Enseignement supérieur et formation professionnelle
Détermination de la biodistribution de nouveaux colorants fluorescents et formation chirurgicale au prélèvement utérin sur modèle porcin en vue du prélèvement utérin sur donneuse en état de mort encéphalique.
- Formation professionnelle
- Recherche appliquée
- Troubles urogénitaux
L'entraînement de chirurgiens au prélèvement d'utérus en vue de greffes humaines conduit à opérer 15 truies sous anesthésie et à les tuer avant tout réveil. Un tranquillisant intramusculaire, un cathéter à chaque oreille et une injection d'anesthésique précèdent l'administration d'un colorant fluorescent dont on veut vérifier qu'il s'élimine par le rein plutôt que par le foie. L'utérus est ensuite prélevé, geste qui ne permet pas de laisser l'animal en vie, avec risques de plaie urologique, de plaie digestive et d'hémorragie aiguë en cours d'intervention. Le porteur affirme qu'aucune simulation ne peut se substituer à cet entraînement, qu'il décrit comme un "pré-requis à l'ouverture de tout nouveau centre de transplantation utérine".
Objectifs
Les colorants spécifiques en mesure de cibler sélectivement une zone d’intérêt chirurgical sont une innovation pour améliorer le traitement des patients. Récemment, une nouvelle formulation de colorant pouvant potentiellement modifier le mode d’élimination des colorants a été mise au point, en passant d’une voie d’élimination par le foie à une voie d’élimination par le rein. Un tel produit permettrait de visualiser en temps réel et par fluorescence le système urinaire du patient en cours de chirurgie et d’éviter de graves complications chirurgicales du système urinaire. Pour les patientes atteintes d’une infertilité utérine absolue, les moyens d’accéder à la parentalité sont limités. La Transplantation Utérine (TU), qui connait un essor mondial depuis la 1ère naissance d’un enfant vivant en bonne santé issu de cette technique en 2014, apparaitrait comme une solution intéressante pour les cas d’absence d’utérus ou dans les cas de cancers. A ce jour plus de 80 transplantations utérines ont été réalisées dans le monde et plus de 40 enfants sont nés. Le greffon est issu d’une donneuse vivante ou d’une donneuse en état de mort encéphalique. En France, 3 greffes utérines ont à ce jour été réalisées en France, à partir de donneuses vivantes, conduisant à 2 naissances vivantes chez la même patiente. Ce projet comporte deux objectifs qui seront menés sur les mêmes animaux à des fins de réduction : -après avoir acquis la technique de greffe utérine, de former des chirurgiens dans les centres de greffes. De plus, la conservation de l’utérus sera étudiée. - vérification de l’élimination rénale d’un colorant.
Bénéfices attendus
L’objectif à terme est de pouvoir offrir la greffe utérine chez les patientes atteintes d’infertilité utérine absolue et améliorer la sécurité des chirurgies vasculaires grace au monitoring urinaire par colorant.
Procédures
Les animaux vont subir une injection de colorant et un prélèvement utérin après injection dans le muscle de tranquillisant, la mise en place d’un cathéter à la veine de chaque oreille et de l’injection intraveineuse d’anesthésique et antidouleur. Ensuite l’utérus sera prélevé sous anesthésie et l’animal sera mis à mort.
Impact sur les animaux
- Malgré l’utilisation d’un prolongateur un stress peut être ressenti par l’animal lors de l’injection d’anesthésique pour les prémédications. - Per-opératoire : risque de plaie urologique (uretère, vessie), plaie vasculaire avec hémorragie aigue, plaie digestive.
Devenir
Mise à mort des 15 porcs car la technique de prélèvement de l’utérus ne permet pas de les laisser en vie.
Remplacement
Cette étude permet de définir la biodistribution d'un nouveau composé dans le corps. Le modèle animal vivant est nécessaire pour définir le trajet du produit après une injection dans la circulation sanguine. L’entrainement chirurgical sur modèle de transplantation utérine sur modèle animal est un pré-requis à l’ouverture de tout nouveau centre de transplantation utérine. En effet, une telle intervention ne peut s’envisager sans un entrainement sur un modèle animal dont l’anatomie pelvienne se rapproche de l’anatomie féminine, en particulier sur le plan de la vascularisation comme c’est le cas sur le modèle porcin. A terme, le prélèvement utérin dans le cadre des prélèvements multi organes va s’intégrer au prélèvement des organes vitaux (cœur, poumons, foie…). Il doit donc être réalisé par des chirurgiens entrainés afin de ne pas mettre en péril ces derniers. Par ailleurs, il n’existe à ce jour aucune technique de simulation envisageable afin d’éviter le recours à l’expérimentation animale.
Réduction
L’utilisation des mêmes animaux pour les 2 objectifs permet de diviser le nombre d’animaux utilisés par deux pour la recherche.
Raffinement
Des points limites généraux et adaptés au modèle permettront l’arrêt de la procédure si nécessaire. La sédation sera effectuée à l’aide d’un prolongateur, ce qui permet de réaliser une injection intra musculaire sans contention. Les porcs sont hébergés sans caillebotis et avec de la sciure et du foin et sont promenés dans un espace plus grand que leur cage pour leur permettre de courir.
Choix des espèces
Le porc est un modèle qui présente les mêmes capacités de métabolisation des composés chimiques que l’Homme et qui est couramment utilisé dans le développement de nouvelles techniques chirurgicales en gynécologie, comme l’illustre le développement de la chirurgie robotique. En effet, la vascularisation pelvienne de la truie est similaire à la vascularisation chez la femme. C’est également pour cette raison que cette espèce a été utilisée à plusieurs reprises afin de construire un modèle pré-clinique de transplantation utérine. Les animaux auront entre 12 et 14 semaines soit environ 40 kg, stade le plus précoce sur lequel le projet peut être réalisé (taille des vaisseaux, taille du bassin).
Rôle d’une protéine régulatrice du cytosquelette dans les plaquettes murines
- Formation professionnelle
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
L'essentiel de ce que subissent ces souris tient à leur élevage et à leur génotypage: 960 souris vont être utilisées, toutes tuées, dans des procédures déclarées d'un niveau de souffrance léger. Le génotypage se fait à l'oreille sur animal vigile, les autres prélèvements sous anesthésie sans réveil. Pour mesurer le temps de saignement, les souris sont laissées vivantes le temps que le sang s'écoule, puis tuées aussitôt après. Une partie des animaux ainsi obtenus est utilisée pour entretenir les compétences du personnel, et certains portent une modification génétique qui les rend sourds, ce que le porteur signale comme une source de stress supplémentaire.
Objectifs
Les plaquettes sanguines sont des petites cellules indispensables à l'hémostase en cas de blessure, elles forment un bouchon qui colmate les vaisseaux et empêche le sang de couler. En cas de problème, leur rôle central dans l’hémostase peut se retourner contre nous : un déficit de plaquettes ou un défaut de fonctionnement peut provoquer soit des saignements excessifs, soit au contraire former des caillots indésirables dans les vaisseaux. Pour bien fonctionner, les plaquettes doivent sans cesse remodeler leur squelette interne, appelé cytosquelette. Ce "squelette" leur permet de changer de forme, de s’activer et de s’agréger au bon moment. Des anomalies dans ce processus perturbent leur efficacité et ont récemment été identifiées chez certains patients, entraînant des troubles de la coagulation. Notre projet vise à mieux comprendre le rôle d’une protéine particulière du cytosquelette, présente dans les plaquettes. Cela nous permettra non seulement d’évaluer son impact sur la coagulation du sang mais aussi, à terme, d'ouvrir la voie à de nouvelles approches thérapeutiques ciblant des maladies hémorragiques ou thrombotiques.
Bénéfices attendus
Ce projet doit permettre une meilleure compréhension des mécanismes impliqués dans la formation et les fonctions plaquettaires, et de trouver de nouvelles cibles thérapeutiques pour les maladies hémorragiques et thrombotiques.
Procédures
Toutes les procédures expérimentales longues ou invasives seront réalisées sous anesthésie générale. Les animaux seront euthanasiés à la fin de ces procédures, sans retour préalable à la conscience. Certaines interventions de courte durée (10 à 60 secondes maximum), comme le génotypage à l’oreille, unique, seront réalisées sous souris vigile afin de limiter le recours à l’anesthésie et réduire le stress.
Impact sur les animaux
Lors de la procédure d’élevage, un stress peut survenir lors de la contention des animaux pour le tatouage et le génotypage. Dans le cas des animaux porteurs de modifications génétiques entraînant une perte auditive, cette altération sensorielle peut également générer un stress supplémentaire.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de leurs procédures expérimentales. Dans le cadre de certaines interventions, comme la prise de sang pour la NFS, les animaux sont laissés vivants pendant le temps nécessaire à la réalisation du temps de saignement.L’euthanasie est effectuée immédiatement après ce temps de saignement. Les tissus et organes seront ensuite prélevés pour analyses conformément aux objectifs expérimentaux.
Remplacement
Dans ce projet, une partie de notre étude repose sur de la culture cellulaire. Ces modèles cellulaires sont essentiels pour orienter nos recherches mais ces lignées ne sont pas des plaquettes. En effet, les plaquettes sont des cellules qui ne peuvent pas être mise en culture car elle ne possèdent pas de noyau et peuvent donc pas se multiplier. Par ailleurs, hors d'un organisme vivant, leur survie est limitée à quelques heures. Il est donc nécessaire de disposer de plaquettes isolées à partir de sang fraichement collecté. Nous avons alors généré un modèle de souris pour comprendre le rôle d'une protéine multifonctionelle dans les plaquettes. Ces souris permettront d'étudier les plaquettes sanguines dans un organismes vivant, d'évaluer les interactions entre toutes les composants du sang et d'évaluer les risques de saignement ou d'occlusion thrombotique des vaisseaux.
Réduction
Nous avons pu définir au plus juste le nombre sans compromettre les résultats (qui resteront statistiquement analysables) en nous basant sur notre expérience personnelle, les données de la littérature et par une validation de ce nombre par un logiciel de statistiques. Enfin, une partie des animaux générés seront utilisés dans un objectif de formation et maintien des compétences du personnel.
Raffinement
Les manipulations seront réalisées dans le souci constant de réduire au maximun l'inconfort et la souffrance des animaux (points limites surveillés, anesthésie). Les animaux seront observés quotidiennement afin de s'assurer de leur bien-être. De plus, le personnel impliqué, formé, dans ce projet est qualifié sur le plan technique et est formé en continu sur les pratiques d'expérimentation animale. Les souris sont anesthésiées dont l'effet perdure tout au long des procédures expérimentales.
Choix des espèces
Le choix de la souris se justifie par des raisons d'ordres scientifiques, pratiques et éthiques. Sa génétique bien connue facilite la création de modèles transgéniques. Des anticorps ont été développés permettant des analyses de qualité, avec des anticorps dirigés contre des antigènes de la plaquette de souris. Par ailleurs, notre structure utilise principalement des souris ce qui offre de nombreux avantages en termes d'animalerie, d'élevage, d'expertises techniques pour l'expérimentation animale, mais également un atout majeur dans le suivi microbiologique et vétérinaire des animaux. La souris est l'animal de laboratoire le plus utilisé en hémostase par la communauté scientifique internationale ce qui permet de comparer les résultats obtenus. Enfin la méthodologie envisagée dans ce projet est adaptée au modèle murin et nous avons acquis au cours des années une expertise notable et de bonnes pratiques expérimentales avec cette espèce. Les souris aussi bien mâles que femelles, seront agées entre 4 semaines et 2 ans.
