Résumé non technique d'un projet d'expérimentation animale publié sur ALURES le 29/07/2025
("EC NTS/RA identifier" : NTS-FR-698894)
Une césarienne de quarante-cinq à soixante minutes est pratiquée sur des femelles à 12,5 jours de gestation pour électroporer un gène dans le cerveau de leurs embryons. 2 547 souris vont être utilisées, 2 196 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger et 351 un niveau modéré. Le porteur indique que les femelles opérées peuvent ressentir une douleur modérée limitant leur mobilité pendant sept à dix jours, et que les souris porteuses de deux copies de la mutation étudiée meurent une dizaine de jours après la naissance. Tous les animaux électroporés sont tués pour analyse de leurs tissus, les femelles césarisées le sont au moment où l’on récupère leurs embryons ou leurs souriceaux, et seuls les mâles reproducteurs peuvent servir à d’autres accouplements.
Objectifs et bénéfices escomptés du projet
Décrire les objectifs du projet.
Le Syndrome d’Atrophie Optique de Bosch-Boonstra-Schaaf (BBSOAS) est une maladie génétique qui affecte le développement du cerveau. Elle est causée par des mutations au niveau d’un gène particulier, qui est essentiel pour la formation et l’organisation des cellules du cerveau. Nous utilisons des souris génétiquement modifiées, qui vont porter des mutations retrouvées chez les patients, pour étudier cette maladie. Nos recherches montrent que certaines mutations provoquent une réduction de la taille d’une partie du cerveau appelée septum qui joue un rôle important dans la motivation, la mémoire ou encore l’apprentissage. En parallèle, les cellules immunitaires du cerveau, appelées microglie, ne semblent pas se déplacer correctement. La microglie est cruciale pour le développement normal du cerveau, aidant à la croissance des cellules nerveuses et à la formation de leurs connexions. Très tôt au cours du développement embryonnaire, des cellules précurseurs se déplacent et se développent pour former le septum. Au même moment, la microglie est recrutée dans le cerveau. Nous pensons que les cellules précurseurs, qui donnent naissance aux cellules du septum, jouent aussi un rôle dans le recrutement précoce de la microglie. Dans notre projet, nous utilisons une technique appelée électroporation in utero, qui permet d’introduire des gènes dans les cellules d’un embryon. Nous ciblerons les cellules précurseurs que nous pourrons suivre grâce à un marqueur fluorescent. Cela nous permettra d’étudier leur développement et de tester des molécules qui pourraient corriger les défauts observés chez les souris atteintes de BBSOAS. Notre objectif est de mieux comprendre les mécanismes de cette maladie et d’identifier des cibles potentielles pour des traitements futurs.
Quels sont les bénéfices susceptibles de découler de ce projet?
L’étude de modèle de souris mimant le BBSOAS a révélé des anomalies dans le cerveau, comme une réduction de la taille d’une partie appelée septum et un problème de recrutement des cellules immunitaires du cerveau. Ces différences dépendent des mutations portées et nous permettent de mieux comprendre leur implication dans le développement du cerveau. À moyen terme, en reliant les symptômes des patients atteints de BBSOAS à la mutation qu’ils portent, nous pourrons améliorer le diagnostic précoce et les soins, ce qui améliorera la qualité de vie des patients. À long terme, nous espérons identifier des cibles pour des traitements qui pourraient contrer les effets négatifs de ces mutations sur le développement du système nerveux.
Nuisances prévues
À quelles procédures les animaux seront-ils soumis en règle générale?
La césarienne est effectuée sur des femelle à 12.5 jours de gestation. Elle dure entre 45 et 60 minutes en fonction du nombre d’embryons portés à électroporer. Le poinçonnage au niveau des oreilles pour identification et génotypage des animaux servant aux accouplements se fera en une seule fois sur animal vigile sous contention et durera moins de 30 secondes par animal. La chirurgie terminale sera réalisée sur animaux ayant reçu une dose léthale d’anesthésique en une seule injection. Cette injection se fera sur animal vigile sous contention et durera moins de 30 secondes.
Quels sont les effets/effets indésirables prévus sur les animaux et la durée de ces effets?
