Souris

280 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent l'ablation chirurgicale des deux tiers du foie et des injections, pour étudier le contrôle de la division des hépatocytes en lien avec le cancer du foie. Le porteur indique que la laparotomie peut provoquer une gêne et une légère douleur, et prévoit une mise à mort anticipée en cas d'atteinte des points limites. Il affirme que le modèle murin est le "seul modèle préclinique" permettant d'invalider ou d'induire des gènes de façon tissu-spécifique.

Objectifs

Le foie est un organe vital qui intervient dans le stockage du glucose, la fabrication de la bile et la détoxification. L'incidence du cancer du foie (CHC) est en forte augmentation depuis 20 ans et ce cancer représente la 3ème cause de mort par cancer dans le monde. Ce cancer grave dispose de très peu de traitements efficaces et l’apport de nouvelles stratégies thérapeutiques représente donc un enjeu majeur dans la prise en charge de cette maladie. Bien que des progrès aient été accomplis dans le déchiffrage des mécanismes moléculaires du CHC, la dissection des événements précoces de la carcinogenèse hépatique, notamment comprendre la transformation tumorale des hépatocytes, cellules majoritaires du foie, est centrale pour mieux comprendre le développement de ce cancer. Des études récentes ont montré que le développement du CHC était intimement lié à un contexte d’altérations au niveau génétique, métabolique et inflammatoire, qui favorise un remaniement du cycle de division de l’hépatocyte. Dans ce cadre, nos travaux visent notamment à décrypter les mécanismes cellulaires et moléculaires régulant le cycle de division des hépatocytes, pour assurer ainsi le maintien de l’intégrité du tissu hépatique. Ce projet nécessitera 280 souris et sera mené pour une durée de 2 ans.

Bénéfices attendus

Les résultats de ce projet nous permettront de définir le rôle de RhoA, DNAM-1 et LECT2, dans le contrôle prolifératif des hépatocytes, mais aussi dans la compréhension des mécanismes sous-jacents assurant l'intégrité génomique dans le foie, mécanismes faisant défaut au cours de l'hépatocarcinogenèse humaine. Ces travaux devraient conduire à élaborer chez l’Homme de nouveaux outils diagnostic/pronostic et des stratégies thérapeutiques innovantes pour ce cancer grave sans traitement effectif.

Procédures

Dans le cadre de ce projet de recherche, une injection intra-péritonéale (une fois, à 6 semaines de vie) sera réalisée sur animal vigile (112 animaux). Par ailleurs, une hépatectomie partielle des 2/3 du foie (chirurgie) sera effectuée sur animal anesthésié (280 animaux). Enfin, une injection intra-péritonéale (une fois, à 8-10 semaines de vie) sera réalisée sur animal vigile (280 animaux).

Impact sur les animaux

Du fait de la laparotomie nécessaire à la chirurgie du foie, les animaux pourraient resssentir soit une gêne au niveau de la zone chirurgicale (présence de sutures/agrafes) ou bien une légère douleur de par l'acte chirurgical. Par ailleurs, l’injection intrapéritonéale pourrait entrainer un certain inconfort, limité dans le temps (passage de l’aiguille au travers de la peau et du péritoine).

Devenir

Des prélèvements et analyses sont nécessaires post-mortem et cela implique donc l’euthanasie (par une méthode réglemantaire) de l’ensemble des animaux (280).

Remplacement

Pour la réalisation de ce projet, l'utilisation d'animaux vivants, en l’occurrence dans notre cas le modèle murin, est indispensable car il constitue le seul modèle préclinique qui permette d’invalider ou d’induire l’expression de gènes de manière tissu-spécifique pour caractériser l’implication de ces derniers dans les mécanismes moléculaires conduisant au CHC.

Réduction

Les groupes expérimentaux seront constitués du minimum d’animaux nécessaire et suffisant pour permettre une analyse statistique robuste des effets observés. Nous pourrons être amenés à manipuler moins de souris si l’effet observé s’avère significatif au cours des premières expériences. L’étude sera arrêtée si l’expérience initiale invalide l’hypothèse de travail. Plusieurs tissus seront prélevés et soumis à diverses analyses (immunologiques, histologiques ou de biologie cellulaire et moléculaire) pour extraire le maximum de données de chaque expérimentation. Pour cette étude, nous estimons que 280 souris seront nécessaires.

Raffinement

Les animaux provenant de l’extérieur seront stabulés une semaine au sein de l’animalerie. Les animaux seront observés quotidiennement afin de respecter leur bien-être. Les souris seront placées dans des conditions optimales (température, hygrométrie, cycle jour nuit 12h/12h, enrichissement des cages, nourriture ad libitum). Les manipulations seront réalisées dans le souci constant de réduire au maximum l’inconfort et la souffrance des animaux. Toute manipulation invasive (hépatectomie partielle) sera précédée d’une anesthésie générale et d'une prise d'antalgique pré/post opératoire. La mise en place d’une grille de suivi strict des points limites permettra d’éviter au maximum le stress et/ou la douleur au cours de l’expérimentation. Dans le cas où un point limite sera atteint avant la fin de l’expérimentation, la mise à mort anticipée de l’animal sera faite. Enfin une veille scientifique continue sera effectuée, évitant ainsi toute expérimentation déjà rapportée dans la littérature.

Choix des espèces

Pour la réalisation de ce projet, l'utilisation d'animaux vivants est indispensable pour déterminer les mécanismes moléculaires conduisant au CHC. Nous avons choisi la souris, car en plus de partager plus de 90% de gènes communs avec l’homme, il existe pour cette espèce des modèles génétiquement altérés pertinents pour l'étude. Les souris utilisées pour ce projet de recherche sont de jeunes adultes (6 à 10 semaines de vie) afin de disposer d'un foie largement engagé dans un état de différenciation avec un système immunitaire en fin de maturation. A ce stade, le tissu hépatique garde une capacité de prolifération en réponse à différents stimuli environnementaux.