Formation aux techniques expérimentales chez le rat, la souris et le lapin
- Formation professionnelle
Rats : 696
Lapins : 120
696 rats, 678 souris et 120 lapins reçoivent des injections, des perfusions et jusqu'à une vingtaine d'interventions par semaine et par animal, gestes exécutés par des personnes en cours d'apprentissage qui ne les maîtrisent pas encore. Ces 1 494 animaux subissent des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, réutilisés d'une session à l'autre pendant douze mois au plus avant d'être tués, parfois pour l'entraînement aux techniques de mise à mort. Le produit administré est une solution saline: rien n'est testé ici, il s'agit d'entretenir le geste technique d'une trentaine de techniciens. Le porteur mentionne des interventions invasives sous sédation ou anesthésie sans dire lesquelles, et prévoit la commande de femelles gestantes pour s'exercer aux mises bas.
Objectifs
Le but de ce projet est de permettre la formation du personnel technique (techniciens et animaliers) d’une ou plusieurs techniques sur le rat, la souris ou le lapin. On estime que l’on réalisera 8 sessions de formation par an, chacune ayant recours à l’utilisation d’un maximum de 15 rats, 15 souris ou 3 lapins, afin de maintenir les compétences techniques d’une trentaine de techniciens. Les animaux utilisés peuvent provenir : - d'animaux réutilisés provenant d’études précliniques (i.e. surnuméraires ou animaux non euthanasiés en fin de projet), ou peuvent être des animaux déjà inclus sur étude si cela n’impacte pas la qualité scientifique de l’étude en question. - dans de rare cas, d’une commande spécifique (ex : formation nécessitant des rongeurs gestants).
Bénéfices attendus
La formation du personnel est nécessaire et requise par la règlementation pour toute personne travaillant avec des animaux de laboratoire afin qu’elles disposent de compétences validées et régulièrement actualisées. En accord avec la Convention européenne sur la protection des animaux vertébrés utilisés à des fins expérimentales ou à d’autres fins scientifiques (STE no. 123), nous mettons en œuvre toutes les mesures nécessaires pour affiner nos pratiques, maintenir les compétences de notre personnel et garantir un niveau élevé de qualité et de bien‑être animal. Toutes ces techniques sont décrites dans des procédures spécifiques internes revues et validées par la Structure pour le Bien-Etre Animal.
Procédures
En fonction des tâches de formation à réaliser, les animaux peuvent être traités par différentes voies (principalement orale mais aussi par injection intramusculaire, voies sous- cutanée ou intraveineuse, intra-oculaires, etc.) et soumis à des techniques de prélèvement (prélèvement sanguin, prélèvement de larmes, etc..). Le composé administré sera une solution saline. La durée de l’administration est généralement rapide (quelques secondes à quelques minutes) et peut atteindre 1 heure maximum chez le rongeur et 30 minutes chez le lapin, dans le cas de formation à la perfusion. Les prélèvements sanguins (sur animal vigile placé dans un tube de contention ou sous anesthésie) sont réalisés à une fréquence et aux volumes conformes aux recommandations éthiques en vigueur. La manipulation des animaux durant les interventions est généralement inférieure à 1 heure par animal par jour (en considérant, par exemple, une journée avec 1 administration + 3 prélèvements sanguins soit environ 30 min). Jusqu’à une vingtaine d’interventions peuvent être réalisées par animal et par semaine en fonction des recommandations éthiques (en considérant, par exemple, une administration quotidienne et un maximum de 12 prélèvements sanguins dans la semaine chez le lapin, 10 chez le rat et 6 chez la souris). Une mise à jeun pendant une durée maximale de 16h pour recueil d’urine/fécès est également possible (avec accès à l’eau). Le cumul de la douleur relative à la ré-utilisation des animaux sera pris en compte Dans certaines situations, les animaux peuvent être soumis à un hébergement individuel dans leur cage (de façon permanente en cas d’agressivité envers ses congénères, ou pendant quelques jours en cas de soins individuels par exemple).
Impact sur les animaux
Les nuisances et effets indésirables attendus correspondent : - à l’inconfort, au stress et/ou à la douleur transitoires liés aux procédures : prélèvements, administration répétée, contention, mise à jeun éventuelle (16h maximum), intervention invasive sous sédation/anesthésie. - à l’inconfort, au stress et/ou à la douleur transitoires liés au geste expérimental compte tenu du fait qu’il sera réalisé par des personnes en formation, ne maitrisant pas encore totalement le geste. - à l’hébergement individuel lorsqu’il ne peut pas être évité (ex : souris mâle arrivée ne pouvant pas être remis en hébergement collectif sous peine de causer des agressions et blessures à ses congénères).
Devenir
Chaque fois que cela sera envisageable, les animaux seront réutilisés dans le cadre de ce même projet, avant mise à mort pour entrainement aux techniques d’euthanasie ou réalisation de bibliothèques de tissus dans un maximum de 12 mois après sa première réutilisation.
Remplacement
La formation du personnel à des techniques d’expérimentation animale ne peut pas être remplacé intégralement par des méthodes alternatives dans la mesure où le personnel doit pouvoir s’entrainer en conditions réelles avant de pouvoir intervenir sur étude réglementaire au risque de ne pas maitriser son geste au niveau requis et causer potentiellement douleur/stress une fois au contact de l’animal tout en compromettant la qualité des données d’étude. Afin de remplacer une partie des animaux utilisés pouvant être utilisés à des fins de formations, on pourra avoir recours au visionnage de vidéos, consultation d’articles, échanges avec scientifiques, utilisation de mannequins ou test sur animaux post-mortem.
Réduction
Le nombre d'animaux utilisés sera le plus petit possible tout en ayant la certitude que le personnel a obtenu un degré d'expertise suffisant (déterminée par le formateur). On aura recours en priorité à la réutilisation d’animaux provenant de surnuméraires de projets annexes. De même, l’utilisation préalable de vidéos, consultation d’articles, échanges avec scientifiques, utilisation de mannequins ou test sur animaux post-mortem pourra permettre de réduire le nombre d’animaux utilisés pour atteindre le niveau de maitrise attendu. Les vidéos utilisées pourront provenir d’une bibliothèque de vidéos de formation déjà existantes, ou pourront être enregistrées au cours des formations pour utilisation lors de formations ultérieures du personnel.
Raffinement
L'état général des animaux est surveillé quotidiennement. Les paramètres suivants sont contrôlés régulièrement afin d’évaluer l’état de santé des animaux : poids corporel et consommation de nourriture, température corporelle, signes cliniques (liste non exhaustive). Toute anomalie est signalée au vétérinaire. Il lui incombe la décision d'apporter des soins ou d’euthanasier les animaux au vu des signes observés. Les animaux sont hébergés en groupe avec enrichissement (3 enrichissements minimum par hébergement). Pour les rats/souris, les enrichissements disponibles comprennent (liste non exhaustive) : tunnels (plastique ou carton), jouets en bois à ronger (buchettes, boules), accessoires de nidification (coton compressé, papier compressé). Pour les lapins, de la musique leur sera diffusée à faible volume pour masquer les bruits de fond de fonctionnement du laboratoire et ainsi réduire le stress lié au bruit. Ils disposent d’une plaque de repos, d’au moins un palet de foin compressé et d’un jouet. Les lapins sont également habitués à la manipulation et au contact humain par le biais de caresses quotidiennes dès leur arrivée au laboratoire. Si l’hébergement individuel est requis; comme par exemple lorsqu'il existe des incompatibilités connues (comme dans le cas des lapins mâles ou des souris mâles entre eux), ou bien pour raison sanitaire, ce choix devra être dûment argumenté et un enrichissement supplémentaire pourra être apporté. Des contacts visuels, auditifs et olfactifs seront maintenus avec les autres animaux.
Choix des espèces
Pour les rongeurs, les animaux peuvent avoir entre 6 semaines et 15 mois. Pour les lapins, les animaux peuvent être entre 3 mois d'âge et 16 mois. Après réception en étude à l’âge de 6-8 semaines (rats/souris) ou 10-14 semaines (lapins), les animaux non utilisés en étude sont réutilisés à des fins de formation pendant une durée maximale de 12 mois avant euthanasie. Dans de rares cas, il est également possible d'avoir recours à des femelles gestantes (rongeurs uniquement, commande spécifique en fonction du besoin), accouplés par l’éleveur et mettant bas au laboratoire afin de réaliser des phases d'entrainement sur les mises bas, la sélection et le traitement des portées, qui nécessitent une technicité différente de celle nécessaire aux expérimentations sur les animaux âgés de 6 semaines ou plus. Après utilisation, les nouveau-nés seront conservés dans la colonie de stock.
Identification des séquences régulatrices dans la régénération chez le poisson zèbre
- Formation professionnelle
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
12 720 poissons zèbres vont être utilisés, tous tués à l'issue, dont 7 020 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Un infarctus est provoqué chirurgicalement sur le cœur, suivi de biopsies et de six prises d'image par animal sous anesthésie, le porteur annonçant une baisse d'activité ou d'appétit après l'opération. L'espoir de stratégies pour régénérer les tissus humains est renvoyé au long terme, l'objet immédiat étant d'identifier les séquences d'ADN qui activent la régénération du cœur du poisson, une partie des animaux étant aussi utilisée pour la formation de personnels. Le porteur affirme que les cultures de cellules et les modèles informatiques ne reproduisent pas ce qui se passe dans un cœur vivant, et justifie l'effectif par des stratégies d'accouplement calculées d'après des expériences antérieures, sans donner de chiffre.
Objectifs
L’objectif de ce projet est de mieux comprendre comment certains tissus peuvent se régénérer après une lésion chez le poisson zèbre. Ce petit poisson est utilisé comme modèle scientifique car il possède une capacité naturelle à reconstruire des organes endommagés, comme la nageoire ou le cœur. Pour atteindre cet objectif, les approches suivantes seront adaptées : 1. Identifier les séquences d'ADN responsables de l'activation des programmes de régénération cardiaque. 2. Évaluer l’impact de l’inhibition pharmacologique ou de la délétion génique de ces éléments sur la régénération cardiaque. En étudiant ces mécanismes, nous espérons identifier des processus biologiques communs qui pourraient, à long terme, aider la recherche médicale à développer de nouvelles stratégies pour favoriser la régénération des tissus chez l’être humain, par exemple après un accident ou une maladie.
Bénéfices attendus
Le poisson zèbre permet d’étudier comment le cœur peut se réparer après un infarctus. En comprenant comment les gènes s’activent pour régénérer le cœur chez le poisson, nous pourrons mieux comprendre pourquoi le cœur humain a plus de difficultés à se réparer. Ces connaissances pourraient ensuite aider à développer de nouvelles stratégies pour améliorer la récupération du cœur après une attaque cardiaque.
Procédures
Biopsie: réalisée une seule fois sous anesthésie générale et analgésie, durée
Impact sur les animaux
LLes effets indésirables prévus sur les animaux : • Biopsie: sous anesthésie générale et analgésique peut induire une gêne très brève de quelques secondes. • Chirurgie cardiaque : sous anesthésie générale et analgésique peut induire une douleur modérée de courte durée après l’infarctus expérimental, pouvant s’accompagner d’une baisse d’activité ou d’appétit. •Imagerie : réalisée sur animaux anesthésiés, 6 photos par animal, chaque photo prenant environ 1 minute.
Devenir
L'ensemble des poissons de ce projet seront mis à mort à la fin de ce projet car l’ensemble des analyses auront été́ réalisées soit au court des procédures soit seront réalisées en post mortem.
