Résumé non technique d'un projet d'expérimentation animale publié sur ALURES le 04/05/2026
("EC NTS/RA identifier" : NTS-FR-585022)
Objectifs et bénéfices escomptés du projet
Décrire les objectifs du projet.
Les microARN sont de petits régulateurs qui contrôlent l’expression de certains gènes seulement. Comme ils sont très conservés au cours de l’évolution, on pense que leurs gènes cibles le sont aussi. Dans l’ovaire, un microARN est fortement et spécifiquement exprimé. Quand on l’inactive chez la femelle médaka et la femelle zebrafish, on observe le même type de défaut de reproduction : moins d’œufs produits et moins bien fécondés. Chez le médaka, un des gènes responsables de la baisse du nombre d’œufs a déjà été identifié comme cible de ce microARN. Le projet consiste à supprimer, chez le zebrafish, uniquement le site de fixation de ce microARN sur ce gène, pour empêcher leur interaction. Si les femelles mutantes pondent elles aussi moins d’œufs, cela montrera que la cible du microARN est conservée au cours de l’évolution. En parallèle, des analyses d’histologie et de biologie moléculaire permettront de décrire plus finement les conséquences de cette mutation sur la reproduction.
Quels sont les bénéfices susceptibles de découler de ce projet?
Les microARN sont très bien conservés au cours de l’évolution, et on considère généralement que leurs cibles le sont aussi. Pourtant, aucun modèle expérimental n’a encore démontré cette conservation évolutive des cibles de microARN, ni celle des phénotypes associés à leur régulation. Notre microARN d’intérêt ayant un impact similaire sur les phénotypes reproducteurs chez le médaka et le zebrafish, démontrer une conservation évolutive de ces phénotypes et de leurs gènes cibles chez le zebrafish pourrait ouvrir de nouvelles voies pour étudier les défauts de fertilité humaine.
Nuisances prévues
À quelles procédures les animaux seront-ils soumis en règle générale?
Ce projet concerne la création d’une lignées mutante. Pour l’établissement de cette lignée, une procédure de génotypage (section d’un fragment de nageoire caudale) sera réalisée sur les animaux. Cette procédure est très rapide: moins de 2 minutes/animal, temps de l’anesthésie et de la récupération à l’anesthésie du poisson compris. La récolte des oeufs est faite dans l’aquarium, une fois qu’ils sont tombés dans le fond après que le mâle a fécondé les oeufs expulsés par la femelle (il n’y a donc pas manipulation directement sur l’animal pour cette récolte).
Quels sont les effets/effets indésirables prévus sur les animaux et la durée de ces effets?
Les effets attendus de cette modification génétique concerneront principalement le système reproducteur, car nos gènes d’intérêts sont principalement exprimés dans les gamètes. Le gène sera modifié pour empêcher la fixation de son inhibiteur dessus et donc empêcher sa régulation. Nous nous attendons principalement à une réduction du nombre d’œufs pondus. Cependant, chez le médaka, il peut arriver un blocage des pontes lorsque les poissons sont mis en couple (arrêt des pontes par la femelle), caractérisé par une absence d’œufs dans le bassin et un gonflement anormal du ventre de la femelle. Si cet événement venait à se produire chez le zébrafish, un autre male serait d’abord ajouté en première instance, afin de stimuler la femelle. Et si cela ne débloque pas la femelle, et que des modifications de la nage ou de comportement alimentaire venant à apparaitre, une euthanasie sera effectuée. Le génotypage est invasif (prélèvement d’un très petit fragment de nageoire) mais les nuisances engendrées seront minimisées par l’anesthésie. Cette opération peut entrainer une réduction temporaire de l’activité de nage. Les anesthésies pratiquées pour les prélèvements (fragment de nageoire) peuvent entrainer une modification du comportement alimentaire dans la journée.
Justifier le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure.
Ce projet vise à étudier le fonctionnement des capacités de reproduction après l’inactivation d’un gène spécifique. Les animaux sont euthanasiés après deux générations pour l’analyse de leurs organes. De cette même génération 100 poissons hétérozygotes (c’est-à-dire présentant une version du gène altéré et une « normale ») seront réutilisés afin de faire un maintien de la lignée (procédure faisant l’objet d’une autre demande d’autorisation de projet à venir ensuite).
Application de la règle des "3R"
1. Remplacement
L’objet du projet est d’étudier le rôle précis de l’interaction entre miR‑202 et le gène tead3b sur la fonction ovarienne et les phénotypes de reproduction. À ce jour, aucune méthode ne permet de reproduire fidèlement la complexité de la régulation génique et des interactions cellule–cellule sans recourir à l’animal entier. Le poisson‑zèbre a été choisi car il s’agit d’un modèle vertébré bien établi en biologie du développement et de la reproduction, présentant un système de reproduction fonctionnel, une proximité avec le modèle médaka déjà étudié pour miR‑202, et des outils génétiques disponibles et maîtrisés.
2. Réduction
In fine, il s’agit de réaliser des prélèvements post-mortem sur 6×4 individus mutants (animaux homozygotes pour la mutation obtenus en F2) et 6×4 individus de génotype sauvage (WT), soit 48 animaux de 2 génotypes différents. Par expérience un effectif de 200 oeufs est nécessaire pour obtenir seulement quelques individus F0 porteurs de mutations intéressantes. La loi de Mendel implique l’obtention de 50 % d’animaux hétérozygote en F1 lorsque les F0 sont croisés avec des animaux WT. Le croisement entre eux d’individus hétérozygotes (+/-) de la génération F1 produira une génération F2 homozygotes pour la mutation (25% de l’effectif de la génération F2). Nous produirons donc le nombre d’individus strictement nécessaires assurant la réalisation de l’analyse de l’ovaire des 48 animaux.
3. Raffinement
Les animaux sont élevés dans les conditions optimales de l’espèce (température, photopériode, qualité d’eau, densité). Les enrichissements faits de plantes seront aussi installés dans les aquariums, sachant que les animaux sont maintenus en aquariums de 10 litres avec la densité de 30 animaux maximum/aquarium. Les manipulations des animaux comme la manipulation pour la mise en ponte ou la mise en bain anesthésiant seront réalisées le plus rapidement pour limiter le stress dû à la préhension. Le comportement des animaux sera observé quotidiennement. Par ailleurs, si une pathologie infectieuse se déclarait chez un animal (imputable ou non à la mutation) alors ce-dernier sera suivi par le vétérinaire qui supervise le cheptel du laboratoire. C’est lui qui prendra les décisions les plus appropriées pour maintenir le bien- être de l’animal (pouvant conduire éventuellement à l’euthanasie de ce dernier).
Expliquer le choix des espèces et les stades de développement y afférents.
Le poisson-zèbre est particulièrement pertinent pour ce projet car il appartient à la même famille phylogénétique que le médaka, un téléostéen, permettant de tester directement la conservation évolutive de l’interaction entre gène/inhibiteur d’expression et des phénotypes reproducteurs associés. Il présente un système reproducteur bien caractérisé avec des phénotypes de fertilité facilement mesurables (nombre d’œufs pondus, taux de fécondation, dynamique folliculaire). Les outils d’édition génomique y sont parfaitement maîtrisés et efficaces, il présente un fort taux de fécondité (200-300 œufs par ponte) et un développement rapide (maturité sexuelle à 3 mois), permettant une production rapide de lignées mutantes. Son ovaire est accessible à l’analyse histologique et transcriptomique Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (3 mois âge de maturité et 6 mois), l’analyse moléculaire, transcriptomique et histologique des ovaires permettant une étude a deux stades de maturité de développement de l’organe.