100 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Souris immunodéprimées porteuses d'une tumeur humaine, elles reçoivent une chimiothérapie par gavage pendant quatorze jours puis de l'iode-131 radioactif, pour tester une combinaison anticancéreuse. Le porteur précise que l'étude est menée comme une "prestation de services" pour le compte d'une entreprise biopharmaceutique. Il affirme qu'une étude in vitro "ne peut représenter la complexité du vivant".

Objectifs

Cette étude est menée dans le cadre de prestations de services contractualisées pour le compte d’une entreprise biopharmaceutique spécialisée dans la recherche et le développement de nouveaux outils thérapeutiques et de diagnostic. Elle s’intéresse à l’évaluation in vivo d’une approche thérapeutique multimodale combinant des agents anti-cancéreux (chimiothérapie) avec de la thérapie interne par radio-isotopes dans le traitement du cancer.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus sont de montrer l'intéret de la combinaison de la chimiothérapie avec une radiothérapie interne à l'iode-131 dans le traitement du cancer.

Procédures

Les animaux recevront une administration par gavage de chimiothérapie pendant 14j consécutifs. Ils recevront également une administration par gavage ou par injection intraveineuse d'iode-131 (1 seule fois ou 2 fois à une semaine d'intervalle)

Impact sur les animaux

Des effets indésirables de la chimiothérapie couplée ou non à l'administration d'iode-131 ne sont à pas exclure. La surveillance quotidienne des animaux permettre de réagir rapidement dès l'appartition de signes cliniques avec une prise en charge médicamenteuse ou une mise à mort de l'animal en cas d'atteinte des points limites définis.

Devenir

A l'issue du projet, tous les animaux seront mis à mort par surdosage d'anesthésie gazeuse puis dislocation cervicale en vue d'analyses ex vivo.

Remplacement

La validation de nouvelles thérapeutiques requiert la détermination de paramètres pharmacocinétiques des molécules candidates sur des modèles animaux adaptés. En effet, la physiologie globale de l’individu entre en jeu et une étude ex vivo ou in vitro ne peut représenter la complexité du vivant.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés a été rationalisé à partir de l'expérience du laboratoire sur l'analyse desparamètres d'intérêt. Ainsi, le nombre d'animaux nécessaire est réduit au maximum en sélectionnant uniquement les expérimentations essentielles. Le nombre d'animaux a été calculé afin de garantir une valeur statistique à l'étude menée.

Raffinement

Un enrichissement des cages d’hébergement sera assuré par l'ajout de briquettes de bois. Pour legavage des animaux, ceux-ci seront habitués à la contention par l'expérimentateur avant le début des procédures. Par ailleurs, les animaux seront suivis de façon quotidienne à l’aide de feuille de score de façon à détecter tout signe d’inconfort et de permettre une action rapide en cas d'atteinte des points limites établis.

Choix des espèces

La validation de nouvelles cibles thérapeutiques requiert la détermination de paramètres pharmacocinétiques des molécules candidates sur des modèles animaux adaptés. En effet, la physiologie globale de l’individu entre en jeu et une étude ex vivo ou in vitro ne peut représenter la complexité du vivant. L'implantation d'une tumeur humaine chez l'animal est possible uniquement chez des individus immunodéprimés. Ainsi la souris immunodéprimée est préférée pour cette étude. Les souris utilisées sont des immunodéficientes adultes de 4-6 semaines d’environ 25 grammes qui sont adaptées à la croissance des tumeurs.

318 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Un état de mal épileptique est induit par injection de kaïnate et un implant crânien est posé pour l'enregistrement EEG, pour étudier le lien entre crises épileptiques et neurodégénérescence. Le porteur indique que les décharges peuvent provoquer un arrêt cardiaque ou conduire l'animal à se blesser dans 10 % des cas, et prévoit la mise à mort des souris perdant plus de 15 % de leur poids. Il affirme qu'il n'existe "pas de modèle alternatif" pour observer les crises et le déclin cognitif.

Objectifs

L'association entre crise épileptique et neurodégénérescence a été observée en clinique. Malgré ça, à l’heure actuelle, aucune étude n’a intégré des modèles précliniques pour examiner systématiquement comment des crises épileptiques peuvent accélérer des processus de neurdégénérescences et en cours de vieillissement. Dans ce projet, nous allons tester les hypothèses suivantes : i) les crises épileptiques suffisent à déclencher les voies amyloïdes et l’hyper phosphorylation de tau dans le cerveau ; ii) ces effets sont plus sévères au cours du vieillissement. Cette exploration est importante, au vu de l’incidence croissante des épilepsies et des comorbidités neurologiques chez la personne âgée.

Bénéfices attendus

Pouvoir mettre en évidence une corrélation pathophysiologique entre une crise épileptique qui arriverait pendant le vieillissement et le développement de la maladie d'Alzheimer.

Procédures

- Entre 2 et 5 injections intra-péritonéales sur une durée de 2 heures - Une procédure chirurgicale d'une durée de 40 minutes.

Impact sur les animaux

L'induction d'un status epilepticus sur la souris engendre des décharges neuronales fortes. Celles-ci peuvent provoquer un arrêt cardiaque ou entrainer l'animal à se blesser dans la cage (morsure de la langues). Ces effets sont observés dans 10 % des cas. L'injection, si nécessaire, de diazépam entraine une somnolence de l'individu avec absence d'hydratation (comblée par une IP de solution saline stérile) et d'alimentation pendant plusieurs heures. La pose d'un implant crânien pour suivi électroencéphalographique peut entrainer un inconfort temporaire, signe de grattage plus intense au niveau de celui-ci.