Remplacement
Dans ce projet, l'utilisation d'animaux est nécessaire pour comprendre comment le cœur peut se réparer naturellement après une blessure. Ce phénomène de régénération implique des mécanismes très complexes qui concernent l’ensemble du corps, comme la circulation du sang, les réactions du système immunitaire ou encore les échanges entre différents types de tissus. Aujourd’hui, les expériences sur des cellules cultivées en laboratoire ou des modèles informatiques ne permettent pas de reproduire avec précision ce qui se passe dans un cœur vivant. Le poisson zèbre, un petit poisson dont le cœur a une grande capacité naturelle de régénération, est utilisé dans ce projet. Il constitue un modèle reconnu et précieux pour mieux comprendre les mécanismes qui pourraient un jour aider à réparer un cœur humain malade.
Réduction
Les stratégies d’accouplements ont été calculées selon les expériences antérieures pour générer un nombre suffisant d’animaux pour mener à bien ce projet et effectuer les tests statistiques nécessaires à l'analyses des données.
Raffinement
Les poissons utilisés dans ce projet sont élevés dans de bonnes conditions (eau propre, température adaptée, éclairage approprié) et leur comportement est observé chaque jour. Toutes les interventions sont réalisées avec le plus grand soin et sous anesthésie, avec des traitements pour limiter la douleur. Des points limites stricts et spécifiques au projet sont appliqués afin de réduire au maximum tout inconfort pour les animaux. Après chaque intervention, les poissons sont surveillés et, si leur état se dégrade, une mise à mort sans douleur est pratiquée immédiatement.
Choix des espèces
Le poisson zèbre (zebrafish) est un animal largement utilisé en recherche biomédicale car il partage environ 70 % de son génome avec l’être humain, et son système cardiovasculaire fonctionne de manière très similaire au nôtre. Pendant le développement, ses embryons se forment à l’extérieur de la mère et sont transparents, ce qui permet d’observer en détail la formation du cœur et des vaisseaux, sans chirurgie ni extraction. Notre étude se fera chez l’adulte, ce poisson possède une capacité remarquable de régénération : il peut réparer entièrement une partie de son cœur après une blessure. Cette aptitude exceptionnelle en fait un modèle idéal pour étudier la régénération des organes et mieux comprendre les mécanismes qui pourraient un jour inspirer la médecine humaine.
Travaux pratiques d’une formation pour être concepteur de projet ou applicateur de procédures expérimentales, modèles rat et souris
- Formation professionnelle
Rats : 150
Aucun de ces animaux n'est tué à l'issue : les 150 souris et 150 rats seront réutilisés dans d'autres travaux pratiques universitaires, au motif qu'ils n'auront été soumis qu'à des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Ils sont manipulés par des stagiaires en formation de concepteur ou d'applicateur, qui apprennent la préhension, la contention, les administrations, dont une injection intra-péritonéale de sérum physiologique, les prélèvements et des tests de comportement. Le porteur annonce ces tests éthologiques sans préciser lesquels, et écarte tout antalgique en le jugeant non pertinent. Il affirme qu'aucune méthode de substitution ne restituerait fidèlement les comportements et réactions des animaux non-humains, et qu'un rat et une souris pour deux stagiaires suffisent désormais.
Objectifs
Les personnels des établissements utilisateurs d'animaux à des fins scientifiques (Concepteurs, applicateurs et soigneurs) ont pour obligation d'être compétents en expérimentation animale. Cette compétence repose pour les concepteurs sur un niveau de formation initiale, une formation spécialisée et une formation continue. Pour les applicateurs, la compétence repose sur une formation spécialisée et une formation continue. Les concepteurs ont pour fonction de concevoir les procédures expérimentales et les projets et les applicateurs ont pour fonction d'appliquer les procédures expérimentales aux animaux. Le projet de travaux pratiques présenté ici comprend la partie pratique des deux programmes de formations spécialisées "concepteur" et "applicateur". La partie théorique de la formation, étant réalisée sous forme de conférences, il nous parait adapté de former ici les stagiaires sur les techniques de base en expérimentation animale (préhension, contention, administrations, prélèvements, études de comportement) chez la souris (espèce animale la plus utilisée en France en recherche) et chez le rat (qui est un modèle utilisé dans les laboratoires locaux).
Bénéfices attendus
Pour les concepteurs, les bénéfices attendus sont l'apport d'une compétence pratique au sujet de la préhension, de la contention, et certaines techniques d'administration et de prélèvements chez les souris et les rats. Pour les applicateurs, en plus de la compétence pré-citée pour les concepteurs, il s'agit de se familiariser à des pratiques simples (dans le sens faciles à mettre en œuvre) mais néanmoins informatives d'étude du comportement animal permettant un suivi du bien-être animal et la mise en oeuvre de procédures expérimentales faiblement invasives. A court terme les bénéfices attendus sont la prise en compte du respect de l'animal lors de la pratique expérimentale : travail dans une ambiance calme, élimination de sources/stimulations perturbantes pour les animaux (ondes/smartphones éteints ; odeur/limitation de parfum) , habituation des animaux aux manipulateurs avant manipulation.
Procédures
Pour le TP (=travaux pratique) sur les gestes de base, les actes les plus contraignants sont l'administration de sérum physiologique (piqûre d'aiguille). Ce sont dans les deux cas des gestes brefs qui durent quelques secondes. Chaque souris sera soumise à deux administrations de sérum physiologique. Chaque rat sera soumis à deux administrations de sérum physiologique. Pour le TP sur le comportement, les actes expérimentaux réalisés sur les animaux ne sont pas douloureux. Les animaux sont tout au plus stressés quelques minutes du fait d'un environnement nouveau et ensuite les tests comportementaux font appel à la curiosité naturelle des animaux. Le test expérimental pour les rats et les quatre tests expérimentaux pour les souris durent entre 3 et 25 min chacun. Les mêmes souris seront impliquées pour les tests successivement avec une période de repos de 5 minutes ou d'une heure entre chaque. Les deux TP sont des procédures expérimentales de classe légère.
Impact sur les animaux
Les nuisances les plus importantes seront de gravité légère : stress léger lié à la préhension et à la contention, douleur, gêne fugace lié à une administration (nuisance équivalente à une piqûre d'aiguille) ou de courtes périodes de séparation sociale et d'exposition à des éléments nouveaux dans le cadre des tests éthologiques. Les animaux (souris et rats) vont être manipulés en réduisant au maximum les nuisances. Nous allons apprendre aux stagiaires les bonnes pratiques d'approche, de gestes en matière de préhension et de contention (qui ne sont pas invasifs).
Devenir
Les animaux seront réutilisés car ils auront été impliqués dans des procédures légères uniquement.
Remplacement
Pour ce projet, il n'existe pas de méthodes de substitution qui pourrait restituer fidèlement les comportements et réactions des animaux qui peuvent être complexes. Les gestes de contention/préhension et autres étant spécifiques de l'espèce rat ou souris, ils doivent être acquis chez l'espèce cible. Toutefois nous mettons en place une approche progressive, et ceci pour chaque espèce Rats et souris : - en tout premier lieu des outils vidéos en provenance d'une source européenne reconnue de tous et d'un intérêt indéniable seront utilisés, car ils présentent des méthodes modernes, de préhension/contention par exemple, - les vidéos sont ensuite discutées et les stagiaires sont interrogés sur ce qui leur parait important, - les stagiaires passent alors à la pratique et ont le temps d'apprendre les gestes au sein de leur petit groupe (4-5 stagiaires par encadrant). Les gestes ou approches à acquérir commencent par l'analyse de vidéos qui ne suffit pas, l'animal devant être vivant pour évaluer les critères de réussite. Si l'approche par analyse vidéo permet une première expérience des méthodes pour le stagiaire, les gestes de base doivent être réalisés pour évaluer leur apprentissage.
Réduction
Nous sommes attentifs à réduire au maximum le nombre d'animaux. Par le passé, nous avons utilisé un rat et une souris par stagiaire, mais à la dernière session de formation, nous avons testé une réduction de ce nombre à un rat et une souris pour deux stagiaires, nombre d'animaux qui a permis d'atteindre également l'objectif pédagogique visé. Par ailleurs, les animaux impliqués dans le TP comportement sont les mêmes que ceux utilisés pour le TP gestes de base, permettant de mutualiser l'utilisation d'animaux. Les animaux ne seront pas euthanasiés et seront réutilisés pour d'autres travaux pratiques universitaires (qui feront le cas échéant l'objet de demandes d'autorisation de projet indépendantes de celle-ci).
Raffinement
Les animaux impliqués dans les procédures expérimentales de ce projet sont hébergés dans la zone d'hébergement pendant plusieurs semaines avant les TP, avec un enrichissement social et physique (acclimatation). Les procédures menées sont tout au plus de classe légère ; le geste le plus contraignant pour les animaux est une administration intra-péritonéale de sérum physiologique. Les tests de comportement sont tout au plus un peu stressants pour les animaux. Dans ces conditions, aucune administration d'antalgique ne sera réalisée car elle n'est pas pertinente. Les autres gestes comme la préhension et la contention ne sont pas douloureux. Un temps est utilisé pour que les animaux se familiarisent aux stagiaires. Une attention particulière sera portée aux animaux pour déceler l'atteinte de points limites, qui sont malgré tout très peu probables.
Choix des espèces
Les espèces qui seront utilisées dans ce projet correspondent aux espèces cibles, c'est à dire aux espèces concernées par le module complémentaire de la formation règlementaire en expérimentation animale. Les stagiaires s'inscrivent à ce module pour ces deux espèces car ce sont les animaux avec lesquels les stagiaires vont travailler dans leurs futures activités de recherche. Les animaux seront des animaux adultes de huit semaines au moins. Nous utilisons ces stades car les animaux adultes correspondent aux animaux utilisés classiquement pour les tests de comportement prévus. Ce sont par ailleurs des stades où les animaux sont facilement manipulables pour les travaux pratiques.
Etude du rôle de l’intestin grêle dans les altérations métaboliques chez le porc.
- Formation professionnelle
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
Un cathéter est posé chirurgicalement dans la veine jugulaire de chaque animal, qui subit ensuite cinq prélèvements de l'intestin grêle sous endoscopie et un régime riche en graisses et en sucres, avec ou sans émulsifiants. 70 cochons vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, l'hébergement en loges individuelles étant reconnu comme une source de stress. L'objectif déclaré est de suivre l'intestin grêle du mini-porc Yucatan pendant l'installation de l'obésité, puis pendant une perte de poids obtenue par un régime de type méditerranéen. Le porteur annonce une prise de poids, une dyslipidémie, un contrôle glycémique perturbé et une hypertension chez les animaux nourris au régime obésogène, en précisant que ces atteintes "font partie des objectifs du projet".
Objectifs
La prévalence actuelle de l’obésité et du surpoids, qui touchent plus de 40% de la population mondiale, et des pathologies associées comme le diabète de type 2, nécessite d’accentuer les efforts de recherche pour comprendre les liens entre alimentation et santé. La composition de l’aliment, notamment riche en lipides et en sucres mais aussi la présence d’émulsifiants dans l’alimentation sont des facteurs clés du développement de l’obésité. De nombreux travaux ont montré le rôle joué par le microbiote intestinal et l’intestin distal dans le développement du surpoids et de l’obésité. Alors que la plupart des travaux se sont focalisés sur le microbiote fécal chez l’Homme, des travaux récents suggèrent que le microbiote du petit intestin pourrait aussi jouer un rôle. Cependant, les données actuelles chez l’Homme ne permettent pas de bien comprendre ce rôle lors de l’installation de l’obésité ou au contraire lors d’une prise en charge diététique pour perdre du poids. Or, ces connaissances sont nécessaires pour pouvoir proposer des stratégies pertinentes pour prévenir ou atténuer les conséquences du surpoids et de l’obésité L’objectif de ce projet est de suivre l’évolution de différents paramètres au niveau du petit intestin chez le mini-porc Yucatan rendu obèse via la consommation d’un régime hyperénergétique riche en lipides et en sucres et contenant ou non des émulsifiants puis lors d’une perte de poids induite par la réduction des apports énergétiques et un régime de type Méditerranéen. Ce régime est en effet connu chez l’Homme pour ses effets protecteurs sur la santé.
