pendant 1 semaine) due au changement de régime alimentaire est attendu pour les souris du modèle cuprizone.
Devenir
L'issue de chacune des procédures 1-6 cloturera un point particulier du projet global sur l'imagerie quantitative de la myéline. Les 440 animaux nécessaires à l'ensemble des procédures seront donc euthanasiés par perfusion intracardiaque (mise à mort décrite en 3.3.3 et demande de dérogation en 3.3.4) permettant le prélèvement de leur système nerveux central.
Remplacement
La spécificité des métriques quantitatives de la technique qihMT pour la myéline doit être démontrée in vivo afin de valider l'IRM ihMT comme marqueur spécifique utilisable dans des protocoles cliniques. Cette démonstration ne pourra être effectuée que sur la base de mesures réalisées à différents points temporels sur des animaux contrôles et modèles caractérisés d’altération/développement de la myéline. Ces mesures seront ensuite corrélées à des analyses histologiques. Ces aspects ne peuvent être conduits chez le patient du fait de l’impossibilité de réaliser une étude histologique sur un même échantillon préalablement exploré in vivo par IRM. Néanmoins, une stratégie de remplacement sera effectuée. Ainsi, à chaque fois que cela sera possible, notamment lors des ajustements de premier niveau (debuggage des séquences IRM, optimisation, tests...), des fantômes (composés chimiques ayant des caractéristiques similaires à la myéline, e.g. systemes de lipides lamellaires synthétiques) seront utilisés en lieu et place des animaux.
Réduction
Les examens IRM seront réalisés de sorte que plusieurs paramètres IRM puissent être ajustés au cours d’une même session et sur des mêmes animaux. La durée des examens n’excèdera néanmoins pas 2h par animal (durée standard d’investigation multimodale IRM sur petit animal). Un suivi longitudinal par exploration IRM non invasive sera effectué sur tous les modèles investigués, réduisant ainsi de manière drastique le nombre d’animaux utilisés.
Raffinement
Le bien-être des animaux est assuré par les animaliers. La stabulation des animaux sera réalisée au sein de notre unité, dans des armoires dédiées à raison de 5 souris / cage et 2 rats / cage pour les animaux contrôles. Après un examen IRM, chaque animal sera placé dans une cage individuelle avec accès facilité à la nourriture/boisson puis replacé dans sa cage une heure après. Les cages de stabulation souris du CRMBM sont dotées d’un environnement enrichi (roues, tunnels... pour la stimulation des animaux). Les procédures expérimentales de chirurgies sont réalisées sous anesthésie générale (anesthésie volatile Isoflurane 3% dans l’oxygene pur et ventilation assistée ou mélange kétamine (100mg/kg de poids)/xylazine (10mg/kg de poids)) et des analgésiques sont administrés (injection intramusculaire de Buprenorphine, 0.1mg/kg).
Choix des espèces
Justification de l’utilisation de souris : Existence de différents modèles génétiques caractérisés de pathologies affectant la myéline chez la souris : modèles Shiverer et Twitcher (modèles génétiques des leucodystrophies, caractérisées par une dysmyélinisation du SNC résultant d’un déficit en galactocérébrosides pour Twitcher ou en Myelin Base Protein (MBP) pour Shiverer), modèle cuprizone et EAE (miment certains effets de la sclérose en plaques par une démyélinisation locale et par des lésions axonales entrainant un déficit cognitif et une incapacité progressive, et effets inflammatoires). Justification de l’utilisation des rats : L’interêt du rat est de disposer de structures de système nerveux central plus grosses que celles de la souris et donc d’un signal IRM plus conséquent. Investigation possible grace au diamètre plus grand du scanner 7T. L’IRM étant une technique très peu sensible, le critère de rapport signal sur bruit élevé est primordial afin de limiter le temps d’examen. Pour toutes les études (hors maturation cérébrale), les animaux seront âgés de >10 semaines correspondant au début de l’âge adulte afin de s’assurer d’un niveau de maturation du système nerveux central maximal. Pour l’étude de la maturation cérébrale, les animaux seront utilisés à différents stades du développement (de D6, jusqu’à >10 semaines).
Détermination de l’implication du système sympathique dans la sclérose latérale amyotrophique
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
212 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélèvement de tissus, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Cette demande ne couvre que la partie élevage d'un projet sur la sclérose latérale amyotrophique, les animaux ne subissant pas d'intervention active mais développant les altérations motrices de la maladie, suivies par une grille de score. Le porteur indique que le phénotype lui-même est dommageable et surveille de près la moitié des animaux. Le bénéfice avancé est une meilleure compréhension d'une maladie mortelle chez l'humain.
Objectifs
Cette DAP ne couvrira que la partie élevage du projet. La moelle épinière thoracique contient l'essentiel des neurones à l'origine de la commande nerveuse autonome sympathique, un acteur majeur du maintien de l'homeostasie corporelle. Les neurones préganglionnaires sympathiques (SPNs), étage de sortie de la commande sympathique, connectent au sein des ganglions sympathiques les neurones postganglionnaires sympathiques qui à leur tour connectent les organes cibles. Les SPNs sont des neurones cholinergiques qui sont moléculairement extremement proches des neurones qui commandent les muscles striés: les motoneurones (MNs). La sclérose latérale amyotrophique (SLA), troisième maladie neurodegerative après Alzeihmer et Parkinson est caracterisée par la perte des neurones moteurs corticaux et des MNs spinaux conduisant à une atrophie musculaire, à la paralysie progressive des malades et au décès des patients par insuffissance respiratoire. Les causes précises de la degenerescence des MNs sont à ce jour encore inconnues et nous ignorons encore si cette degenerescence est initiée directement au niveau des MNs ou au niveau de son partenaire synaptique: le muscle. Notre hypothèse est que les SPNs sont aussi atteints dans la SLA et participent via un dysfonctionnement du controle vasculaire et nerveux des muscles à la degenerescence des MNs. L' objectif de ce projet est donc de mettre en évidence des altérations précoses (avant l'apparition des symptomes moteurs) de la regulation sympathique sur un modele murin de la SLA, la souris SOD1 G93A.
Bénéfices attendus
Ce projet va permettre de mieux comprendre les mécanismes de la SLA. La maladie se déclare à l’âge adulte chez l'humain (40- 80 ans) et va évoluer, en 3 à 5 ans, vers la paralysie complète et le décès du patient par paralysie des muscles respiratoires. Il est donc important pour les patients qu'on avance sur la connaissance de cette maladie (cause, détection de signes précoses, traitements, etc.)