Les femelles gestantes ayant subi une cesarienne pour l’électroporation de leurs embryons pourront présenter une douleur ou une gêne de niveau modéré au niveau de l’incision pouvant réduire leur mobilité. Cette gêne est temporaire et devrait disparaitre après cicatrisation, entre 7 à 10 jours. Les souris porteuses d’une seule copie de nos mutations ne présentent aucun phénotype dommageable. Les souris porteuses de deux copies mutées meurent environ 10 jours après la naissance. Les mutations étudiées n’induisent donc pas effets indésirables avant la naissance, les embryons étant de taille comparable aux sauvages. Pour cette procédure nous prélèverons systématiquement avant la naissance les portées pouvant comporter des embryons présentant deux copies mutées évitant ainsi l’apparition de tout problème de santé sur nos souris. Chaque souris arrivant à terme ne sera porteuse que d’une seule mutation.
Justifier le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure.
L’ensemble des animaux électroporés sera mis à mort pour récupération et analyse des tissus post mortem. Les femelles gestantes ayant subi une césarienne ne pourront être réutilisées dans aucune autre procédure et seront donc mises à mort systématiquement au moment de la récupération de leurs embryons ou au moment de la mise à mort de leurs souriceaux. Les males ayant servi pour les accouplements pourront servir à d’autres accouplements.
Application de la règle des "3R"
1. Remplacement
Nous utilisons des cultures cellulaires in vitro, notamment des organoides de tissus cérébraux afin de remplacer autant que possible les expériences sur animaux vivants. Cependant, étudier le développement du système nerveux requiert un système biologique dynamique intégré tel qu’un organisme vivant. En effet, la microglie ne se forme pas dans le cerveau : elle tire son origine d’une structure extra-embryonnaire et colonise le cerveau en développement grâce au développement parallèle du système sanguin et à la vascularisation. Ainsi des facteurs spatiaux et temporels sont indispensables au bon développement du cerveau et impossibles à recréer à l’identique in vitro. C’est pourquoi le recours à un modèle animal reste indispensable pour comprendre les mécanismes qui mènent aux symptômes variés et complexes observés chez les patients.
2. Réduction
Nous avons estimé avec un outil statistique prédictif le nombre de souris nécessaire par groupe (9 souris) pour obtenir des résultats avec une puissance statistique suffisante (>80%) en se basant sur les analyses de nos précédents résultats. En considérant une perte potentielle de 10% d’animaux, incompressible et classique dans le cadre d’une chirurgie, 10 échantillons de chaque mutation étudiée seront analysés pour chaque lot expérimental. Pour obtenir cette taille d’effectif de 10 échantillons, il nous faudra 4 portées pour chaque stade de développement étudié. Les échantillons seront analysés au fil de l’eau et si le bon effectif d’embryons/souriceaux est obtenu avant d’atteindre le nombre de portées prévues, nous ne génèrerons pas de portée supplémentaire. Enfin, nous utilisons une stratégie de croisement qui permet d’utiliser tous les animaux générés que nous analyserons en parallèle.
3. Raffinement
Les conditions de réalisation de la chirurgie ont été optimisées afin de réduire au maximum la souffrance des animaux ; tapis chauffant avec sonde rectale pour maintien précis de la température, application d’anesthésique local, cage de réveil chauffée, traitements antalgiques et antiinflammatoire (pendant et après la chirurgie). Chaque femelle gestante ayant subi une césarienne sera suivie avec une évaluation de leur état réalisée selon une grille de score qui prévoit des critères d’arrêt précoce et des points limites adaptés. Pour la collecte d’animaux après la naissance, nous prévoyons d’utiliser des stratégies de croisement nous assurant de ne générer aucun animal porteur de deux copies de nos mutations. Chaque souris ne sera porteuse que d’un seul type de mutation. Les animaux électroporés seront tous génotypés post mortem.
Expliquer le choix des espèces et les stades de développement y afférents.
Nous avons choisi la souris en raison de sa grande similarité génétique avec l’homme. De plus, le développement d’un embryon de souris est très similaire à celui d’un embryon humain et les mécanismes neurodeveloppementaux que nous souhaitons étudier sont les mêmes. Enfin, il existe déjà des lignées de souris transgéniques portant des mutations retrouvées chez les patients BBSOAS que nous possédons déjà au laboratoire et qui sont d’excellents modèles validés de cette maladie génétique. Pour cela, nous électroporerons les précurseurs neuronaux à 12,5 jours de gestation embryonnaire qui est un stade précoce où ces cellules précurseurs vont commencer à se différencier et à migrer pour aller former le futur septum. Le pic de recrutement des cellules immunitaires commence au même moment. Pour laisser le temps aux cellules électroporées de migrer et au gène électroporé de s’exprimer, nous analyserons les cerveaux embryonnaires 2, 4 ou 6 jours post électroporation ainsi qu’après la naissance.