Bénéfices attendus
Ce projet ayant recours à l’expérimentation animale est complémentaire d’une étude clinique menée chez l’Homme. Ce projet mené chez le mini-porc apportera des connaissances plus fines sur la cinétique des interactions entre le microbiote du petit intestin et les modifications du métabolisme et du comportement alimentaire dans la mise en place de l’obésité et la perte de poids. Nos analyses permettront d’identifier des espèces bactériennes et/ou des métabolites bactériens d’intérêt et leurs liens avec la composition de l’aliment. Ces données pourront être comparées aux données obtenues chez l’Homme. Ces connaissances seront utiles pour, à terme, proposer des régimes alimentaires préservant la santé chez l’homme via leur action sur la composition ou le métabolisme bactériens et pour développer des probiotiques à partir des souches bactériennes identifiées.
Procédures
Endoscopie sous anesthésie générale pour prélèvement de biopsies mucosales : 1 endoscopie sur 20 porcs conventionnels et 5 endoscopies sur une période de 16 semaines sur 50 mini-porcs Pose chirurgicale d’un cathéter jugulaire sous anesthésie générale : 50 mini-porcs, 1 seule fois, possibilité de répéter si problème de fonctionnement du cathéter Tests de comportement alimentaire : validation du dispositif sur 20 porcs conventionnels, tests de préférence et motivation, 50 mini-porcs, répété 5 fois en 16 semaines Tests de tolérance au glucose nécessitant le prélèvement de 40 mL de sang en 2h, 50 mini-porcs, répété 5 fois en 16 semaines Hébergement en cages individuelles : 50 mini-porcs pendant 18 semaines et 20 porcs conventionnels pendant 2 semaines Mise à jeun nocturne de 18h à 8h : 50 mini-porcs pendant 18 semaines et 20 porcs conventionnels pendant 2 semaines
Impact sur les animaux
Un développement de perturbations du métabolisme avec des signes cliniques tels qu’une augmentation du poids, un profil lipidique plasmatique perturbé (triglycéridémie, cholestérolémie, LDL-cholestérol augmentés), une perturbation du contrôle glycémique lors d’une hyperglycémie provoquée et une hypertension, est attendu chez les animaux recevant le régime riche en lipides et en sucres additionné ou non d’émulsifiant mais font partie des objectifs du projet. Une perte de poids pour les groupes recevant un régime moins riche en énergie que le régime obésogène est attendue mais fait partie des objectifs du projet. La chirurgie pour la pose de cathéter peut engendrer de l’inconfort transitoire au réveil et des douleurs post-opératoires. La répétition des prélèvements sous endoscopie (5 prélèvements par animal) peut entrainer de l’inconfort transitoire au réveil. L’hébergement en loges individuelles peut engendrer du stress.
Devenir
Les animaux utilisés en procédure 1 seront mis à mort. Il s’agit d’animaux dit de réforme qui ne seraient pas rentrés dans la chaine alimentaire. Cette mise à mort sera suivie de divers prélèvements afin de constituer une banque de tissus. Les animaux de la procédure 2 seront mis à mort afin de pouvoir prélever divers organes et tissus et analyser les effets des différents traitements sur des paramètres physiologiques et métaboliques.
Remplacement
L’objectif de ce projet est de mettre en relation des données issues de la composition de l’aliment, du microbiote intestinal et de l’intestin en regard de perturbations du métabolisme et du comportement alimentaire. Ces derniers font intervenir de nombreux organes (tissu adipeux, foie, cerveau, muscle). Le manque de connaissances actuel et la complexité de ces interactions rend difficile leur modélisation in vitro ou in silico, justifiant le recours à l’animal pour les étudier..
Réduction
Le projet prévoit l’utilisation de 20 porcs conventionnels et 50 mini-porcs. Le nombre de porcs conventionnels utilisés permettra d’observer l’ensemble des comportements alimentaires individuels (4 profils type sont décrits chez le porc) et de travailler sur des animaux de poids différents. Un nombre de minimal de 8 mini-porcs par groupe a été calculé sur la base de nos expériences précédentes sur le développement de l'obésité chez ce modèle animal. Afin de s’affranchir de difficultés liées notamment au fonctionnement du cathéter jugulaire, un nombre de 10 mini-porcs par groupe a été décidé. Le choix de procéder à des prélèvements duodéno-jéjunaux sous endoscopie permet d’éviter de mettre à mort des animaux à chaque point de la cinétique choisie et donc de réduire le nombre d’animaux.
Raffinement
Toutes les expériences seront réalisées par du personnel formé et expérimenté. La surface des loges et les interactions visuelles, tactiles et auditives entre animaux permettront aux mini-porcs d’avoir des interactions avec les congénères. Des jouets (chaine, ballon) permettront d’enrichir le milieu et aux animaux d’avoir de l’activité physique. Ils seront régulièrement remplacés pour limiter l’ennui. La pose d’un cathéter jugulaire à demeure permettra d’éviter les prises de sang répétées lors de certains tests. La procédure chirurgicale de pose de ce cathéter sera faite sous anesthésie générale avec mise en place d’une analgésie per-opératoire. La procédure de prélèvements sous endoscopie sera réalisée sous anesthésie et analgésie pour éviter stress et inconfort. Une pesée hebdomadaire des animaux et une surveillance quotidienne de leur état clinique et de leur comportement ainsi que la mesure de leur consommation alimentaire quotidienne sera mise en place afin de détecter tout signe de mal-être ou inconfort. Des points limites ont été définis et seront scrupuleusement suivis pendant les expérimentations.
Choix des espèces
Le mini-porc est un modèle pertinent pour l’étude de la mise en place de l’obésité car il reproduit les signes cliniques du syndrome métabolique (augmentation de poids et d’adiposité, notamment viscérale, perturbations du bilan lipidique plasmatique, augmentation de la pression artérielle, perte de la sensibilité à l’insuline) lorsqu’il consomme de façon chronique un régime riche en lipides et en sucres. Des altérations du microbiote intestinal et de la fonction de barrière intestinale sont aussi décrites comme chez l’Homme. L’utilisation de porcs conventionnels pour une partie du projet est liée à des raisons de disponibilité au sein de l’établissement utilisateur. L’anatomie oro-gastrique des deux races est identique. Nous utiliserons des porcs conventionnels de poids corporels variés (entre 45 et 90 kg). Les porcs conventionnels utilisés seront des animaux de réforme de 3 à 6 mois d’âge afin que la gamme de poids soit proche de celle des mini-porcs utilisés dans le reste du projet. Les mini-porcs utilisés seront de jeunes adultes (12 à 14 mois d’âge) afin de travailler sur des animaux avec un microbiote stable au début de l’expérience et s’affranchir d’une variabilité liée au vieillissement.
Formation tutorée à l’imagerie intravitale chez la souris : de la chirurgie à l’imagerie haute-résolution
- Formation professionnelle
Une chambre dorsale est implantée chirurgicalement dans le dos de chaque souris, qui reçoit ensuite des injections de cellules tumorales et un agent de contraste avant des séances de microscopie confocale sous anesthésie générale. 10 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue parce qu'elles portent ce dispositif, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le port de la chambre impose un hébergement individuel dont le porteur reconnaît qu'il peut induire de l'apathie. Ces implantations forment un à trois personnels déjà qualifiés en chirurgie et en imagerie, et le porteur écarte toute nuisance liée aux cellules tumorales au motif de la durée de maintien des animaux, sans jamais indiquer cette durée.
Objectifs
L'imagerie optique des tissus sur animal vivant, autrement appelée "imagerie intravitale", est actuellement la seule méthode pour étudier les aspects dynamiques des processus physiologiques ou pathologiques à l'échelle cellulaire. Cette méthodologie passe par l'implantation chirurgicale de chambres dorsales, crâniennes ou abdominales au travers desquelles les tissus à observer sont physiquement exposés de manière stérile. Introduite depuis plusieurs années, elle a été développée essentiellement en cancérologie pour : 1- analyser les mouvements et interactions cellulaires ; 2- observer les modifications anatomiques et fonctionnelles des réseaux vasculaires ; 3-comprendre et optimiser les mécanismes d'action de molécules thérapeutiques. Ces chambres ont été développées par des laboratoires académiques et restent confinées à leurs propres fins de recherche. Dans le laboratoire, nous avons développé et validé un modèle de chambre dorsale multimodal toléré sur plusieurs mois par la souris. L'expérience acquise à ce jour avec ce dispositif nous a permis de définir une procédure chirurgicale optimisée en terme de gestes opératoires tant dans leur réalisation que dans leur enchainement réduisant ainsi la durée de la chirurgie à son minima et améliorant la survie de l'animal. De la même manière, les procédures en imagerie optique suivent désormais des protocoles précis à la fois dans la prise en charge des animaux et leur maintien en conditions les plus favorables possibles, que dans les protocoles d'acquisition d'images proprement dits. Nous souhaitons former 1 à 3 personnels préalablement qualifié en chirurgie et en imagerie photonique.
Bénéfices attendus
A l'issue de la formation, le stagiaire aura connaissance de l'ensemble des étapes pour l'implantation et le suivi en imagerie d'une chambre dorsale sur animal greffé. Toutes les informations éthiques et scientifiques lui auront été communiquées (documents papier et échanges oraux). Le format tutorat de la formation permet une prise en charge quasi individuelle du stagiaire conduisant à une meilleure interaction entre les différents intervenants. Un support technique post-tutorat pourra garantir la bonne mise en application des procédures apprises au moment de la formation. Une fois l'ensemble de la procédure acquis, les stagiaires pourront la mettre à profit pour leur propre projet de recherche et former d'autres personnels s'ils le jugent opportun.
Procédures
Implantation de la chambre dorsale sous anesthésie générale : 45min entre le début de l'anesthésie et le réveil de l'animal : la procédure en elle-même dure 30 min. L'intervention inclut l'injection d'agents analgésiques lors de la chirurgie sous anesthésie générale (2 injections par animal, durée 20 secondes par injection), Fixation de la chambre dorsale par suture (durée 10 minutes maximum), Incision de la peau (durée quelques secondes), Injection intradermique de cellules tumorales sous anesthésie générale (1 par animal - 30sec). 2. Phase d'imagerie: Injection de l'agent de contraste sous anesthésie générale (1 par animal - 2min), Acquisition d'images en microscopie (1 par animal- 30min).
Impact sur les animaux
La procédure chirurgicale entrainera une contrainte légère et transitoire (anesthésie générale). La présence de la chambre entrainera une contrainte modérée en termes de mobilité et de douleur. L'injection d'agent de contraste lors de la procédure d'imagerie entrainera une contrainte légère et transitoire (anesthésie générale). Les injections de cellules tumorales et les injections entraineront un stress physique et transitoire (préhension) et une douleur et une contrainte légère et transitoire (injections sous anesthésie locale ou générale). L'examen en microscopie confocale sous anesthésie générale entrainera une contrainte légère et transitoire. Aucune nuisance spécifique n'est attendue suite à l'injection des cellules tumorales par voie sous-cutanée vu la durée de maintien des animaux en procédure. Les animaux en hébergement individuel pourront souffrir de la diminution de leurs interactions sociales avec d'autres individus, ce qui peut induire de l'apathie.
Devenir
A la fin de la procédure, tous les animaux seront euthanasiés car porteurs de chambres dorsales.