Procédures
Les animaux ne subiront aucune procédure. Seul le phénotype sera dommageable et donc suivi dans le temps grâce à une feuille de scoring. L'ensemble des animaux du projet seront concernés (n=80)
Impact sur les animaux
La mutation portée par les animaux est similaire à celle de l'homme. Ces animaux vont présenter des altérations motrices qui seront surveillées de très près par une équipe compétente (50% des animaux de l'étude)
Devenir
Afin de réduire le nombre d'animaux utilisés, des prélèvements de tissus seront faits. Cela permettra de faire des études histologiques et immunohistologiques.
Remplacement
le nombre d'animaux choisit pour l'étude est le minimum nécessaire afin d'obtenir des résultats statistiques fiables. Il est important de ne faire ni trop, ni trop peu afin de ne pas avoir à refaire l'ensemble de l'expérimentation. Ce nombre a été choisit sur la base de d'expériences précedentes du laboratoire et de la bibliographie dans ce domaine. Les tests utilisés seront d'abord un test de normalité afin de savoir si les courbes des données recueillies suivent la loi normale. En fonction, des tests paramétriques ou non seront faits afin de comparer nos lots.
Réduction
Un grand nombre d'expérimentations dans notre laboratoire sont faites ex vivo, sur cellules vivantes. Cela a permis d'obtenir un certain nombre de données en évitant toute souffrance animale. Toutefois, dans certains cas, il est indispensable de travailler dans un système intégré comme un organisme complet. Ainsi, il n'est, dans notre cas, pas possible de reproduire les modifications de commande nerveuse sympathique dans une modèle de maladie, avec uniquement des systèmes ex-vivo. Pour le traitement des données, nous utiliserons des tests ANOVA one and two ways.
Raffinement
Les individus porteurs de la mutation seront suivis régulierement. Un scoring sera fait toutes les semaines à partir de P60 puis tous les 3 jours à partir de P90. Sauf en cas d'avis vétérinaire pour un soin, aucun animal ne sera isolé inutilement afin de préserver le caractère grégaire de la souris.
Choix des espèces
La souris est un modèle dont le génome est parfaitement connu. De plus, un modele murin de la sclérose latérale amyotrophique existe. Le système de reproduction des souris permet d'avoir régulièrement des animaux dans un espace relativement réduit. Enfin le choix de l'espèce est aussi conforme au R de réduire puisque nous avons choisi un modèle mammifère relativement petit. Les mâles reproducteurs seront mis en accouplement dès 7 semaines à la descente des testicules. Les stades de prélèvements sont ceux habituellement utilisés dans la littérature pour l'évaluation de la SLA sur ce modele murin.
Analyse du rôle de GD3 dans la progression tumorale du glioblastome
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
280 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère, dont 172 en gravité sévère. Elles reçoivent des greffes de cellules de glioblastome sous la peau ou dans le cerveau, cette dernière suivie d'une étude de survie jusqu'au franchissement d'un score de souffrance. Le porteur euthanasie les animaux à une perte de poids de 20 % ou à un score de souffrance défini. L'objectif est d'analyser le rôle d'un ganglioside, le GD3, dans l'agressivité de cette tumeur cérébrale.
Objectifs
L'objectif est d’analyser le rôle de l'expression du ganglioside GD3 dans l'agressivité du GBM. Pour cela, nous étudierons l'impact de l'expression de GD3 dans la capacité des cellules de GBM à former des tumeurs (propriétés de tumorigénicité) ainsi que dans la progression tumorale.
Bénéfices attendus
Le GBM est une tumeur cérébrale dont le pronostic est sombre. Il n’existe aucun traitement curatif et la survie médiane des patients est de un an avec un traitement combinant chirurgie, chimiothérapie et radiothérapie. La récidive est inévvitable dans un délai de 7 à 10 mois. Il est donc urgent de rechercher de nouvelles stratégies thérapeutiques efficaces pour les patients. L’utilisation du ganglioside GD3 comme cible thérapeutique comme agent anti-cancéreux pour le traitement du GBM a fait l’objet de plusieurs publications.
Procédures
Les animaux seront soumis aux interventions suivantes: 1) Greffes sous-cutanées (108 animaux, une seule intervention de 1 minute environ); 2) Greffes intra-cérébrales (172 animaux, une seule intervention de 30 minutes environ); 3) Injection i.p. pour l'anesthésie des animaux avant les greffes intra-cérbrales ou les perfusions intra-cardiaques (172 animaux, quelques secondes d'intervention); 4) Injections sous-cutanées d'analgésiques lors des greffes intra-cérébrales (172 animaux, quelques secondes d'intervention).
Impact sur les animaux
Hormis une perte de poids qui reflète la progression tumorale des tumeurs intracraniales, aucun autre effet indésirable n'est attendu dans ce projet. Les administrations intracérébrales (exécutées sous anesthésie) n’induisent en principe pas de souffrances à la suite de la chirurgie. L’injection sous-cutanée induit une douleur légère, dont la durée est limitée à l’intervention. Néanmoins, Le suivi de l’état général des animaux sera réalisé en mesurant quotidiennement le poids corporel et en surveillant l’apparition de signes définis comme points limites. Lorsque nous observerons une perte de poids supérieure ou égale à 20%, en référence au poids initial de l'animal ou un score de souffrance supérieur ou égal à 10, les animaux seront euthanasiés sans délai (grille de scores en annexe).
Devenir
Procédure 1: tous les animaux seront euthanasiés lorsque les tumeurs atteindront 1500 mm3, ou en cas d'absence de prise tumorale. Procédure 2: tous les animaux seront euthanasiés 60 jours après la greffe tumorale pour effectuer des analyses histologiques. Procédure 3: tous les animaux seront euthanasiés dès le franchissement d'un score limite défini par la grille de scores (étude de survie). Procédure 4: tous les animaux seront euthanasiés afin de prélever les cerveaux pour l'analyse des volumes tumoraux et des marqueurs histologiques.
Remplacement
l n’existe à l’heure actuelle, aucune autre méthode qui pourrait se substituer à l’expérimentation animale dans ce domaine.
Réduction
Afin de minimiser le nombre d'animaux utilisés, un maximum d'expériences sera réalisé in vitro. Le nombre d'animaux prévu dans chaque groupe est basé sur un calcul d'effectif permettant de prédire que nous avons 80% de chance d’obtenir un résultat statistiquement significatif.