Devenir

A la suite de la procédure 1, les animaux seront mise à mort par CO2 car leur utilisation est terminée. Les animaux de la procédure 2 seront mise a mort comme décrit dans la procédure pour prélèvement d'organes.

Remplacement

Il n'existe pas de modèle alternatif pour observer les crises épileptiques et le déclin cognitif (maladie d'alzheimer) dans leur globalité.

Réduction

Cette étude permettra de faire des analyses en longitudinales sur les animaux d'un an puisque le comportement sera effectué sur les méme animaux que le prélèvement d'organes. De plus, Nous avons prévu de créer une banque d'échantillons à partir des prélèvements qui seront effectués (organes et sang). Elle nous servira à la suite du projet ou encore pour des études préliminaires pour des nouveaux.

Raffinement

Le raffinement passe par le maintien de l'enrichissement dans les cages notamment en cas d'isolement des souris pour les besoins de l'expérience. La socialisation sera de nouveau rendue possible quand les contraintes expérimentales le permettront. Tous les animaux seront surveillés lors de la procédure 1 et un SE supérieur à 2 H entrainera l'injection IP de diazépam à 0.5mg/kg pour stopper les crises et éviter ainsi une surmortalité. Pour la procédure 2 avec chirurgie, une grille de score (ci-joint) sera établie et permettra par exemple de : -procéder à une désinfection en cas de palie ou de suture problématique sous isoflurane, -surveiller le poids de l'animal avec une mise à mort si perte > 15% et apport de nourriture appétente si perte entre 10 et 15%. Pour les enregistrement EEG, une habituation à la contention sera effectuée chaque jour pour minimiser les stress lors des enregistrements.

Choix des espèces

L'espèce souris a été choisi en fonction des modèles nécessaires à l'étude. Un modèle isomorphe est nécessaires. La mise en place d'un modèle épileptique artificiellement induit . La souris répond aux besoins scientifiques et aux règles des 3R. Le fond génétique C57Bl/6 est utilisé dans le modèle car il a pu montrer la meilleure réponse physiopathologique. Le modèle d'épilepsie utilisé ici, induit par injection de kainate est un modèle connu et robuste. Il permet l'étude de la physiopathologie de l'épilepsie. Les animaux utilisés sont des adultes mâles agés de 2 mois, 6 mois et 9 mois. Les souris seront gardées au long court pour les points de prélèvement à 6 mois, 9 mois et 1 an. Nous allons induire une crise épileptique a des stades différents de la vie pour évaluer les conséquences de celle-ci en fonction de l'âge.

360 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Génétiquement modifiées pour développer un cancer du foie, elles reçoivent des traitements par gavage cinq jours sur sept ou par injection pendant huit semaines, des échographies sous anesthésie, puis une ponction cardiaque terminale. Le porteur affirme n'attendre "aucun effet indésirable" des immunomodulateurs testés, alors que les souris portent une tumeur hépatique évolutive. Il conclut qu'aucun modèle ne reproduit ces interactions et parle d'un "passage obligatoire par le modèle animal".

Objectifs

Notre projet est d’évaluer l’intérêt de l’immunomodulation dans le CHC, et pour se faire il est nécessaire d’utiliser un modèle murin de CHC immunocompétent. Nous proposons d’utiliser un modèle de souris transgénique (ASVB) développant un carcinome hépatocellulaire évoluant en trois stades bien définis : dysplasie, nodulaire, et diffus (Dupuy, et al., 2003 ; Contreres, et al., 2006 ; Tijeras-Raballand, et al., poster AACR 2019, Atlanta). Ce modèle ASV-B est un modèle de souris transgénique mis au point sur des souris de fond génétique C57BL6. L’oncogène T du virus SV40 est monté sous le promoteur de la thrombine, permettant ainsi une expression exclusive dans les hépatocytes. De plus, le transgène est monté sur le chromosome Y, ainsi seuls les mâles sont malades, alors que les femelles sont saines. Dans ce modèle, la carcinogenèse et l’angiogenèse mime à la perfection celle observée chez l’homme (CHC sur foie sain) (Dupuy, et al., 2003 ; Tijeras-Raballand, et al., poster AACR 2019, Atlanta). De plus, des résultats préliminaires ont montré une augmentation de l’expression de PD-1 et PD-L1 au cours du développement du CHC (Tijeras-Raballand, et al., abstract accepté ILCA 2019). Toutes ces caractéristiques en font un excellent modèle d’étude pour ce projet.

Bénéfices attendus

Le carcinome hépatocellulaire (CHC= cancer du foie) est la troisième cause de mortalité par cancer dans le monde. La mortalité élevée du cancer du foie est principalement liée au manque de traitements curatifs pour les formes avancées. En effet¸ malgré les avancées technologiques dans le dépistage du cancer du foie, seul 30-40% des patients sont éligibles à un traitement curatif (résection chirurgicale, destruction percutanée, transplantation hépatique). Afin de proposer des traitements curatifs à une plus large proportion des patients, il est important d’identifier de nouvelles stratégies thérapeutiques. Notre projet consiste à étudier l’effet des anti-PD1 ou anti- PDL1 dans un modèle de souris génétiquement modifié, qui développe un cancer du foie similaire et comparable à celui de l’homme. Le projet a pour but de montrer l’efficacité de plusieurs anti-PD-1, anti-PD-L1 et combinaisons d’intérêt avec des anti-angiogéniques à tester pour le traitement du CHC, et ce dans un système intégré, nous entendons par là, dans un système où les cellules tumorales, les cellules immunitaires, les cellules endothéliales et tout le microenvironnement si typique d’une tumeur puissent interagir. Ce projet tend donc à proposer des méthodes combinatoires, permettant à la fois d’augmenter l’efficacité des thérapies proposées, ainsi que d’éviter l’apparition de résistance.