Remplacement
La formation s'adresse à des personnes autorisées et qualifiées en chirurgie et imagerie. Il s'agit de transmettre les gestes opératoires spécifiques à la greffe de chambre dorsale dont la maitrise dépend de l'élasticité cutanée, du réseau vasculaire et du derme à préserver au mieux afin de garantir une greffe qui sera exploitable pour l'imagerie. Ces paramètres ne peuvent être correctement reproduits sur des fantômes plastiques de souris. De plus, les acquisitions en imagerie peuvent être biaisées par une mauvaise prise en charge de l'animal et de son monitoring. Par ailleurs, les protocoles en imagerie sont réalisés après injection intraveineuse d'un biomarqueur pour réhausser le signal des microvaisseaux. Or ce type d'expérience n'est absolument pas réalisable sur fantômes. Pour toutes ces raisons, le recours à l'animal est incontournable et indispensable dans ce projet.
Réduction
Afin de réduire le nombre d'animaux, l'équipe formatrice implantera un seul animal afin de garantir la qualité de la séance d'imagerie en cas d'échec de l'implantation par le stagiaire (risque d'inflammation, mauvaise fixation de la chambre). Pour le stagiaire, 2 animaux seront nécessaires pour qu'il acquiert les 2 postes du binôme formateur (chirurgie/assistant chirurgie).
Raffinement
Toutes les interventions sur l'animal, de l'implantation de la chambre dorsale à l'imagerie intravitale, seront réalisées sous anesthésie générale. Concernant la procédure chirurgicale, une anesthésie locale sera réalisée avant l'incision de la peau et un anti-douleur sera administré avant le réveil de l'animal. Les animaux seront surveillés quotidiennement afin de détecter précocement l'apparition de signes cliniques. Des points limites précoces ont été définis et seront strictement appliqués. Les animaux seront pesés au moins 2 fois par semaine afin de prévenir une éventuelle détérioration de l'état général. Si des signes de douleurs sont détectés un analgésique sera administré après analgésie locale. Avant l'implantation chirurgicale, les animaux seront stabulés en groupe, aliment et eau ad libitum, un enrichissement adapté sera présent dans toutes les cages. Compte tenu de la présence de la chambre dorsale, les animaux devront être hébergés individuellement après la procédure chirurgicale. Cependant une augmentation de l'enrichissement permettra de réduire l'impact de l'isolement et l'animal restera en contact visuel avec ses congénères. Afin de favoriser la récupération post-chirurgicale, un aliment préhensile et energétique sera ajouté dans toutes les cages.
Choix des espèces
Le développement du modèle de chambre dorsale a été conduit chez la souris, animal de référence pour les études en cancérologie. La souris de la souche sélectionnée est préférée du fait de son élasticité cutanée et de l'absence de poils qui facilitera la greffe chirurgicale en particulier pour des novices à ce type de chirurgie. Les animaux seront adultes (minimum 8 semaines). Compte-tenu de l'encombrement de la chambre dorsale sur le dos de l'animal et de la procédure chirurgicale, la physionomie de l'animal doit être suffisamment robuste pour limiter la mortalité lors de la chirurgie. Des études préliminaires ont montré une mortalité opératoire plus importante quand l'animal avait moins de 8 semaines.
EDU II Enseignement pratique des traitements chirurgicaux mini-invasifs
- Formation professionnelle
Un porc pour un à deux stagiaires : 8 510 porcs vont être utilisés dans des procédures menées sous anesthésie, tués avant tout réveil, pour former environ 7 500 chirurgiens en cinq ans. Chaque animal subit une chirurgie terminale de trois à huit heures et des prélèvements sanguins, après un jeûne de plus de seize heures que le porteur reconnaît susceptible d'entraîner une sensation de faim durant la nuit. Le projet relève de la formation professionnelle, avec environ trente sessions par an et des cours parfois intégrés aux cursus universitaires. Le porteur décrit simulateurs, mannequins, réalité virtuelle et cadavres comme des étapes préalables, puis conclut qu'aucun d'eux ne reproduit les difficultés de dissection, les saignements et les hémorragies d'une salle d'opération.
Objectifs
Ce projet a pour objectif de proposer une formation pratique aux professionnels de santé notamment les chirurgiens et les spécialistes réalisant des interventions guidées par l’image (radiologues, cardiologues, pneumologues, gastro-entérologues, urgentistes, etc.) afin de maîtriser les techniques modernes de chirurgie mini-invasive guidée par l’image. Les programmes de formation sont soumis à l’approbation du comité scientifique et de la Direction. Chaque cours est conçu et régulièrement mis à jour par un groupe d’experts de la discipline concernée, sur la base des recommandations scientifiques nationales et internationales, ainsi que des besoins identifiés en matière de formation aux nouvelles techniques. Certaines de ces formations sont intégrées aux cursus académiques de l’Université. Dans une démarche de réduction du nombre d’animaux utilisés, lorsque le contenu pédagogique le permet, les animaux peuvent également être mobilisés pour des activités de recherche avant leur euthanasie en fin de session. Sur les 5 années du projet nous estimons conduire 500 formations qui aboutiront à la formation d'environ 7500 chirurgiens.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à maintenir et développer un programme international de formation en chirurgie mini-invasive reconnu pour son excellence scientifique et pédagogique, avec pour bénéfices attendus l’amélioration des compétences techniques et de l’autonomie des praticiens, la diffusion des bonnes pratiques chirurgicales à l’échelle internationale et, in fine, l’amélioration de la qualité et de la sécurité des soins aux patients. L’entraînement progressif sur des modèles pédagogiques adaptés, incluant le recours au modèle animal porcin lorsque nécessaire, permet l’apprentissage de gestes et de technologies complexes dans des conditions anatomiques et opératoires comparables à celles de la chirurgie humaine, réduisant ainsi les risques lors des interventions cliniques.
Procédures
Les animaux subiront une chirugie terminale et des prélèvements de sang sous anesthésie générale et analgésie, d'une durée de 3 à 8 heures.
Impact sur les animaux
Les nuisances et effets indésirables attendus pour les animaux sont principalement liés aux procédures chirurgicales réalisées dans un cadre de formation, incluant l’anesthésie générale, les manipulations, les incisions chirurgicales, les gestes invasifs et l’utilisation de dispositifs médicaux. Ces procédures peuvent entraîner une douleur, un stress physiologique et/ou psychologique, ainsi que des atteintes tissulaires transitoires ou irréversibles. Plus précisément, ils peuvent être associés à la manipulation des animaux lors de l’injection intramusculaire de sédatifs (stress transitoire lié à l’isolement en box sans contention pendant 1 à 2 minutes ainsi qu’une douleur passagère au site d’injection), à la pose d’un cathéter au niveau de la veine auriculaire sous sédation (une douleur locale et un risque d’hématome), ainsi qu’à l’induction de l’anesthésie par injection intraveineuse via le cathéter chez un animal déjà sédaté, (risque rare d’hyperthermie maligne liée aux agents anesthésiques, incidence moyenne estimée à 1 pour 10 000) et à un risque de défaillance cardio-respiratoire. Enfin, la mise à jeun pré-anesthésique, d’une durée d’un peu plus de 16 heures selon l’horaire de l’intervention, avec un dernier repas administré avant 16 h, est susceptible d’entraîner une sensation de faim durant la nuit et au réveil, l’alimentation étant différée après la sédation afin de limiter le risque de vomissement.
Devenir
L’ensemble des animaux sera mis à mort en fin de formation car les chirurgiens auront été formés à plusieurs interventions chirurgicales ne permettant pas de garder en vie des animaux de manière éthique.
Remplacement
Les formations en chirurgie mini-invasive guidée par l’image combinent des sessions théoriques et pratiques. Elles intègrent la présentation et la discussion interactive d’interventions retransmises en direct, l’analyse de cas cliniques, ainsi que des entraînements sur différents types de modèles, choisis en fonction des objectifs pédagogiques et de la complexité des techniques à enseigner. Pour limiter le recours aux animaux vivants, l’acquisition des compétences manuelles se fait principalement à l’aide de simulateurs, tels que des boîtes ou mannequins d’entraînement contenant des objets ou des organes, manipulés avec des instruments spécifiques de chirurgie mini-invasive sous contrôle vidéo. Des simulateurs de réalité virtuelle complètent cette formation. Ces outils permettent de développer les gestes fondamentaux, la coordination œil-main et les capacités d’orientation spatiale. L’apprentissage des compétences « procédurales » pour certaines interventions s’effectue quant à lui sur cadavre. Cependant, ces différents modèles présentent des limites. Dans le cadre de programmes de formation avancés, seul le modèle animal permet de reproduire de manière réaliste l’environnement, les contraintes, les risques et les résultats associés aux procédures chirurgicales complexes. Le porc est alors le modèle privilégié en raison de ses similitudes anatomiques et physiologiques avec l’être humain.
Réduction
L’utilisation de simulateurs alternatifs permet d’acquérir les compétences manuelles de base et de limiter autant que possible le recours aux modèles vivants. Un animal permet en général de former 1 à 2 stagiaires à plusieurs procédures chirurgicales. Lorsque l’utilisation d’un animal est nécessaire, celui-ci est systématiquement mutualisé entre plusieurs stagiaires et pour plusieurs procédures au cours d’une même session, afin d’optimiser chaque utilisation. Ainsi, un même animal permet généralement de former un à deux stagiaires à plusieurs techniques chirurgicales différentes Chaque formation accueille entre 34 et 40 participants, et environ trente sessions sont organisées chaque année, toutes spécialités confondues.Tous les moyens disponibles sont mis en œuvre pour réduire l’utilisation animale : développement de modèles alternatifs, réalisation de plusieurs procédures sur un même animal au cours d’une session, mutualisation entre stagiaires, et collecte d’organes pour des entraînements ex vivo.
Raffinement
Avant les sessions pratiques réalisées dans un environnement chirurgical strict, les animaux sont hébergés en groupe social dans un environnement contrôlé en température et hygrométrie, avec lumière progressive et musique. Ils reçoivent une alimentation adaptée à leurs besoins, de l’eau à volonté, des jouets et dispositifs qui favorisent leurs comportements naturels comme l’exploration, le fouissage et le mâchouillement (balles, objets type Kong, aliments dispersés au sol...). Toutes les interventions sont réalisées sous anesthésie générale profonde avec traitement de la douleur. Des points limites ont été établis pour ne pas engendrer de souffrance animale durant les procédures. Une équipe qualifiée composée de zootechniciens et médecins assure au quotidien l’entretien, la surveillance et les soins des animaux. La structure en charge du bien-être animal accompagne la mise en œuvre des expériences. Avec le vétérinaire désigné, elle conseille les responsables de cours dans l’amélioration de leurs pratiques en faveur du bien-être des animaux et de l’application des 3R.
Choix des espèces
Le porc, du fait de sa taille, de son anatomie et de sa physiologie, est le modèle animal le plus pertinent pour enseigner la chirurgie mini-invasive. Cela permet d’exposer les stagiaires à toutes les contraintes d’un modèle vivant et de reproduire à l’identique les étapes d’une procédure chirurgicale, réalisée avec les instruments et technologies identiques à celles qui seront utilisées ensuite sur l’humain dans leur activité clinique. Le modèle vivant permet également de les confronter aux réalités d’une chirurgie, à savoir les difficultés de dissection, d’accès aux organes ciblés, les risques de saignement, d’hémorragie… dans un environnement qui reproduit à l’identique celui d’une salle d’opération. A l’heure actuelle, aucun simulateur, mécanique ou virtuel, ne peut répliquer ces situations. Porcs charcutiers (Large White/Piétrain/Duroc) juvéniles (2 à 6 mois) entre 20 et 60 Kg pour avoir un modèle le plus proche possible de la taille humaine. La taille des organes des porcs à ce stade de croissance correspond en effet déjà à ce qui peut être observé en clinique chez l’homme, il offre les repères anatomiques recherchés par le praticien et permet d’utiliser les mêmes équipements et matériels chirurgicaux que chez le patient.