Raffinement
La détection de toute souffrance de l’animal sera assurée et le niveau de souffrance évalué en fonction d’une grille de score. Les animaux seront euthanasiés dès l’apparition d’un signe de détresse (perte de poids supérieure ou égale à 20% du poids initial, posture, prostration, difficultés à respirer, à se déplacer, ataxie). Pour le bien-être de l'animal, les souris seront logées selon les normes requises avec un enrichissement (copeaux de bois, dômes) et en groupes de 5 individus par cage afin d’éviter le stress de l’isolement.
Choix des espèces
La souris (Mus musculus) a été choisie comme animal modèle pour plusieurs raison : 1) La facilité, la praticité pour maintenir cette espèce dans notre structure et le fait que notre animalerie d’hébergement soit équipée pour accueillir des souris ; 2) Les personnes concernées par ce projet maîtrisent la manipulation de cet animal ; 3) le faible coût d’entretien des animaux ; 4) l’injection de cellules cancéreuses est communément pratiquée chez cette espèce et maîtrisée depuis de nombreuses années ; 5) La prise tumorale est rapide (entre 15 jours et 2 mois selon la lignée cellulaire concernée) quand des cellules de glioblastome sont injectées dans le cerveau. Les souris seront réceptionnées à l’animalerie à l’âge de 6 semaines et utilisées à l’âge de 7 semaines, en accord avec les protocoles décrits pour ce modèle physiopathologique classique.
Acquisition et maintien des compétences techniques en expérimentation animale.
- Formation professionnelle
- Recherche appliquée
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
Rats : 300
400 souris et rats vont être utilisés, tués à l'issue, dans des procédures déclarées de gravité légère. Ils servent non à produire des connaissances mais à entraîner le personnel aux gestes techniques, gavage, injections par plusieurs voies et prélèvements de sang, chaque animal subissant un geste par jour. Le porteur reconnaît qu'une fausse route lors du gavage ou une instillation peut provoquer la mort de l'animal. Il présente cette formation comme un moyen d'améliorer le bien-être des animaux non-humains et écarte tout remplacement, l'objectif étant l'entraînement lui-même.
Objectifs
La bonne réalisation d’un projet scientifique utilisant des animaux de laboratoire requiert que le personnel appliquant les procédures expérimentales soit parfaitement formé aux gestes techniques nécessaires à l’atteinte des objectifs dudit projet. Cela passe obligatoirement par l’acquisition et le maintien du niveau de maîtrise de ces gestes, en particulier pour les nouveaux arrivants (stagiaires, doctorants, post-doctorants, techniciens, chercheurs…). Ainsi, la bonne formation du personnel permet d’une part d’améliorer le bien-être des animaux en prévenant les gestes mal effectués et d’autre part d’éviter de refaire des expérimentations en raison du manque de reproductibilité des résultats scientifiques et donc de limiter le nombre d’animaux utilisés. Au regard de la réglementtaion, un établissement utilisateur doit s’assurer de la bonne formation de son personnel et du maintien de son expertise dans la réalisation de gestes techniques par la mise en place d’un tutorat. Même si cet apprentissage peut-être réalisé à l’extérieur de l’établissement dans le cadre de la formation continue, il est très rare que la personne formée applique directement les gestes appris dans un protocole sans les revalider au sein de son laboratoire. Ceci nécessite donc d’utiliser au sein d’un établissement des animaux de laboratoire dédiés à la formation et au maintien des compétences du personnel. Au lieu de les intégrer dans des projets individuels, il est plus judicieux de les regrouper au sein d’un même projet supervisé par le responsable de la formation et du suivi des compétences qui permettra de rationaliser le nombre d’animaux utilisés.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de former les personnes impliquées dans la mise en oeuvre des procédures. Il contribuera ainsi à améliorer leurs compétences techniques favorisera la réalisation de gestes sûrs et améliorera le bien-être des animaux en limitant leur stress ou leur inconfort.
Procédures
Les animaux seront utilisés pour la formation du personnel à différents gestes techniques nécessaires à l'adminitration de substances (gavage; application cutanée; instillations nasale et intratrachéale; injections intrapéritonéale, sous-cutanée, intramuculaire et intraveineuse) ou aux prélèvements sanguins (veine caudale et aorte abdominale). Pour un animal donné, une seule de ces techniques sera réalisée par jour et un temps d'attente de 48 h sera respecté entre deux gestes. Chaque geste ne prendra que quelques minutes tout au plus.
Impact sur les animaux
Les nuisances subies par les animaux sont principalement dues aux voies d'administration même si le plus grand soin sera pris pour que les administrations de subtances soient réalisées en limitant au maximum l'inconfort des animaux. Si des effets indésirables étaient observés, ils seraient la conséquence d'un geste mal réalisé. Pour le gavage, une fausse route pourrait conduire à la mort de l'animal due à l'entrée de sérum physiologique ou huile dans le poumon. Pour les instillations endotrachéales, l'administration du sérum physiologique pourrait conduire dans de rares cas à un arrêt respiratoire. De toutes les manières, dès l'apparition de signes de souffrance non réversibles, les animaux seront mis à mort.
Devenir
A l'issue de chaque procédure, les animaux peuvent soit être utilisés dans une autre procédure en respectant un délai de 48 h entre deux gestes, soit être mis à mort car le nombre cumulé de procédures apparait suffisamment important pour un même animal. En raison du degré de gravité des procédures (légère), il est considéré que les animaux peuvent être utilisés dans d'autres procédures du même projet sans préjudice notable pour leur bien-être.
Remplacement
Difficilement applicable à ce projet puisqu’il vise à garantir le niveau de compétence du personnel dans la réalisation des gestes en expérimentation animale.
Réduction
Diminution du nombre d’animaux utilisés dans les projets par la rationalisation des animaux utilisés pour l’apprentissage des gestes techniques et la diminution des erreurs expérimentales conduisant à refaire des expérimentations sur animaux.
Raffinement
La réalisation d'expérimentations sur animaux nécessite que les personnes amenées à les réaliser maîtrisent les gestes techniques requis à l'administration de subtsances ou à la collecte des tissus et les réalisent dans les règles de l'art. Cela est nécessaire pour limiter l'inconfort et le stress des animaux lors des expérimentations. Par ailleurs, le partage d'expériences entre les expérimentateurs et les tuteurs permet d'améliorer les pratiques et par conséquent le bien être des animaux.