Procédures

Les animaux seront soumis à 1 type d'intervention en étant vigiles: L'administration du traitement soit par gavage 5 jours sur 7 soit en intrapéritonéale 3 fois par semaine pendant 8 semaines. Ils seront ensuite anesthésiés pour être soumis à un échodoppler qui n'est pas une précédure invasive, donc non douloureuse 3fois (à 8 12 et 16 semaines). Enfin, ils seront soumis à un prélèvement intracardiaque sous anesthésie générale où les animaus ne seront pas réveillés à 16semaines.

Impact sur les animaux

Il n'y a aucun effets indésirables attendus avec l'utilisation d'immunomodulateurs. Aussi, la dose sélectionnée de Sorafenib (traitement contrôle dont on connaît les effets) a été choisie pour ne pas induire d'effets indésirables.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort après l’échographie de la 16ème semaine par ponction cardiaque puis dislocation cervicale sous anesthésie générale. Ce sera un prélèvement total de sang pour des analyses post mortem.

Remplacement

Notre projet consiste à étudier l’effet des anti-PD1 ou anti-PD-L1 dans un modèle de souris génétiquement modifié, qui développe un cancer du foie similaire et comparable à celui de l’homme. Le projet a pour but de montrer l’efficacité de plusieurs anti-PD-1, anti-PD-L1 et combinaisons d’intérêt avec des anti-angiogéniques à tester pour le traitement du CHC, et ce dans un système intégré, nous entendons par là, dans un système où les cellules tumorales, les cellules immunitaires, les cellules endothéliales et tout le microenvironnement si typique d’une tumeur puissent interagir. A ce jour, aucun modèle ne permet de mimer ce type d’interaction, d’où un passage obligatoire par le modèle animal.

Réduction

Afin de réduire le nombre d’animaux, tout en étant statistiquement valide, le nombre d’animaux par groupe (10) a été déterminé grâce aux expérimentateurs (personnel en charge de l’échographie, anatomo-pathologistes, pharmacologues et chercheurs) qui participent à ce projet et qui ont de l’expérience avec ce modèle. De plus, dans la mesure du possible, plusieurs groupes de traitements seront testés en parallèle afin de ne pas multiplier le groupe contrôle (ou placebo), pour un total de 360 animaux sur 36 mois. Nous réaliserons des tests de Student et Anova en comparant le groupe CTRL avec les groupes de monothérapie et les groupes de monothérapie avec les combinaisons.

Raffinement

Le projet n’inclut pas d'interventions douloureuses et les animaux seront observés quotidiennement. Différents points limites seront particulièrement surveillés tels que la perte de poids (qui ne sera jamais pris en compte individuellement dans la mesure où l’accroissement du volume hépatique peut provoquer une légère prise de poids), le gonflement de l’abdomen (signe de développement tumoral trop important) et la survenue d’une gêne pour se déplacer (signe de douleur possible au niveau hépatique). Le comportement et l’apparence physique feront aussi l’objet d’observations. Les dispositions retenues pour stopper ou atténuer les problèmes liés à l’apparition de points limites seront prises dès constatation. Les souris seront hébergées en portoir ventilé avec alimentation standard classique Harlan 20.16) et eau stérile ad libitum. Cycle nycthéméral 12h jour/12h nuit Température : 22°C Aussi, les souris disposeront d’enrichissement tels que maison rouge, nids en papier kraft ou buchette de bois à ronger pour leur permettre d’exprimer tout le comportement social normal d’une souris et ainsi améliorer leurs conditions d’hébergements.

Choix des espèces

Nous utilisons un modèle de souris transgénique qui développe un carcinome hépatocellulaire (CHC). Ce modèle est un des rares modèles immuno-compétents de CHC, disponibles pour l’étude de nouvelles thérapies. Le modèle ASV-B est un modèle de souris transgénique mis au point sur des souris de fond génétique C57BL6. L’oncogène T du virus SV40 est monté sous le promoteur de la thrombine, permettant ainsi une expression exclusive dans les hépatocytes. De plus, le transgène est monté sur le chromosome Y, ainsi seuls les mâles sont malades, alors que les femelles sont saines. Dans ce modèle, la carcinogenèse mime à la perfection celle observée chez l’homme (CHC sur foie sain). Les anomalies vasculaires observées sont également les mêmes que celles observées chez l’homme et permettent d’analyser les effets anti-angiogéniques attendus des molécules, en plus de leurs effets antitumoraux. Enfin, ce modèle possède un stroma immun riche et complexe, à l’image de celui observer dans les tumeurs issues de patients. Le début de l’administration des médicaments aura lieu à l’âge de 8 semaines. En effet, dans ce modèle, 3 stades de carcinogenèse bien définis ont été mis en évidence. Une hyperplasie (8 semaines), stade nodulaire (12 semaines) et carcinome diffus (à partir de la semaine 16). En oncologie, les patients commençant à être traités une fois leur pathologie déclarée, cela explique pourquoi nous attendons également le début de la carcinogenèse dans les animaux.

108 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections de tamoxifène pendant quatre jours puis six séances d'électrostimulation du mollet sous anesthésie générale, pour étudier le rôle d'une protéine du métabolisme énergétique dans les cellules souches musculaires. Le porteur décrit un projet de recherche fondamentale et affirme que l'analyse détaillée du tissu musculaire ne peut se faire sur "animal entier vivant", ce qui justifie la mise à mort de toutes les souris. Il indique que l'électrostimulation ne peut être reproduite in vitro et conclut au caractère "indispensable" du modèle animal.