Etude des effets d’une nouvelle méthode de radiothérapie
- Formation professionnelle
- Production de routine
- Recherche appliquée
- Cancers
- Troubles respiratoires
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système respiratoire
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
- Toxicologie et autres tests de sécurité
Issues de sept lignées génétiquement modifiées, les souris de ce projet reçoivent jusqu'à cinq injections de tamoxifène pour activer leurs mutations avant d'être irradiées. Elles sont 7 548 au total, dont 3 192 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère et 180 dans des procédures menées sous anesthésie, tuées avant tout réveil. L'irradiation du thorax peut provoquer une inflammation pulmonaire puis une fibrose avec difficultés respiratoires, celle de l'abdomen du sang dans les selles, et l'injection de cellules tumorales des tumeurs suivies par imagerie sous anesthésie jusqu'à six fois. Toutes sont tuées pour analyses post-mortem. Interrogé sur le remplacement, le porteur recopie mot pour mot son argumentaire de réduction du nombre d'animaux, sans citer une seule méthode sans animaux.
Objectifs
De nouvelles méthodes de radiothérapie permettent de réduire ces effets secondaires tout en préservant une efficacité contre les tumeurs comparable aux traitements actuels. Afin de définir les meilleures conditions cliniques de ces nouveaux traitements de radiothérapie , il est nécessaire de i) poursuivre l’étude de la compréhension des mécanismes de ces nouvelles modalités de radiothérapie et ii) réaliser les études précliniques pour définir les meilleures conditions cliniques d’utilisation de ces nouveaux traitements. Pour cela, nous nous intéresserons aux effets de ces nouvelles méthodes de radiothérapie sur du tissu sain comme les poumons et l’intestin. Nous chercherons également à caractériser sur des tumeurs l’impact de ces nouvelles modalités de radiothérapie.
Bénéfices attendus
A l’issue de ce projet, nous aurons défini les conditions cliniques optimales d’une nouvelle méthode de radiothérapie. En cas de résultats positifs, ces paramètres d’irradiation seront intégrés aux futures machines de radiothérapie et permettront une amélioration des traitements par radiothérapie (i.e. moins d’effets secondaires, meilleure contrôle de la tumeur) pour les patients atteints de cancer.
Procédures
Dans un premier lot d’animaux, des animaux vigiles issus de sept lignées de souris génétiquement modifiées seront injectés par voie intrapéritonéale avec du tamoxifène. En fonction des lignées, les animaux recevront entre une et cinq injections de tamoxifène (durée du geste inférieure à 10 sec). Les animaux seront ensuite irradiés avec une nouvelle modalité de radiothérapie. Lors de l’irradiation, les animaux seront anesthésiés (1 fois au cours de l’expérience pendant une durée de 3 à 5 min) puis placés en contention sur un support d’irradiation. Les animaux seront ensuite suivis par imagerie scanner pour petit animal, à partir du 4ème mois après l’irradiation. Lors des séances d’imagerie, les animaux seront anesthésiés pendant une durée de 5 à 10 min. Chaque animal recevra, au maximum, 4 séances d’imagerie. Dans un deuxième lot, des animaux vigiles issus de quatre lignées génétiquement modifiées seront injectés avec un traitement. En fonction des lignées, les animaux recevront entre une et cinq injections de ttraitement (durée du geste inférieure à 10 sec). Dans un troisième lot, des cellules tumorales seront injectées aux animaux vigiles (1 fois au cours de l’expérience - durée du geste inférieure à 10 sec). Les animaux seront ensuite irradiés et suivi par imagerie pour petit animal. Lors des séances d’imagerie, les animaux seront anesthésiés pendant une durée de 5 à 10 min. Chaque animal recevra, au maximum, 6 séances d’imagerie. Dans un quatrième lot, des injections seront réalisées sur des animaux vigiles (1 fois au cours de l’expérience - durée du geste inférieure à 10 sec).
Impact sur les animaux
Lors de l’injection du produit, il est possible de ressentir une légère douleur ou une gêne pendant un court moment. Une petite perte de poids peut aussi survenir dans les 5 à 10 jours suivant le traitement. Trois rythmes d’injection seront testés : une seule injection, trois injections par semaine (par exemple lundi, mercredi et vendredi) et cinq injections par semaine. Chez les animaux recevant plusieurs injections, une perte de poids peut apparaître dans la semaine qui suit la fin du traitement. Pour l’étude de la toxicité sur les tissus sains : • Après une irradiation du thorax, les animaux peuvent présenter une inflammation des poumons entre 1 et 3 mois après le traitement. Si la toxicité est forte, cela peut évoluer vers une fibrose (envahissement du tissu pulmonaire) après 4 à 5 mois. Dans ce cas, une perte de poids et des difficultés à respirer peuvent apparaître. • Après une irradiation de l’abdomen, une perte de poids peut être observée dans les 10 à 15 jours suivants, ainsi que la présence possible de sang dans les selles. Pour étudier l’efficacité du traitement contre les tumeurs, les animaux recevront une injection de cellules tumorales. Ces cellules provoqueront le développement de tumeurs dans les poumons, dont la croissance sera suivie régulièrement par imagerie. Selon le degré d’envahissement du poumon, des difficultés respiratoires et une perte de poids peuvent apparaître. L’injection peut entraîner une douleur passagère. Pendant les séances d’irradiation, les souris seront anesthésiées avec de l’isoflurane, un gaz anesthésiant. Cela peut causer une gêne temporaire et sans conséquence durable. À court terme, des irritations de la peau (rougeurs, plaies, nécroses) peuvent survenir à cause du traitement.
Devenir
Les animaux sont mis à mort pour des analyses post-mortem.
Remplacement
Plusieurs mesures ont été prises pour réduire le nombre d’animaux à utiliser tout au long du projet : 1-Des études antérieures ont été réalisées au laboratoire afin de déterminer les doses optimales pour caractériser les effets biologiques de cette nouvelle méthode de radiothérapie. De la même manière, des études antérieures utilisant l’injection de cellules tumorales par voie intra-veineuse ont permis de déterminer la quantité de cellules à injecter, le délai de prise tumorale ainsi que l’évaluation de la pertinence des méthodes de suivi de la progression tumorale. 2-Les temps des prélèvements seront adaptés en fonction de la croissance tumorale et de la radiosensibilité de chaque lignée tumorale. 3-Du fait d’études pilotes antérieures, le nombre d’animaux par groupe est optimisé par un test de puissance statistique lors de la comparaison des différentes modalités de radiothérapie. 4-L’optimisation et l’utilisation d’un suivi du développement des complications par imagerie (scanner ou bioluminescence) permet de suivre les animaux tout en évitant de multiplier les prélèvements ainsi que le nombre d’animaux utilisés pour cette étude. 5-Les deux sexes seront étudiés ce qui permettra de réduire, dans le cas de lignées transgéniques, le nombre d’animaux à produire.
Réduction
Plusieurs mesures ont été prises pour réduire le nombre d’animaux à utiliser tout au long du projet : 1-Des études antérieures ont été réalisées au laboratoire afin de déterminer les doses optimales pour caractériser les effets biologiques de cette nouvelle méthode de radiothérapie. De la même manière, des études antérieures utilisant l’injection de cellules tumorales par voie intra-veineuse ont permis de déterminer la quantité de cellules à injecter, le délai de prise tumorale ainsi que l’évaluation de la pertinence des méthodes de suivi de la progression tumorale. 2-Les temps des prélèvements seront adaptés en fonction de la croissance tumorale et de la radiosensibilité de chaque lignée tumorale. 3-Du fait d’études pilotes antérieures, le nombre d’animaux par groupe est optimisé par un test de puissance statistique lors de la comparaison des différentes modalités de radiothérapie. 4-L’optimisation et l’utilisation d’un suivi du développement des complications par imagerie (scanner ou bioluminescence) permet de suivre les animaux tout en évitant de multiplier les prélèvements ainsi que le nombre d’animaux utilisés pour cette étude. 5-Les deux sexes seront étudiés ce qui permettra de réduire, dans le cas de lignées transgéniques, le nombre d’animaux à produire.
Raffinement
Pour la procédure d’évaluation des effets secondaires de la radiothérapie, une grille de score est mise en place pour évaluer de façon objective l’état des animaux. En particulier, nous évaluerons le poids de façon hebdomadaire, les difficultés respiratoires, le sang dans les fèces et l’isolement. Le suivi par imagerie sera également un point majeur de notre évaluation du développement de effets secondaires et du suivi de la progression tumorale. Nous pourrons ainsi décider d’augmenter la surveillance et minimer les gênes respiratoires chez les animaux. En particulier, le nombre et la taille des tumeurs seront des éléments importants et déterminants pour assurer le bien-être de l’animal. Pour les procédures incluant une irradiation, une anesthésie générale ainsi qu’une contention physique sur un support adaptée seront réalisées au moment de l’irradiation pour éviter tout inconfort et douleurs des animaux. Ces mesures permettront de minimiser le stress de l’animal induit par les traitements d’irradiation. Aucune douleur n’est attendue au moment de l’irradiation dans ces conditions.
Choix des espèces
La souris est le modèle classiquement utilisé dans les études de toxicité radio-induite car il présente plusieurs avantages : i) il s’agit d’un modèle préclinique pertinent pour la radiothérapie car les réponses moléculaires et cellulaires des tissus murins à l’irradiation sont comparables à celles observées chez l’Homme ii) la souris est un mammifère génétiquement proche de l’Homme iii) son usage en préclinique a permis de mettre au point un grand nombre de nouveaux traitements Nous utiliserons des souris adultes âgées de 8 semaines à 12 mois. Les organes étudiés sont alors matures, limitant les potentiels biais expérimentaux induits par l’irradiation d’organes à des stades de maturation différents. De plus, les animaux adultes supportent également mieux l’anesthésie et l’irradiation.
Formation sur la perfusion capillaire et les effets de l’ischémie sur les organes
- Formation professionnelle
Provoquer un accident vasculaire cérébral chez la souris sert ici à entraîner des doctorants en neurosciences au geste chirurgical, le projet étant déclaré à finalité exclusivement éducative. 140 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées 48 heures après l'opération. Chaque animal subit deux chirurgies sous anesthésie séparées par 55 minutes d'occlusion de l'artère cérébrale moyenne, et peut ensuite présenter une démarche rigide, une asymétrie corporelle, une baisse d'activité motrice et une perte de poids de 5 à 10 %. Un formateur encadre deux à trois étudiants qui pratiquent après démonstration, et le porteur justifie ces 140 mises à mort par le fait qu'une meilleure maîtrise du geste réduira le nombre d'animaux que ces étudiants utiliseront plus tard.
Objectifs
L’accident vasculaire cérébral (AVC) ischémique ne provoque pas seulement une lésion directe du cerveau, mais entraîne également d’importantes perturbations du système immunitaire. Ce phénomène, appelé affaiblissement des défenses immunitaires induit par l’AVC, augmente la sensibilité aux infections, telles que la pneumonie post-AVC, et aggrave le pronostic des patients. Les organes périphériques — notamment la moelle osseuse, la rate, les poumons et le foie — jouent un rôle essentiel dans cette réponse systémique. Comprendre les modifications immunitaires survenant dans ces organes après un AVC est crucial pour développer des stratégies thérapeutiques visant à limiter cet affaiblissement immunitaire. Afin d’étudier plus précisément les mécanismes moléculaires impliqués dans ces altérations du système immunitaire, nous réaliserons une occlusion transitoire de l’artère cérébrale moyenne chez la souris. Quarante-huit heures plus tard, les animaux seront euthanasiés et les organes prélevés pour des analyses moléculaires. Le cerveau sera également utilisé pour des analyses d’imagerie cellulaire à haute résolution. Nous proposons de former de nouveaux chercheurs sur cette thématique. Le projet a un objectif exclusivement éducatif et s’inscrit dans le cadre d’une formation destinée aux doctorants en neurosciences.