Choix des espèces
Le rat et la souris sont les deux espèces les plus couramment utilisées dans les études de toxicologie et sont les modèles sélectionnés dans les lignes directrices de l’OCDE portant sur les essais in vivo de toxicité des produits chimiques. La compréhension des effets toxiques chez l’animal de laboratoire et chez l’homme de nombreuses substances chimiques retrouvées en milieu professionnel est encore parcellaire. En raison de la complexité des processus physiologiques mis en oeuvre, les études chez l’animal de laboratoire ne peuvent pas encore être substituées par des études sur des cultures de cellules. Par ailleurs, afin d’améliorer le bien-être des animaux et la reproductibilité des résultats, il est nécessaire de prévenir les gestes mal réalisés en formant le personnel et en assurant le maintien de son niveau d’expertise dans les modèles expérimentaux de Toxicologie utilisés au sein de l'établissement, en l'occurence des rats et de souris.
Modulation du niveau de DNM2 par croisement génétique dans le traitement des myopathies liées à MTM1
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
70 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles portent une mutation reproduisant une myopathie myotubulaire, avec atrophie musculaire, paralysie progressive des membres postérieurs et déformation du dos, et subissent des tests moteurs puis une mesure terminale des propriétés musculaires sous anesthésie sans réveil. Le porteur cherche à valider une thérapie par croisement génétique modulant la protéine dynamine 2. Le bénéfice reste une "preuve de concept" pour de futures approches chez les patients.
Objectifs
Nous souhaitons valider chez la souris, une preuve de concept pour les myopathies myotubulaires lié à MTM1 en modulant le niveau de la protéine Dynamine 2 par croisement génétique. En effet, Les animaux mutant Mtm1-KO montrent une sur expression de la Dynamine 2 que nous souhaitons faire diminuer par croisement avec une souris mutante (atteinte de CMT) présentant une diminution du niveau de cette même protéine.
Bénéfices attendus
Le projet vise à fournir une preuve de concept que la modulation de la protéine dynamine 2 peut améliorer le phénotype MTM1. Ceci pourrait conduitre au développement d'approches thérapeutique pour les patients atteints de myopathie myotubulaire.
Procédures
Les souris seront soumises à une série de tests phénotypiques à l'âge de 7 à 8 semaines. Ces expériences consistent à mesurer la force du musculaire, la position des pattes lors des déplacements, l’habilité à se déplacer sur une barre crantée (3 essais/jour/souris). Mesurer l’activité électrique musculaire par EMG (Electromyographie) et la mesure des propriétés contractiles musculaires in situ (AURORA). Pour ces 2 expériences seulement un essai sera réalisé.
Impact sur les animaux
Pour cette étude deux modèles murins seront utilisés, un modèle atteint de Myopathie Centro-Nucléaire (CNM) et un deuxième atteint de la maladie de CMT. La souris atteintes de la maladie de CMT présente un phénotpe léger avec une légère perte de poids par comparaison avec la souris contrôle. Aucune douleur n'est observée chez ces animaux. En revanche, la souris atteinte de myopathie myotubulaire (MTM1-KO) présente un phénotype sévère avec une atrophie musculaire pouvant conduire à une paralysie progressive des membres postérieurs et l’apparition d’une cyphose (dos arrondie). Cependant, les premiers signes du phénotype dommageable n’apparaissent qu’à l’âge de 4-5 semaines pour atteindre un maximum à environ 8 semaines. A noter qu’il existe une certaine variabilité phénotypique entre les animaux mutant et que tous ne développeront pas l’ensemble des signes de la maladie. Les mesures d’électromyographies (EMG) nécessitent une immobilisation de l’animal réalisé sous anesthésie pour une durée maximum de 10 minutes. Pour réaliser la stimulation électrique, un courant de 0.9 mA à 4 mA est délivré grâce à des électrodes de stimulation (avec un diamètre équivalent aux aiguilles utilisé en acupuncture) implanté sous la peau de l’animal. De la même manière, une électrode de réception est également implantée sous la peau de la souris. Les expériences de mesure de la force musculaire (AURORA) sont réalisées sous anesthésie profonde. Une petite incision est réalisée au-dessus du nerf sciatique permettant de poser de part et d’autre de ce dernier les électrodes de stimulation électrique et un courant de 1 à 10 mA sera délivré pour induire la contraction du muscle. Un deuxième acte chirurgical consiste à dégager le muscle tibial antérieur afin de le fixer sur l’appareil de mesure.
Devenir
Les animaux seront gardés en vie et replacés dans leur cage jusqu'à la procédure suivante. Après les mesures électrophysiologique, l’animal est réchauffé sur une plaque maintenue à 37°C jusqu’à son réveil. La dernière expérimentation qui est "sans réveil" consiste à mesurer les propriétés contractiles musculaires in situ (AURORA) sous anesthésie.
Remplacement
Pour caractériser cette maladie (CMT) et évaluer l’efficacité de ce croisement génétique nous souhaitons étudier la souris. Le modèle murin étant physiologiquement et structurellement assez proche de l’Homme, nous permet d’étudier d’une part la physiopathologie et d’autre part l’amélioration des symptômes apporté par la régulation de cette protéine par croisement génétique. D’une part, une étude exclusivement réalisée sur des cellules ne pourrait pas se suffire à elle-même car les effets sur l’ensemble de l’organisme et l’évaluation sur le bénéfice de la force musculaire seraient impossibles à évaluer. D’autre part une étude sur culture de cellules mutante ne peut être envisagée car le phénotype pathologique ne se développe pas et le bénéfice de la force musculaire ne peut être mesuré (REMPLACEMENT).
Réduction
Plusieurs procédures expérimentales seront réalisées avec un test maximum par jour. Le nombre d’animaux sera réduit au maximum pour obtenir une puissance statistique suffisante. Le nombre de géniteurs sera réduit en créant des cages d’accouplements avec deux femelles pour un mâle. Nos connaissances sur ce modèle animal mutant et les études réalisées sur d’autres thérapies montrent que 15 souris par groupe seront nécessaires pour obtenir une étude concluante. Cependant une première étude pilote sera réalisée avec 10 animaux, afin de vérifier le phénotype et le niveau de la protéine Dynamine 2. En tenant compte des géniteurs, des animaux d’expérience, nous prévoyons 100 animaux pour cette étude (REDUCTION).