Objectifs

Le maintien de la quantité et de la qualité du tissu musculaire strié squelettique est crucial pour une bonne qualité de vie, et est facilité par la remarquable capacité de ce tissu à s’adapter soit à une augmentation de l’activité musculaire (exercice physique) soit à une diminution de l’activité musculaire (immobilisation, alitement prolongé). Les cellules souches musculaires (les cellules satellites) ont une contribution importante à cette capacité d’adaptation du tissu musculaire grâce à leur capacité de différenciation et de fusion avec les fibres musculaires, processus conduisant à une accumulation de noyaux au sein des fibres musculaires. Cette accumulation de noyaux au sein des fibres musculaires dépend des propriétés énérgétiques des cellules souches et de la fibre musculaire. Ainsi, des données obtenues sur des cultures cellulaires montrent qu’une protéine X régulant les processus énergétiques des cellules favorise l’accumulation de noyaux au sein des fibres musculaires. Il a également été démontré qu’un protocole d’exercice consistant à électrostimuler les muscles du mollet de souris saines se traduit par une augmentation du nombre de noyaux au sein des fibres musculaires. Nous avons donc pour objectif d’utiliser ce protocole d’exercice par électrostimulation afin d’étudier le rôle de la protéine X dans l’accumulation de noyaux générée par l’exercice. Ce projet permettra de mieux comprendre le rôle des cellules souches musculaires dans le maintien du bon fonctionnement du muscle strié squelettique et l’influence d’une protéine dont la fonction est de réguler les processus énergétiques cellulaires.

Bénéfices attendus

Ce projet de recherche fondamentale permet de mieux comprendre le rôle d’une protéine régulant les processus énergétiques des cellules souches dans le fonctionnement du tissu musculaire.

Procédures

Chaque animal recevra une injection par jour de tamoxifène ou d’huile en intra péritonéale pendant 4 jours. Chaque animal sera ensuite soumis à 6 séances d’exercice d’électrostimulation du mollet réparties sur une période de 7 jours (i.e., 3 séances consécutives, 1 jour de repos, 3 séances consécutives). Chaque séance d’exercice d’électrostimulation sera réalisée sous anesthésie générale et durera un maximum de 20 minutes. Afin d’évaluer la progression du cycle cellulaire des cellules souches musculaires, les animaux seront supplémentés à l’aide d’un analogue de la thymidine (0,5 mg/ml repris dans une solution glucosée à 1%) administré dans l’eau de biberon 24h avant la première séance et jusqu’à la fin de la procédure expérimentale (soit pendant 8 jours consécutifs).

Impact sur les animaux

Des nuisances et effets indésirables "modérés" sont attendus du fait d’un cumul d’actes (injections ip, électrostimulation, anesthésies). L’injection de tamoxifène dans les animaux adultes n’induit pas en soi de phénotype dommageable comme montré dans des études précédentes. Les données de la littérature ne rapportent pas d’effets indésirables de l’administration d’EdU dans l’eau de biberon. Il a été démontré que le protocole d’exercice par électrostimulation n’induit aucune altération de la fonction et de la structure musculaire ainsi qu’aucun changement de mobilité, d’activité et de comportement des animaux. Aussi, il a été démontré que les anesthésies répétées à l’isoflurane liées au protocole d’électrostimulation n’induisent pas de troubles anxieux ou de modifications du comportement, de l’activité et de la mobilité des animaux. Les animaux ne présentent aucun signe de prostration ou d’amaigrissement et sont en mesure de se mouvoir, de s’alimenter et de s’hydrater normalement dès leur réveil. Enfin, aucun animal n’a dû être mis à mort du fait de la procédure d’exercice par électrostimulation.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort car le projet nécessite une analyse détaillée du tissu musculaire qui ne peut pas être réalisée sur animal entier vivant.

Remplacement

Pour ce projet, les modèles animaux sont indispensables car la procédure implique un exercice d’électrostimulation qui est impossible à reproduire in vitro. Aussi, les études de physiologie nécessitent l'utilisation de modèles animaux car seule l'analyse du tissu, voire de l'organisme entier permet d'identifier le réel impact de ces interactions moléculaires et cellulaires sur la fonction de l'organe

Réduction

Nous utilisons un dispositif expérimental totalement non-invasif qui permet de réaliser des protocoles d’électrostimulation et de mesurer la force musculaire de manière concomitante sur les mêmes animaux rendant les préparations chirurgicales totalement obsolètes et réduisant ainsi le nombre d’animaux utilisés. Nous proposons d’établir des banques biologiques informatisées issues des expérimentations qui pourront à terme limiter l'utilisation de nouveaux animaux. Des prélèvements multiples sont réalisés après euthanasie sur le même individu pour des tests parallèles. L'utilisation des animaux est strictement réduite au nombre nécessaire pour l'établissement des données expérimentales, à l'aide des analyses statistiques effectués précédemment pour ces procédures. Les analyses statistiques précédentes de l'équipe permettent d'ajuster le nombre d'animaux requis. La taille de l’échantillon (12 animaux par condition) a été déterminée en prévoyant, à l’aide de tests statistiques adaptés, une augmentation de 15% du nombre de noyaux par fibre à l’issue du protocole d’électrostimulation chez les animaux contrôles

Raffinement

Les protocoles les moins invasifs et les moins douloureux possibles sont privilégiés. Les procédures expérimentales utilisées incluent un recours systématique à l'anesthésie générale profonde lors de l’exercice d’électrostimulation. Des mesures sont prises pour améliorer les conditions d'élevage afin d'enrichir l'environnement des souris. Aussi, un suivi quotidien des animaux permet d’éviter toute souffrance inutile et de prendre les mesures adéquates dans le cas d’un éventuel phénotype dommageable

Choix des espèces

Le tissu musculaire de la souris est très proche de celui de l'homme dans sa structure et son fonctionnement. Le modèle murin permet d’invalider la protéine X soit dans la fibre musculaire, soit dans la cellule souche afin d’évaluer les impacts fonctionnels, tissulaires et cellulaires sous-jacents. Les processus physiologiques impliqués dans l’homéostasie du muscle squelettique ont été largement décrits chez des animaux adultes. Les animaux seront utilisés entre 8 et 12 semaines d'âge.