Bénéfices attendus
Nous proposons de former de nouveaux chercheurs à cette méthode chirurgicale, qui permet d’étudier l’impact de l’accident vasculaire cérébral ischémique sur les organes périphériques. Une meilleure maîtrise de cette technique leur permettra de réduire le nombre d’animaux utilisés lorsqu’ils réaliseront ce type d’expérimentations dans le cadre de leurs travaux de recherche.
Procédures
Les souris seront anesthésiées et suivront une chirurgie(durée : environ 20 minutes). 55 minutes plus tard, ils seront réanesthésiés et suivront une deuxième chirurgie (durée : 10 minutes). Deux jours plus tard, les animaux seront euthanasiés, et leur cerveau et les organes périphériques seront prélevés.
Impact sur les animaux
Après une occlusion d’une heure, les souris peuvent présenter un pelage mal entretenu, une démarche rigide, une diminution de l’activité motrice ainsi qu’une asymétrie corporelle (comportement de rotation, inclinaison d’un côté lorsqu’on tient l’animal par la queue, flexion du membre antérieur controlatéral). Une diminution du réflexe des vibrisses peut également être observée. Après 48 heures, une perte de poids comprise entre 5 et 10 % peut survenir. Nuisances liées aux injections d’anesthésiques et d’analgésiques : Les souris seront soumises à une anesthésie gazeuse, entraînant un stress léger lié à l’induction anesthésique. À la suite des injections, les nuisances attendues sont une douleur post-injection et un stress associé à la contention. Nuisances liées à la chirurgie : Douleur ou inconfort liés à la cicatrisation de la plaie.
Devenir
A l’issue de toutes les expériences, les animaux seront euthanasiés et leur cerveau sera prélevé
Remplacement
Nous souhaitons analyser l’impact de l’accident vasculaire cérébral ischémique sur plusieurs organes périphériques. Dans ce contexte, le recours à un modèle animal est indispensable, car ces interactions systémiques ne peuvent être reproduites de manière pertinente in vitro.
Réduction
L’expertise de nos instructeurs sur ces modèles garantit que le nombre d'animaux utilisés est minimisé par une pratique toujours de haute qualité dès le départ. Ce projet a aussi pour but de former les étudiants afin qu’ils soient en mesure de réaliser au mieux les procédures qu’ils auront apprises et transmettre ainsi ces techniques dans leur laboratoire d’origine. Une meilleure connaissance des nouvelles techniques de chirurgie et d'imagerie leur permettra de réduire le nombre d’animaux utilisés lorsqu’ils voudront réaliser ces techniques pour leurs besoins de recherche. Le nombre d'animaux est adapté à nos objectifs éducatifs. Nous devons démontrer et mettre en pratique les procédures pendant nos formations. Lors de la formation, les instructeurs réalisent une démonstration de la procédure puis les étudiants auront l’occasion de pratiquer la procédure sous-couvert des instructeurs.
Raffinement
Nos mesures mises en place pour réduire la douleur pendant les actes expérimentaux impliquent une induction et un suivi de l'anesthésie, une mise en place d'analgésie et une installation tout au long des interventions chirurgicales d’un contrôle de la température par tapis chauffant. Les animaux opérés seront observés par l’expérimentateur pendant la période qui suit le réveil (2h) ainsi que pendant les deux jours suivants. L'évaluation des points limites se fera selon une grille d'évaluation incluant le poids de l'animal, l'état de la plaie, l'état du pelage, les déficits neurologiques et les signes de douleur. Selon le score obtenu, les souris pourront recevoir une injection d’un antalgique, et de l’aliment hydraté pourra être ajouté au fond de la cage. Des points limites suffisamment prédictifs et spécifiques au projet seront définis et appliqués. Après leur arrivée dans notre animalerie, les animaux suivront une période d’acclimatation d’une semaine avant le début des procédures. Les sessions de formation sont encadrées par un formateur pour deux à trois étudiants, garantissant ainsi un accompagnement individualisé et un apprentissage optimal des procédures.
Choix des espèces
La souris est une espèce de choix pour les études sur le système nerveux central des vertèbres. L'organisation du système nerveux central de cette espèce est assez proche de celle de l'homme, ce qui permet une extrapolation des résultats obtenus chez cette espèce à l'espèce humaine. Cela contribue à mieux comprendre les mécanismes à une échelle cellulaire ainsi qu’au niveau des circuits neuronaux. Nous utilisons le modèle souris qui est l'espèce de rongeur permettant d'obtenir aisément des animaux modifiés génétiquement. Le projet sera réalisé sur des animaux agés de plus de 6 semaines, ce qui correspond à l’âge adulte pour ces espèces. Leur poids et leur taille sont stabilisés, et la taille du cerveau homogène pour une bonne reproductibilité des procédures chirurgicales.
Étude de l’impact de la modulation des gènes dans des cellules non neuronales dans un contexte d’ataxie cérébelleuse. EU4/4
- Formation professionnelle
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Déplacées à pied entre quatre établissements utilisateurs, dans une cage fermée glissée dans un double emballage opaque, les souris de ce volet passent d'un site à l'autre selon l'étape du protocole. 360 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour tester la modulation d'un gène de cellules non neuronales dans deux modèles d'ataxie cérébelleuse. Prélèvement de tissu à l'oreille dans les deux premiers établissements, chirurgie d'une heure et injection d'un vecteur dans le cervelet dans le troisième, tests comportementaux répétés jusqu'à cinq fois, puis injection d'un fixateur dans le quatrième pour une partie des animaux. 52 femelles rejoignent un projet d'élevage pour la reproduction avant d'être tuées, les 308 autres sont tuées pour prélèvement de tissus.
Objectifs
Les ataxies cérébelleuses sont un groupe de maladies neurodégénératives caractérisées par des troubles de la marche, une perte d'équilibre et de coordination motrice. Ces troubles sont causés par la dégénérescence des neurones du cervelet. Du fait de la faible prévalence de ces maladies, la mise en place d'études cliniques s'est avérée difficile et, à ce jour, aucun traitement curatif n'est disponible et très peu de médicaments sont proposés aux patients. Au fil des années, des modèles murins reproduisant les symptômes de plusieurs formes d'ataxie cérébelleuse ont été développés. Chaque modèle reproduit les principales caractéristiques génétiques, la dégénérescence cellulaire et les symptômes observés chez les patients. Au sein de ce projet multi-établissement (effectués dans 4 établissements utilisateurs, nommés ici EU1/EU2/EU3/EU4) nous avons sélectionné deux modèles murins d'ataxie cérébelleuse pouvant servir de paradigme pour ce groupe de maladies : l'ataxie spinocérébelleuse de type 1 (SCA1) et l'ataxie de Friedreich (AF). En fait, ces maladies couvrent l'hétérogénéité de ce groupe en termes de mode de transmission, de type de mutation génétique et de fonction de la protéine mutée. Nous avons récemment réalisé une analyse du cervelet afin d'identifier les principaux dysfonctionnements impliqués dans ces maladies. Nous avons constaté que la perte neuronale peut être influencée par des anomalies de certains types cellulaires non neuronaux qui contribuent au bon fonctionnement des neurones. Parmi ces anomalies, nous avons identifié un gène dont l'expression est plus faible chez les souris malades que chez les souris saines, dans les deux modèles de maladie. Ce projet vise donc à rétablir l'expression de ce gène au même niveau que chez les souris saines afin de démontrer son rôle dans la maladie. Dans cette optique, nous injecterons dans le cervelet de souris anesthésiées un vecteur portant un fragment génétique destiné à augmenter l'expression du gène spécifiquement dans un type particulier de cellules non neuronales, avant l'apparition des symptômes. En surveillant le comportement des souris et en réalisant des analyses moléculaires et histologiques ultérieures, nous espérons améliorer ou retarder l'apparition des symptômes chez les souris injectées. En complément, la seconde partie de notre projet tend à démontrer que la diminution d’expression de ce gène à elle seule suffit à faire apparaître les symptômes moteurs de la maladie chez des souris saines.
Bénéfices attendus
Par la modulation d'un gène spécifique et la combinaison de tests comportementaux, d'analyses histologiques, moléculaires et biochimiques, ce projet vise à élucider le rôle des cellules non neuronales dans l'ataxie cérébelleuse. Plus précisément, grâce à deux modèles murins paradigmatiques d'ataxie cérébelleuse, nous cherchons à démontrer la fonction cruciale d'une protéine produite par les cellules non neuronales pour protéger la fonction neuronale et ainsi prévenir les symptômes neurologiques. Ce projet pourrait prouver l'intérêt de ce gène pour le développement de futurs médicaments applicables à plusieurs types d'ataxies cérébelleuses.
Procédures
Les animaux de ce projet seront soumis à un prélèvement de tissus à l’oreille unique, procédure prenant environ 5 secondes au sein de l’EU1 et de l’EU2. Par la suite, un traitement sera administré par une intervention chirurgicale unique durant 1 heure et qui sera réalisée sous anesthésie et analgésie au sein de l’EU3. Des tests comportementaux, dont la durée totale est de 15 minutes, seront réalisés sur les animaux (au maximum 3 répétitions par test, EU3). En fonction du traitement reçu, ces tests seront réalisés soit 1 fois sur les animaux soit 5 fois (au maximum). Pour finir, une partie des animaux recevra une dernière chirurgie avec injection d’un fixateur sous anesthésie et analgésie pour prélèvements d’organes (intervention prenant 10 minutes au sein de l’EU4).
Impact sur les animaux
Un des deux modèles murins de ce projet commence à perdre du poids à partir de 20 semaines d’âge accompagné de symptômes ataxiques. Le second modèle de ce projet ne présente pas de symptômes ataxiques avant 9 mois mais à partir de 4 à 5 mois des symptômes légers de défaut de coordination motrice sont visibles lors de tests comportementaux. Les tests comportementaux ne sont pas invasifs, sont indolores et n’impliquent qu’un court et léger stress ne causant donc aucun dommage durable aux animaux. La procédure chirurgicale d’injection est accompagnée des mesures d’anesthésie et analgésie nécessaires en amont et lors de l’opération. Il est toutefois possible que les animaux soient soumis à de la douleur post-opératoire pendant les jours suivant la procédure. En prévision de cela, nous optons pour un traitement analgésique post-opératoire pour tous les animaux ayant reçu une injection.
Devenir
Les animaux utilisés dans ce projet sont des organismes génétiquement modifiés qui ne peuvent être replacés ou relâchés. Une partie des animaux produits (femelles) sera réutilisée pour reproduction au sein d’un projet d’élevage déjà en place dans l’EU2 avant mise à mort. Le reste sera étudié puis mis à mort pour prélèvement de tissus et analyses histologiques, moléculaires et biochimiques.
Remplacement
Ce projet comprenant un axe d’études comportementales, il n’est pas possible de se passer du modèle animal. De plus, il n’est pas possible à l’heure actuelle de reproduire en culture cellulaire des réseaux neuronaux complexes comme ceux que nous allons étudier.
Réduction
Toutes les procédures ont été conçues pour réduire au minimum le nombre d’animaux utilisés, sans compromettre la fiabilité des résultats des expériences. Les analyses statistiques ont été prévues en amont pour déterminer les tailles d’effectifs adéquates. De plus, afin de minimiser le nombre d’animaux, les mêmes individus seront utilisés pour les analyses comportementales, histologiques, moléculaires et biochimiques Des animaux des 2 sexes seront utilisés car l'ataxie spinocérébelleuse de type 1 et l’ataxie de Friedreich affectent de manière égale les mâles et les femelles. Ceci nous permet de générer moins d’animaux pour former nos groupes expérimentaux.