Raffinement
Un certain nombre de procédures seront mises en place afin d’améliorer le bien-être de l’animal. De la nourriture sera placé dans la cage afin de soulager l’animal dans ses déplacements. Les souris seront hébergées par groupe de 2 à 4 par cage et la qualité de l’air sera assurée par une ventilation. Des nids seront disposés dans chaque cage avec un accès illimité à la boisson et à la nourriture. Les cages d’accouplements seront constituées de deux femelles par cage facilitant l’élevage des petits. Le bien-être des animaux sera contrôlé quotidiennement afin de détecter au plus tôt les premiers signes de souffrance comme l’apathie, la prostration, l’abaissement des paupières et l’apparition d’une cyphose. Pour le nouveau-né, la souffrance sera évaluée visuellement : capacité à se retourner, couleur de la peau, capacité à se mouvoir. À partir du sevrage, une perte de poids de 20% en une semaine conduira à l’arrêt du protocole. En cas de douleur intense, un analgésique pourra être administré et l’étude sera prématurément stoppée (RAFFINEMENT).
Choix des espèces
Afin d’évaluer et de comprendre les mécanismes cellulaires induits par une mutation du gène DNM2 et les effets de la modulation de cette protéine, nous avons besoin d'effectuer des expériences physiologiques in vivo. Ces mesures ne peuvent pas être réalisées sur d'autres espèces évolutivement plus éloignées de l’homme car la structure du muscle est différente. De plus, la souris est la seule espèce physiologiquement et structurellement assez proche de l’Homme dans laquelle nous pouvons réaliser les manipulations génétiques pour obtenir ces modèles de pathologie humaine. Lors d'une précédente étude nous avons constaté qu'à l’âge adulte c'est à dire à 7 et 8 semaines, le phénotype lié à la maladie était exprimé. Ainsi, nous souhaitons réaliser les test comportementaux à cet âge afin d'évaluer la maladie et le bénéfice de ce croisement sur la pathologie.
Validation d’une molécule ciblant un récepteur membranaire pour l’imagerie des tumeurs neuroendocrines 1/2
- Recherche appliquée
- Cancers
1 728 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles subissent des xénogreffes de tumeurs neuroendocrines, sous la peau ou par chirurgie dans la rate, des anesthésies répétées et des séances d'imagerie, avant prélèvement des tumeurs et des organes. Le porteur met au point une molécule d'imagerie visant le récepteur à la somatostatine, avec une extension thérapeutique espérée. Il affirme que l'usage d'un "organisme entier" est "indispensable" pour évaluer la toxicité.
Objectifs
Les Tumeurs NeuroEndocrines (TNE) sont des tumeurs rares et hétérogènes dans leur présentation anatomopathologique et clinique. Cela rend leur diagnostic, leur pronostic et la prise en charge thérapeutique particulièrement difficiles. L’approche théranostique (utilisation de l’imagerie pour cartographier les cellules cancéreuses et les traiter de manière ciblée) est particulièrement développée pour ce type de tumeurs. Celle-ci utilise en effet la présence d’une molécule particulière à la surface des cellules tumorales (le récepteur à la somatostatine). Cette stratégie thérapeutique est actuellement la plus efficace pour le traitement des TNE mais elle comporte quelques limites. En effet, le récepteur à la somatostatine n’est pas toujours présent, notamment dans les tumeurs les plus agressives. Nous savons qu’il existe un autre récepteur présent dans ces tumeurs, le récepteur X, et nous souhaitons l’utiliser pour développer une nouvelle approche théranostique. Cela nous permettrait de proposer un nouvel outil pour l’imagerie, et à plus long terme pour la thérapie. Cette stratégie pourrait s’avérer profitable dans d’autres pathologies tumorales puisque ce récepteur existe dans d’autres types de cancers. Dans ce projet, nous proposons de cibler le récepteur X grâce à une petite molécule appelée aptamère, qui est facile à produire. Notre agent ciblant le récepteur X sera dans un premier temps couplé à une molécule fluorescente, puis à un élément radioactif. Nous souhaitons démontrer que l’aptamère peut être utilisé en imagerie des TNE grâce à deux modèles murins de progression tumorale que nous maîtrisons au laboratoire.
Bénéfices attendus
En cas de réussite, ce projet appuiera la transition de notre stratégie de l’imagerie vers la thérapie. Pour cela, il suffira de modifier le couplage de l’aptamère en utilisant un composé radioactif adapté aux traitements anticancéreux. Cela constituera une stratégie thérapeutique complémentaire à celle déjà existante pour le traitement des TNE. Les retombées potentielles de ce projet pourront également concerner d’autres cancers. En effet, le récepteur X est présent dans de nombreux types de tumeurs.
Procédures
- Anesthésies répétées (pour chirurgie et imagerie) - Injections sous-cutanées - Injections intraveineuses - Procédure chirurgicale : greffe intrasplénique (10 minutes depuis le début de l’anesthésie jusqu’à la suture de la laparotomie) dans 3 procédures (2, 4 et 6) - Pousse tumorale limitée (taille inférieure à 1500mm3 pour le modèle sous-cutané, nodules hépatiques millimétriques dans le modèle intrasplénique)
Impact sur les animaux
La xénogreffe par injection sous-cutanée est réalisée sur animal vigile. Les tumeurs développées dans ce modèle sont de petite taille. Elles n’entraînent pas de gêne chez les animaux. Aucune métastase n’est observée. La xénogreffe par injection intrasplénique implique une petite chirurgie sous anesthésie générale avec un risque de douleur au réveil. L'imagerie implique également une petite anesthésie générale.
Devenir
Mise à mort de tous les animaux à l’issue de chaque procédure pour analyse des tumeurs développées et des organes prélevés.
Remplacement
Notre projet vise à développer un nouvel outil permettant l’imagerie in vivo des tumeurs neuroendocrines grâce au récepteur X, puis de développer un agent thérapeutique. L’utilisation d’un organisme entier est donc indispensable car il faut évaluer la toxicité éventuelle de notre molécule au niveau des différents organes. La molécule a été au préalable testée sur des cultures de cellules tumorales afin de remplacer une partie des travaux chez la souris.
Réduction
Quatre aptamères différents ont été testés sur des cultures de cellules tumorales. Seuls deux de ces aptamères seront testés chez la souris. De plus, le nombre d'animaux par groupe a été réduit au minimum tout en générant des résultats valables sur le plan statistique. A chaque étape du projet, nous sélectionnerons la meilleure molécule et le meilleur modèle, ce qui permettra de réduire également le nombre d’animaux utilisés.