600 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une bactériémie à staphylocoque doré résistant à la méticilline leur est provoquée par injection dans la veine de la queue, avec prélèvements sanguins quotidiens pendant dix jours, pour étudier le rôle protecteur de la protéine cavéoline-1. Le porteur indique que l'aggravation de l'infection conduit à prostration, cyanose et perte de poids, la mise à mort étant alors anticipée. Il reconnaît qu'une étude sur cellules a déjà établi le rôle de la cavéoline-1, mais affirme que la confirmation "doit" passer par un modèle in vivo.

Objectifs

La famille des exotoxines EDIN (A, B et C) de S. aureus compromet la perméabilité vasculaire par induction de tunnels transcellulaires. Des résultats non publiés montrent que cavéoline-1, une protéine fortement exprimée dans les cellules endothéliales, limite la formation et l’élargissement de ces tunnels transencellulaires. La perte d’expression de la cavéoline-1 entraine i) un doublement du nombre des tunnels transcellulaires provoqués par l’EDIN et ii) l’élargissement de ces tunnels. Des études antérieures sur modèle souris ont montré que l’EDIN est responsable d’une plus grande capacité des bactéries à induire une augmentation de la perméabilité vasculaire, associée à une plus forte dissémination de S. aureus dans les tissus par voie hématogène. Basé sur des résultats obtenus in vitro, l’objectif de notre étude est de démontrer que la perte d’expression de la cavéoline-1 chez l’animal est responsable d’une hyper-susceptibilité des animaux à la bactériémie induite par la souche LUG1799 du clone ST80-SARM-IV PVL+ et que ceci est directement lié à l’activité de la toxine EDIN-B. La souche LUG1799 est représentative des souches de S. aureus résistantes à la méticilline, problème majeur en Europe et en France. Nous nous baserons sur des études précédentes pour limiter le nombre d’animaux engagés dans cette étude et par une approche d’analyse statistique pour définir le nombre d’animaux par groupe.

Bénéfices attendus

Des travaux antérieurs ont permis de montrer un lien causal entre la formation des tunnels transendothéliaux induits par l’exotoxine EDIN de S. aureus et la survenue de dysfonctions vasculaires : œdème et hémorragie. De plus un exemple de formation transitoire de tunnels transcellulaires en physiologie est décrit lors de la transmigration des leucocytes à travers l’endothélium. Bien qu'elle ait été longtemps controversée, la première preuve de transcytose de leucocytes au travers des cellules endothéliales a été démontrée in vivo et/ou in vitro pour les monocytes, les neutrophiles, les lymphocytes, grâce à l’imagerie confocale à haute résolution. L'intégrité de la barrière endothéliale est maintenue lors de la diapédèse des leucocytes au travers des cellules endothéliales grâce à la formation d'un anneau d’actine-myosine qui est étroitement ajusté à la taille des leucocytes. Cet anneau stabilise le pore pendant le passage des leucocytes empêchant la fuite de plasma et la formation associée d'œdème. La formation de tunnels transcellulaires de taille régulée est aussi essentielle pour permettre l'écoulement de l'humeur aqueuse. Le dysfonctionnement de ces tunnels transcellulaires affecte la résistance à l'écoulement avec augmentation de la pression intraoculaire, provoquant le glaucome. Les protéines responsables de la régulation de ces tunnels transcellulaires sont largement inconnues. Nous avons identifié le rôle inhibiteur de la cavéoline-1 sur la formation et l’élargissement des tunnels transcellulaires induits par l’EDIN. Cette étude permettra de démontrer le rôle protecteur de la cavéoline-1 lors de la bactériémie induite par une souche clinique de S. aureus ST80-SARM-IV edinB+ et ouvrira à une meilleure compréhension de la régulation des tunnels transcelluaires dans les processus physiologiques et pathophysiologiques.

Procédures

Cette procédure consiste en l’administration de S. aureus par injection intravasculaire dans la veine de la queue avec suivi de la bactériémie par prélèvement sanguin quotidien de 20 microlitres (3 minutes par intervention) durant 10 jours. Cette procédure est néanmoins modérée car conduit à une mise à mort anticipée des animaux lors de l’apparition d’un phénotype caractéristique d’aggravation de la bactériémie.