Raffinement
Le transport court des animaux entre les différents établissements utilisateurs sera réalisé à pied et de préférence en début de journée, pour limiter l’impact sur la phase de repos des animaux, dans une cage fermée placée dans un double emballage opaque et fermé. Les animaux seront habitués à l’expérimentateur avant le début des manipulations pour minimiser leur stress. Nous utiliserons des méthodes de contention peu stressantes, comme des tunnels ou le fait de simplement prendre les souris dans la paume de la main au lieu de les prendre par la queue. Les animaux seront aussi habitués aux dispositifs pour tests comportementaux en amont de la réalisation des tests. De plus, nous effectuons un marquage temporaire de couleur à la base de la queue avec un feutre non toxique afin de différencier plus facilement les souris sans avoir besoin de contention pour les identifier lors du comportement. Les animaux seront surveillés tout au long de l’étude à l’aide d’une liste de points limites adaptés et précoces. Pour la prise en charge de la douleur péri-opératoire, nous avons mis en place un protocole analgésique complet accompagné d’une grille de score adaptée pour surveiller le bon rétablissement des animaux. En complément, une grille de score est mise en place afin de surveiller l’état de santé des animaux et de pouvoir mettre en place un traitement précoce et adapté à l’apparition de symptômes.
Choix des espèces
Dans ce projet, nous avons choisi d'utiliser des modèles murins parce que ces derniers présentent des similitudes anatomiques et physiologiques avec le tissu humain : les mêmes types de cellules avec une organisation tissulaire similaire. Ces similitudes entre le cerveau de la souris et celui de l'homme sont cruciales pour disposer de connaissances solides qui pourront être transférées à l'avenir pour soigner l'homme. Il n'existe pas encore d'outils cellulaires capables de récapituler l'état de développement et la complexité de la structure du cerveau animal. La souris est actuellement l’animal de laboratoire sur lequel nous disposons des plus nombreux outils génétiques et moléculaires pour travailler. Les deux modèles utilisés au sein de ce projet sont déjà bien caractérisés ce qui nous permet de prévoir et gérer l’apparition des symptômes ataxiques ainsi que de tester un traitement par modulation génique avant apparition des symptômes. Les tests comportementaux seront effectués à l’âge où les symptômes ataxiques sont significativement visibles afin de mesurer l’efficacité de notre traitement.
Étude de l’impact de la modulation des gènes dans des cellules non neuronales dans un contexte d’ataxie cérébelleuse. EU2/4
- Formation professionnelle
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Pour démontrer le rôle d'un gène exprimé dans des cellules non neuronales du cervelet, deux lignées de souris reproduisant l'ataxie spinocérébelleuse de type 1 et l'ataxie de Friedreich sont utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. 360 souris sont concernées par ce volet. Chacune subit un prélèvement de tissu à l'oreille, une chirurgie d'une heure sous anesthésie pour injecter un vecteur dans le cervelet, puis des séries de tests comportementaux répétés jusqu'à cinq fois, et une partie d'entre elles une dernière chirurgie d'injection de fixateur. 52 femelles sont réutilisées pour la reproduction avant d'être tuées, les 308 autres tuées pour prélèvement de tissus. Les tests comportementaux, que le porteur qualifie d'indolores et sans dommage durable, ne sont jamais nommés.
Objectifs
Les ataxies cérébelleuses sont un groupe de maladies neurodégénératives caractérisées par des troubles de la marche, une perte d'équilibre et de coordination motrice. Ces troubles sont causés par la dégénérescence des neurones du cervelet. Du fait de la faible prévalence de ces maladies, la mise en place d'études cliniques s'est avérée difficile et, à ce jour, aucun traitement curatif n'est disponible et très peu de médicaments sont proposés aux patients. Au fil des années, des modèles murins reproduisant les symptômes de plusieurs formes d'ataxie cérébelleuse ont été développés. Chaque modèle reproduit les principales caractéristiques génétiques, la dégénérescence cellulaire et les symptômes observés chez les patients. Au sein de ce projet multi-établissement (effectués dans 4 établissements utilisateurs, nommés ici EU1/EU2/EU3/EU4) nous avons sélectionné deux modèles murins d'ataxie cérébelleuse pouvant servir de paradigme pour ce groupe de maladies : l'ataxie spinocérébelleuse de type 1 (SCA1) et l'ataxie de Friedreich (AF). En fait, ces maladies couvrent l'hétérogénéité de ce groupe en termes de mode de transmission, de type de mutation génétique et de fonction de la protéine mutée. Nous avons récemment réalisé une analyse du cervelet afin d'identifier les principaux dysfonctionnements impliqués dans ces maladies. Nous avons constaté que la perte neuronale peut être influencée par des anomalies de certains types cellulaires non neuronaux qui contribuent au bon fonctionnement des neurones. Parmi ces anomalies, nous avons identifié un gène dont l'expression est plus faible chez les souris malades que chez les souris saines, dans les deux modèles de maladie. Ce projet vise donc à rétablir l'expression de ce gène au même niveau que chez les souris saines afin de démontrer son rôle dans la maladie. Dans cette optique, nous injecterons dans le cervelet de souris anesthésiées un vecteur portant un fragment génétique destiné à augmenter l'expression du gène spécifiquement dans un type particulier de cellules non neuronales, avant l'apparition des symptômes. En surveillant le comportement des souris et en réalisant des analyses moléculaires et histologiques ultérieures, nous espérons améliorer ou retarder l'apparition des symptômes chez les souris injectées. En complément, la seconde partie de notre projet tend à démontrer que la diminution d’expression de ce gène à elle seule suffit à faire apparaître les symptômes moteurs de la maladie chez des souris saines.
Bénéfices attendus
Par la modulation d'un gène spécifique et la combinaison de tests comportementaux, d'analyses histologiques, moléculaires et biochimiques, ce projet vise à élucider le rôle des cellules non neuronales dans l'ataxie cérébelleuse. Plus précisément, grâce à deux modèles murins paradigmatiques d'ataxie cérébelleuse, nous cherchons à démontrer la fonction cruciale d'une protéine produite par les cellules non neuronales pour protéger la fonction neuronale et ainsi prévenir les symptômes neurologiques. Ce projet pourrait prouver l'intérêt de ce gène pour le développement de futurs médicaments applicables à plusieurs types d'ataxies cérébelleuses.
Procédures
Les animaux de ce projet seront soumis à un prélèvement de tissus à l’oreille unique, procédure prenant environ 5 secondes au sein de l’EU1 et de l’EU2. Par la suite, un traitement sera administré par une intervention chirurgicale unique durant 1 heure et qui sera réalisée sous anesthésie et analgésie au sein de l’EU3. Des tests comportementaux, dont la durée totale est de 15 minutes, seront réalisés sur les animaux (au maximum 3 répétitions par test, EU3). En fonction du traitement reçu, ces tests seront réalisés soit 1 fois sur les animaux soit 5 fois (au maximum). Pour finir, une partie des animaux recevra une dernière chirurgie avec injection d’un fixateur sous anesthésie et analgésie pour prélèvements d’organes (intervention prenant 10 minutes au sein de l’EU4).
Impact sur les animaux
Un des deux modèles murins de ce projet commence à perdre du poids à partir de 20 semaines d’âge accompagné de symptômes ataxiques. Le second modèle de ce projet ne présente pas de symptômes ataxiques avant 9 mois mais à partir de 4 à 5 mois des symptômes légers de défaut de coordination motrice sont visibles lors de tests comportementaux. Les tests comportementaux ne sont pas invasifs, sont indolores et n’impliquent qu’un court et léger stress ne causant donc aucun dommage durable aux animaux. La procédure chirurgicale d’injection est accompagnée des mesures d’anesthésie et analgésie nécessaires en amont et lors de l’opération. Il est toutefois possible que les animaux soient soumis à de la douleur post-opératoire pendant les jours suivant la procédure. En prévision de cela, nous optons pour un traitement analgésique post-opératoire pour tous les animaux ayant reçu une injection.
Devenir
Les animaux utilisés dans ce projet sont des organismes génétiquement modifiés qui ne peuvent être replacés ou relâchés. Une partie des animaux produits (femelles) sera réutilisée pour reproduction au sein d’un projet d’élevage déjà en place dans l’EU2 avant mise à mort. Le reste sera étudié puis mis à mort pour prélèvement de tissus et analyses histologiques, moléculaires et biochimiques.
Remplacement
Ce projet comprenant un axe d’études comportementales, il n’est pas possible de se passer du modèle animal. De plus, il n’est pas possible à l’heure actuelle de reproduire en culture cellulaire des réseaux neuronaux complexes comme ceux que nous allons étudier.
Réduction
Toutes les procédures ont été conçues pour réduire au minimum le nombre d’animaux utilisés, sans compromettre la fiabilité des résultats des expériences. Les analyses statistiques ont été prévues en amont pour déterminer les tailles d’effectifs adéquates. De plus, afin de minimiser le nombre d’animaux, les mêmes individus seront utilisés pour les analyses comportementales, histologiques, moléculaires et biochimiques Des animaux des 2 sexes seront utilisés car l'ataxie spinocérébelleuse de type 1 et l’ataxie de Friedreich affectent de manière égale les mâles et les femelles. Ceci nous permet de générer moins d’animaux pour former nos groupes expérimentaux.
Raffinement
Le transport court des animaux entre les différents établissements utilisateurs sera réalisé à pied et de préférence en début de journée, pour limiter l’impact sur la phase de repos des animaux, dans une cage fermée placée dans un double emballage opaque et fermé. Les animaux seront habitués à l’expérimentateur avant le début des manipulations pour minimiser leur stress. Nous utiliserons des méthodes de contention peu stressantes, comme des tunnels ou le fait de simplement prendre les souris dans la paume de la main au lieu de les prendre par la queue. Les animaux seront aussi habitués aux dispositifs pour tests comportementaux en amont de la réalisation des tests. De plus, nous effectuons un marquage temporaire de couleur à la base de la queue avec un feutre non toxique afin de différencier plus facilement les souris sans avoir besoin de contention pour les identifier lors du comportement. Les animaux seront surveillés tout au long de l’étude à l’aide d’une liste de points limites adaptés et précoces. Pour la prise en charge de la douleur péri-opératoire, nous avons mis en place un protocole analgésique complet accompagné d’une grille de score adaptée pour surveiller le bon rétablissement des animaux. En complément, une grille de score est mise en place afin de surveiller l’état de santé des animaux et de pouvoir mettre en place un traitement précoce et adapté à l’apparition de symptômes.
Choix des espèces
Dans ce projet, nous avons choisi d'utiliser des modèles murins parce que ces derniers présentent des similitudes anatomiques et physiologiques avec le tissu humain : les mêmes types de cellules avec une organisation tissulaire similaire. Ces similitudes entre le cerveau de la souris et celui de l'homme sont cruciales pour disposer de connaissances solides qui pourront être transférées à l'avenir pour soigner l'homme. Il n'existe pas encore d'outils cellulaires capables de récapituler l'état de développement et la complexité de la structure du cerveau animal. La souris est actuellement l’animal de laboratoire sur lequel nous disposons des plus nombreux outils génétiques et moléculaires pour travailler. Les deux modèles utilisés au sein de ce projet sont déjà bien caractérisés ce qui nous permet de prévoir et gérer l’apparition des symptômes ataxiques ainsi que de tester un traitement par modulation génique avant apparition des symptômes. Les tests comportementaux seront effectués à l’âge où les symptômes ataxiques sont significativement visibles afin de mesurer l’efficacité de notre traitement.