Raffinement
Les animaux seront hébergés avec dômes et boules de coton dans les cages. Ils seront pesés deux fois par semaine. Si des signes de souffrance sont identifiés après la chirurgie (prostration, difficulté de déplacement), une analgésie pourra être maintenue (par exemple par ajout de Doliprane dans l’eau de boisson). Si une perte de poids supérieure à 20% du poids maximal (28g) survient, l’animal sera immédiatement mis à mort. La xenogreffe sous-cutanée est réalisée par le personnel de la plateforme qui maîtrise parfaitement le geste. Les animaux reçoivent des analgésiques (buprénorphine 0.05 mg/kg, et lidocaïne en crème 5% au niveau de la zone de la laparotomie) avant la chirurgie afin de prévenir toute souffrance. La petite laparotomie nécessaire à l’injection est suturée à l’aide de fil chirurgical résorbable, ce qui améliore considérablement le confort des animaux.
Choix des espèces
Pour acquérir les données nécessaires à la validation de nos séquences aptamères pour l’imagerie des TNE, nous avons besoin d’utiliser des modèles mimant au mieux la pathologie. Nos modèles de xénogreffes sur souris ont été validés lors d’études antérieures et sont bien caractérisés et maîtrisés. La souris est relativement proche de l’homme. De, plus l'utilisation de souris immunodéficientes facilite la prise tumorale. Toutes les xénogreffes seront réalisées sur des souris Athymic nude ou Swiss nude de 5 à 7 semaines, qui est l'âge optimal d'utilisation des souches de souris immunodéprimées et pour lequel nos modèles de xénogreffes ont été validés lors d'études antérieures.
Etude des troubles de l’humeur associés à l’obésité : mécanismes neurochimiques
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système nerveux
470 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélèvement du cerveau, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles reçoivent un régime hyperlipidique, une partie subit une chirurgie stéréotaxique implantant une sonde dans le cerveau, un isolement en cage individuelle de trois semaines et des tests comportementaux dont le détail n'est pas précisé. Le porteur étudie les troubles de l'humeur associés à l'obésité et à l'inflammation, avec des retombées nutritionnelles ou pharmacologiques renvoyées au long terme. Il affirme que le recours au modèle animal reste une "nécessité expérimentale".
Objectifs
Le thème général du projet concerne l'étude des effets nocifs d'une alimentation déséquilibrée sur les troubles de l'humeur. Plus précisément, il s'agit ce caractériser et de comprendre le développement des troubles de l'humeur associés à la consommation chronique d'un régime hypercalorique hyperlipidique chez la souris. Nous nous intéressons particulièrement aux effets de cette alimentation sur l'inflammation dite "de bas bruit" qu'elle va générer, et qui va médier un certain nombre de processus conduisant à la perturbation du fonctionnement des systèmes de neurotransmission monoaminergiques qui peuvent sous-tendre le développement des troubles de l'humeur, jusqu'à la dépression. Si certains effets de l'inflammation dans ces phénomènes sont aujourd'hui décrits, les mécanismes neurochimiques précis mis en jeu ne sont pas encore totalement élucidés. En particulier, leur implication dans le déficit de réponse aux antidépresseurs, dont la proportion est largement plus présente chez les patients dépressifs présentant une inflammation chronique, reste peu étudiée et reste à démontrer.
Bénéfices attendus
Ce travail apportera des données scientifiques utiles pour une meilleure compréhension des mécanismes impliqués dans la dépression associée à l’inflammation. Puisque ce projet s’inscrit dans le cadre de recherches translationnelles (c’est-à-dire permettant d’aborder une même question par des approches précliniques et cliniques), il permettra à plus long terme de développer de nouvelles stratégies nutritionnelles et/ou pharmacologiques pour améliorer la réponse thérapeutique et la prise en charge des individus atteints de troubles de l’humeur, en particulier lorsque ces derniers sont associés à un contexte inflammatoire.
Procédures
Des chirurgies seront réalisées sur souris anesthésiées, afin d'insérer dans une région spécifique du cerveau une sonde de dialyse, permettant de receuillir le milieu extracellulaire et d'y doser un neurotransmetteur, la dopamine. Il est prévu un nombre de 120 souris pour cette procédure, qui sera réalisée une seule fois sur chaque animal. Les souris seront soumises à la contention nécessaire à une injection intra-péritonéale (470 souris), 120 souirs seront placées en isolement pendant 3 semaines. Les souris seront soumises à des tests comportementaux (420 souris).
Impact sur les animaux
La prise de poids induite par l'exposition chronique au régime hyperlipidique et les désordres métaboliques associés pourront être cause de nuisance pour les souris. Un comportement anxieux et/ou de type dépressif (modèlisé ici) est atendu chez les souris soumises au régime hyperlipidique et fait l'objet de cette étude. Les douleurs attendues concernent celles liées à la chirurgie stéréotaxique, la contention et l'injection intra-péritonéale et l'isolement en cage individuelle.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin des procédures, afin de prélever leur cerveau pour analyses ultérieures.
Remplacement
L'objectif général du projet est de mieux comprendre chez l'animal les ménanismes mis en jeu dans le développement des troubles de l'humeur en condition inflammatoire induite par une exposition chronique à un régime obésogène. Dans ce contexte de recherche, le recours à des modèles animaux pertinents et adaptés à l'étude des troubles de l'humeur reste une nécessité expérimentale afin d'appréhender la réalité physiologique de nos résultats. La recherche d'alternatives dans des bases de données démontre que les solutions de rechange ne sont pas à ce jour disponibles ou applicables.
Réduction
Les mêmes souris seront sucessivement soumises à plusieurs tests lors de l'évaluation comportementale.Lorsque cela est possible, les mêmes souris seront soumises à plusieurs tests lors de l'évaluation comportementale. De même, un maximum de mesures biologiques (périphériques et cérébrales) sera réalisé sur chaque animal dans la limite de compatibilité entre les différentes techniques. Le nombre minimal de souris pour chaque groupe expérimental est fixé afin d'obtenir une puissance statistique satisfaisante, afin de ne pas répéter la procédure.