Impact sur les animaux

Des expériences antérieures ont montré que des souris transgéniques invalidées pour le gène de la cavéoline-1 du même fond génétique que celle que nous élevons (C57BL/6, 12-14 semaines) une fois infectées par voie intravasculaire (veine de la queue) par 103 CFU de Salmonella typhimurium souche SB300 meurent en 7 jours (temps ½) alors que les souris sauvages meurent en 13 jours. Cet effet de susceptibilité à l’infection est à mettre en parallèle avec une translocation accrue des bactéries vers le foie avec formation de larges granulomes et translocation dans la rate, une forte augmentation de marqueurs de la réponse immunitaire (IFN-gamma, IL-6, TNF-alpha) dans le sang et la production de taux élevés de NO dans le sérum. Cette réponse péjorative de marqueurs immunitaires est récapitulée par l’injection de LPS de S. typhimurium. Les souris lors de l’infection meurent plus rapidement du fait d’une réaction immunitaire élevée et translocation de Salmonella plus forte dans les organes essentiels. Aucune étude à ce jour n’a permis de définir si des souris invalidées dans le gène de la cavéoline-1 sont plus susceptibles à des bactériémies induites par des bactéries à Gram-positif, S. aureus étant la plus fréquemment isolée dans la bactériémie à Gram-positif chez l’homme que l’infection soit d’origine nosocomiale ou communautaire. Un ensemble de résultats obtenus in vitro sur cellules primaires endothéliales humaines concordent pour indiquer que la perte d’expression de la cavéoline-1 entraine une augmentation du nombre et du diamètre des tunnels transendothéliaux provoqués par les exotoxines EDIN (A, B et C). Nous chercherons à prouver chez l’animal invalidé pour la cavéoline-1 que lors de la bactériémie à S. aureus produisant l’EDIN-B les animaux montrent des signes d’hyper-susceptibilité à l’infection du fait d’induction de fuites vasculaires. Nous suivrons l’évolution de la bactériémie provoquant un phénotype caractéristique de bactériémie aggravée conduisant à la prostration, immobilité, apathie, des animaux avec hérissement des poils, le tremblement, la cyanose, et perte de poids significative de plus de 20%. Ce suivi des animaux permettra une mise à mort anticipée des souris présentant un phénotype de bactériémie aggravée.

Devenir

Les animaux sont mis à mort à l’issue de chaque procédure.

Remplacement

Une étude de biologie cellulaire conduite sur cellules endothéliale en remplacement d’expériences sur l’animal nous permet d’affirmer que la cavéoline-1 est un gène de susceptibilité à la formation de tunnels transendothéliaux qu’induit l’EDIN. La formation de ces tunnels transendothéliaux corrèle avec l’apparition de fuites vasculaires. Cette approche de remplacement de type biologie cellulaire nous a permis de limiter le nombre de gènes de susceptibilité à l’EDIN à étudier pour ne sélectionner que la cavéoline-1. Le rôle protecteur de la cavéoline-1 dans l’infection bactériémique par une souche de S. aureus produisant l’exotoxine EDIN-B doit être confirmée par une approche in vivo.

Réduction

Pour limiter le nombre d’animaux engagés dans cette étude nous procèderons en étapes successives avec une seule procédure de « suivi d’aggravation de la bactériémie » et nous définirons le nombre d’animaux par groupe grâce à un calcul statistique de puissance. Pour l'étape 1 (établissement de la CFU50) les effectifs ont été calculés sur la base d'expériences précédentes sur d'autres modèles animaux. Pour les étapes 2, 3 et 4 les effectifs ont été calculés sur la base d'une analyse de puissance. Pour approximation, une analyse de puissance d'un test de comparaison de proportions a été réalisée, pour un risque 5%, une puissance de 80%, donnant des effectifs de 30 animaux par groupe. Ceci correspond à une différence entre les groupes variant de 0.13 à 0.35, suffisante pour répondre à la question biologique.

Raffinement

Une surveillance quotidienne des animaux selon la grille d’évaluation de la douleur du stress et inconfort du SBEA, nous permettra de détecter au plus tôt les points limites de souffrance de l’animal. Les points limites seront : des changements de comportement, tels que l'isolement dans le groupe, ainsi que prostration, immobilité, apathie, hérissement des poils, le tremblement, la cyanose, et une perte de poids significative (plus de 20%) seront mis à mort. Dans ces conditions, la mise à mort sera anticipée par dilacération cervicale pour abréger les souffrances de l’animal (technique validée 1A). Des cotons imbibés d’eau et de la nourriture « Dietgel » seront placés dans la cage dans le cas ou certaines souris auraient du mal à se déplacer.

Choix des espèces

Etude comparative de souris transgéniques invalidées dans le gène codant la cavéoline-1 de fond génétique C57BL/6 (B6.Cg-Cav1tm1Mls/J, Jackson via Charles River) versus souris sauvage « littermate ». Les souris C57BL/6 sont sensibles à l’infection intraveineuse par S. aureus (geste technique validé 18A). Nous savons d’expériences précédentes (n° dap160118) que l’injection de doses comprises entre 5x 106 et 5x 108 CFU suivant les souches de S. aureus conduit à un état de prostration, immobilité, apathie avec hérissement des poils, le tremblement, la cyanose, et une perte de poids significative de plus de 20% conduisant à une mise à mort anticipée de 50 % des animaux sur 10 jours. La valeur de CFU50 des souris C57BL/6 à l bactériémie LUG1799 sera déterminée dans l’étape n°1. La souris est l'espèce de choix pour l'étude de l'infection par S. aureus : espèce naturellement colonisée par S. aureus comme l'homme, pathogenèse infectieuse proche de celle de l'homme, espèce permissive à l'infection par S. aureus, littérature abondante. Notre étude portant sur l’infection de type bactériémie sera conduite sur des animaux de 8-16 semaines selon un protocole publié portant sur un modèle de souris invalidées dans le gène codant la cavéoline-1.

200 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des cellules souches humaines leur sont injectées dans les cuisses sous anesthésie pour y former des tératomes, tumeurs servant à vérifier la pluripotence de lignées cellulaires. Le porteur indique que la croissance de ces tumeurs peut gêner la mobilité de l'animal et retient des souris NSG "très immunodéprimées" pour éviter le rejet des cellules humaines. Il présente cette formation de tératomes comme "indispensable" pour démontrer la pluripotence, sans mentionner d'alternative in vitro validée.