Raffinement
A leur arrivée, les souris bénéficient d'une période minimale d'une semaine d'habituation à leur nouvel environnement avant de débuter les expérimentations. En concertation avec la structure Bien-Etre du laboratoire, nous avons défini les meilleurs conditons d'hébergement possibles ainsi que les points limites et d'arret précoces et adaptés. Les souris seront ainsi hébergées par 5 (excepté pour le test comportemental de mesure de fatigue en cage individuelle avec roue d'activité sur une période maximale de 3 semaines), avec présence de différents enrichissements, surveillance quotidienne et soins apportés rapidement si nécessaire. Les protocoles réalisés sur les animaux sont au préalables soumis puis approuvés par l'équipe en charge de l'animalerie afin d'assurer les bonnes conditions d'expérimentation. Pour les procédures invasives et/ou susceptibles de générer une douleur, les soins pré- et pos-opératoires sont appliqués, l'anesthésie, l'analgésie et l'euthanasie sont mises en place de façon appropriée par des expérimentateurs formés et expérimentés. Le nombre d'animaux utilisé est calculé afin d'avoir des tests statistiques robustes évitant la répétition des expériences.
Choix des espèces
L’espèce animale utilisée ici est la souris, dont la petite taille et la facilité de manipulation permet un hébergement facile au sein de l’animalerie du laboratoire, dans le respect des règles d’éthique. Les manipulations nutritionnelles sont également faciles à conduire chez la souris et les expériences de comportement sont faciles à mettre en œuvre et très bien maitrisées au laboratoire qui possède tout l’équipement dédié. Les animaux arriveront au laboratoire à l’âge du sevrage (P21). Ils seront mis immédiatement sous régime contrôle ou hyperlipidique jusqu’à la fin de l’expérience. Toutes les expériences seront ensuite faites à l’âge adulte (après 15 semaines d'exposition au régime).
Imagerie nucléaire par Tomographie par Emission de Positon (TEP)
- Recherche appliquée
- Diagnostic des maladies
Rats : 520
1 820 souris et rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures déclarées de gravité légère. Chaque animal reçoit sous anesthésie une injection intraveineuse de radiotraceur, suivie d'une imagerie TEP de vingt minutes à deux heures, avant mise à mort par dislocation cervicale, surdose anesthésique ou perfusion intracardiaque de fixateur. Le projet développe des candidats-imagerie et des candidats-médicaments pour diverses pathologies. Le porteur justifie le recours à l'animal par l'impossibilité réglementaire de mener ces recherches chez l'humain sain et par l'absence d'alternative.
Objectifs
Nous poursuivons 2 objectifs scientifiques et technologiques principaux: i) le développement de nouveaux candidats-imagerie afin d’améliorer la détection et le suivi des pathologie, ii) amener des candidats-médicaments aux phases précliniques de validation ce qui apporterait de nouvelles possibilités de traitements contre différentes pathologies.
Bénéfices attendus
Un des problèmes majeurs de nombreuses pathologies, parmi lesquelles les cancers, est le diagnostic tardif ce qui rend leur traitement difficile. Parallèlement à la recherche de nouveaux traitements, la recherche en imagerie médicale permet de détecter l’apparition de pathologies plus précocement, plus précisément et/ou plus spécifiquement, contribuant ainsi à un meilleur diagnostic des pathologies, à évaluer l’éligibilité des patients à une thérapie donné, et/ou à un meilleur suivi de l’évolution.
Procédures
Les animaux reçoivent, sous anesthésie une injection intraveineuse de maximum 100μL de radiotraceur (5-10MBq selon les radiotraceurs) en solution isotonique stérile et apyrogène. Le volume injecté sera expérience dépendant en fonction de l'efficacité du radiomarquage. Si des injections sont réalisées plusieurs fois sur un même animal, une période de récupération d'au minimum 48H est alors envisagée. A noter qu’une personne habilitée (partie prenante de la collaboration) à travailler avec des radioéléments sera en charge des animaux, des injections jusqu’aux manipulations pré- et post-imagerie. 0 minutes à 2 heures (selon le traceur utilisé) après injection, l’acquisition en imagerie sous caméra microTEP/CT est réalisée pour une durée de 20 à 120 minutes, sous anesthésie. La caméra est équipée d’un système de monitoring cardiaque et respiratoire ainsi que d’un système de chauffage permettant de corriger la diminution de température corporelle induite par l’anesthésie. L'animal fait l'objet d'une surveillance visuelle pendant toute la durée de l'examen. En fin de procédure l’animal est réveillé, placé dans une pièce de stabulation post-examen, chauffé, avec eau et nourriture ad libitum.
Impact sur les animaux
L’imagerie TEP est une procédure non douloureuse réalisée sur animal anesthésié. Tous les animaux seront examinées et surveillées avant, durant et après l’imagerie. Pendant l’examen, un support chauffant permet de lutter contre l’hypothermie due à l’anesthésie et la respiration est suivie. Les seules sources de stress sont l’induction anesthésique, l'injection du radiotraceur et le réveil. Le protocole sera arrêté si l’animal présente des difficultés à respirer (augmentation de la fréquence respiratoire visible au niveau des flancs), si l’animal est prostré ou en retrait, ou s’il présente une perte de poids supérieure ou égale à 20% du poids de départ. Les animaux sont suivis quotidiennement, week-end compris, pour s'assurer de leur bien-être et de l'absence de souffrance. Nous effectuerons un contrôle préalable de l’état physiologique des animaux avant de les inclure dans la procédure expérimentale.
Devenir
Les animaux ne nécessitant pas d'étude immunohistochimiques seront mis à mort à la fin de la procédure d'imagerie soit par dislocation cervical soit par surdose anesthésique. Les animaux nécessitant des études immunohistochimiques seront mis à mort à la fin de la procédure d'imagerie par perfusion intracardiaque de paraformaldéhyde sous anesthésie profonde.
Remplacement
Le recours à l’expérimentation animale se justifie par l’impossibilité réglementaire de conduire ce type de recherche chez l’homme sain, et le choix de l’espèce par le besoin d’un modèle animal déjà documenté, en l'absence d'alternative possible.
Réduction
Pour notre étude d’une durée totale de 5 ans, nous envisageons d’utiliser au maximum 1300 souris (Mus musculus) et 520 rats (Rattus norvegicus). Ce nombre total d’animaux sera déterminé au plus juste, mais il nous faudra dans le même temps disposer de suffisamment d’échantillons pour obtenir des résultats statistiquement exploitables et fiables avec des tests statistiques Paramétrique ou non (définis en fonction de la taille de l’échantillon et de l’évaluation de la normalité de la distribution).
Raffinement
Le personnel impliqué est formé et qualifié à l’expérimentation animale (niveaux 1 et 2). Les animaux seront commandés chez un fournisseur agréé et seront livrés directement à l’animalerie de CERIMED au minimum une semaine avant la première procédure expérimentale. Les animaux sont suivis quotidiennement, week-end compris, pour s'assurer de leur bien-être et de l'absence de souffrance. Nous effectuerons un contrôle préalable de l’état physiologique des animaux avant de les inclure dans la procédure expérimentale. Suivant la grille d'évaluation de la souffrance (annexe), si le score est élevé (15 à 20), la mise à mort sera réalisée sans délais. Dans ce protocole, le comportement et le poids des animaux seront observés régulièrement. En fonction des scores obtenus grâce à la grille d'évaluation de la douleur, l'analgésie sera réalisée par administration de paracétamol (200mg/kg, voie orale ou Carprofène à 20mg/kg, ou de buprénorphine voie s.c. 0.05 mg/kg)).
Choix des espèces
Les études biomédicales font appel à des modèles animaux qui visent à mimer au plus près les processus physiologiques et pathologiques rencontrés chez l’humain. Les rongeurs sont des animaux de choix à double titre : d’une part par les facilités d’élevage et de stabulation en animalerie, d’autre part en raison de l’avènement des techniques de manipulations génétiques chez la souris Les animaux seront utilisés au stade adulte, à six - huit semaines, car c’est le protocole communément utilisé dans la littérature. Après réception, les animaux sont hébergés au minimum pendant une semaine avant le début du protocole.
Etude de l’efficacité d’un vaccin contre Pseudomonas aeruginosa
- Recherche appliquée
- Troubles respiratoires
258 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélèvement de la rate, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à sévère, dont 120 en gravité sévère. Elles reçoivent quatre injections vaccinales, des prélèvements de sang en rétro-orbitaire, puis une inoculation de la bactérie Pseudomonas aeruginosa par voie nasale, avec un suivi clinique toutes les quatre heures. Le porteur indique que l'infection peut provoquer des douleurs élevées et présente cette étape comme "indispensable" avant le passage à l'humain. Le bénéfice annoncé se limite au déclenchement d'essais cliniques ultérieurs.
Objectifs
Le projet vise à étudier l’efficacité d’un vaccin optimisé contre Pseudomonas aeruginosa, bactérie pathogène représentant un problème de santé publique majeur. Ce projet permettra de mettre au point la preuve de concept de ce vaccin candidat en modèle pré-clinique murin. Cette étape est indispensable afin de passer aux essais sur l’homme.
Bénéfices attendus
Obtention de résultats précliniques concernant l'efficacité d'un vaccin contre Pseudomonas aeruginosa permettant de passer au déclenchement des phases cliniques suivantes.
Procédures
4 injections de doses vaccinales seront réalisées en sous-cutanée sur les animaux vigiles. 3 prélèvements de sang en rétro-orbitaire seront effectués sous brève anesthésie générale volatile. L'inoculation bactérienne sera unique par voie intranasale sous brève anesthésie générale volatile. L'état clinique des animaux sera observé sur animaux vigiles toutes les 4 heures lors du développement de l'infection. Le prélévement de la rate des animaux sera réalisé post-mortem.
Impact sur les animaux
Une douleur de niveau légère sera générée par l’injection de la dose vaccinale et de niveau modérée pour les potentiels effets de la vaccination. Des douleurs de niveau élevé pourraient résulter de l’infection induite à Pa.
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort à la fin des expériences pour le prélèvement et l'étude de la rate.
Remplacement
Dans le cadre de ce projet scientifique, un vaccin vivant atténué a été développé et optimisé. Une souche de Pseudomonas aeruginosa (bactérie pathogène pour l’Homme) modifiée génétiquement est inactivée par un traitement photochimique de façon à empêcher sa propagation suite à la vaccination et permettant de contrôler la dose injectée. La souche conserve cependant une activité métabolique permettant de déclencher une réponse immunitaire efficace. Ce vaccin présente ainsi la sécurité d’utilisation de bactéries mortes combiné à l’efficacité d’un vaccin vivant atténué. Le vaccin a fait l’objet d’optimisations tant sur le protocole de préparation des doses vaccinales que sur l’échelle de production et la forme du produit final de celui-ci. Le remplacement n'est pas possible dans le cas de cette étude pré-clinique indispensable pour valider la sécurité d'utilisation et l'efficacité du vaccin développé. Ce projet permettra d’évaluer la réponse immunitaire complexe suite à la vaccination à l’aide d’un vaccin candidat optimisé et ensuite face à un challenge infectieux à dose létale en modèle pré-clinique murin. Cette étape est indispensable afin de passer aux essais sur l’Homme.
Réduction
Chaque groupe expérimental sera constitué d’un nombre d'animaux suffisant en adéquation avec les protocoles standards utilisés dans la littérature. Les lots d'animaux seront constitués de 6 souris répété 1 fois (2*6 souris par groupe expérimental) hormis les groupes utilisés dans l'étude préliminaire qui ne nécessitent pas d'être répétés (1*6 souris par groupe test) : nombre minimal et suffisant pour un traitement statistique approprié.
Raffinement
Les animaux seront placés en conditions SPF (« specific pathogene-free »). Les souris seront placées dans des cages standards et adéquates au niveau de la taille, de la propreté, de la température (23 +/- 2°C), du cycle lumineux (12h) et des congénères (toujours les mêmes souris ensemble dans une cage). La nourriture et la boisson sont disponibles en continu. Les animaux auront bénéficié d’une semaine d’acclimatation. Pour chaque prélèvement sanguin, les souris subiront une brève aesthésie générale. Des points limites ont été définis afin de limiter la souffrance inutile des animaux. Dans le cas où les points limites seraient atteints, l’animal sera mis à mort avant la fin de procédure pour arrêter toutes souffrances inutiles.
Choix des espèces
La souris est l’espèce la plus susceptible de fournir des résultats satisfaisants et comparables aux études précédemment publiées dans le cadre des études de l’équipe de recherche et dans cette thématique de façon plus générale. Les souris C57BL/6 sont les modèles choisies car elles sont sensibles aux infections à Pa (aiguës ou chroniques) et qu’elles sont capable de produire des taux d’anticorps élevés. Stade de développement des animaux : âgés de 6 à 8 semaines. À ce stade, les animaux auront un système immunitaire mature.