Objectifs

Etude comparée des capacités de différenciations des lignées de cellules souches ES humaines et d’iPSC reprogrammées dans le cadre des pathologies leucémiques. Plusieurs lignées cellulaires seront à tester. Plusieurs facteurs plus ou moins aléatoires entrent en jeu : la capacité à obtenir des cellules différenciables en quantité suffisante, l'obtention d'échantillons des patients afin d’en déterminer les profils génétiques, profils qui peuvent comporter 1 ou plusieurs mutations, notre capacité à reproduire ces profil génétiques entièrement ou partiellement etc… Actuellement, nous pouvons établir cette liste non exhaustive des différentes lignées cellulaires à tester : - cellules hES transduites par les lentivirus vides ou codant pour différents shARN (TET2, RUNX1, EZH2, ANKRD26, RAD21, ASXL1..) ainsi que pour différents transgénèse cDNA (GATA1s, ANKRD26, CALRwt, CALRmut, JAK2mut, MPLmut..), - cellules iPSC donneur sain - cellules d’IPSC à partir des patients avec les néoplasmes myéloprolifératifs (mutations de JAK2, CALR, MPL) - cellules d’IPSC à partir des patients présentant des thrombopénies avec ou sans prédisposition aux leucémies (RUNX1, FLNA, ANKRD26, ETV6, NBEAL2) - cellules d’IPSC à partir des patients avec les leucémies myélomonocytaires (mutations dans des molécules de signalisation, des régulateurs épigénétiques, des facteurs d’épissage). - cellules d’IPSC génétiquement modifiées par la technologie CRISPR/CAS9 pour des molécules de signalisation, des régulateurs épigénétiques, des facteurs d’épissage.

Bénéfices attendus

Les cellules IPS et hES peuvent servir à reproduire les mécanismes impliqués dans une pathologie hématopoïétique notamment lorsqu’il est difficile d’obtenir des prélèvements de patients. Par exemple, cela permettrait d’étudier l’embryogénèse humaine. A terme, ces techniques pourraient permettre d’obtenir des cellules hématopoïétiques (globules rouges ou plaquettes) en nombres suffisants et immunitairement compatibles avec les patients. Ceci limiterait les risques de rejet (système HLA, rhésus, etc..), pallierait au manque de cellules sanguines pour les transfusions et limiterait les risques de transmission pathologique entre donneur et receveur (maladie du greffon contre l'hôte).

Procédures

Injection intra musculaire au niveau supérieur de la cuisse arrière (biceps cruraux gauche et droit) une fois, durée: 2 minutes incluant la préhension. - Les injections de tératomes se font sous anesthésie gazeuse (isoflurane 3% pendant l'induction et 2% pour le maintient sous anesthésie). Elles sont réalisées avec des seringues à insuline pour éviter tout problème lors de l'injection du matrigel (désolidarisation aiguille/seringue,...).

Impact sur les animaux

L'injection des cellules en intramusculaire peut éventuellement au maximum entrainer des problèmes modérés de mobilité pour l'animal.

Devenir

Les animaux sont mis à mort pour étude des cellules de tératome.

Remplacement

Les cellules induites in vitro seront caractérisées sur le plan moléculaire afin de vérifier qu’elles n’ont pas d’anomalies génétiques importantes comme duplication ou perte de chromosome, si les mutations qui conduisent aux maladies qu’on étudie sont présentes et si ces cellules ont toujours la capacité à se différencier en tous types cellulaires.Des marqueurs spécifiques qui correspondent à l’état de pluripotence avant toute utilisation chez l'animal seront recherchés par séquençage. La confirmation de l'état pluripotent chez l'animal est indispensable pour pouvoir considérer les cellules comme réellement pluripotentes.

Réduction

Afin de limiter l'utilisation d'animaux l'injection des 5 souris se fera en deux étapes décalées dans le temps : dans un premier temps 3 souris seront injectées. Si il y a obtention de 3 tératomes exploitables dans les 3 mois post-injection impartis, nous n'injecterons pas les 2 autres souris. Dans le cas contraire, nous ajouterons 2 souris au premier lot. Pour ramener un taux d'échec moyen par injection de 40% à 20% par souris (échec ou prise trop lente du greffon), nous injecterons les deux cuisses de chaque souris en même temps.

Raffinement

Les injections se font sous anesthésie gazeuse (isoflurane), dans les 2 biceps cruraux afin d'impacter le moins possible la mobilité de l'animal. Elles sont réalisées avec des seringues à insuline pour éviter tout problème lors de l'injection du matrigel (désolidarisation aiguille/seringue,...), limiter le volume mort dans la seringue et ainsi garantir l'injection de la bonne quantité de cellules. Ces seringues sont pré-montées avec des aiguilles très fines limitant ainsi le traumatisme pour l'animal. Des pooints limite très stricts ont été définis et seront appliqués conernant les éventuels impacts de la croissance des tératomes sur la mobilité.

Choix des espèces

L'induction de tératomes dans les souris immunodéficientes est considérée comme indispensable pour démontrer la pluripotence des lignées cellulaires obtenues in vitro. Ces essais ont été standardisés pour prouver la formation des 3 feuillets germinaux (endoderme, mesoderme et ectoderme) et donc la pluripotence des cellules souches. Chez la souris, cette induction intramusculaire, est pratique, aisée à réaliser, reproductible et quantifiable. Nous avons choisi les souris NSG car elles sont très immunodéprimées et dépourvues de lymphocytes B, T et NK murins, ce qui permet d’éviter le rejet de greffe des cellules humaines à greffer. En raison de leur déficit immunitaire combiné sévère, les souris NSG ont une capacité de rejet des greffes allogéniques ou de tissus xénogéniques réduites, et sont donc d'excellents hôtes pour les cellules et les tissus d’origine humaine. Animaux injectés entre 6 et 10 semaines, pour des raisons de système immunitaire faible.